CN103626644A - 抗肿瘤活性化合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种制备高纯度化合物oblongifolin C和guttiferone K的方法，它包括如下步骤：（a）将云南藤黄用甲醇、乙醇、丙酮或丁酮室温浸泡提取或加热回流提取，减压浓缩提取液至无有机溶剂味，得浸膏A；（b）对浸膏A进行硅胶柱层析分离，得浸膏B；（c）对浸膏B进行MCI柱或大孔树脂柱层析分离，得浸膏C；（d）对浸膏C进行MPLC纯化，收集含有目标化合物的流份，得浸膏D；（e）对浸膏D进行HPLC纯化，收集目标化合物流份，减压，浓缩，干燥。

Description

抗肿瘤活性化合物的制备方法
技术领域
本发明属于天然药物领域，特别是涉及一种抗肿瘤活性化合物的制备方法
背景技术
据文献报道，从植物中提取的化合物oblongifolin C对宫颈癌和肝癌具有显著的抑制活性，guttiferone K对卵巢癌和结肠癌具有显著的抑制活性。故而，oblongifolin C或/和guttiferone K有望作为活性成分用于制备抗肿瘤药物制剂。
Wafaa Hamed等（J.Nat.Prod.2006，69:774-777）从Garcinia oblongifolia的树皮中分离得到化合物oblongifolin C，其采用乙酸乙酯浸泡提取，两次硅胶柱层析分离，以庚烷-乙酸乙酯混合溶液进行洗脱，采用制备液相以乙腈-水-0.1%甲酸混合溶液洗脱进行纯化，制得。Gang Xu等（J.Agric.Food Chem.2008，56(23):11144-11150）从Garciniayunnanensis的果皮中分离得到化合物oblongifolin C，其采用丙酮浸泡提取，提取物经硅胶柱层析分离，三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮依次洗脱，三氯甲烷洗脱部位再进行硅胶柱层析分离，正己烷-丙酮混合溶液进行梯度洗脱，洗脱液再采用制备液相经反相C18柱纯化制得。Sheng-Xiong Huang等（J.Nat.Prod.2009，72:130-135）从Garciniaoblongifolia的树皮中分离得到化合物oblongifolin C，其采用丙酮浸泡提取，提取物水混悬后以三氯甲烷萃取，三氯甲烷萃取部位用硅胶柱层析分离，以正己烷-丙酮混合溶液进行梯度洗脱，洗脱液再采用制备液相经反相C18柱以甲醇-水混合溶液进行梯度洗脱，再经过凝胶LH-20柱以甲醇进行洗脱，再采用制备液相以含0.3%甲酸的乙腈-0.3%甲酸的水混合溶液为流动相进行洗脱，纯化，制得。
Shugeng Cao等（J.Nat.Prod.2007，70:686-688）从Rheedia calcicola的果实中分离得到化合物guttiferone K，其采用乙醇渗滤提取，回收溶剂后提取物用甲醇-水（9:1）混悬，以正己烷萃取。甲醇-水层稀释为70%甲醇溶液，再用二氯甲烷萃取。二氯甲烷层回收有机溶剂后，残渣用甲醇复溶，经C18固相萃取柱，后采用制备液相以甲醇-水（85:15）洗脱，制得。Milena Masullo等（J.Agric.Food Chem.2008，56(13):5205-5210）从Garcinia cambogia的果实中分离得到化合物guttiferone K，其采用乙醇浸泡提取20天，回收有机溶剂后，提取物以水混悬，用二乙醚萃取，二乙醚萃取物再采用半制备高效液相经反相ODS色谱柱分离纯化，以含0.1%三氟乙酸的水-含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液为洗脱液洗脱，纯化，制得。Gang Xu等（J.Agric.Food Chem.2008，56(23):11144-11150）从Garcinia yunnanensis的果皮中分离得到化合物guttiferone K，其采用丙酮浸泡提取，提取物经硅胶柱层析分离，三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮依次洗脱，氯仿洗脱部位再进行硅胶柱层析分离，正己烷-丙酮混合溶液进行梯度洗脱，洗脱液再经过硅胶柱层析分离，以石油醚-丙酮混合溶液进行梯度洗脱，后再采用制备液相经反相C18柱，以乙腈-0.1%乙酸水为流动相洗脱，纯化，制得。Hui yang等（J.Agric.Food Chem.2010，58(8):4749-4755）从Garcinia livingstonei果实中分离得到化合物guttiferone K，其采用甲醇浸泡提取，回收有机溶剂后用水混悬，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取部位经两次凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，用甲醇洗脱，后再采用制备液相进行纯化，制得。Giovanna R.Almanza等（Nat.Prod.Comm.2011，6(9):1269-124）从Rheedia acuinata的茎皮中分离得到化合物guttiferone K，其采用石油醚浸泡提取后，药渣再经二氯甲烷浸泡提取，二氯甲烷提取物再经减压液相柱色谱（VLC）纯化，以二氯甲烷-石油醚及甲醇-二氯甲烷为流动相依次进行梯度洗脱，洗脱液在经多次柱层析，后经重结晶纯化，制得。
