CN107119101A - 利用野生酸枣内生菌发酵生产皂甙类和黄酮类的方法 - Google Patents
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Abstract
利用野生酸枣内生菌发酵生产皂甙类和黄酮类的方法。芽孢杆菌(uncultured Bacillus sp.)菌株，GenBank登录号：KY393358，由上述内生菌发酵制备皂甙类和黄酮类的方法：(1)菌种活化；(2)制备种子液；(3)发酵；(4)皂甙类和黄酮类的精制，将上述皂甙类和黄酮类组分经过离心、过滤、醇沉、萃取、低压浓缩、层析、结晶和干燥后得到高纯度的皂甙类和黄酮类。本发明开创了利用野生酸枣内生菌发酵方法制备皂甙类和黄酮类的规模化生产新途径；本发明利用葡萄糖为原料，通过内生菌发酵技术制备皂甙类和黄酮类，发酵液组分简单，产物存在于发酵液中，杂质少，易于纯化。
Description
技术领域
本发明涉及野生酸枣加工和皂甙类和黄酮类的生产技术领域，尤其涉及的是一种利用野生酸枣内生菌发酵生产皂甙类和黄酮类的方法。
背景技术
酸枣[Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chow.]为鼠李科枣属的一种灌木或小乔木，种仁、果肉、叶和根均可入药，能起到镇静安神、敛汗生津、养肝宁心的作用，广泛分布于我国中、北部地区，抗逆性强，是一种耐旱、耐寒、耐盐碱的野生药用植物，并且具有较高经济价值和药用价值的野生果树资源。中医典籍《神农本草经》中记载，酸枣可以“安五脏，轻身延年”，酸枣仁用于虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗、津伤口渴、是一种广受人们认可的安神药物。酸枣仁皂苷A、B、B1(jujuboside A、B、B1)较早从酸枣仁的甲醇提取液中分离出的3个中性皂苷。近年，运用多种色谱和波谱方法(IR,UV,MS,NMR)分离鉴定出酸枣仁皂苷E、D、H(jujuboside E、D、H)及一种新羽扇豆烷型三萜化合物，命名为罗珠子酸甲酯(alphitolic acid methylester)。近年酸枣仁生物碱及脂肪酸类成分研究也有新进展，如从酸枣仁中分离出环肽类生物碱jubanine。较早报道的黄酮类为黄酮苷Spinosin和Zivulgarin。目前对酸枣的研究多集中于果仁部分，并发现与酸枣仁宁心安神功效发挥密切相关的物质可能为其所含有的三萜皂苷类、黄酮类及环肽类生物碱等化学成分，而对酸枣其他组织的研究报道国内外报道均较少。目前仅刘东、高振峰等分别从山西酸枣体内分离获得76株内生细菌和40株内生真菌，吴家飞等从南酸枣(Choerospondiasaxillaris)中分离到一株对芒果炭疽病菌拮抗作用较强的菌株WYG5，有关酸枣内生菌的研究目前尚未见报道。迄今为止，有众多学者对酸枣进行过一些研究，但主要集中在酸枣仁的化学成分和药理药效方面，而少见关于酸枣产药用活性成分内生菌的报道，鉴于药用植物内生菌具有潜在的重要应用价值，为寻找植物内生菌产生与宿主植物相同或相似有效成分。酸枣资源是有限的，人们对它的过度利用已经对生态环境造成了破坏，利用酸枣内生菌发酵产生与宿主有相同或相似药用价值的成分，既可以节约药材，保护生态环境，降低生产成本，还可以弥补季节性的缺陷，实现循环可持续地生产。
工业上目前传统的制备酸枣仁总皂苷的方法主要是提取技术，主要有热回流提取法、超声提取法、高速逆流色谱分离法及酶法提取等，这些方法的主要弊端在于所得酸枣仁总皂苷纯度低、提取能耗大、有机溶剂对环境污染严重等。从酸枣仁中提取分离总黄酮类物质的方法均为萃取法。如：药材先用石油醚或乙醚索式提取法脱脂后，用甲醇或70％乙醇加热回流提取，再用乙酸乙脂或正丁醇萃取得总黄酮，目前所使用的技术中采用萃取法从酸枣仁中提取分离总黄酮类物质，不但重现性不好，而且提取物中杂质较多，黄酮含量不高。用现有技术制备获得的皂甙类和黄酮类工艺复杂，成本高，如何才能有效地解决上述现有技术的缺陷，开发研究出一种具有产业化前景、生产工艺简单、经济效益良好、无二次污染等特点的绿色、环境友好型的全新皂甙类和黄酮类生产和制备技术是一个亟待解决的问题。