CN104262129B - 一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法 - Google Patents

一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104262129B
CN104262129B CN201410564384.XA CN201410564384A CN104262129B CN 104262129 B CN104262129 B CN 104262129B CN 201410564384 A CN201410564384 A CN 201410564384A CN 104262129 B CN104262129 B CN 104262129B
Authority
CN
China
Prior art keywords
obtains
vitamin
sherwood oil
menaquinone
natto
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410564384.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN104262129A (zh
Inventor
陈杰鹏
段丽丽
陈煜藩
陈鸿锐
邱雪莲
蔡桂珠
洪琳
胡留松
黄晓莹
张岳霖
许志锴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shuan Jun Bio Tech Ltd Guangdong
Original Assignee
Shuan Jun Bio Tech Ltd Guangdong
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shuan Jun Bio Tech Ltd Guangdong filed Critical Shuan Jun Bio Tech Ltd Guangdong
Priority to CN201410564384.XA priority Critical patent/CN104262129B/zh
Publication of CN104262129A publication Critical patent/CN104262129A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104262129B publication Critical patent/CN104262129B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C46/00—Preparation of quinones
    • C07C46/10—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus？subtilis？natto)ST188,CGMCC？No.8400以及一种用该菌株提纯高纯度的维生素甲萘醌-7的高收率方法。该方法包括以下步骤：1)将所述纳豆菌发酵液喷雾干燥，用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干粉，获得浸溶液；2)将步骤1)获得的浸溶液浓缩得到浸膏；3)将步骤2)获得的浸膏通过柱层析，并进行梯度或等度洗脱，收集液浓缩，得到甲萘醌-7粗品；4)将步骤3)得到的甲萘醌-7粗品结晶提纯，即得所述维生素甲萘醌-7纯品。

Description

一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法
本申请要求2014年03月31日提交的中国专利申请号为201410129217.2，发明名称为“一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法”的发明专利申请的优先权。
技术领域
本发明涉及一种纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto)ST188，CGMCCNo.8400，以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法。
背景技术
由于维生素K具有促进凝血的作用,又被称为凝血维生素。近半个世纪以来，人们对维生素K的认识仅限于其对凝血系统的影响，直到1960年Bouckaert发现维生素K可以促进兔子的骨折愈合。1975年，Pettifor等首次提出维生素K参与人体骨代谢的假说之后，人们对维生素K在骨骼新陈代谢的作用才有了深入的认识。
维生素K族包括数个脂溶性的2-甲基-1,4-萘醌衍生物。天然的维生素K包括维生素K1(即叶绿醌)和维生素K2(即甲萘醌类)，其以在2-甲基-1,4-萘醌环状结构的3号位置上的亲脂性侧链为特征。叶绿醌的侧链是确定长度的不饱和烃链，甲萘醌的侧链则是不确定长度的不饱和烃链。(维生素K1即叶绿醌为一种化合物，维生素K2为一系列化合物)。
维生素K2不单有促进凝血、改善动脉硬化的作用，国外也有作者在研究其对肝癌和白血病的作用。现在我国已进入老龄化社会，骨质疏松患者发病率较高。大量资料研究表明，维生素K2缺乏可导致老年人髋骨骨折和骨密度降低。维生素K2缺乏，血清未羧化骨钙蛋白水平降低，血清羧化骨钙蛋白水平也可能降低，从而可能导致老年人骨密度降低发生髋骨骨折危险。
