CN105949256B

CN105949256B - 一种从芹菜中分离纯化芹菜苷的方法

Info

Publication number: CN105949256B
Application number: CN201610363939.3A
Authority: CN
Inventors: 徐鑫; 庄林武; 张田田; 宋丹丹; 刘国艳
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2016-05-30
Filing date: 2016-05-30
Publication date: 2018-08-28
Anticipated expiration: 2036-05-30
Also published as: CN105949256A

Abstract

本发明属于本发明属于天然提取物技术领域，具体涉及一种从芹菜中分离纯化芹菜苷的方法。该方法采用芹菜为原料，通过乙醇浸提、聚酰胺树脂柱层析初步分离和制备型高效液相精制的步骤进一步分离获得高纯度芹菜苷。本发明中采用一种聚酰胺树脂，对芹菜黄酮提取物初步纯化，减少中间流程，提高分离纯化芹菜苷效率；结合制备型高效液相色谱，具有上样量大，分离周期短，获得样品纯度高等优点。整个工艺过程操作方便，能耗低，具有良好的应用前景。

Description

一种从芹菜中分离纯化芹菜苷的方法

技术领域

本发明属于天然提取物技术领域，具体涉及一种从芹菜中分离纯化芹菜苷的方法。

背景技术

芹菜是一种两年生的伞形科草本植物，原产于地中海沿岸，在我国有着悠久的栽培历史。芹菜中黄酮类化合物是优良的活性氧清除剂和脂质抗氧化剂，具有多种生物活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、抗衰老等作用。

芹菜中含量较高的黄酮类化合物芹菜苷，又名芹菜甙，英文名Apiin，是以芹菜素为苷元的黄酮苷，分子式为C₂₆H₂₈O₁₄，CAS号：26544-34-3，溶于热水及热乙醇，几乎不溶于乙醚。现已有相关分离纯化芹菜苷的专利及文献报道如：方法一，钱少华(专利申请号：99116604.3)通过重结晶方式从石崖茶中提取一种芹菜素和芹菜甙混合物；方法二，王克勤[芹菜黄酮类物质的分离纯化与药理功能研究，长沙:湖南农业大学，2009]将芹菜醇提物先用XDA-1树脂进行分离，再用聚酰胺树脂进行分离，然后用Sephadex LH-20柱色谱以及HSCCC(高速逆流色谱分离)进行分离，最终得到3种成分，其中一种黄酮类物质为芹菜苷。

上述方法主要是对芹菜苷分离纯化，方法一中利用重结晶方法，产量高，成本低，但是很难得到高纯度芹菜苷，方法二中结合大孔树脂和聚酰胺树脂，以及多种分离手段。分离过程步骤较为繁琐，而且生产周期较长，一次很难大量生产，并且生产所需成本较高。芹菜苷具有多种生物活性，在抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、抗衰老、降低心血管疾病等方面发挥重要作用，但是高纯度的芹菜苷价格高，所以需要找到一种快速、高效的提取方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷与不足，提供一种从芹菜中提取芹菜苷的高效、简便的方法。

为了解决以上技术问题，本发明提供一种分离芹菜中芹菜苷的方法，依次包括以下步骤：

(1)乙醇浸提

取新鲜芹菜，洗净除杂，干燥后粉碎，用一定体积浓度乙醇溶液放于反应釜中浸提，所述芹菜粉末与乙醇溶液的料液比为1：10～20(g/mL)，提取液经过滤，减压浓缩至棕黑色浸膏，备用；

(2)聚酰胺树脂柱层析初步分离

将棕黑色浸膏用纯水溶解，样品上聚酰胺树脂并充分吸附，先用纯水以1.0BV/h～2.0BV/h流速水洗，水洗4BV～6BV；再用一定体积浓度的乙醇溶液以1.0BV/h～2.0BV/h等度洗脱，醇洗4BV～6BV，收集该部分洗脱液，减压浓缩得黄棕色浸膏。