云南藤黄（Garcinia yunnanensis Hu）是我国的特有植物，分布于云南省西南部。液相分析结果显示，其植物体各部位均有含量较高的抗肿瘤活性化合物oblongifolin C和guttiferone K。目前尚未见从云南藤黄中大量提取制备高纯度化合物oblongifolin C和guttiferone K的相关报道。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种高纯度抗肿瘤活性化合物oblongifolin C和guttiferone K的制备方法。
具体地说，本发明第一方面是提供了一种式（Ⅰ）化合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
（a）将云南藤黄用甲醇、乙醇、丙酮或丁酮室温浸泡提取或加热回流提取，溶剂用量5～10倍，减压浓缩提取液至无有机溶剂味，得浸膏A；
（b）对浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的10～20倍，规格为100～300目，用三氯甲烷溶剂进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液，得浸膏B；
（c）对浸膏B进行MCI柱或大孔树脂柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩洗脱液，得浸膏C；
（d）对浸膏C进行MPLC纯化：将含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压，浓缩，干燥。
在一优选例中，所述方法包括如下步骤：
（a）将云南藤黄用丙酮室温浸泡提取，丙酮体积为云南藤黄药材质量的5倍，每次浸泡48h，共浸泡提取3次，合并丙酮浸泡提取液，减压浓缩至无丙酮味，得浸膏A；
（b）对浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的10倍，规格为200目，浸膏A用三氯甲烷进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液，得浸膏B；
（c）对浸膏B进行MCI柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩洗脱液，得浸膏C；
（d）对浸膏C进行MPLC纯化：将含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，流速为20mL/min，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压，浓缩，干燥。
本发明第二方面是提供了式（Ⅱ）化合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
Figure BDA0000379632740000031
（a）将云南藤黄用甲醇、乙醇、丙酮或丁酮室温浸泡提取或加热回流提取，溶剂用量5～10倍，减压浓缩提取液至无有机溶剂味，得浸膏A；
（b）对浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的10～20倍，规格为100～300目，用三氯甲烷溶剂进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液，得浸膏B；
（c）对浸膏B进行MCI柱或大孔树脂柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩洗脱液，得浸膏C；
（d）对浸膏C进行MPLC纯化：将含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩洗脱液，得浸膏D；
（e）对浸膏D进行HPLC纯化：将含有目标化合物的流份经ODS制备色谱柱纯化，洗脱液是以等比例的乙腈与甲醇形成的混合溶液再与0.1%甲酸水按85:15的体积比形成的混合溶液，流速为20mL/min，收集保留时间为20～30min的目标化合物流份，减压、浓缩、干燥。
在一优选例中，所述方法包括如下步骤：
（a）将云南藤黄用丙酮室温浸泡提取，丙酮体积为云南藤黄药材质量的5倍，每次浸泡48h，共浸泡提取3次，合并丙酮浸泡提取液，减压浓缩至无丙酮味，得浸膏A；
（b）对浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的10倍，规格为200目，浸膏A用三氯甲烷进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液，得浸膏B；
（c）对浸膏B进行MCI柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩洗脱液，得浸膏C；
（d）对浸膏C进行MPLC纯化：将含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩洗脱液，得浸膏D；