维生素K2作为一种营养物质，并可以作为骨代谢调整物质，覆盖全身的作用；副作用较少，呈脂溶性，可以饭后服用，不论什么年龄都适宜使用。(邹志强，维生素K2的研究进展，中国骨质疏松杂志，2005，11(3)：389-392)
1995年日本开始将维生素K2制剂作为改善骨量减少、疼痛的骨质疏松症的药物销售。(王理明，维生素K2与骨质疏松，2007，26(4)：293-295)
维生素K2(2-甲基-3-全反式-聚戊烯-1,4-萘醌)或甲萘醌类是一族异戊烯基衍生物。由5个碳原子组成的异戊二烯残基的数量可用于区分甲萘醌系化合物。其命名规则是基于异戊二烯基的数量，例如“甲萘醌”或“MK”之后加上基团的数量。尽管甲萘醌侧链上已经被发现最多达到15个异戊二烯基，但在人类和动物组织中出现的只有含有2到13个异戊二烯基的甲萘醌。脱甲基化的甲萘醌，即在2号碳原子位点上未结合的甲萘醌也已经被发现。
维生素K2的一般性名称或常用名为甲萘醌，其基本成分为甲萘醌-4(MK-4)和甲萘醌-7(MK-7)。已知MK-7是活性最强的维生素K2中的一种。
叶绿醌及2种常见的甲萘醌结构图如下所示。
维生素K1
分子量：450
甲萘醌-4
分子量：444
甲萘醌-7
分子量：649
然而目前，还没有一种能够简单、高效的提纯维生素K2的方法，尤其是提纯维生素K2的MK-7的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto)ST188,CGMCCNo.8400以及一种用该菌株提纯维生素甲萘醌-7(MK-7)的方法。该方法简单高效，并且能够获得维生素MK-7较高的纯度和收率。
本发明所提供的纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto)ST188，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年10月31日，保藏号为:CGMCCNo.8400。
本发明提供的提纯维生素甲萘醌-7的方法包括以下步骤：
1)将纳豆菌发酵液喷雾干燥，用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干粉，获得浸溶液，所述纳豆菌为纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto)ST188，保藏号为:CGMCCNo.8400；
2)将步骤1)获得的浸溶液浓缩得到浸膏；
3)将步骤2)获得的浸膏通过柱层析，并进行梯度或等度洗脱，将收集液浓缩，得到甲萘醌-7粗品；
4)将步骤3)得到的甲萘醌-7粗品结晶提纯，即得所述维生素甲萘醌-7纯品。
美国大豆出口理事会(USSEC)定义纳豆为发酵大豆制品。亚洲部分国家的日常食物均为发酵大豆制品，包括酱油、味噌、腐乳、纳豆、天贝、豆豉、霉豆渣、酱糗子等。发酵大豆制品的不同之处在于，大豆作为酶解基质有时与谷物结合使用，参与发酵过程的微生物亦有所不同。而纳豆是完全以大豆经过芽孢杆菌或纳豆枯草杆菌发酵而来的。本申请所述的纳豆菌发酵液是以黄豆粉经过纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto)发酵而获得的发酵液。所述纳豆枯草芽孢杆菌可以从市购的日本传统食品纳豆中分离获得。
根据本发明的一个实施方式，所述纳豆菌发酵液可以为将所述纳豆枯草芽孢杆菌ST188接种在含有10-50g/1000mL黄豆粉和5-45g/1000mL蔗糖的培养基中，在30-40℃，经过20-48小时发酵获得纳豆菌发酵液，其中所述纳豆枯草芽孢杆菌ST188的接种浓度为5-20％。
根据本发明的一个实施方式，在喷雾干燥(本发明中简称：喷干)所述纳豆菌发酵液之前，通过向所述纳豆菌发酵液中添加大豆油，可以有效保护所述纳豆菌发酵液中维生素MK-7不被喷干过程的高温破坏，因此，有助于提高MK-7的收率。
根据本发明的一个实施方式，只要向所述纳豆菌发酵液中添加的大豆油即可有利于提高维生素MK-7的收率。优选情况下，向纳豆菌发酵液中添加0.1-1重量％的大豆油，更有利于提高维生素MK-7的收率。
根据本发明的一个实施方式，在步骤1)中，将喷干水分控制在3％以下，从而有利于MK-7的提取。同时，采用喷干粉来提取，比发酵液直接用有机溶剂萃取，可以减少80％的有机溶剂的用量，同时因为含水少而有利于减压浓缩。
根据本发明的一个实施方法，在步骤1)中，用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干粉的条件包括：将纳豆菌发酵液喷干粉与溶剂按1：3-8的质量比混合，更优选以1：3-6的质量比混合，在15-40℃的温度下，以20-60rpm搅拌速率搅拌20-40min，固液分离，所得清液即为浸溶液。其中，固液分离可以采用本领域技术人员已知的任意一种固液分离方式，例如静置沉淀、过滤、离心分离等方法中的任意一种或多种结合的方式。此外，对于所得固体可以进行多次提取或浸溶(多次提取或浸溶可以尽可能提高收率)。
根据本发明的一个实施方式，在步骤1)中，所述溶剂选自甲醇、石油醚、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯和75-100体积％乙醇中的一种或多种。更优选情况下，所述溶剂选自石油醚、丙酮、二氯甲烷、异丙醇、乙酸乙酯和75-100体积％乙醇中的一种或多种。