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供利用野生酸枣内生菌发酵生产皂甙类和黄酮类化合物的方法，该方法采用微生物发酵方法制备皂甙类和黄酮类，与传统的通过酸枣等提取的方法相比，工艺简单，成本低，不发生结构异化，完整地保持了皂甙类和黄酮类有效成分的原有化学结构和优良药效；采用野生酸枣内生菌发酵法制备皂甙类和黄酮类，微生物培养所用的营养基质是工业生产的副产物，既可以使废弃物得到有效利用，又能带来较大的经济效益；反应快捷、产物污染小、途径新，目前尚未有利用野生酸枣内生菌发酵的方法来制备皂甙类和黄酮类的报道。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种利用野生酸枣内生菌发酵生产皂甙类和黄酮类的方法，包括如下步骤：选取从野生酸枣内提取纯化的芽孢杆菌(uncultured Bacillus sp.)，GenBank登录号：KY393358；
步骤(1)菌种活化
将在4℃下保存的所述芽孢杆菌菌株由斜面转接到固体培养基中，30℃下，在恒温培养箱培养12～20h；
步骤(2)制备种子液
取上述经活化后的菌种，接种到种子培养基中(装液量100mL/500mL三角瓶)，摇床转速180r/min，30℃震荡培养12～20h。
步骤(3)发酵
将上述种子液按2％～4％(体积分数)的接种量接入到装有培养基的发酵罐中发酵，装料系数0.75，控制温度28～31℃，pH 7.0～7.2，保持溶氧饱和度12％以上，培养5d，收集发酵液。
步骤(4)皂甙类和黄酮类的精制
将(4)中的皂甙类和黄酮类发酵液组分经过离心、过滤、醇沉、萃取、低压浓缩、层析、结晶和干燥后得到高纯度的皂甙类和黄酮类。
进一步的，上述技术方案中，按照质量体积比，所述步骤(1)中培养基的组成为：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％NH4NO3，0.5％KH2PO4，0.01％MgSO4，1.5％琼脂，其余为水。pH 7.0～7.2，115℃灭菌25min。
进一步的，上述技术方案中，按照质量体积比，所述步骤(2)中培养基的组成为：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％NH4NO3，0.5％KH2PO4，0.01％MgSO4，其余为水。pH 7.0～7.2，115℃灭菌25min。
进一步的，上述技术方案中，按照质量体积比，所述步骤(3)中培养基的组成为：4％～6％葡萄糖，0.06％NH4NO3，0.5％KH2PO4，0.01％MgSO4，其余为水。pH 7.0～7.2，115℃灭菌25min。发酵温度28～31℃，通气量0.7-0.9:1(V:V)，搅拌速度180-190r/min，pH 7.0～7.2。
进一步的，本发明中，离心、过滤、醇沉、萃取、低压浓缩、层析、结晶和干燥属于现有技术，本领域技术人员可以根据产物需要合理选择；本发明优选将发酵液收集后，经4000r/min高速离心15min，分为菌体和发酵液两部分，过滤得到的菌体采用体积分数60％乙醇，210W超声浸提30min，过滤、收集浸提液，再经真空抽滤，合并过滤的发酵液和浸提液，50℃减压浓缩，去除乙醇。用乙酸乙酯萃取，浓缩后于4℃冰箱保存备用。取上述乙酸乙酯萃取物，加少许甲醇使之溶解，样品溶于热乙醇中，配置浓度为1mg/ml上样液，并加入5ml氯化钠。取30ml上样液以2ml/min的流速通过树脂层并浸泡树脂2h，用浓度为95％、65％的乙醇在2ml/min的流速下分别对乙酸乙酯相浸膏、正丁醇相浸膏进行洗脱，收集洗脱液，在60℃水浴锅蒸馏除去溶剂得到固体并烘干至粉末。上硅胶柱(5inner diameter×130cm)，用体积比为9.6:0.4比例的氯仿/甲醇以15ml/min的速度洗脱，并收集洗脱产物再用SephadexLH-20，以甲醇作为流动相洗脱，进行进一步纯化并结晶。
进一步的，本发明中皂甙类和黄酮类的测定方法：
