CN103601788B - 从黧蒴锥叶子中提取分离三萜鞣花单宁类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从黧蒴锥叶子中提取分离三萜鞣花单宁类化合物的方法，包括以下步骤：1)以黧蒴锥叶子为原料，用丙酮提取，得提取液；2)提取液回收丙酮，过滤，得滤液；3)所得滤液过大孔树脂，水洗，然后用20～50％体积的有机溶剂洗脱，再用70～100％体积的有机溶剂洗脱至流出液无酚性反应，收集70～100％体积的有机溶剂洗脱液；4)洗脱液减压回收有机溶剂，直至大量结晶析出，冷却，静置，分离出结晶，即得。本发明采用大孔树脂柱进行层析，结合特殊的洗脱工艺，在降低成本的同时提高了产品的收率(收率可达0.37％以上)，而且纯度较高；整个方法简单易操作，且易于产业化。
Description
技术领域
本发明涉及植物中有效成分提取技术领域，具体涉及从黧蒴锥叶子中提取分离三萜鞣花单宁类化合物的方法。
背景技术
黧蒴锥(Castanopsis fissa(Champ.ex Benth.)Rehd.et Wils.)为壳斗科锥属植物，别名裂壳锥、大叶槠栗、大叶栎、大叶锥、大叶枹等。在我国华南地区均广泛分布，为我国南方优良的速生丰产乡土树种，植物资源非常丰富，在民间广泛用于心脑血管、止血、止泻、慢性溃疡等疾病的治疗。已有文献对该植物的化学成分进行了详细研究(Phytochemistry,2011,72(16):2006-2014)，文献中采用80％丙酮水溶液提取，经Sephadex LH-20(10～100％甲醇溶液洗脱)、HP20SS CC(60％、70％、80％、90％、100％甲醇溶液洗脱)及Chromatorex ODS(50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇溶液洗脱)层析相结合，分离精制得到三萜鞣花单宁类化合物，分子式为C44H54O14，分子量为806，化学名称为[3,24-(S)-HHDP-2α,3β,23,24-tetrahydroxytaraxastan-28,20β-olide]，结构式如下式所示：
上述文献虽然可以分离精制得到三萜鞣花单宁类化合物，但该方法中用到了Sephadex LH-20、HP20SS CC及Chromatorex ODS多次层析，工艺相对较复杂且成本较高，不易于实现产业化，另外收率也不是很理想(新鲜叶的收率为0.27％)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新的从黧蒴锥叶子中提取分离三萜鞣花单宁类化合物的方法。该方法工艺简单、成本低廉，收率较高，且易于产业化。
本发明所述的从黧蒴锥叶子中提取分离三萜鞣花单宁类化合物的方法，包括以下步骤：
1)以黧蒴锥叶子为原料、丙酮为溶媒进行提取，获得提取液；
2)提取液回收丙酮，过滤，得滤液；
3)所得滤液过大孔树脂，水洗，然后用20～50％体积的有机溶剂洗脱，再用70～100％体积的有机溶剂洗脱至流出液无酚性反应，收集70～100％体积的有机溶剂洗脱液；其中，所述大孔树脂的型号为D-101、AB-8、HPD500、HPD600、D-4020或HP-20；所述的有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮；
4)将收集的洗脱液减压回收有机溶剂，直至大量结晶析出，冷却，静置，分离出结晶，即得到三萜鞣花单宁类化合物。
上述方法中，
步骤1)中，原料黧蒴锥的叶子可以是新鲜叶也可以是干叶，最好是切细后再加溶媒进行提取。提取用丙酮的体积浓度通常为50～100％，当原料为黧蒴锥新鲜叶时，优选用体积浓度为80～100％的丙酮提取；当为干叶时，优选用体积浓度为50～60％的丙酮提取。提取的方式可以是室温浸提或者加热回流提取，室温浸提时，每次浸提时的溶媒用量为原料重量的5～15倍(干叶的用量稍大些)，浸提时间为12～24h；回流提取时，每次提取时的溶媒用量为原料重量的3～8倍，提取时间通常为1～3h。不论以何种方式进行提取，提取的次数通常为1～3次。