根据本发明的一个实施方式，在步骤2)和步骤3)中，所述浓缩可以为减压浓缩或蒸发浓缩。本发明优选减压浓缩。所述减压浓缩的条件包括：温度为40-95℃，真空度小于3000Pa。
根据本发明的一个实施方案，将步骤2)获得的浸膏以湿法上柱脱色包括：将硅胶和石油醚按1:1.5-2质量比混匀后装柱，再将步骤2)获得的浸膏和石油醚按1:0.5-1质量比混匀后上柱。
根据本发明的一个实施方案，在步骤3)中，所述柱层析的方法包括：首先将步骤2)获得的浸膏以湿法上柱脱色，并以第一淋洗剂洗脱；然后将脱色后的产物以湿法干法混合上柱方式进行纯化，即先以湿法装柱，再将脱色后的产物以干法装柱的方式装填于湿法装柱的上层，并以第二淋洗剂洗脱，其中湿法干法混合上柱的柱中，湿法装柱与干法装柱的体积比为1：0.2-2。
根据本发明的一个实施方式，在步骤3)中，所述第一淋洗剂为非极性溶剂，优选为石油醚、正己烷和环己烷中的一种或多种。所述第一淋洗剂的用量为层析柱体积的2-3倍。
根据本发明的一个实施方式，将脱色后的产物以湿法干法混合上柱方式进行纯化包括：先将硅胶和石油醚以1：1.5-2的质量比混匀后装柱；再将脱色后的产物与硅胶和石油醚以1：3-4：4-5的质量比混合、阴干后装填在先以湿法装填的柱中。
根据本发明的一个实施方式，所述在湿法干法混合上柱的柱中，所述湿法装柱与所述干法装柱的体积比为1：0.2-2(即1-10：2)时，即可有利于提高维生素MK-7的收率，优选情况下，所述湿法装柱与所述干法装柱的体积比为1：0.5-1(即1-2：1)，更有利于提高维生素MK-7的收率。本发明通过采用湿法干法混合上柱的柱层析，可以更有效的吸附杂质，分离效果更好，并且适当的提高湿法装柱与干法装柱的体积比可以提高产品纯度；另外，MK-7纯度与收率较高的同时填料用量也较少。
根据本发明的一个实施方式，所述柱层析可以为硅胶柱层析、大孔树脂柱层析、SephadexLH20凝胶柱层析和聚酰胺柱层析中的任意一种或其组合。
根据本发明的一个实施方式，所述湿法装柱和所述干法装柱中使用的硅胶可以为本领域技术人员已知的能够用于层析柱的硅胶。优选情况下，所述硅胶为100-400目之间，小孔(例如，比表面积≥550m2/g，孔容≤0.7mL/g)、中孔(例如，比表面积为大于300m2/g至小于550m2/g，孔容为大于0.7mL/g至小于0.9mL/g)或粗孔(例如，比表面积为200m2/g至小于300m2/g，孔容为≥0.85mL/g)的硅胶。
根据本发明的一个实施方式，在步骤3)中，柱层析分离的方法可以采用本领域技术人员已知的方法，本发明没有特别要求。例如柱层析分离可以在低压(小于0.5MPa)、中压(0.5-5MPa)或高压(大于5MPa至40MPa)下进行分离。
根据本发明的一个实施方式，在步骤3)中，所述第二淋洗剂选自石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、异丙醇、正丁醇、丙酮、甲醇、乙醇、乙腈和水中的一种或多种。更优选情况下，所述第二淋洗剂选自石油醚、体积比为1：9的二氯甲烷和石油醚的混合物或者体积比为1：9的三氯甲烷和石油醚的混合物。所述第二淋洗剂的用量为：所述石油醚的用量为层析柱体积的10-15倍，所述体积比为1：9的二氯甲烷和石油醚的混合物的用量为层析柱体积的4-5倍，所述体积比为1：9的三氯甲烷和石油醚的混合物的用量为层析柱体积的4-5倍。
根据本发明的一个实施方式，在步骤4)中，将所述甲萘醌-7粗品结晶提纯包括：将所述甲萘醌-7粗品用溶剂进行结晶以及重结晶。优选情况下，所述溶剂可以选自石油醚、正己烷、环己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、异丙醇、正丁醇、丙酮、甲醇、乙醇、乙腈和水中的一种或多种。
根据本发明的一个实施方式，在步骤4)中，可以采用蒸发结晶或冷却结晶，结晶的温度可以为-10℃至95℃。优选地，在结晶析出过滤后，洗涤结晶，并进行重结晶，以提高最终获得的甲萘醌-7的纯度。
根据本发明的方法，能够获得纯度和收率较高的维生素MK-7。优选情况下，通过向纳豆菌发酵液中添加0.1-1重量％的大豆油，有效保护了所述纳豆菌发酵液中维生素MK-7不被喷干过程的高温破坏，从而提高了纳豆菌发酵液中维生素MK-7的量，提高了维生素MK-7的收率；同时，通过湿法上柱脱色以及湿法干法混合上柱纯化的方式，简化了纯化步骤，提高了效率，并且提高了维生素MK-7的纯度。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是根据本发明实施例1的方法获得的产物的液相色谱图。
图2是根据本发明实施例1的方法获得的产物的H谱。
图3是根据本发明实施例1的方法获得的产物的C谱。
图4是根据本发明实施例1的方法获得的产物的DEPT135谱。
图5是根据本发明实施例1的方法获得的产物的COSY谱。
图6是根据本发明实施例1的方法获得的产物的HSQC谱。
图7是根据本发明实施例1的方法获得的产物的HMBC谱。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
以下实施例中所用试剂均来自商购。
核磁共振谱通过BrukerAvanceIII-600MHz核磁共振波谱仪获得。
维生素MK-7的纯度通过美国waters公司高效液相色谱仪测量。
维生素MK-7的收率通过下式计算：