（e）对浸膏D进行HPLC纯化：采用Waters2535或2545制备液相色谱仪，色谱柱为Waters Xbridge Prep C18OBD column(19×250mm，5μm)，洗脱液是以等比例的乙腈与甲醇形成的混合溶液再与0.1%甲酸水按85:15的体积比形成的混合溶液，流速为20mL/min，收集保留时间20min的目标化合物流份，减压，浓缩，干燥。
本发明的有益效果如下：
本发明的方法可从一种植物中可同时、依次制备两种抗肿瘤活性较强的天然化合物，分离过程较简便易行。相比于现有技术所公开的多次硅胶柱层析和重结晶纯化方法，本发明的方法采用常规硅胶、MCI或大孔树脂柱层析，可大量制备目标化合物。MCI或大孔树脂柱层析材料死吸附较少，化合物得率较高，且材料可反复利用，从而降低了生产成本。本发明的方法采用MCI/大孔树脂及中压制备液相进行分离时所使用的混合有机试剂为乙醇-水或甲醇-水，该试剂可回收再利用，从而节约了能源。更重要地是，用本发明的方法所分离得到的化合物oblongifolin C和guttiferone K经液相检测其纯度均>98%。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
附图说明
图1为化合物oblongifolin C在UV245nm时的UPLC-UV色谱图；
图2为化合物oblongifolin C在UV280nm时的UPLC-UV色谱图；
图3为化合物oblongifolin C在UV351nm时的UPLC-UV色谱图；
图4为化合物guttiferone K在UV245nm时的UPLC-UV色谱图；
图5为化合物guttiferone K在UV280nm时的UPLC-UV色谱图；
图6为化合物guttiferone K在UV351nm时的UPLC-UV色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
制备抗肿瘤化合物oblongifolin C
实施例1
a)将云南藤黄果皮用丙酮浸泡提取，每次浸泡使用的丙酮体积为待提取的云南藤黄药材质量的5倍，每次浸泡48h，共浸泡提取3次；合并丙酮浸泡提取液，减压浓缩至无丙酮味得浸膏A；
b)对所得浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的10倍，规格为200目，浸膏A采用硅胶柱层析用三氯甲烷进行洗脱，洗脱5～10个柱体积，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液得浸膏B；
c)对所得浸膏B采用MCI柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份；
d)采用MPLC纯化：含有所述化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，流速为20mL/min，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份（约第17至21个柱体积的洗脱液），减压浓缩洗脱液得纯度>98%的化合物oblongifolin C。
化合物oblongifolin C的UPLC-UV色谱图及相对峰面积数据如下：
UV245nm（图1）
峰号 保留时间 面积 相对峰面积% 高度 积分类型
1 4.941 484 0.03 144 bb
2 5.661 1733 0.11 335 bb
3 6.150 332 0.02 95 bb
4 7.716 218 0.01 80 bb
5 8.629 1645969 99.73 289560 bb
6 9.379 540 0.03 152 bb
7 10.359 670 0.04 171 bb
8 10.942 413 0.03 102 bb
表1
UV280nm（图2）
峰号 保留时间 面积 相对峰面积% 高度 积分类型
1 2.415 555 0.06 193 bb
2 3.120 442 0.05 158 bb
3 4.112 167 0.02 59 bb
4 4.952 416 0.04 110 bb
5 5.673 744 0.08 143 bb
6 6.150 358 0.04 77 bb
7 7.721 244 0.03 75 bb
8 8.629 962020 99.50 169680 bb
9 9.370 665 0.07 169 bb
10 10.355 579 0.06 131 bb
11 10.945 643 0.07 136 bb
表2
UV351nm（图3）
峰号 保留时间 面积 相对峰面积% 高度 积分类型
1 4.094 6 0.00 13 tt
2 4.121 198 0.02 67 bb
3 4.954 393 0.03 120 bb
4 5.655 165 0.01 68 bb
5 8.629 1202955 99.76 214161 bb
6 10.369 650 0.05 137 bb
7 10.941 1004 0.08 201 bb
8 11.349 496 0.04 122 bb
表3
化合物oblongifolin C的结构鉴定数据如下：
EI-MS:670[M]+；
HRESI-MS:693.4147[M+Na]+；
[α]20 D(c=0.21，CHCl3):+14.5；
UV(EtOH):λmax(logε)230(sh)，282(3.93)，356(sh)nm；