HPLC分析的检测条件为:黄酮类检测：色谱柱为Kromasil C18(5μm,4.6mm×150mm)；流动相：甲醇：0.2％磷酸＝50:50(v/v)；流速：0.8ml/min；检测波长：260；柱温：25℃；进样量：10μL；皂苷类检测：色谱柱为Kromasil C18(5μm,4.6mm×150mm)；流动相：乙腈：水＝2:3(v/v)；流速：1ml/min；检测波长：204；柱温：35℃；进样量：10μL。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明开创了利用酸枣内生菌发酵方法制备皂甙类和黄酮类的规模化生产新途径；本发明优化了皂甙类和黄酮类的分离纯化技术与工艺参数，建立了一套下游加工方法，此方法具有工艺简单，成本低，不发生结构异化，完整地保持了皂甙类和黄酮类有效成分的原有化学结构和优良药效易于操作等优点；同时具有生产周期短，不受气候和地理环境条件的限制，易于提取和应用面广等特性，适合于工业化生产。本发明利用葡萄糖为原料，通过野生酸枣内生菌发酵技术制备，发酵液组分简单，产物存在于发酵液中，杂质少，易于纯化，制备得到的皂甙类和黄酮类与皂甙类和黄酮类标准品一致。
附图说明
图1酸枣内生菌菌株发酵液与芦丁标品薄层层析图谱比较图。图中J:为内生菌菌株发酵液；X:芦丁标品；
图2皂甙类和黄酮类对照品与内生菌发酵液高效液相色谱比较图。
其中，2-A是黄酮类标准品；2-B是皂甙A标准品；2-C是内生菌发酵液，其中a为黄酮类物质，b为皂甙类物质。
图3为本发明中菌种的16S rDNA图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：如图1-3所示：
实施例1
一种利用野生酸枣内生菌发酵生产皂甙类和黄酮类的方法，其步骤如下：选取从野生酸枣内提取纯化的芽孢杆菌(uncultured Bacillus sp.)，GenBank登录号：KY393358；其16S rDNA图如图3所示；
(1)菌种活化
将在4℃下保存菌株由斜面培养基转接到固体培养基中，30℃下，在恒温培养箱培养12～20h。其中培养基的组成为：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％NH4NO3，0.5％KH2PO4，0.01％MgSO4，1.5％琼脂，其余为水。pH 7.0～7.2，115℃灭菌25min。
(2)制备种子液
取上述经活化后的菌种，接种到种子培养基中(装液量100mL/500mL三角瓶)，摇床转速180r/min，30℃震荡培养12～20h。其中培养基的组成为：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％NH4NO3，0.5％KH2PO4，0.01％MgSO4，其余为水。pH 7.0～7.2，115℃灭菌25min。
(3)发酵
将上述种子液按2％～4％(体积分数)的接种量接入到装有培养基的发酵罐中发酵，装料系数0.75，控制温度28～31℃，pH 7.0～7.2，保持溶氧饱和度12％以上，培养5d，收集发酵液。其中培养基的组成为：4％～6％葡萄糖，0.06％NH4NO3，0.5％KH2PO4，0.01％MgSO4，其余为水。pH 7.0～7.2，115℃灭菌25min。发酵温度28～31℃，通气量0.7-0.9:1(V:V)，搅拌速度180-190r/min，pH 7.0～7.2。
(4)皂甙类和黄酮类的精制
将发酵液收集后，经4000r/min高速离心15min，分为菌体和发酵液两部分，过滤得到的菌体采用体积分数60％乙醇，210W超声浸提30min，过滤、收集浸提液，再经真空抽滤，
合并过滤的发酵液和浸提液，50℃减压浓缩，去除乙醇。用乙酸乙酯萃取，浓缩后于4℃冰箱保存备用。取上述乙酸乙酯萃取物，加少许甲醇使之溶解，样品溶于热乙醇中，配置浓度为1mg/ml上样液，并加入5ml氯化钠。取30ml上样液以2ml/min的流速通过树脂层并浸泡树脂2h，用浓度为95％、65％的乙醇在2ml/min的流速下分别对乙酸乙酯相浸膏、正丁醇相浸膏进行洗脱，收集洗脱液，在60℃水浴锅蒸馏除去溶剂得到固体并烘干至粉末。上硅胶柱(5inner diameter×130cm)，用体积比为9.6:0.4比例的氯仿/甲醇以15ml/min的速度洗脱，并收集洗脱产物再用Sephadex LH-20，以甲醇作为流动相洗脱，进行进一步纯化并结晶。