MK-7的收率＝MK-7纯品纯度×MK-7纯品重量×100％/(发酵液中MK-7浓度×发酵液体积)
实施例1
制备纳豆菌发酵液：
将纳豆(购自日本生物科技公司)用无菌水溶解、稀释后涂抹在琼脂糖-纤维蛋白平板(制作方法参见：魏华、赵祥颖、刘建军，纳豆激酶的活性测定[J].山东轻工业学院学报，2007,21(1)60-63.)上，在37℃培养18h后产生透明圈，选择透明圈较大的菌落利用紫外线(15s)多代诱变，得到纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto)ST188(菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年10月31日，保藏号为:CGMCCNo.8400)。
将500mL所得纳豆枯草芽孢杆菌ST188接种在含有185g黄豆粉和185g蔗糖的10000mL培养基中，在37℃，经过24小时发酵获得纳豆菌发酵液。
(1)向1000g纳豆菌发酵液中添加5g的大豆油然后在90℃喷干，用240g的甲醇浸溶40g纳豆菌发酵液喷干粉，所述浸溶在20℃以40rpm搅拌速率搅拌30min的条件下进行，固液分离后获得浸溶液；将获得的固体采用相同的浸溶条件进行第二次浸溶；
(2)将步骤(1)获得的浸溶液过滤后在55℃，2600Pa下减压浓缩，得到浸膏；
(3)先将8g硅胶与石油醚按1：2质量比混匀后装柱，再将步骤(2)获得的8g浸膏与石油醚以1：1的质量比湿法装柱，并用40g石油醚作为第一淋洗剂进行洗脱(在0.1MPa)1次；
(4)先将硅胶和石油醚以1：2的质量比混匀后湿法装柱，再将步骤(3)用第一淋洗剂洗脱获得的脱色产物与硅胶和石油醚以1：3：4的质量比混合、阴干后装填在先以湿法装填的柱中，湿法装柱与干法装柱的体积比为1：1，并用80g体积比为1：9三氯甲烷和石油醚的混合物作为第二淋洗剂进行洗脱(在1MPa下)1次，通过此操作可以一步纯化就得到纯度为40％的维生素MK-7；
(5)将步骤(4)获得的混合物用其30倍质量的正丁醇溶解，然后蒸发结晶，对获得的晶体进行重结晶，最终获得的产物经高效液相色谱仪获得的色谱图如图1所示、产物的氘代氯仿溶液的H谱如图2所示、C谱如图3所示、DEPT135谱如图4所示、COSY谱如图5所示、HSQC谱如图6所示，以及HMBC谱如图7所示。
1HNMR(600.13MHz,CDC13)：δ1.563(6H,s),δ1.92(12H,s),δ1.676(3H,s),δ1.677(3H,s),δ1.901-2.104(24H,m),δ2.188(3H,s),δ3.350-3.394(2H,d),δ4.992-5.146(7H,m),δ7.658-7.710(2H,m),δ8.052-8.110(2H,m)；13CNMR(150.92MHz,CDC13):δ12.68,16.02,16.43,17.69,25.70,26.01,26.50,26.67,26.70,26.77,39.73,119.06,123.84,124.14,124.26，124.40,126.19,126.31,131.25,132.15,132.18,133.27,133.33,134.89,134.92,135.23,137.56,143.35,146.16,184.52,185.46。
根据谱图解析，可认为该产物核磁共振氢谱、碳谱及化学位移相关谱与维生素甲萘醌-7的结构式相符，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。
另外，由图1可以看出最终获得的产物中含有大量的维生素MK-7。经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为95％，所得维生素MK-7的收率为93％。
实施例2
采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7，不同的是，在步骤(4)中，湿法装柱与干法装柱的体积比为2：1。
最终获得的产物与实施例1获得的产物的H谱、C谱、DEPT135谱、COSY谱、HSQC谱以及HMBC谱一致，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。
同时，经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为99％，所得维生素MK-7的收率为93％。
实施例3
采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7，不同的是，在步骤(4)中，湿法装柱与干法装柱的体积比为1：2。
最终获得的产物与实施例1获得的产物的H谱、C谱、DEPT135谱、COSY谱、HSQC谱以及HMBC谱一致，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。
同时，经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为93％，所得维生素MK-7的收率为92％。
实施例4
采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7，不同的是，在步骤(4)中，先将硅胶和石油醚以1：1.5的质量比混匀后湿法装填柱的部分，再将步骤(3)获得的混合物脱色后与硅胶和石油醚以1：4：5的质量比混合、阴干后装填在先以湿法装填的柱中。