IR(CHCl3):νmax3535，3338，2927，1727，1646，1611，1523，1442，1383，1290，1215，1114cm-1；
1H-NMR(600MHz in CD3OD+0.1%TFA-d)及13C-NMR(150MHz in CD3OD+0.1%TFA-d)数据见表4所示。
表4化合物oblongifolin C的1H-NMR、13C-NMR数据
Figure BDA0000379632740000071
Figure BDA0000379632740000081
实施例2
a)将云南藤黄枝条用甲醇加热回流提取，每次浸泡使用的甲醇体积为待提取的云南藤黄药材质量的6倍，每次浸泡48h，共浸泡提取3次；合并甲醇浸泡提取液，减压浓缩至无甲醇味得浸膏A；
b)对所得浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的14倍，规格为100目，浸膏A采用硅胶柱层析用三氯甲烷进行洗脱，洗脱5～10个柱体积，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液得浸膏B；
c)对所得浸膏B采用MCI柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份；
d)采用MPLC纯化：含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，流速为20mL/min，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩洗脱液得纯度>98%的化合物oblongifolin C。
实施例3
a)将云南藤黄叶子用乙醇浸泡提取，每次浸泡使用的乙醇体积为待提取的云南藤黄药材质量的8倍，每次浸泡48h，共浸泡提取3次；合并乙醇浸泡提取液，减压浓缩至无乙醇味得浸膏A；
b)对所得浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的18倍，规格为200目，浸膏A采用硅胶柱层析用三氯甲烷进行洗脱，洗脱5～10个柱体积，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液得浸膏B；
c)对所得浸膏B采用大孔树脂柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份；
d)采用MPLC纯化：含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，流速为20mL/min，薄层层析检测，收集含有所述化合物的流份，减压浓缩洗脱液得纯度>98%的化合物oblongifolin C。
实施例4
a)将云南藤黄干皮用丁酮加热回流提取，每次浸泡使用的丁酮体积为待提取的云南藤黄药材质量的10倍，每次浸泡48h，共浸泡提取3次；合并丁酮浸泡提取液，减压浓缩至无丁酮味得浸膏A；
b)对所得浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的20倍，规格为300目，浸膏A采用硅胶柱层析用三氯甲烷进行洗脱，洗脱5～10个柱体积，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液得浸膏B；
c)对所得浸膏B采用大孔树脂柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份；
d)采用MPLC纯化：含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，流速为20mL/min，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩洗脱液得纯度>98%的化合物oblongifolin C。
实施例5
a)将云南藤黄果实用丙酮浸泡提取，每次浸泡使用的丙酮体积为待提取的云南藤黄药材质量的10倍，每次浸泡48h，共浸泡提取3次；合并丙酮浸泡提取液，减压浓缩至无丙酮味得浸膏A；
b)对所得浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的20倍，规格为300目，浸膏A采用硅胶柱层析用三氯甲烷进行洗脱，洗脱5～10个柱体积，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液得浸膏B；
c)对所得浸膏B采用MCI柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份；
d)采用MPLC纯化：含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，流速为20mL/min，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩洗脱液得纯度>98%的化合物oblongifolin C。
制备抗肿瘤化合物guttiferone K
实施例6
a)将云南藤黄果皮用丙酮浸泡提取，每次浸泡使用的丙酮体积为待提取的云南藤黄药材质量的5倍，每次浸泡48h，共浸泡提取3次；合并丙酮浸泡提取液，减压浓缩至无丙酮味得浸膏A；