附图1薄层层析(TLC)检测结果表明，野生酸枣内生菌菌株在Rf为0.46处有与芦丁标准品颜色相同，迁移率相当的显色斑，紫外光下显黄色荧光，进一步确定野生酸枣内生菌菌株具有能够发酵产生黄酮类物质的能力。
实施例2本发明制备的皂甙类和黄酮类的检测
(1)菌种活化
将在4℃下保存菌株由斜面转接到固体培养基中，30℃下，在恒温培养箱培养12～20h。其中培养基的组成为：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％NH4NO3，0.5％KH2PO4，0.01％MgSO4，1.5％琼脂，其余为水。pH 7.0～7.2，115℃灭菌25min。
(2)制备种子液
取上述经活化后的菌种，接种到种子培养基中(装液量100mL/500mL三角瓶)，摇床转速180r/min，30℃震荡培养12～20h。其中培养基的组成为：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％NH4NO3，0.5％KH2PO4，0.01％MgSO4，其余为水。pH 7.0～7.2，115℃灭菌25min。
(3)发酵
将上述种子液按2％～4％(体积分数)的接种量接入到装有培养基的发酵罐中发酵，装料系数0.75，控制温度28～31℃，pH 7.0～7.2，保持溶氧饱和度12％以上，培养5d，收集发酵液。其中培养基的组成为：4％～6％葡萄糖，0.06％NH4NO3，0.5％KH2PO4，0.01％MgSO4，其余为水。pH 7.0～7.2，115℃灭菌25min。发酵温度28～31℃，通气量0.7-0.9:1(V:V)，搅拌速度180-190r/min，pH 7.0～7.2。
(5)皂甙类和黄酮类的精制
将发酵液收集后，经4000r/min高速离心15min，分为菌体和发酵液两部分，过滤得到的菌体采用体积分数60％乙醇，210W超声浸提30min，过滤、收集浸提液，再经真空抽滤，
合并过滤的发酵液和浸提液，50℃减压浓缩，去除乙醇。用乙酸乙酯萃取，浓缩后于4℃冰箱保存备用。取上述乙酸乙酯萃取物，加少许甲醇使之溶解，样品溶于热乙醇中，配置浓度为1mg/ml上样液，并加入5ml氯化钠。取30ml上样液以2ml/min的流速通过树脂层并浸泡树脂2h，用浓度为95％、65％的乙醇在2ml/min的流速下分别对乙酸乙酯相浸膏、正丁醇相浸膏进行洗脱，收集洗脱液，在60℃水浴锅蒸馏除去溶剂得到固体并烘干至粉末。上硅胶柱(5inner diameter×130cm)，用体积比为9.6:0.4比例的氯仿/甲醇以15ml/min的速度洗脱，并收集洗脱产物再用Sephadex LH-20，以甲醇作为流动相洗脱，进行进一步纯化并结晶。
附图2皂甙类和黄酮类标准品与野生酸枣内生菌发酵液高效液相色谱比较图。由发酵产物的HPLC图谱显示，皂甙类保留时间为Rt＝6.732，黄酮类标准品保留时间Rt＝5.015并各有一主要吸收峰，酸枣内生菌菌株的发酵产物的出峰顺序依次为：组分a在保留时间Rt＝5.432min，出现新的吸收峰，组分b在保留时间Rt＝6.715min处有一主要吸收峰，可以看出，组分a与组分黄酮类的保留时间相近，组分b与组分皂甙类的保留时间相近，由此可以确定野生酸枣内生菌菌株发酵液制备得到的物质与皂甙类和黄酮类标准品结构一致。
通过分析可以证明本发明制备的产品为高纯度皂甙类和黄酮类。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种利用野生酸枣内生菌发酵生产皂甙类和黄酮类的方法，其特征是，其步骤如下：选取从野生酸枣内筛选的芽孢杆菌(uncultured Bacillus sp.)，GenBank登录号：KY393358；
步骤(1)菌种活化
将在4℃下保存的所述芽孢杆菌菌株由斜面转接到固体培养基中，30℃下，在恒温培养箱培养12～20h；
