CN106620032B - 一种瑞香狼毒总二萜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种瑞香狼毒总二萜的制备方法,属于植物提取技术领域。瑞香狼毒中总二萜由乙醇提取、乙酸乙酯萃取以及反相中压柱层析分离等三步获得。所制得的瑞香狼毒总二萜中的二萜含量高达90%以上。本方法采用反相ODS柱,依次以80%与95%甲醇溶液进行洗脱,有效除去了非二萜类杂质,工艺合理,并且本方法成本低廉,操作步骤简单,易于放大,非常适合规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于植物提取技术领域,涉及一种瑞香狼毒总二萜的制备方法,特别是涉及一种采用萃取技术和反相ODS柱层析技术联用提取制备瑞香狼毒中总二萜的方法。
背景技术
瑞香狼毒(Stellerachamaejasme L.)系瑞香科狼毒属植物,俗名断肠草,分布于中、俄、蒙、朝等国,在我国主要产自北方各省区及西南地区,生于海拔2600~4200米干燥而向阳的高山草坡、草坪或河滩台地。其味苦辛,性平,有大毒,入肺脾肝经,根入药,有逐水祛痰、破积杀虫之功效。现代药理学研究表明瑞香狼毒具有很好的抗肿瘤活性,最新研究还发现其具有抗病毒、抗菌、抗惊厥和免疫调节等作用。目前,从瑞香狼毒中分离鉴定出的化学成分主要有二萜类、倍半萜类、黄酮类、香豆素类、木脂素类等,其中,瑞香狼毒中的二萜类成分含量极低,但具有很好的药理活性。如尼地吗啉(gnidimacrin)对人类白血病K562,胃癌Kato-Ⅲ、MKN-28、MKN-45等细胞系均具有强烈的抑制作用,其IC50值可达0.12ng/mL(FengW,et al.CHINESE J CANCER RES,1996.17(02));狼毒酯A~C(stelleralide A~C)显示出潜在的抗HIV活性,其EC90值低至1nM(Asada Y,et al.ORG LETT,2011.13(11));荛花酯J(wikstroelideJ)抑制人类非小细胞肺癌细胞A549的IC50值为0.024μM,而机理研究进一步证明荛花酯J是拓扑异构酶Ⅱ的良好抑制剂,它能有效地诱导肿瘤细胞在G2~M期的凋亡(Liu L,et al.BIOORGAN MED CHEM,2014.22(15))。诸如此类,文献中对瑞香狼毒二萜药理作用研究的报道有很多,但鲜有对其提取制备方法的报道,这说明从事这方面的研究具有重要意义。
发明内容
本发明在前期研究瑞香狼毒化学成分的基础上,提供了一种快速制备瑞香狼毒药材中总二萜的新工艺。以瑞香狼毒药材为原料,经乙醇提取、乙酸乙酯萃取以及反相ODS中压柱层析等步骤,所得流份直接减压浓缩至干即可获得目标成分含量大于90%的瑞香狼毒总二萜部位。步骤为:
(1)取瑞香狼毒药材,粉碎,置于提取釜中,加入无水乙醇浸泡2~3小时后,在减压下50~60℃水浴加热前煮,冷凝回流,提取3~4次,每次2~4小时。合并提取液,负压下干燥至无醇味,得浸膏。
(2)将上述浸膏用纯水超声分散得分散液,置于分液漏斗中,加入乙酸乙酯萃取,重复3~4次。之后放去水层,合并乙酸乙酯层,在负压下蒸干,得萃取物。
(3)将上述萃取物以甲醇-水溶液分散后,湿法上样,过反相层析柱,依次以两个不同浓度的甲醇-水溶液洗脱,中压泵加压,流量控制在100~150mL/min,收集第二个甲醇-水流份,干燥即得瑞香狼毒总二萜。
上述步骤(1)中按液料比计提取药材所用无水乙醇的体积为药材质量的8~10倍。
上述步骤(2)中分散浸膏所用纯水的体积为浸膏质量的5~7倍,萃取所用乙酸乙酯的体积为分散液体积的2~3倍。
上述步骤(3)中分散萃取物所用甲醇-水溶液的体积浓度为80~85%,其体积为萃取物质量的1~2倍。
上述步骤(3)中反相柱层析所用填料为ODS,粒径为40~50μm。
上述步骤(3)中两次洗脱所用甲醇-水溶液的体积浓度依次为80~85%和95~100%,洗脱后收集第二次洗脱的甲醇-水流份。
综上所述,本发明具有的优点为:
(1)采用无水乙醇冷浸法与减压回流煎煮法结合,提取充分。
(2)采用纯水分散、乙酸乙酯萃取的方法除去大部分水溶性杂质,减少了后续上柱的样品量,同时减轻了对反相柱分离的干扰,使ODS对二萜的分离能力大大增强,更能适应规模化提取的需要。
(3)反相层析柱首先以80%甲醇-水洗脱,除去含量较高的黄酮、香豆素等成分,之后以95%甲醇-水洗下所有二萜类成分,也避免如脂肪酸等弱极性成分的引入。
(4)提取、萃取及反相柱层析等操作均在较低温度下进行,有效减少了二萜类成分的分解。
(5)本发明工艺简单,产品目标成分含量高、色泽好,非常适合大规模生产。
附图说明
图1为实施例1所得瑞香狼毒总二萜的UPLC-MS分析色谱图。其中(a)示瑞香狼毒总二萜的UPLC-MS总离子流色谱图(TIC);(b)示已报道16个二萜类化合物的提取离子流色谱图(EIC)的叠加图。
图2为紫外分光光度法测定实施例1所得瑞香狼毒总二萜中二萜类成分含量的标准曲线。
具体实施方式
现结合实施例和附图对本发明做进一步详细说明,实施例仅限于说明本发明,而非对本发明的限定。
实施例1
取瑞香狼毒药材1kg,粉碎成粗粉,置于提取釜中,加入8L无水乙醇浸泡2小时后,水浴50℃,在减压下煎煮3次,冷凝回流,每次2小时。之后合并3次提取液,负压干燥得浸膏115g。将浸膏用0.6L纯水超声分散后,在分液漏斗中,加入1.2L乙酸乙酯萃取,重复3次。之后放去水层,将合并的乙酸乙酯层在负压下蒸干,得萃取物66g。将萃取物以70mL80%甲醇-水溶液分散后,湿法上样,过40~50μm ODS反相层析柱(柱长40cm,内径8cm),依次以80%、95%甲醇-水溶液充分洗脱,中压泵加压,流量控制在100mL/min,收集95%甲醇-水流份,干燥即得瑞香狼毒总二萜4.4g。
采用UPLC-MS对实施例1所得瑞香狼毒总二萜进行定性分析,采用提取离子流色谱图(EIC)及生成分子式的方法初步鉴定出16个含量较高的文献已报道二萜类化合物。由此可知,所得总二萜样品的主要成分为二萜类化合物。具体结果如表1及附图1;图1为实施例1所得瑞香狼毒总二萜的UPLC-MS分析色谱图。其中(a)示瑞香狼毒总二萜的UPLC-MS总离子流色谱图(TIC);(b)示已报道16个二萜类化合物的提取离子流色谱图(EIC)的叠加图。(色谱条件:流动相为甲醇(B)/水(A),0~20min,80%~100%B;20~30min,100%B。质谱条析:采用正离子模式,毛细管温度320℃,干燥气流速8L/min,喷雾压力45psig,毛细管电压3500V,碎片电压175V,扫描电压65V,四级杆射频电压750V,质荷比范围100-2000,其他参数为默认。)
表1 16种瑞香狼毒总二萜中初步鉴定的二萜类化合物
以wikstroelide M为对照品(自制),采用紫外分光光度法测定实施例1所得瑞香狼毒总二萜中二萜类成分的含量。对照品溶液用甲醇配制,浓度范围为1.56~25μg/mL,设定检测波长260nm,分别测定各浓度下的吸光度,并以对照品浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,所得线性方程为y=0.0401x+0.014,相关系数R2=0.9999。取实施例1所得瑞香狼毒总二萜,用甲醇溶解,稀释成浓度为15μg/mL的溶液,测得吸光度为0.575,计算得二萜类成分含量为93.27%。相关实验数据见表2及附图2。
表2 对照品wikstroelide M的浓度与吸光度
实施例2
取瑞香狼毒药材2kg,粉碎成粗粉,置于提取釜中,加入13L无水乙醇浸泡2小时后,水浴55℃,在减压下煎煮3次,冷凝回流,每次2小时。之后合并3次提取液,负压干燥得浸膏227g。将浸膏用1.4L纯水超声分散后,在分液漏斗中,加入3L乙酸乙酯萃取,重复3次。之后放去水层,将合并的乙酸乙酯层在负压下蒸干,得萃取物134g。将萃取物以140mL 80%甲醇-水溶液分散后,湿法上样,过40~50μm ODS反相层析柱(柱长40cm,内径8cm),依次以80%、95%甲醇-水溶液充分洗脱,中压泵加压,流量控制在110mL/min,收集95%甲醇-水流份,干燥即得瑞香狼毒总二萜9.0g。