b)对所得浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的10倍，规格为200目，浸膏A采用硅胶柱层析用三氯甲烷进行洗脱，洗脱5～10个柱体积，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液得浸膏B；
c)对所得浸膏B采用MCI柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份；
d)采用MPLC纯化：含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，流速为20mL/min，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份（约第8至14个柱体积的洗脱液）。
e)采用HPLC纯化：采用Waters2535或2545制备液相色谱仪，色谱柱为WatersXbridge Prep C18OBD column(19×250mm，5μm)，洗脱液是以等比例的乙腈与甲醇形成的混合溶液再与0.1%甲酸水按85:15的体积比形成的混合溶液，流速为20mL/min，收集保留时间约20min的化合物流份，减压浓缩洗脱液得纯度>98%的化合物guttiferoneK。
化合物guttiferone K的UPLC-UV色谱图及相对峰面积数据如下：
UV245nm（图4）
峰号 保留时间 面积 相对峰面积% 高度 积分类型
1 0.825 1184 0.04 813 bb
2 0.957 866 0.03 682 bb
3 1.227 472 0.02 307 bb
4 1.343 138 0.00 111 bb
5 1.495 3144 0.10 1498 bb
6 1.715 919 0.03 534 bb
7 2.819 2017 0.07 662 bb
8 3.285 15120 0.49 3821 bb
9 4.140 1142 0.04 364 bb
10 4.339 1574 0.05 346 bb
11 4.511 6667 0.22 1380 bb
12 4.709 9968 0.32 1660 bb
13 5.012 3043467 98.60 617182 bb
表5
UV280nm（图5）
峰号 保留时间 面积 相对峰面积% 高度 积分类型
1 1.397 268 0.01 209 bb
2 1.494 4141 0.22 2104 bb
3 1.712 1145 0.06 650 bb
4 2.817 1554 0.08 395 bb
5 3.039 331 0.02 97 bb
6 3.285 8511 0.45 1987 bb
7 3.493 170 0.01 109 bb
8 4.146 903 0.05 273 bb
9 4.331 850 0.05 229 bb
10 4.514 4250 0.23 854 bb
11 4.708 4773 0.25 834 bb
12 5.012 1845154 98.56 373211 bb
表6
UV351nm（图6）
峰号 保留时间 面积 相对峰面积% 高度 积分类型
1 1.495 188 0.01 130 bb
2 2.813 204 0.01 74 bb
3 3.285 1341 0.06 374 bb
4 3.482 489 0.02 193 bb
5 3.600 230 0.01 111 bb
6 4.327 1244 0.06 305 bb
7 4.515 5148 0.23 1053 bb
8 4.707 6844 0.31 1132 bb
9 5.012 2228004 99.30 449569 bb
表7
化合物guttiferone K的结构鉴定数据如下：
HRFABMS: 603.3712[M+H]+；
[α]23 D(c=0.35,CHCl3):-2；
UV(MeOH):λmax(logε)241(sh),255(4.54),325(4.14)nm；
IR(film):νmax3348,2968,2916,2857,1728,1670,1640,1602,1542,1519,1440,1376,1289,1191,1116cm-1；
1H-NMR(500MHz in CD3OD)及13C-NMR(125MHz in CD3OD)数据见表2所示。
表8化合物guttiferone K的1H-NMR、13C-NMR数据
实施例7
a)将云南藤黄枝条用甲醇加热回流提取，每次浸泡使用的甲醇体积为待提取的云南藤黄药材质量的6倍，每次浸泡48h，共浸泡提取3次；合并甲醇浸泡提取液，减压浓缩至无甲醇味得浸膏A；
b)对所得浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的14倍，规格为100目，浸膏A采用硅胶柱层析用三氯甲烷进行洗脱，洗脱5～10个柱体积，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液得浸膏B；
c)对所得浸膏B采用MCI柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份；