最终获得的产物与实施例1获得的产物的H谱、C谱、DEPT135谱、COSY谱、HSQC谱以及HMBC谱一致，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。
同时，经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为94％，所得维生素MK-7的收率为93％。
实施例5
采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7，不同的是，在步骤(1)中，向1000g纳豆菌发酵液中添加10g的大豆油。
最终获得的产物与实施例1获得的产物的H谱、C谱、DEPT135谱、COSY谱、HSQC谱以及HMBC谱一致，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。
同时，经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为96％，所得维生素MK-7的收率为95％。
实施例6
采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7，不同的是，在步骤(1)中，向1000g纳豆菌发酵液中添加1g的大豆油。
最终获得的产物与实施例1获得的产物的H谱、C谱、DEPT135谱、COSY谱、HSQC谱以及HMBC谱一致，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。
同时，经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为95％，所得维生素MK-7的收率为90％。
实施例7
采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7，不同的是，在步骤(1)中，向纳豆菌发酵液中不添加大豆油。
最终获得的产物与实施例1获得的产物的H谱、C谱、DEPT135谱、COSY谱、HSQC谱以及HMBC谱一致，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。
同时，经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为93％，所得维生素MK-7的收率为80％。
实施例8
采用实施例1的方法进行提纯纳豆菌发酵液中维生素MK-7，不同的是，在步骤(4)中，层析柱直接采用干法装柱即步骤(3)所获得产物与硅胶和石油醚按1：4：4质量比混匀后阴干，再装柱，用10倍柱床体积的石油醚淋洗，一步纯化后的MK-7纯度为30％。为了获得较高的产物纯度，进行3次重复。
最终获得的产物与实施例1获得的产物的H谱、C谱、DEPT135谱、COSY谱、HSQC谱以及HMBC谱一致，即可确认该产物为维生素甲萘醌-7。
同时，经色谱分析确定产物中维生素MK-7的纯度为90％，所得维生素MK-7的收率为90％。
通过以上实施例可以看出，采用本发明提供的提纯维生素MK-7的方法，能够获得纯度较高，收率较高的维生素MK-7。
本申请包括但不限于以上实施例，凡是在本申请精神的原则下进行的任何等同替代或局部改进，都将视为在本申请的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种提纯维生素甲萘醌-7的方法，该方法包括以下步骤：
1)将纳豆菌发酵液喷雾干燥，其中，将纳豆菌发酵液喷雾干燥前，向所述纳豆菌发酵液中添加0.1-1重量％的大豆油，用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干粉，获得浸溶液，所述纳豆菌为纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto)ST188，保藏号为:CGMCCNo.8400；
2)将步骤1)获得的浸溶液浓缩得到浸膏；
3)将步骤2)获得的浸膏通过柱层析，并进行梯度或等度洗脱，将收集液浓缩，得到甲萘醌-7粗品；
4)将步骤3)得到的甲萘醌-7粗品结晶提纯，即得所述维生素甲萘醌-7纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤3)中，所述柱层析的方法包括：首先将步骤2)获得的所述浸膏以湿法上柱脱色，并以第一淋洗剂洗脱；然后将脱色后的产物以湿法干法混合上柱方式进行纯化，即先以湿法装柱，再将脱色后的产物以干法装柱的方式装填于湿法装柱的上层，并以第二淋洗剂洗脱，其中湿法干法混合上柱的柱中，所述湿法装柱与所述干法装柱的体积比为1：0.2-2。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1)中，所述提取或浸溶条件包括：将纳豆菌发酵液喷干粉与溶剂按1：3-8的质量比混合，在15-40℃的温度下，以20-60rpm搅拌速率搅拌20-40min，固液分离，所得清液即为浸溶液。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，在步骤1)中，所述溶剂选自甲醇、石油醚、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯和75-100体积％乙醇中的一种或多种。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，在步骤2)以及步骤3)中，所述浓缩为减压浓缩，所述减压浓缩的条件包括：温度为40-95℃，真空度小于3000Pa。