步骤(2)制备种子液
取步骤(1)中经活化后的菌种，接种到种子培养基中，摇床转速180r/min，30℃震荡培养12～20h；
步骤(3)发酵
将步骤(2)中种子液按体积分数2％～4％的接种量接入到装有培养基的发酵罐中发酵，装料系数0.75，控制温度28～31℃，pH 7.0～7.2，保持溶氧饱和度12％以上，培养5d，收集发酵液；
步骤(4)皂甙类和黄酮类的精制
将步骤(4)中的含皂甙类和黄酮类的发酵液组分经过离心、过滤、醇沉、萃取、低压浓缩、层析、结晶和干燥后得到高纯度的皂甙类和黄酮类。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，按照质量体积比，固体培养基的组成为：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％NH4NO3，0.5％KH2PO4，0.01％MgSO4，1.5％琼脂，其余为水。pH 7.0～7.2，115℃灭菌25min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，按照质量体积比，固体培养基的组成为：1％葡萄糖，0.25％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.06％NH4NO3，0.5％KH2PO4，0.01％MgSO4，其余为水。pH 7.0～7.2，115℃灭菌25min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，按照质量体积比，固体培养基的组成为：1％～6％葡萄糖，0.06％NH4NO3，0.5％KH2PO4，0.01％MgSO4，其余为水。pH 7.0～7.2，115℃灭菌25min。发酵温度28～31℃，通气量0.7-0.9:1(V:V)，搅拌速度180-190r/min，pH 7.0～7.2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，菌种接种到种子培养基中的装液量为100mL/500mL三角瓶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，离心、过滤、醇沉、萃取、低压浓缩、层析、结晶和干燥具体操作为：将发酵液收集后，经4000r/min高速离心15min，分为菌体和发酵液两部分，过滤得到的菌体采用体积分数60％乙醇，210W超声浸提30min，过滤、收集浸提液，再经真空抽滤，合并过滤的发酵液和浸提液，50℃减压浓缩，去除乙醇；用乙酸乙酯萃取，浓缩后于4℃冰箱保存备用；取上述乙酸乙酯萃取物，加少许甲醇使之溶解，样品溶于热乙醇中，配置浓度为1mg/ml上样液，并加入5ml氯化钠；取30ml上样液以2ml/min的流速通过树脂层并浸泡树脂2h，用浓度为95％、65％的乙醇在2ml/min的流速下分别对乙酸乙酯相浸膏、正丁醇相浸膏进行洗脱，收集洗脱液，在60℃水浴锅蒸馏除去溶剂得到固体并烘干至粉末；上5inner diameter×130cm硅胶柱，用体积比为9.6:0.4比例的氯仿/甲醇以15ml/min的速度洗脱，并收集洗脱产物再用Sephadex LH-20，以甲醇作为流动相洗脱，进行进一步纯化并结晶。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，本发明中皂甙类和黄酮类的测定方法：
HPLC分析的检测条件为:黄酮类检测：色谱柱为Kromasil C18，5μm,4.6mm×150mm；流动相：甲醇：0.2％磷酸＝50:50(v/v)；流速：0.8ml/min；检测波长：260；柱温：25℃；进样量：10μL；皂苷类检测：色谱柱为Kromasil C18，5μm,4.6mm×150mm；流动相：乙腈：水＝2:3(v/v)；流速：1ml/min；检测波长：204；柱温：35℃；进样量：10μL。
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