实施例3
取瑞香狼毒药材2kg,粉碎成粗粉,置于提取釜中,加入15L无水乙醇浸泡2小时后,水浴60℃,在减压下煎煮3次,冷凝回流,每次3小时。之后合并3次提取液,负压干燥得浸膏231g。将浸膏用2L纯水超声分散后,在分液漏斗中,加入4L乙酸乙酯萃取,重复3次。之后放去水层,将合并的乙酸乙酯层在负压下蒸干,得萃取物145g。将萃取物以150mL 80%甲醇-水溶液分散后,湿法上样,过40~50μm ODS反相层析柱(柱长40cm,内径8cm),依次以80%、95%甲醇-水溶液充分洗脱,中压泵加压,流量控制在120mL/min,收集95%甲醇-水流份,干燥即得瑞香狼毒总二萜9.8g。
实施例4
取瑞香狼毒药材5kg,粉碎成粗粉,置于提取釜中,加入50L无水乙醇浸泡2小时后,水浴60℃,在减压下煎煮3次,冷凝回流,每次4小时。之后合并3次提取液,负压干燥得浸膏618g。将浸膏用4L纯水超声分散后,在分液漏斗中,加入5L乙酸乙酯萃取,重复3次。之后放去水层,将合并的乙酸乙酯层在负压下蒸干,得萃取物335g。将萃取物以400mL 80%甲醇-水溶液分散后,湿法上样,过40~50μm ODS反相层析柱(柱长40cm,内径8cm),依次以80%、95%甲醇-水溶液充分洗脱,中压泵加压,流量控制在150mL/min,收集95%甲醇-水流份,干燥即得瑞香狼毒总二萜22.4g。
Claims (4)
1.一种瑞香狼毒总二萜的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)取瑞香狼毒药材,粉碎,置于提取釜中,加入无水乙醇浸泡2~3小时后,在减压下50~60℃水浴加热煎煮,冷凝回流,提取3~4次,每次2~4小时,合并提取液,负压下干燥至无醇味,得浸膏;
(2)将上述浸膏用纯水超声分散得分散液,置于分液漏斗中,加入乙酸乙酯萃取,重复3~4次,之后放去水层,合并乙酸乙酯层,在负压下蒸干,得萃取物;
(3)将上述萃取物以甲醇-水溶液分散后,湿法上样,过反相层析柱,依次以两个不同浓度的甲醇-水溶液充分洗脱,中压泵加压,流量控制在100~150mL/min,收集第二个甲醇-水流份,干燥即得瑞香狼毒总二萜;
所述步骤(3)中两次洗脱所用甲醇-水溶液的体积浓度依次为80~85%和95~100%,洗脱后收集第二次洗脱的甲醇-水流份;
所述步骤(3)中反相柱层析所用填料为ODS,粒径为40~50μm。
2.如权利要求1所述的一种瑞香狼毒总二萜的制备方法,其特征在于所述步骤(1)中按液料比计提取药材所用无水乙醇的体积为药材质量的8~10倍。
3.如权利要求1所述的一种瑞香狼毒总二萜的制备方法,其特征在于所述步骤(2)中分散浸膏所用纯水的体积为浸膏质量的5~7倍,萃取所用乙酸乙酯的体积为分散液体积的2~3倍。
4.如权利要求1所述的一种瑞香狼毒总二萜的制备方法,其特征在于所述步骤(3)中分散萃取物所用甲醇-水溶液的体积浓度为80~85%,其体积为萃取物质量的1~2倍。
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Stelleralides A-C, Novel Potent Anti-HIV Daphnane-Type Diterpenoids from Stellera chamaejasme L;Yoshihisa Asada等;《ORGANIC LETTERS》;20111231;第13卷(第11期);第2904-2907页,尤其是第2904页摘要第1-3行,第2905页右栏第2段、左栏备注(12) * |
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