6.根据权利要求2所述的方法，其中，将步骤2)获得的所述浸膏以湿法上柱脱色包括：将硅胶和石油醚按1：1.5-2质量比混匀后装柱，再将步骤2)获得的浸膏和石油醚按1：0.5-1质量比混匀后上柱。
7.根据权利要求2或6所述的方法，其中，所述第一淋洗剂为非极性溶剂；所述第一淋洗剂的用量为层析柱体积的2-3倍。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述第一淋洗剂为石油醚、正己烷和环己烷中的一种或多种。
9.根据权利要求2所述的方法，其中，将脱色后的产物以湿法干法混合上柱方式进行纯化包括：先将硅胶和石油醚以1：1.5-2的质量比混匀后装柱；再将所述脱色后的产物与硅胶和石油醚以1：3-4：4-5的质量比混合、阴干后装填在先以湿法装填的柱中。
10.根据权利要求2或9所述的方法，其中，所述第二淋洗剂选自石油醚、体积比为1：9的二氯甲烷和石油醚的混合物或者体积比为1：9的三氯甲烷和石油醚的混合物，其中，所述石油醚的用量为层析柱体积的10-15倍，所述体积比为1：9的二氯甲烷和石油醚的混合物的用量为层析柱体积的4-5倍，所述体积比为1：9的三氯甲烷和石油醚的混合物的用量为层析柱体积的4-5倍。
11.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述纳豆菌发酵液为将所述纳豆枯草芽孢杆菌ST188接种在含有10-50g/1000mL黄豆粉和5-45g/1000mL蔗糖的培养基中，在30-40℃，经过20-48小时发酵获得纳豆菌发酵液，其中所述纳豆枯草芽孢杆菌ST188的接种浓度为5-20％。
12.一种纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto)ST188，保藏号为:CGMCCNo.8400。
CN201410564384.XA 2014-03-31 2014-10-21 一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法 Active CN104262129B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410564384.XA CN104262129B (zh) 2014-03-31 2014-10-21 一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410129217.2A CN103898175A (zh) 2014-03-31 2014-03-31 一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法
CN201410129217.2 2014-03-31
CN201410564384.XA CN104262129B (zh) 2014-03-31 2014-10-21 一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104262129A CN104262129A (zh) 2015-01-07
CN104262129B true CN104262129B (zh) 2016-02-03

Family

ID=50989741

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410129217.2A Pending CN103898175A (zh) 2014-03-31 2014-03-31 一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法
CN201410564384.XA Active CN104262129B (zh) 2014-03-31 2014-10-21 一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410129217.2A Pending CN103898175A (zh) 2014-03-31 2014-03-31 一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN103898175A (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104177244B (zh) * 2014-09-03 2016-04-13 玉溪健坤生物药业有限公司 从淡豆豉中提取、纯化和结晶获得mk-7的方法
CN104694589A (zh) * 2015-02-12 2015-06-10 中国科学院合肥物质科学研究院 基于利用黄杆菌原位发酵分离偶联合成维生素k2的方法
CN104694588A (zh) * 2015-02-12 2015-06-10 中国科学院合肥物质科学研究院 基于纳豆芽孢杆菌发酵制备维生素mk-7的制备方法
CN108676766B (zh) * 2018-06-01 2021-02-09 天津大学 基因修饰的应用及其获得的菌株