d)采用MPLC纯化：含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，流速为20mL/min，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份。
e)采用HPLC纯化：采用Waters2535或2545制备液相色谱仪，色谱柱为WatersXbridge Prep C18OBD column(19×250mm，5μm)，洗脱液是以等比例的乙腈与甲醇形成的混合溶液再与0.1%甲酸水按85:15的体积比形成的混合溶液，流速为20mL/min，收集保留时间约30min的目标化合物流份，减压浓缩洗脱液得纯度>98%的化合物guttiferone K。
实施例8
a)将云南藤黄叶子用乙醇浸泡提取，每次浸泡使用的乙醇体积为待提取的云南藤黄药材质量的8倍，每次浸泡48h，共浸泡提取3次；合并乙醇浸泡提取液，减压浓缩至无乙醇味得浸膏A；
b)对所得浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的18倍，规格为200目，浸膏A采用硅胶柱层析用三氯甲烷进行洗脱，洗脱5～10个柱体积，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液得浸膏B；
c)对所得浸膏B采用大孔树脂柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份；
d)采用MPLC纯化：含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，流速为20mL/min，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份。
e)采用HPLC纯化：采用Waters2535或2545制备液相色谱仪，色谱柱为WatersXbridge Prep C18OBD column(19×250mm，5μm)，洗脱液是以等比例的乙腈与甲醇形成的混合溶液再与0.1%甲酸水按85:15的体积比形成的混合溶液，流速为20mL/min，收集保留时间约20min的目标化合物流份，减压浓缩洗脱液得纯度>98%的化合物guttiferone K。
实施例9
a)将云南藤黄干皮用丁酮加热回流提取，每次浸泡使用的丁酮体积为待提取的云南藤黄药材质量的10倍，每次浸泡48h，共浸泡提取3次；合并丁酮浸泡提取液，减压浓缩至无丁酮味得浸膏A；
b)对所得浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的20倍，规格为300目，浸膏A采用硅胶柱层析用三氯甲烷进行洗脱，洗脱5～10个柱体积，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液得浸膏B；
c)对所得浸膏B采用大孔树脂柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份；
d)采用MPLC纯化：含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，流速为20mL/min，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份。
e)采用HPLC纯化：采用Waters2535或2545制备液相色谱仪，色谱柱为WatersXbridge Prep C18OBD column(19×250mm，5μm)，洗脱液是以等比例的乙腈与甲醇形成的混合溶液再与0.1%甲酸水按85:15的体积比形成的混合溶液，流速为20mL/min，收集保留时间约30min的目标化合物流份，减压浓缩洗脱液得纯度>98%的化合物guttiferone K。
实施例10
a)将云南藤黄果实用丙酮浸泡提取，每次浸泡使用的丙酮体积为待提取的云南藤黄药材质量的10倍，每次浸泡48h，共浸泡提取3次；合并丙酮浸泡提取液，减压浓缩至无丙酮味得浸膏A；
b)对所得浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的20倍，规格为300目，浸膏A采用硅胶柱层析用三氯甲烷进行洗脱，洗脱5～10个柱体积，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液得浸膏B；
c)对所得浸膏B采用MCI柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份；
d)采用MPLC纯化：含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，流速为20mL/min，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份。
e)采用HPLC纯化：采用Waters2535或2545制备液相色谱仪，色谱柱为WatersXbridge Prep C18OBD column(19×250mm，5μm)，洗脱液是以等比例的乙腈与甲醇形成的混合溶液再与0.1%甲酸水按85:15的体积比形成的混合溶液，流速为20mL/min，收集保留时间约20min的目标化合物流份，减压浓缩洗脱液得纯度>98%的化合物guttiferone K。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。