步骤2)中，通常采用减压浓缩回收提取溶媒丙酮，回收得越完全越好。过滤时除去的部分为叶绿素和蜡质等。
步骤3)中，用水洗柱的目的是为了除去大部分的糖类物质，其用量通常为树脂体积的3～6倍。用20～50％体积的有机溶剂洗树脂柱可以除去残留的一部分糖、小分子物质以及极性较大的物质等，其用量通常为树脂体积的4～6倍。该步骤中，用70～100％体积的有机溶剂洗脱的终点是至流出液无酚性反应，具体可以用2wt％FeCl3水溶液检测；申请人在大量的试验基础上总结得出，洗至无酚性反应所需的70～100％体积的有机溶剂的用量约为树脂体积的6～10倍。优选采用80～90％体积的有机溶剂洗脱至流出液无酚性反应。
与现有技术相比，本发明采用大孔树脂柱进行层析，结合依次用水、20～50％体积的有机溶剂以及70～100％体积的有机溶剂进行洗脱的工艺，在降低成本的同时提高了产品收率(新鲜叶的收率可达0.37％以上)，而且纯度较高；另一方面，通过工业生产上常用的大孔树脂柱来实现分离的目的，因此更易于产业化；再者，整个方法只经一次柱层析即可实现最终产物的分离，既简单而且易操作。
附图说明
图1为发明实施例1制得的最终产物的核磁共振氢谱谱图；
图2为发明实施例1制得的最终产物的核磁共振碳谱谱图。
具体实施方式
下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
以下各实施例中所述的甲醇、乙醇及丙酮的浓度均为体积百分比浓度。
实施例1
1)取黧蒴锥新鲜叶6.0kg，切细，加入原料重量5倍的80％丙酮溶液，室温浸提24h，过滤，滤渣再加入原料重量5倍的80％丙酮溶液，室温浸提12h，过滤，合并滤液，得到提取液；
2)提取液经减压回收丙酮至完全时，过滤去叶绿素及蜡质，得滤液；
3)将步骤2)所得滤液上D101大孔树脂层析，用4倍树脂体积的水洗柱，然后用4倍树脂体积的50％乙醇洗脱，再用80％乙醇洗脱至无酚性反应(2wt％FeCl3水溶液检测，80％乙醇用量约为树脂体积的7倍)，收集80％乙醇洗脱液；
4)将收集的80％乙醇洗脱液减压浓缩回收乙醇，直至有大量晶体析出，放置过夜，过滤，干燥，得到白色针状体23.2g。
将上述所得的白色针状晶体进行核磁共振氢、碳谱分析，谱图分别如图1和图2所示，具体波谱特性如下：
1H-NMR(500MHz,pyridine-d5)δ:0.74(3H,s,H-27),0.83-0.84(3H,m,H-29),0.84(3H,s,H-26),0.89(1H,m,H-11a),1.00-1.05(1H,m,H-18),1.01(3H,s,H-25),1.09-1.13(1H,m,H-15a),1.12-1.15(1H,m,H-13),1.21(1H,m,H-16a),1.23(3H,s,H-30),1.26-1.29(2H,m,H-7),1.36(1H,m,H-11b),1.42-1.46(1H,m,H-21a),1.46-1.51(2H,m,H-22),1.53-1.59(2H,m,H-12),1.56-1.60(1H,m,H-19),1.65(1H,dd,J＝5.3,14.0Hz,H-1a),1.77(1H,m,H-21b),1.82-1.84(2H,m,H-6),1.93(1H,m,H-16b),2.07(1H,dd,J＝5.3,14.0Hz,H-1b),2.19(1H,m,H-15b),2.36(1H,d,J＝5.8Hz,H-5),3.98(1H,d,J＝11.3Hz,H-24a),4.13(1H,d,J＝10.9Hz H-23a),4.34(1H,m,H-2),4.41(1H,d,J＝10.9Hz,H-23b),5.86(1H,d,J＝5.8Hz,H-3),5.40(1H,d,J＝11.3Hz,H-24b),7.21(1H,s,H-HHDP-3),7.23(1H,s,H-HHDP-3')；
13C-NMR(500MHz,pyridine-d5)δ:14.2(C-27),15.7(C-26),18.5(C-29),18.7(C-6),18.9(C-25),21.9(C-11),24.1(C-30),25.4(C-12),27.2(C-21),27.5(C-15),27.9(C-16),32.1(C-22),33.8(C-7),36.6(C-10),40.8(C-8),41.3(C-14),42.2(C-17),42.3(C-19),43.3(C-13),44.1(C-5),46.8(C-1),46.9(C-4),48.2(C-18),51.5(C-9),64.9(C-23),65.1(C-24),67.4(C-2),76.4(C-3),83.9(C-20),107.9(C-HHDP-3),107.9(C-HHDP-3'),115.5(C-HHDP-1),116.4(C-HHDP-1'),126.8(C-HHDP-2),127.8(C-HHDP-2'),137.4(C-HHDP-5),137.9(C-HHDP-5'),146.3(C-HHDP-4),146.4(C-HHDP-4'),146.6(C-HHDP-6),146.6(C-HHDP-6'),169.4(C-HHDP-7),169.6(C-HHDP-7'),176.6(C-28)。
因此，可确定上述白色针状体即为三萜鞣花单宁类化合物，结构式如下式所示：
另外，对上述所得的白色针状体进行纯度检测(HPLC，下同)，纯度为97.0％。
对比例1
1)同实施例1；
2)同实施例1；
3)将步骤2)所得滤液上D101大孔树脂层析，用4倍树脂体积的水洗柱，然后直接用80％乙醇洗脱至无酚性反应(2wt％FeCl3水溶液检测，80％乙醇用量约为树脂体积的7倍)，收集80％乙醇洗脱液；
4)将收集的80％乙醇洗脱液减压浓缩回收乙醇，直至有大量晶体析出，放置过夜，过滤，干燥，得到白色针状体25.0g。
上述所得的白色针状体经核磁共振氢、碳谱分析，可知其确为三萜鞣花单宁类化合物，但是对其进行纯度检测，其纯度只有85.2％。
实施例2
1)取黧蒴锥新鲜叶6.1kg，切细或粉碎，加入原料重量5倍的80％丙酮溶液，回流提取2h，过滤，滤渣再加入原料重量5倍的80％丙酮溶液，回流提取2h，过滤，合并滤液，得到提取液；
2)提取液经减压回收丙酮至完全时，过滤去叶绿素及蜡质，得滤液；
3)将步骤2)所得滤液上HP-20大孔树脂层析，用4倍树脂体积的水洗柱，然后用4倍树脂体积的30％乙醇洗脱，再用90％乙醇洗脱至无酚性反应(2wt％FeCl3水溶液检测，90％乙醇用量约为树脂体积的6倍)，收集90％乙醇洗脱液；
4)将收集的90％乙醇洗脱液减压浓缩回收乙醇，直至有大量晶体析出，放置过夜，过滤，干燥，得到白色针状体24.1g，即为本发明所述的三萜鞣花单宁类化合物。经检测，其纯度为96.8％。
实施例3
1)取黧蒴锥新鲜叶6.5kg，切细，加入原料重量10倍的90％丙酮溶液，室温浸提24h，过滤，滤渣再加入原料重量5倍的90％丙酮溶液，室温浸提10h，过滤，合并滤液，得到提取液；
2)提取液经减压回收丙酮至完全时，过滤去叶绿素及蜡质，得滤液；
3)将步骤2)所得滤液上D-4020大孔树脂层析，用6倍树脂体积的水洗柱，然后用5倍树脂体积的50％甲醇洗脱，再用80％甲醇洗脱至无酚性反应(2wt％FeCl3水溶液检测，80％甲醇用量约为树脂体积的7倍)，收集80％甲醇洗脱液；
4)将收集的80％乙醇洗脱液减压浓缩回收乙醇，直至有大量晶体析出，放置过夜，过滤，干燥，得到白色针状体25.1g，即为本发明所述的三萜鞣花单宁类化合物。经检测，其纯度为97.6％。
实施例4
1)取黧蒴锥干叶2.0kg，切细，加入原料重量15倍的60％丙酮溶液，室温浸提20h，过滤，滤渣再加入原料重量10倍的60％丙酮溶液，室温浸提15h，过滤，合并滤液，得到提取液；
2)提取液经减压回收丙酮至完全时，过滤去叶绿素及蜡质，得滤液；
3)将步骤2)所得滤液上HPD500大孔树脂层析，用3倍树脂体积的水洗柱，然后用6倍树脂体积的20％乙醇洗脱，再用85％乙醇洗脱至无酚性反应(2wt％FeCl3水溶液检测，85％乙醇用量约为树脂体积的8倍)，收集85％乙醇洗脱液；
4)将收集的85％乙醇洗脱液减压浓缩回收乙醇，直至有大量晶体析出，放置过夜，过滤，干燥，得到白色针状体30.9g，即为本发明所述的三萜鞣花单宁类化合物。经检测，其纯度为96.7％。
实施例5
1)取黧蒴锥干叶2.2kg，切细，加入原料重量15倍的60％丙酮溶液，室温浸提15h，过滤，滤渣再加入原料重量10倍的80％丙酮溶液，室温浸提12h，过滤，合并滤液，得到提取液；
2)提取液经减压回收丙酮至完全时，过滤去叶绿素及蜡质，得滤液；
3)将步骤2)所得滤液上AB-8大孔树脂层析，用4倍树脂体积的水洗柱，然后用6倍树脂体积的40％甲醇洗脱，再用95％甲醇洗脱至无酚性反应(2wt％FeCl3水溶液检测，95％甲醇用量约为树脂体积的8倍)，收集95％甲醇洗脱液；
4)将收集的95％甲醇洗脱液减压浓缩回收乙醇，直至有大量晶体析出，放置过夜，过滤，干燥，得到白色针状体33.8g，即为本发明所述的三萜鞣花单宁类化合物。经检测，其纯度为97.1％。
Claims (7)
1.从黧蒴锥叶子中提取分离三萜鞣花单宁类化合物的方法，包括以下步骤：
1)以黧蒴锥叶子为原料、丙酮为溶媒进行提取，获得提取液；
2)提取液回收丙酮，过滤，得滤液；
3)所得滤液过大孔树脂，水洗，然后用20～50％体积的有机溶剂洗脱，再用70～100％体积的有机溶剂洗脱至流出液无酚性反应，收集70～100％体积的有机溶剂洗脱液；其中，所述大孔树脂的型号为D-101、AB-8、HPD500、HPD600、D-4020或HP-20；所述的有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮；
4)将收集的洗脱液减压回收有机溶剂，直至大量结晶析出，冷却，静置，分离出结晶，即得到三萜鞣花单宁类化合物。
2.根据权利要求1所述的从黧蒴锥叶子中提取分离三萜鞣花单宁类化合物的方法，其特征在于：步骤3)中，20～50％体积的有机溶剂的用量为树脂体积的4～6倍。
3.根据权利要求1所述的从黧蒴锥叶子中提取分离三萜鞣花单宁类化合物的方法，其特征在于：步骤3)中，70～100％体积的有机溶剂的用量为树脂体积的6～10倍。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的从黧蒴锥叶子中提取分离三萜鞣花单宁类化合物的方法，其特征在于：步骤3)中，用80～90％体积的有机溶剂洗脱至流出液无酚性反应。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的从黧蒴锥叶子中提取分离三萜鞣花单宁类化合物的方法，其特征在于：步骤3)中，水的用量为树脂体积的3～6倍。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的从黧蒴锥叶子中提取分离三萜鞣花单宁类化合物的方法，其特征在于：步骤1)中，提取用丙酮的体积浓度为50～100％。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的从黧蒴锥叶子中提取分离三萜鞣花单宁类化合物的方法，其特征在于：步骤1)中，提取的方式为浸提或加热回流提取。
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