CN104744555A

CN104744555A - 一种从植物天然皂素无患子中提取分离无患子皂甙b的方法

Info

Publication number: CN104744555A
Application number: CN201510165567.9A
Authority: CN
Inventors: 余俐佳; 杨江勇; 洪汉君; 国岛崇嗣; 村田雄司; 李峰
Original assignee: CHENGDU SANHERB BIOTECH CO LTD; Saraya Co Ltd
Current assignee: CHENGDU SANHERB BIOTECH CO LTD; Saraya Co Ltd
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2015-04-09
Publication date: 2015-07-01

Abstract

本发明公开了一种从无患子果皮中提取分离无患子总皂甙及无患子皂甙B的方法，包括干燥、粉碎无患子果皮，用溶剂提取过滤，浓缩得浸膏；浸膏合并后，加水溶解，经大孔树脂，以溶液洗脱，分得无患子总皂甙组分；再经由TLC及HPLC跟踪确定，取步骤2含无患子皂甙B的洗脱部分进行硅胶柱层析，再进行凝胶柱层析，最终得到无患子皂甙B的步骤。该方法利用大孔树脂分离、硅胶柱层析、凝胶柱层析以及配备以HPLC及TLC跟踪指导分离等技术，从无患子中分离出纯度达90％以上的无患子皂甙B产品。该方法操作简便可控，获得的产品杂质少，纯度高，制备的无患子皂甙B可作为无患子皂甙质量标准的标准品，为无患子的质量控制和进一步更合理的开发利用打下基础。

Description

一种从植物天然皂素无患子中提取分离无患子皂甙B的方法

技术领域

本发明涉及一种植物天然皂素的提取分离的方法，具体是指从无患子中提取分离无患子皂甙B的方法。

背景技术

无患子(拉丁学名：Sapindus mukorossi Gaertn.)，无患子科无患子属，多年生落叶乔木，原产于我国长江流域以南各地以、中南半岛各地及印度和日本。相传以无患树的木材制成的木棒可以驱魔杀鬼，因此名为无患。而拉丁学名Sapindus是soap indicus的缩写，意思是“印度的肥皂”，因为它那厚肉质状的果皮含有皂素，只要用水搓揉便会产生泡沫，可用于清洗，是古代的主要清洁剂之一。此外，除了清洗效用外，无患子还可以入药，近期有研究表明其具有消炎，杀菌，抗胃癌，胃溃疡，生育抑制以及促进微量元素吸收药用效果。

有文献报道，从无患子科植物无患子中提取出的无患子皂甙类化合物，无患子皂甙B可有降压、杀菌、以及溶血的作用。家兔0.04mg/kg皮下注射，可使血压下降25％。对饲喂胆甾醇的实验性动脉粥样硬化的兔，可降低胆甾醇含量，降血压，增加卵磷脂含量。目前，无患子皂甙B标准品在市场上的饱含量并不多，大部分研究侧重于无患子总皂甙的提取分离，且对于无患子皂甙B市场上并没有统一的标准，从而对于无患子质量的评价存在很大的分歧。

中国专利申请CN 1097764公开了一种从油患子外壳提取含有皂甙物质溶液的方法，它包括油患子的干燥、脱壳、壳体粉碎、萃取(浸泡)、沉降、过滤、精馏等过程，最后可得到主要含有皂甙，还含有氨基酸、维生素，总有效物质量为15-28％(wt％的水溶液产品，但该方法提取的无患子中为混合物，不能用于无患子皂甙B的单独提取。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种从无患子中提取分离无患子皂甙B的方法。

本发明的上述目的是通过如下技术方案实现的：

一种从无患子果皮中提取分离无患子总皂甙及无患子皂甙B的方法，包括以下步骤：

1)干燥、粉碎无患子果皮，用溶剂提取过滤，浓缩得浸膏；

2)浸膏合并后，加水溶解，经大孔树脂，以溶液洗脱，分得无患子总皂甙组分；

3)再经由TLC及HPLC跟踪确定，取步骤2含无患子皂甙B的洗脱部分进行硅胶柱层析，再进行凝胶柱层析，最终得到无患子皂甙B。

在本发明中，所述步骤1)中所述提取溶剂为醇类溶剂和水，优选为C1-3的醇、更优选为甲醇或乙醇；采用甲醇或乙醇浸提时，优选三次提取，采用体积比为(6:5:4)的比例微沸提取，提取时间控制分别为微沸(3：2：1)小时；再所述过滤优选为趁热过滤，浓缩优选在减压条件下处理。

在本发明中，所述步骤2)中溶解浸膏的水优选为体积为5-10倍的水，更优选为5倍。使用HP-20大孔树脂，洗脱剂为乙醇和水的混合溶剂，分别以乙醇体积比为0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％的乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，，以TLC为指导分离，每梯度用洗脱液用量相同，一般而言约200ml。溶剂回收，循环使用。收集乙醇浓度为0％，10％，40％，60％，100％的组分，分别记为Fr0，Fr1，Fr2，Fr3，Fr4。

在本发明中，所述步骤3)中，用以进行再次分离的步骤2的洗脱组分为Fr3组分。硅胶柱层析时使用的硅胶为100～300目，洗脱剂为氯仿：甲醇(体积比)为95:5～0:100，优选采用如下浓度的洗脱剂洗脱：甲醇体积比为0，5％，10％，15％，20％，30％，40％，100％的MEOH-CH₃Cl混合溶剂；洗脱剂用量分别为100ml；200ml；200ml；200ml；200ml；200ml；200ml；100ml并分别以TLC及HPLC跟踪指导下，不等体积地收集17个流分，分别标记为(Fr3.0，Fr3.1，Fr3.2，Fr3.3，……，Fr3.16)。合并Fr3.11和Fr3.12组分，采用凝胶柱层析为SephadexLH-20，用甲醇/氯仿(1：1)等度洗脱。并分别以TLC及HPLC跟踪指导下收集流分，分别标记为Fr3.11-12-1，Fr3.11-12-2，……Fr3.11-12-5。Fr3.11-12-3即为无患子皂甙B。

无患子皂甙B属于齐墩果烷型三萜皂甙，其极性小，在水中溶解性差，故本法采用先醇提再综合配以大孔树脂、硅胶、凝胶等分离手法，采用低极性洗脱液洗脱，后经NMR检测，得到高纯度无患子皂甙B。

本发明的有益效果在于：该方法利用大孔树脂分离、硅胶柱层析、凝胶柱层析以及配备以HPLC及TLC跟踪指导分离等技术，从无患子中分离出纯度达90％以上的无患子皂甙B产品。该方法操作简便可控，获得的产品杂质少，纯度高，制备的无患子皂甙B可作为无患子皂甙质量标准的标准品，为无患子的质量控制和进一步更合理的开发利用打下基础。

附图说明

图1为无患子皂甙B的结构图。

图2为无患子皂甙B的¹HNMR图谱。

图3为无患子皂甙B的¹³CNMR图谱。

具体实施方式

实施例1

1)将无患子果皮干燥、粉碎，用80％乙醇—水溶液以1:6；1:5；1:4的料液比分别微沸浸提3h；2h；1h；将浸提液过滤，旋干；溶剂回收，循环使用；三次浸提所得浸膏合并得总浸膏。

2)使用HP-20大孔树脂分离，以5倍体积的水溶解浸膏，以水冲柱至流分无色，后分别以(10％～100％)乙醇-水梯度洗脱，以HPLC跟踪，共先后收集乙醇浓度为(0％，10％，40％，60％，100％)，即(Fr0～Fr4)共五组流分。分别减压蒸馏溶剂回收循环使用。

3)对组分Fr3进行硅胶柱层析，使用的硅胶为200～300目，洗脱剂为氯仿/甲醇(100％0，V/V)，梯度洗脱MEOH％(0；5；10；15；20；30；40；100)％—CH3Cl体系(100；200；200；200；200；200；200；100)ml洗脱，分别不等体积收集(Fr3.0；Fr3.1；Fr3.2；Fr3.3；……；Fr3.16)16组流分。别以通过TLC配以碘及H₂SO₄(20％，火烤)显色。合并Fr3.11～Fr3.12点，旋干，再用氯仿：甲醇＝1:1溶液溶解Fr3.11-12，进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，氯仿/甲醇(1：1，V/V)作洗脱剂洗脱，分离得系列组分Fr3.11-12-1～Fr3.11-12-5，TLC及HPLC-MS检测，Fr3.11-12-3即为无患子皂甙B，面积归一法纯度为90％以上。溶剂分别回收循环使用。

化合物1，即无患子皂甙无患子皂甙B的结构确定，通过MS及NMR数据，并与文献数据比对确定其结构，其NMR数据如下：

¹H NMR(400MHz,d₄-MeOH)δ5.23(d,J＝5.6Hz,2H),4.52-4.44(m,3H),4.11(d,J＝14.0Hz,1H),3.93-3.80(m,5H),3.77-3.70(m,4H),3.68-3.51(m,7H),3.43-3.27(m,3H),3.22(t,J＝10.8Hz,1H),2.83(dd,J＝13.2,3.2Hz,1H),2.11-1.82(m,5H),1.83-1.44(m,11H),1.45-1.14(m,14H),1.12-1.16(m,2H),0.97(s,3H),0.94(s,3H),0.91(s,3H),0.81(s,3H),0.70(s,3H)；¹³CNMR(100MHz,d₄-MeOH)δ181.87,145.15,123.55,106.43,104.56,101.25,82.35,82.23,82.02,77.55,76.19,75.16,73.99,72.88,72.69,71.56,71.00,69.89,69.66,69.60,69.47,67.15,66.94,65.31,64.56,47.57,47.19,43.92,42.92,42.65,40.45,39.65,37.58,34.87,33.76,33.35,31.59,28.80,26.54,24.50,24.04,18.82,18.05,17.76,16.44,13.81。

Claims

1.一种从无患子果皮中提取分离无患子总皂甙及无患子皂甙B的方法，包括以下步骤：

1)干燥、粉碎无患子果皮，用溶剂提取过滤，浓缩至浸膏无溶剂味；

2)浸膏合并后，加水溶解，经大孔树脂，以洗脱剂洗脱，分得无患子总皂甙组分；

3)再经由TLC及HPLC跟踪确定，对其中的大孔树脂60％以上乙醇洗脱部分进行硅胶柱层析，再进行凝胶柱层析，最终得到无患子皂甙B。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤1中的提取溶剂为水或醇类溶剂，优选为C1-3的醇，更优选为甲醇或乙醇。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤1优选三次提取，三次提取的溶剂体积比为6:5:4，微沸提取，提取时间控制为3：2：1小时；所述过滤优选为趁热过滤，浓缩优选在减压条件下处理。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，所述步骤2)中溶解浸膏的水优选为体积为5-10倍的水；所述大孔树脂为HP-20大孔树脂，洗脱剂为乙醇和水的混合溶剂。

5.如权利要求4所述的方法，所述洗脱剂为体积比10:90-90:10的乙醇：水的混合溶剂；所述洗脱采用梯度洗脱。

6.如权利要求5所述的方法，所述梯度洗脱是按顺序以乙醇：水(体积比)为10:90、20:8030:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10的浓度洗脱，每梯度用洗脱液用量相同。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法，所述步骤2)中溶解浸膏的水优选为体积为5-10倍的水，更优选为5倍；分别以乙醇体积比为0％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％的乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，以TLC为指导分离，每梯度用洗脱液用量为200ml；收集乙醇浓度为0％，10％，40％，60％，100％的组分，分别记为Fr0，Fr1，Fr2，Fr3，Fr4。

8.如权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述步骤3中，硅胶柱层析时使用的硅胶为100～300目，洗脱剂为氯仿：甲醇(体积比)为95:5～0:100，梯度洗脱。

9.如权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述步骤3中，凝胶柱层析为SephadexLH-20，用甲醇：氯仿＝1：1(体积比)的洗脱剂等度洗脱。

10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其中在本发明中，所述步骤3)中，用以进行再次分离的步骤2的洗脱组分为Fr3组分；优选采用如下浓度的洗脱剂洗脱：甲醇体积比为0，5％，10％，15％，20％，30％，40％，100％的MEOH-CH₃Cl混合溶剂；洗脱剂用量分别为100ml；200ml；200ml；200ml；200ml；200ml；200ml；100ml；并分别以TLC及HPLC跟踪指导下，收集17个流分，分别标记为(Fr3.0，Fr3.1，Fr3.2，Fr3.3，……， Fr3.16)；合并Fr3.11和Fr3.12组分，采用凝胶柱层析为SephadexLH-20，用甲醇/氯仿(1：1)等度洗脱；并分别以TLC及HPLC跟踪指导下收集流分，分别标记为Fr3.11-12-1，Fr3.11-12-2，……Fr3.11-12-5；Fr3.11-12-3即为无患子皂甙B。