Claims (4)

1.一种式（Ⅰ）化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
Figure FDA0000379632730000011
（a）将云南藤黄用甲醇、乙醇、丙酮或丁酮室温浸泡提取或加热回流提取，溶剂用量5～10倍，减压浓缩提取液至无有机溶剂味，得浸膏A；
（b）对浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的10～20倍，规格为100～300目，用三氯甲烷溶剂进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液，得浸膏B；
（c）对浸膏B进行MCI柱或大孔树脂柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩洗脱液，得浸膏C；
（d）对浸膏C进行MPLC纯化：将含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压，浓缩，干燥。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
（a）将云南藤黄用丙酮室温浸泡提取，丙酮体积为云南藤黄药材质量的5倍，每次浸泡48h，共浸泡提取3次，合并丙酮浸泡提取液，减压浓缩至无丙酮味，得浸膏A；
（b）对浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的10倍，规格为200目，浸膏A用三氯甲烷进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液，得浸膏B；
（c）对浸膏B进行MCI柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩洗脱液，得浸膏C；
（d）对浸膏C进行MPLC纯化：将含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，流速为20mL/min，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压，浓缩，干燥。
3.一种式（Ⅱ）化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
Figure FDA0000379632730000021
（a）将云南藤黄用甲醇、乙醇、丙酮或丁酮室温浸泡提取或加热回流提取，溶剂用量5～10倍，减压浓缩提取液至无有机溶剂味，得浸膏A；
（b）对浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的10～20倍，规格为100～300目，用三氯甲烷溶剂进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液，得浸膏B；
（c）对浸膏B进行MCI柱或大孔树脂柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩洗脱液，得浸膏C；
（d）对浸膏C进行MPLC纯化：将含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩洗脱液，得浸膏D；
（e）对浸膏D进行HPLC纯化：将含有目标化合物的流份经ODS制备色谱柱纯化，洗脱液是以等比例的乙腈与甲醇形成的混合溶液再与0.1%甲酸水按85:15的体积比形成的混合溶液，流速为20mL/min，收集保留时间为20～30min的目标化合物流份，减压，浓缩，干燥。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
（a）将云南藤黄用丙酮室温浸泡提取，丙酮体积为云南藤黄药材质量的5倍，每次浸泡48h，共浸泡提取3次，合并丙酮浸泡提取液，减压浓缩至无丙酮味，得浸膏A；
（b）对浸膏A进行硅胶柱层析分离：硅胶用量为浸膏的10倍，规格为200目，浸膏A用三氯甲烷进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩三氯甲烷洗脱液，得浸膏B；
（c）对浸膏B进行MCI柱层析分离：以乙醇与水按90:10的体积比形成的混合溶液进行洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩洗脱液，得浸膏C；
（d）对浸膏C进行MPLC纯化：将含有目标化合物的流份经中压ODS柱层析纯化，以甲醇与水按85:15-100:0的体积比形成的混合溶液进行梯度洗脱，薄层层析检测，收集含有目标化合物的流份，减压浓缩洗脱液，得浸膏D；
（e）对浸膏D进行HPLC纯化：采用Waters2535或2545制备液相色谱仪，色谱柱为Waters Xbridge Prep C18OBD column(19×250mm，5μm)，洗脱液是以等比例的乙腈与甲醇形成的混合溶液再与0.1%甲酸水按85:15的体积比形成的混合溶液，流速为20mL/min，收集保留时间20min的目标化合物流份，减压，浓缩，干燥。
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