(3)制备型高效液相精制

将黄棕色浸膏溶于一定体积浓度的甲醇溶液中，用制备型高效液相色谱仪进一步分离纯化，色谱柱为C18，流动相为甲醇和0.1％甲酸水，控制一定流速进行洗脱，检测波长为267nm和333nm，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩、冷冻干燥、研磨过筛，得淡黄色粉末，即得到所要分离的单体化合物。

本发明步骤(1)中的“一定体积浓度乙醇溶液放于反应釜中浸提”，其中乙醇体积浓度为40％～95％，优选体积浓度70％乙醇浸提。

本发明步骤(1)中的“反应釜提取条件”，其中反应釜温度40℃～60℃，优选50℃。

本发明步骤(1)中的“反应釜提取条件”，其中反应釜转速400r/min～600r/min，优选500r/min。

本发明步骤(1)中的“反应釜提取条件”，其中反应釜提取时间1h～3h，优选1.5h～2.5h，更优选择2h。

本发明步骤(1)中的“反应釜提取条件”，其中反应釜提取次数2～6次，优选3～5次，更优选择4次。

本发明步骤(2)中的“按一定比例溶于纯水中”，溶解方式：将溶解液于20KHz～40KHz的超声频率下超声处理10min，得聚酰胺树脂上样液。

本发明步骤(2)中的“聚酰胺树脂初步分离”，所述棕黑色浸膏与纯水用量比为1：3～5(g/mL)；棕黑色浸膏与聚酰胺树脂的用量比为1：40～50(g/mL)。

本发明步骤(2)中的“用一定体积浓度的乙醇溶液以1.0BV/h～2.0BV/h等度洗脱”，一定体积浓度的乙醇其体积浓度为40％，70％或95％，优选体积浓度70％乙醇洗脱。

本发明步骤(3)的“将黄棕色浸膏溶于一定体积浓度的甲醇溶液”中，其中甲醇的体积浓度为40％～55％，溶解方式：将溶解液于20KHz～40KHz的超声频率下超声处理10min中，得制备型高效液相上样液。

本发明步骤(3)的“以甲醇和0.1％甲酸水为流动相进行洗脱”，洗脱方式有45％甲醇-0.1％甲酸水等度洗脱，50％甲醇-0.1％甲酸水等度洗脱，55％甲醇-0.1％甲酸水等度洗脱，甲酸-0.1％甲酸水梯度洗脱，优选50％甲醇-0.1％甲酸水等度洗脱。

本发明步骤(3)中的“控制一定流速进行洗脱”中，其洗脱流速为10mL/min～50mL/min，优选25mL/min进行洗脱。

本发明提供一种分离芹菜中芹菜苷的方法，首先采用聚酰胺初步分离，再用制备型高效液相色谱进行精制，所得目标化合物纯度高。除此之外，还具有以下优势：

(1)提取液经过聚酰胺树脂初步分离，可以去除提取液中大部分杂质，简化混合物组成，降低分离难度；并且还能减少制备次数，保护制备型高效液相色谱柱不被污染，从某种意义上延长了色谱柱寿命。只选择一种树脂分离，使得工艺简单，操作方便。

(2)采用制备型高效液相色谱法分离纯化得到芹菜苷，具有样品纯度高，操作简单，分离效率高，工艺周期短等优点。

(3)提取，纯化过程中没有使用对环境和人体危害大的有机溶剂，操作中所用醇类物质可以回收使用并且聚酰胺树脂再生后可以重复使用多次，降低对环境污染，节约成本，绿色环保。

(4)优化了柱层析的条件(洗脱液的组成，洗脱流速，洗脱体积)，提高纯化目标物质的效率。

(5)优化了制备型高效液相色谱的条件(洗脱流速，洗脱液的组成)，提高纯化芹菜苷的效率，节约成本，适合实验室及工业化规模生产。

附图说明

图1是本发明方法流程图。

图2是芹菜总黄酮的制备型高效液相色谱图。

图3是芹菜苷的HPLC图及其UV图。

图4是芹菜苷正负离子模式下质谱图及其负离子模式下二级质谱图。

具体实施方式

为了让发明的目的更加清楚明白，以下结合实施例和附图说明本发明技术方案，但保护范围不受此限制。芹菜中提取分离芹菜苷流程如图1所示。

实施例1

(1)芹菜黄酮提取物制备：将新鲜芹菜洗净、除杂、干燥，取2kg干芹菜粉碎机粉碎，按照料液比1:20(g/mL)加入体积浓度40％乙醇溶液，放入10L反应釜，反应釜温度为50℃，转速为400r/min，每次提取时间1.5h，连续提取6次；提取液经过滤、合并、减压浓缩得棕黑色浸膏18g，备用；

(2)聚酰胺树脂粗分离：按照棕黑色浸膏与聚酰胺树脂的用量比1:40(g/mL)，准备聚酰胺树脂720mL，用大量的蒸馏水冲洗，除去漂浮的碎树脂颗粒后装于层析柱(5cm×100cm)中，用体积浓度95％乙醇溶液置换树脂中水，静置过夜。再用体积浓度95％乙醇溶液以2.0BV/h的流速淋洗至流出液与水按1:5比例混合无浑浊。再将上述聚酰胺树脂中的乙醇用大量的蒸馏水冲洗，至流出液无醇味。

将上述棕黑色浸膏按照料液比1:3(g/mL)溶于54mL纯水中超声处理，超声波频率28KHz，超声时间10min。样品上聚酰胺树脂并充分吸附，先用4BV水进行洗脱，再用6BV体积浓度为40％乙醇洗脱，控制上样及洗脱流速为2.0BV/h，收集体积浓度40％乙醇洗脱液，减压浓缩得黄棕色浸膏5.4g。

(3)制备型高效液相色谱分离纯化：取上述黄棕色浸膏按照料液比4:1(mg/mL)溶于体积浓度45％甲醇溶液中超声处理，超声波频率28KHz，超声时间10min。选择色谱柱为C18(10μm，30mm×250mm)，流动相为45％甲醇-0.1％甲酸水，柱流速为25mL/min，紫外检测波长为267nm和333nm，用45％甲醇-0.1％甲酸水平衡色谱柱20min，每次进样体积50mL，收集目标组分馏分，将得到的馏分合并、减压浓缩、冷冻干燥、研磨过筛，得淡黄色粉末620mg，纯度为98.51％，其中该条件下芹菜总黄酮的制备型高效液相色谱图见图2，芹菜苷的高效液相色谱图及其紫外最大吸收谱图见图3。

(4)化合物结构鉴定：经紫外光谱测定、高效液相色谱-质谱测定、以及核磁共振谱氢谱和碳谱测定，分析该组分为芹菜苷，结构如下：

芹菜苷：UVλmax(甲醇)：267，339nm；ESI-MS(m/z)：563.10[M-H]^-、565.2[M+H]⁺(具体数据见图4a和图4b)；负离子模式下二级质谱中特征子离子碎片269.33(芹菜素碎片)(具体数据见图4c)；¹H-NMR(600MHz，DMSO-d6)δppm：3.18～3.93(12H，m，H-2”～6”，H-2”'～5”')，5.16(1H，d，J＝7.2Hz，H-1”)，5.36(1H，d，J＝1.2Hz，H-1”')，6.43(1H，d，J＝2.1Hz，H-6)，6.81(1H，d，J＝2.1Hz，H-8)，6.86(1H，s，H-3)，6.94(2H，dd，J＝8.7，2.1Hz，H-3'，5')，7.96(2H，dd，J＝8.7，2.1Hz，H-2'，6')；¹³C-NMR(150MHz，DMSO-d6)δppm：60.5(C-6”)，64.5(C-5”')，69.8(C-4”)，73.9(C-4”')，76.0(C-2”')，77.0(C-5”)，75.7(C-2”)，76.8(C-3”)，79.3(C-3”')，94.8(C-8)，99.3(C-1”)，99.9(C-6)，102.9(C-3)，105.3(C-10)，108.7(C-1”')，116.0(3'，C-5')，120.9(C-1')，128.6(2'，C-6')，156.9(C-5)，161.1(C-9)，161.4(C-4')，162.6(C-7)，164.3(C-2)，181.9(C-4)。

以上数据与文献报道芹菜苷基本一致，鉴定为芹菜苷(Apigenin 7-O-β-D-apiofuranosyl(1→2)-β-D-glucopyranoside)。

实施例2

(1)芹菜黄酮提取物制备：将新鲜芹菜洗净、除杂、干燥，取2kg干芹菜粉碎机粉碎，按照料液比1:10(g/mL)加入体积浓度95％乙醇溶液，放入10L反应釜，反应釜温度为40℃，转速为600r/min，每次提取时间1h，连续提取2次；提取液经过滤、合并、减压浓缩得棕黑色浸膏26g，备用；

(2)聚酰胺树脂粗分离：按照棕黑色浸膏与聚酰胺树脂的用量比1:45(g/mL)，准备聚酰胺树脂1170mL，用大量的蒸馏水冲洗，除去漂浮的碎树脂颗粒后装于层析柱(5cm×100cm)中，用体积浓度95％乙醇溶液置换树脂中水，静置过夜。再用体积浓度95％乙醇溶液以1.5BV/h的流速淋洗至流出液与水按1:5比例混合无浑浊。再将上述聚酰胺树脂中的乙醇用大量的蒸馏水冲洗，至流出液无醇味。

将上述棕黑色浸膏按照料液比1:5(g/mL)于130mL纯水中超声处理，超声波频率20KHz，超声时间10min。样品上聚酰胺树脂并充分吸附，先用6BV水进行洗脱，再用5BV体积浓度为95％乙醇洗脱，控制上样及洗脱流速为1.5BV/h，收集体积浓度95％乙醇洗脱液，减压浓缩至黄棕色浸膏13.5g。

(3)制备型高效液相色谱分离纯化：取上述黄棕色浸膏按照料液比5:1(mg/mL)溶于体积分数55％甲醇溶液中超声处理，超声波频率40KHz，超声时间10min。选择色谱柱为C18(10μm，30mm×250mm)，流动相为55％甲醇-0.1％甲酸水，柱流速为10mL/min，紫外检测波长267和333nm，用55％甲醇-0.1％甲酸水流动相平衡色谱柱20min，每次进样体积50mL，收集目标组分馏分，将得到的馏分合并、减压浓缩、冷冻干燥、研磨过筛，得淡黄色粉末810mg，纯度为97.58％。

(4)化合物结构鉴定：目标组分结构鉴定同具体实施1中步骤(4)化合物结构鉴定。

实施例3

(1)芹菜黄酮提取物制备：将新鲜芹菜洗净、除杂、干燥，取2kg干芹菜粉碎机粉碎，按照料液比1:20(g/mL)加入体积浓度75％乙醇溶液，放入10L反应釜，反应釜温度为60℃，转速500r/min进行，每次提取时间2h，连续提取3次；提取液经过滤、合并、减压浓缩得棕黑色浸膏24g，备用；

(2)聚酰胺树脂粗分离：按照棕黑色浸膏与聚酰胺树脂的用量比1:50(g/mL)，准备聚酰胺树脂1200mL，用大量的蒸馏水冲洗，除去漂浮的碎树脂颗粒后装于层析柱(5cm×100cm)中，用体积浓度95％乙醇溶液置换树脂中水，静置过夜。再用体积浓度95％乙醇溶液以1.0BV/h的流速淋洗至流出液与水按1:5比例混合无浑浊。再将上述聚酰胺树脂中的乙醇用大量的蒸馏水冲洗，至流出液无醇味。

将上述棕黑色浸膏按照料液比1:4(g/mL)溶于96mL纯水中超声处理，超声波频率24KHz，超声时间10min。样品上聚酰胺树脂并充分吸附，先用5BV水进行洗脱，再用4BV体积浓度为75％乙醇洗脱，控制上样及洗脱流速为1.0BV/h，收集体积浓度75％乙醇洗脱液，减压浓缩至黄棕色浸膏6.25g。

(3)制备型高效液相色谱分离纯化：取上述黄棕色浸膏按照料液比6:1(mg/mL)溶于体积浓度50％甲醇溶液中超声处理，超声波频率32KHz，超声时间10min。选择色谱柱为C18(10μm，30mm×250mm)，流动相为50％甲醇-0.1％甲酸水，柱流速为50mL/min，紫外检测波长为267nm和333nm，用50％甲醇-0.1％甲酸水流动相平衡色谱柱20min，每次进样体积50mL，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩、冷冻干燥、研磨过筛，得淡黄色粉末750mg，纯度为97.65％。

(4)化合物结构鉴定：目标组分结构鉴定同具体实施1中步骤(4)中化合物结构鉴定。

实施例4

(1)芹菜黄酮提取物制备：将新鲜芹菜洗净、除杂、干燥，取2kg干芹菜粉碎机粉碎，按照料液比1:10(g/mL)加入体积浓度40％乙醇溶液，放入10L反应釜，反应釜温度为40℃，转速为400r/min，每次提取时间2.5h，连续提取5次；提取液经过滤、合并、减压浓缩得棕黑色浸膏20g，备用；

(2)聚酰胺树脂粗分离：按照棕黑色浸膏与聚酰胺树脂的用量比1:40(g/mL)，准备聚酰胺树脂800mL，用大量的蒸馏水冲洗，除去漂浮的碎树脂颗粒后装于层析柱(5cm×100cm)中，用体积分数95％乙醇溶液置换树脂中水，静置过夜。再用体积浓度95％乙醇溶液以2.0BV/h的流速淋洗至流出液与水按1:5比例混合无浑浊。再将上述聚酰胺树脂中的乙醇用大量的蒸馏水冲洗，至流出液无醇味。

将上述棕黑色浸膏按照料液比1:3(g/mL)溶于60mL纯水中超声处理，超声波频率32KHz，超声时间10min。样品上聚酰胺树脂并充分吸附，先用5BV水进行洗脱，再用4BV体积浓度为40％乙醇洗脱，控制上样及洗脱流速为2.0BV/h，收集体积浓度40％乙醇洗脱液，减压浓缩至黄棕色浸膏5.2g。

(3)制备型高效液相色谱分离纯化：取上述黄棕色浸膏按照料液比5:1(mg/mL)溶于体积分数40％甲醇溶液中超声处理，超声波频率20KHz，超声时间10min。选择色谱柱为C18(10μm，30mm×250mm)，流动相为甲醇-0.1％甲酸水，洗脱梯度如下：40％甲醇-0.1％甲酸水0min～3min；45％甲醇-0.1％甲酸水5min～25min；90％甲醇-0.1％甲酸水27min～35min；40％甲醇-0.1％甲酸水40min～45min，柱流速为25mL/min，紫外检测波长为267nm和333nm，用40％甲醇-0.1％甲酸水流动相平衡色谱柱20min，每次进样体积50mL，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩、冷冻干燥、研磨过筛，得淡黄色粉末600mg，纯度为98.78％。

实施例5(1)芹菜黄酮提取物制备：将新鲜芹菜洗净、除杂、干燥，取2kg干芹菜粉碎机粉碎，按照料液比1:20(g/mL)加入体积浓度75％乙醇溶液，放入10L反应釜，反应釜温度为60℃，转速500r/min进行，每次提取时间2h，连续提取4次；提取液经过滤、合并、减压浓缩得棕黑色浸膏26g，备用；

将上述棕黑色浸膏按照料液比1:3(g/mL)溶于78mL纯水中超声处理，超声波频率40KHz，超声时间10min。样品上聚酰胺树脂并充分吸附，先用5BV水进行洗脱，再用5BV体积浓度为75％乙醇洗脱，控制上样及洗脱流速为2.0BV/h，收集体积浓度75％乙醇洗脱液，减压浓缩至黄棕色浸膏6.77g。

(3)制备型高效液相色谱分离纯化：取上述黄棕色浸膏按照料液比4:1(mg/mL)溶于体积分数50％甲醇溶液中超声处理，超声波频率24KHz，超声时间10min。选择色谱柱为C18(10μm，30mm×250mm)，流动相为50％甲醇-0.1％甲酸水，柱流速为25mL/min，紫外检测波长267nm和333nm，用50％甲醇-0.1％甲酸水的流动相平衡色谱柱20min，每次进样体积50mL，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩、冷冻干燥、研磨过筛，得淡黄色粉末780mg，纯度为98.23％。

Claims

1.一种从芹菜中分离纯化芹菜苷的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)乙醇浸提

干燥的芹菜粉末用体积浓度40％～95％乙醇溶液于反应釜中浸提，芹菜粉末与乙醇溶液的料液比为1：10～20(g/mL)，提取液经过滤，减压浓缩至棕黑色浸膏，备用；

(2)聚酰胺树脂柱层析初步分离

将棕黑色浸膏按一定比例溶于纯水中，样品上聚酰胺树脂并充分吸附，先用纯水以1.0BV/h～2.0BV/h流速水洗，水洗4BV～6BV；再用一定体积浓度乙醇溶液以1.0BV/h～2.0BV/h等度洗脱，醇洗4BV～6BV，收集该部分洗脱液，减压浓缩得黄棕色浸膏；

(3)制备型高效液相精制

将黄棕色浸膏溶于一定体积浓度的甲醇溶液中，用制备型高效液相色谱仪进一步分离纯化，色谱柱为C18，流动相为甲醇和0.1％甲酸水，控制一定流速进行洗脱，检测波长为267nm和333nm，收集目标组分馏分，将得到的馏分减压浓缩、冷冻干燥、研磨过筛，得淡黄色粉末，即芹菜苷。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述乙醇溶液体积浓度为70％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中浸提条件为：提取温度40℃～60℃；反应釜转速400r/min～600r/min；提取时间1h～3h；反应釜提取次数2～6次。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中浸提条件为：温度50℃；反应釜转速500r/min；提取时间1.5h～2.5h；反应釜提取次数3～5次。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述棕黑色浸膏按一定比例溶于纯水中，溶解方式：将溶解液置于20KHz～40KHz的超声频率下超声处理10min，得聚酰胺树脂上样液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述棕黑色浸膏与纯水的用量比为1：3～5(g/mL)；棕黑色浸膏与聚酰胺树脂的用量比为1：40～50(g/mL)。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述用一定体积浓度乙醇溶液以1.0BV/h～2.0BV/h等度洗脱，一定体积浓度的乙醇其体积浓度为40％，70％或95％。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述用一定体积浓度乙醇溶液以1.0BV/h～2.0BV/h等度洗脱，一定体积浓度的乙醇其体积浓度为70％。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述将黄棕色浸膏溶于一定体积浓度的甲醇溶液中，其甲醇体积浓度为40％～55％，溶解方式：将溶解液于20KHz～40KHz的超声频率下超声处理10min，得制备型高效液相上样液。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的以甲醇和0.1％甲酸水为流动相进行洗脱时，其洗脱方式有45％甲醇-0.1％甲酸水等度洗脱，50％甲醇-0.1％甲酸水等度洗脱，55％甲醇-0.1％甲酸水等度洗脱或甲醇-0.1％甲酸水梯度洗脱。