CN111394405A (zh) * 2019-05-14 2020-07-10 江苏臻大天园健康科技有限公司 一种纳豆发酵液中维生素k2提取工艺
CN110041184B (zh) * 2019-05-30 2022-02-01 福建康鸿生物科技有限公司 一种维生素甲萘醌-7的提纯方法
CN110699272B (zh) * 2019-07-02 2023-03-24 广东双骏生物科技有限公司 一种纳豆枯草芽孢杆菌以及生产mk-7的方法
JP7304957B2 (ja) * 2019-07-02 2023-07-07 サンゲン バイオサイエンス カンパニー，リミテッド 納豆菌及びｍｋ－７の生産方法
CN113004134B (zh) * 2021-03-04 2023-04-07 中国科学院合肥物质科学研究院 一种利用棕榈油提取物分离纯化发酵液中维生素k2的方法
CN114790468A (zh) * 2022-04-08 2022-07-26 浙江珲达生物科技有限公司 一种mk-7的发酵生产方法
CN115304464B (zh) * 2022-09-02 2023-03-14 新拓洋生物工程有限公司 一种维生素k2（35）的提取方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6677143B2 (en) * 1998-05-17 2004-01-13 Honda Trading Company Method for culturing Bacillus subtilis natto to produce water-soluble vitamin K and food product, beverage, or feed containing the cultured microorganism or the vitamin K derivative
JP4104741B2 (ja) * 1998-09-08 2008-06-18 旭松食品株式会社 ビタミンｋ高生産性菌株及びそれを用いたビタミンｋの生産方法
JP3834048B2 (ja) * 2004-12-28 2006-10-18 株式会社日本生物科学研究所 納豆菌培養液に由来する食品の製造方法
CN102827798A (zh) * 2012-09-14 2012-12-19 上海红马饲料有限公司 一种维生素k2高产菌株
CN102808005A (zh) * 2012-09-14 2012-12-05 上海红马饲料有限公司 一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素k2的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103898175A (zh) 2014-07-02
CN104262129A (zh) 2015-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104262129B (zh) 一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法
CN101190258A (zh) 富含小白菊内酯的总倍半萜内酯提取物及其制备方法和应用
CN107823237A (zh) 一种牛蒡根总黄酮的提取方法
CN102078339B (zh) 一种富集纯化桑黄中桑黄总黄酮的方法
CN108299453B (zh) 一种从补骨脂中分离补骨脂素、异补骨脂素和补骨脂酚的方法
CN102070688A (zh) 一种富集纯化淫羊藿中淫羊藿苷的方法
CN103819326B (zh) 一种从微生物中分离纯化辅酶q10的方法
CN105734091A (zh) 一种由红曲霉液态发酵法生产高纯度红曲素和红曲黄素的方法
CN103408610B (zh) 从梨树叶中提取熊果苷的方法
CN103113433B (zh) 一种从巧玲花中提取橄榄苦苷的方法
CN102010387B (zh) 一种提纯奥利司他的方法
CN103169727B (zh) 流苏花总黄酮类化合物及其制备方法和应用
WO2012061984A1 (zh) 制备芍药内酯苷和芍药苷的方法
CN105175426B (zh) 一种从四方藤中提取纯化岩白菜素的方法
CN109453234B (zh) 桑白皮制品及其制备方法
CN103570647A (zh) 从红豆杉细胞培养液中制备高纯度紫杉醇的方法
CN106220480A (zh) 罐组装动态逆流提取铁皮石斛中石斛酚的工艺
CN106109668B (zh) 荔枝果肉中抑制肝细胞脂质聚集主效酚类成分的纯化方法
CN107954839A (zh) 一种抗炎活性化合物peniroquesine A及其制备方法和应用
CN104610214B (zh) 一种快速制备瑞香狼毒中6种化合物的方法
CN104961667B (zh) 一种萝卜硫素的纯化方法
CN101270134B (zh) 葫芦茶素的制备方法
CN105367615B (zh) 一种大豆苷的分离纯化方法
CN106620032B (zh) 一种瑞香狼毒总二萜的制备方法
CN105924481B (zh) 一种红景天苷的提取方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant