CN115232187B - 一种从龙脑樟中提取7β-羟基白桦脂酸的方法及应用 - Google Patents
一种从龙脑樟中提取7β-羟基白桦脂酸的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于天然产物分离纯化技术领域，涉及一种从龙脑樟中提取7β‑羟基白桦脂酸的方法及应用，该方法采用龙脑樟枝叶提取挥发油后的龙脑樟去油枝叶为原料，粉碎后加入有机溶剂提取，过滤，减压浓缩成提取后的浸膏；浸膏用复溶溶剂进行溶解，进行柱色谱分离，先用二氯甲烷与甲醇＝(70‑90):1进行冲洗，再用二氯甲烷与甲醇＝50:1进行冲洗，收集二氯甲烷与甲醇＝50:1段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至干，得到特征馏分浓缩物；向特征馏分浓缩物中加入结晶溶剂，室温静置，离心过滤后，反复结晶，得白色粉末状物质，即为7β‑羟基白桦脂酸。本发明快速从龙脑樟中分离得到的7β‑羟基白桦脂酸可用于制备新的抗炎药物，所得7β‑羟基白桦脂酸纯度达98.65％，得率达0.85％。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物分离纯化技术领域，尤其涉及一种从龙脑樟中提取7β-羟基白桦脂酸的方法及应用。
背景技术
龙脑樟(Cinnamomum Camphora chvar.Borneol)为樟科樟属常绿性乔木，龙脑樟枝叶富含天然右旋龙脑(简称天然冰片)，具有通诸窍、散郁火、消肿止痛的功效。右旋龙脑为龙脑樟的主要有效成分，天然冰片又名“天然右旋龙脑”，是一种常用的名贵中药及高级香料，素有植物麝香之称，具有开窍醒神、淸热止痛的作用，并能显著促进药物吸收，常作为复方中药的辅药、引药、食品添加剂及日化产品添加剂而被广泛应用。
目前，天然冰片多通过水蒸气蒸馏法从龙脑樟枝叶提取，途中产生大量残渣(龙脑樟去油枝叶)。这些残渣要么晾干后用作锅炉燃料，要么还田作肥料，资源利用率不高，其主要原因是对龙脑樟去油枝叶的化学成分并未提取和开发，不仅造成资源的严重浪费，而且对环境也造成了污染。
白桦脂酸是一种三萜类物质，具有抗炎、抗癌以及神经保护的作用。白桦脂醇在白桦树皮中的含量较高，也存在于一些其他植物中，如CN102558281B从山茱萸果核中提取得到了白桦脂酸，先将山茱萸果核粉碎，用石油醚脱脂后，再用有机溶剂提取得到膏状提取物，膏状提取物上样于弱极性或非极性大孔吸附树脂吸附柱，再用高浓度乙醇洗脱得到白桦脂酸粗提物，再用甲醇或乙醇进行重结晶，得到高纯度的白桦脂酸，此方法所用大孔树脂为了保证样品全部溶解，所以采用60％的乙醇溶解样品进行上样，虽然得到白桦脂酸，但是60％的乙醇在冲洗大孔树脂的时候，会造成白桦脂酸的损失，使其收率降低。CN101768200B采用溶剂回流法从藕节、藕节炭中提取制备了3-表白桦脂酸，此方法用硅胶作为载体，对其浸膏进行吸附然后溶剂提取，而浸膏与硅胶并不能充分吸附，采用溶剂提取时，会溶出很多杂质，造成后期结晶次数增多，收率降低。
基于此，本发明提供从龙脑樟中提取7β-羟基白桦脂酸方法，且该化合物在龙脑樟中研究尚未见报道。
发明内容
为了充分利用提取天然冰片之后的残渣(残渣主要是龙脑樟去油枝叶)，本发明提供一种从龙脑樟中提取7β-羟基白桦脂酸的方法及应用，从龙脑樟去油枝叶中提取得多了7β-羟基白桦脂酸，可用于抗炎药物。
为了解决上述技术问题，本发明是这样实现的：
一种从龙脑樟中提取7β-羟基白桦脂酸的方法，龙脑樟枝叶提取挥发油后，残渣为龙脑樟去油枝叶，取龙脑樟去油枝叶粉碎，加入有机溶剂提取，过滤，减压浓缩成提取后的浸膏；浸膏用复溶溶剂进行溶解，进行柱色谱分离，先用二氯甲烷与甲醇＝(70-90):1进行冲洗，再用二氯甲烷与甲醇＝50:1进行冲洗，收集二氯甲烷与甲醇＝50:1段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至干，得到特征馏分浓缩物；向特征馏分浓缩物中加入结晶溶剂，室温静置，离心过滤后，反复结晶，得白色粉末状物质，即为7β-羟基白桦脂酸。
可选的，提取龙脑樟去油枝叶的有机溶剂为50％-90％的乙醇水溶液，料液比为1:1-30(kg/L)，提取方式为室温搅拌提取。
可选的，浸膏在复溶溶剂溶解前，采用脱脂溶剂进行脱脂，所述脱脂溶剂为石油醚。
可选的，复溶溶剂为甲醇、乙醇和丙酮中的任意一种。
可选的，脱色采用的脱色材质为硅藻土、活性炭、氧化铝的一种或任意组合。
可选的，所述结晶溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、氯仿、正丁醇与异丙醇中的任意两种，其比例为1:1，室温结晶。
本发明通过脱脂、脱色、柱色谱以及结晶等方法快速从龙脑樟中分离得到7β-羟基白桦脂酸，所得7β-羟基白桦脂酸纯度达98.65％，得率达0.85％。该方法简易、高效、投资少，使用提取天然冰片后的龙脑樟废料作为原料相对于现有技术白桦脂酸的制备原料来说成本低，且适合大规模生产，彻底解决龙脑樟提取冰片后的原料深加工问题。。
附图说明
图1是本发明实施例1所得白色粉末状物质的质谱图；
图2是本发明实施例1所得白色粉末状物质的氢谱图；
图3是本发明实施例1所得白色粉末状物质碳谱图。
图4是不同浓度的7β-羟基白桦脂酸下细胞存活率柱状图。
图5是不同浓度的7β-羟基白桦脂酸对RAW264.7细胞NO释放量柱状图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
龙脑樟枝叶经水蒸气蒸馏提取挥发油后，残渣为龙脑樟去油枝叶，取500g龙脑樟去油枝叶粉碎，按料液比1:10(g/mL)的比例加入体积百分浓度80％的乙醇水溶液，室温搅拌提取2小时，过滤，减压浓缩成提取后的浸膏。
在提取后的浸膏中加入脱脂溶剂石油醚，所使用的石油醚与浸膏的比为5:1，石油醚提取两次。
脱脂后的浸膏用甲醇进行溶解，并加入原料质量5％的活性炭脱色，脱色后经过滤、减压浓缩为密度为1.2，加入一定量的200-300目硅胶进行干法拌料进行柱色谱分离，先用二氯甲烷与甲醇＝80:1进行冲洗，再用二氯甲烷与甲醇＝50:1进行冲洗，洗脱液经TLC检测二氯甲烷与甲醇＝50:1段馏分显色有紫色斑点，收集二氯甲烷与甲醇＝50:1段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至干。
向特征馏分浓缩物中加入质量为浓缩物1倍的二氯甲烷与甲醇的混合液(二氯甲烷：甲醇＝1:1)，室温静置12h，离心过滤后，反复结晶，得白色粉末状物质4.35g，纯度为99.65％。
由电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析白色粉末状物质的分子量为472，如图1所示；结合氢谱和碳谱得出其分子式为C30H48O4，不饱和度为7，1H-NMR数据如图2所示，显示6个甲基[δ0.97(s,3H,C-25)；δ1.02(s,3H,C-24)；δ1.05(s,3H,C-27)；δ1.09(s,3H,C-26)；δ1.11(s,3H,C-23)；δ1.75(s,3H,C-30)；],2个烯键质子[δ4.59(s,2H,C-29a)；δ4.66(s,2H,C-29b)]。13C-NMR中如图3所示,羧基化学位移δ180.87(C-28)；双键化学位移δ108.48(C-29)和δ150.15(C-20)，这是典型的羽扇豆烷型骨架。与化合物白桦脂酸的核磁数据进行比较发现，氢谱中化学位移在δ3.50–δ3.56(m,2H,C-3,19处多出一个信号)，揭示环上有一处CH2被羟基取代，碳谱中δ33.78(C-7β)化学位移左移，说明C-7被羟基取代。因此，化合物被鉴定为7β-羟基白桦脂酸。
核磁数据如下:
1HNMR(CDCl3)-δ0.72–δ0.78(m,3H,H-1,5)；δ0.97(s,3H,H-25)；δ1.02(s,3H,H-24)；δ1.05(s,3H,H-27)；δ1.09(s,3H,H-26)；δ1.11(s,3H,H-23)；δ1.15–δ1.26(m,5H,H-9,11,12)；δ1.34–δ1.45(m,4H,H-6,16)；δ1.48–δ1.57(m,7βH,H-2,18,21,22)；δ1.75(s,3H,H-30)；δ2.37–δ2.43(m,3H,H-13,15)；δ3.50–δ3.56(m,3H,H-3,7,19)；δ4.59(s,2H,H-29a)；δ4.66(s,2H,H-29b).13CNMR(CDCl3)-δ39.04(C-1)；δ27.39(C-2)；δ78.49(C-3)；δ39.11(C-4)；δ55.57(C-5)；δ19.56(C-6)；δ35.88(C-7)；δ41.65(C-8)；δ50.10(C-9)；δ38.44(C-10)；δ21.07(C-11)；δ24.73(C-12)；δ38.78(C-13)；δ42.17(C-14)；δ29.92(C-15)；δ32.32(C-16)；δ47.37(C-17)；δ48.14(C-18)；δ49.47(C-19)；δ150.15(C-20)；δ30.28(C-21)；δ38.26(C-22)；δ27.95(C-23)；δ16.32(C-24)；δ16.51(C-25)；δ16.77(C-26)；δ15.75(C-27β)；δ180.87(C-28)；δ108.48(C-29)；δ19.12(C-30).
白色粉末状物质结构式如下：
分子式为C30H48O4，化学名为化合名为：7β-羟基白桦脂酸，其对应英文名为：7β-hydroxy betulinic acid。该化合物为白色，其熔点为(mp)：230–233℃；紫外光谱分析其在252，298，320nm有最大吸收，红外光谱分析显示在3425cm-1(OH)、2950cm-1(CH2)、1710cm-1(COOR)、1691cm-1((C＝C)、1342cm-1(CH3)处有吸收，ESI-MS m/z[M-H]-为471。
实施例2
龙脑樟枝叶经水蒸气蒸馏提取挥发油后，取1000g龙脑樟去油枝叶粉碎，按料液比1:15(g/mL)的比例加入体积百分浓度90％的乙醇水溶液，室温搅拌提取2小时，过滤，减压浓缩成提取后的浸膏。
在提取后的浸膏中加入脱脂溶剂石油醚，所使用的石油醚与浸膏的比为3:1，石油醚提取两次。
脱脂后的浸膏用甲醇进行溶解，并加入原料质量10％的活性炭脱色，脱色后经过滤、减压浓缩为密度为1.2，加入一定量的200-300目硅胶进行干法拌料进行柱色谱分离，先用二氯甲烷与甲醇＝90:1进行冲洗，再用二氯甲烷与甲醇＝50:1进行冲洗，收集二氯甲烷与甲醇＝50:1段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至干。
向特征馏分浓缩物中加入质量为浓缩物2倍的二氯甲烷与甲醇的混合液(二氯甲烷：丙酮＝1:1)，室温静置12h，离心过滤后，反复结晶，得白色粉末状物质6.45g，纯度为97.43％，经质谱与核磁共振谱鉴定为7β-羟基白桦脂酸。
实施例3
龙脑樟枝叶经水蒸气蒸馏提取挥发油后，取1000g龙脑樟去油枝叶粉碎，按料液比1:20(g/mL)的比例加入体积百分浓度70％的乙醇水溶液，室温搅拌提取2小时，过滤，减压浓缩成提取后的浸膏。
在提取后的浸膏中加入脱脂溶剂石油醚，所使用的石油醚与浸膏的比为1:1，石油醚提取两次。
脱脂后的浸膏用甲醇进行溶解，并加入原料质量15％的活性炭脱色，脱色后经过滤、减压浓缩为密度为1.2，加入一定量的200-300目硅胶进行干法拌料进行柱色谱分离，先用二氯甲烷与甲醇＝80:1进行冲洗，再用二氯甲烷与甲醇＝50:1进行冲洗，洗脱液经TLC检测(图1)二氯甲烷与甲醇＝50:1段馏分显色有紫色斑点，收集二氯甲烷与甲醇＝50:1段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至干。
向特征馏分浓缩物中加入质量为浓缩物1倍的二氯甲烷与甲醇的混合液(二氯甲烷：乙醇＝1:1)，室温静置12h，离心过滤后，反复结晶，得白色粉末状物质5.17g，纯度为98.22％，经质谱与核磁共振谱鉴定为7β-羟基白桦脂酸。
实施例4
龙脑樟枝叶经水蒸气蒸馏提取挥发油后，取1000g龙脑樟去油枝叶粉碎，按料液比1:15(g/mL)的比例加入体积百分浓度60％的乙醇水溶液，室温搅拌提取2小时，过滤，减压浓缩成提取后的浸膏。
在提取后的浸膏中加入脱脂溶剂石油醚，所使用的石油醚与浸膏的比为2:1，石油醚提取两次。
脱脂后的浸膏用甲醇进行溶解，并加入原料质量5％的活性炭脱色，脱色后经过滤、减压浓缩为密度为1.2，加入一定量的200-300目硅胶进行干法拌料进行柱色谱分离，先用二氯甲烷与甲醇＝70:1进行冲洗，再用二氯甲烷与甲醇＝50:1进行冲洗，洗脱液经TLC检测二氯甲烷与甲醇＝50:1段馏分显色有紫色斑点，收集二氯甲烷与甲醇＝50:1段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至干。
向特征馏分浓缩物中加入质量为浓缩物1倍的二氯甲烷与甲醇的混合液(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，室温静置12h，离心过滤后，反复结晶，得白色粉末状物质5.87g，纯度为97.35％，经质谱与核磁共振谱鉴定为7β-羟基白桦脂酸。
实施例5
龙脑樟枝叶经水蒸气蒸馏提取挥发油后，取1500g龙脑樟去油枝叶粉碎，按料液比1:5(g/mL)的比例加入体积百分浓度50％的乙醇水溶液，室温搅拌提取2小时，过滤，减压浓缩成提取后的浸膏。
在提取后的浸膏中加入脱脂溶剂石油醚，所使用的石油醚与浸膏的比为4:1，石油醚提取两次。
脱脂后的浸膏用甲醇进行溶解，并加入原料质量10％的活性炭脱色，脱色后经过滤、减压浓缩为密度为1.2，加入一定量的200-300目硅胶进行干法拌料进行柱色谱分离，先用二氯甲烷与甲醇＝80:1进行冲洗，再用二氯甲烷与甲醇＝50:1进行冲洗，洗脱液经TLC检测二氯甲烷与甲醇＝50:1段馏分显色有紫色斑点，收集二氯甲烷与甲醇＝50:1段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至干。
向特征馏分浓缩物中加入质量为浓缩物1倍的甲醇，室温静置12h，离心过滤后，反复结晶，得白色粉末状物质3.34g，纯度为98.28％，经质谱与核磁共振谱鉴定为7β-羟基白桦脂酸。
实施例6
龙脑樟枝叶经水蒸气蒸馏提取挥发油后，取1000g龙脑樟去油枝叶粉碎，按料液比1:20(g/mL)的比例加入体积百分浓度90％的乙醇水溶液，室温搅拌提取2小时，过滤，减压浓缩成提取后的浸膏。
在提取后的浸膏中加入脱脂溶剂石油醚，所使用的石油醚与浸膏的比为4:1，石油醚提取两次。
脱脂后的浸膏用甲醇进行溶解，并加入原料质量20％的活性炭脱色，脱色后经过滤、减压浓缩为密度为1.2，加入一定量的200-300目硅胶进行干法拌料进行柱色谱分离，先用二氯甲烷与甲醇＝70:1进行冲洗，再用二氯甲烷与甲醇＝50:1进行冲洗，洗脱液经TLC检测二氯甲烷与甲醇＝50:1段馏分显色有紫色斑点，收集二氯甲烷与甲醇＝50:1段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至干。
向特征馏分浓缩物中加入质量为浓缩物1倍的丙酮溶液，室温静置12h，离心过滤后，反复结晶，得白色粉末状物质6.78g，纯度为98.97％，经质谱与核磁共振谱鉴定为7β-羟基白桦脂酸。
如下提供本发明制备的7β-羟基白桦脂酸抗炎活性评价。
1.待评价样品：上述制备的7β-羟基白桦脂酸的抗炎活性评价。
2.试验方法：
(1)RAW264.7细胞由普洱茶科学重点实验室提供，在含1％青霉素-链霉素和10％FBS的高糖DMEM中培养。使用Esco CO2培养箱(中国上海)在37℃的恒定温度下在5％CO2气氛下培养细胞。每三天传代一次。细胞复苏后，传至4代后方可用于建模。
(2)根据MTT法测定7β-羟基白桦脂酸对RAW264.7巨噬细胞的细胞毒性。将细胞(5×105细胞/孔)接种在96孔板中培养24小时。接下来，更换培养基，并在其中添加不同浓度的样品(0-100μg/mL)(对照组除外)进行24小时处理。接下来，完全吸取每个孔中的培养液，并在其中进一步添加含有1mg/mL MTT的100μL无血清培养基，培养4小时。添加100μL MTT停止缓冲液(10％十二烷基硫酸钠加0.01M盐酸)并处理16-20小时以停止反应。最后，使用微孔板读取器(Tecan Infinite 200Pro，奥地利)在57β0nm处读取每个孔的吸光度。细胞存活率＝(空白组OD值-样品组OD值)/空白组OD值×100％。
(3)通过Griess试验检测NO的分泌量。RAW264.7β细胞(5×105细胞/孔)在96孔板中培养24小时，在每个孔(对照组除外)中分别加入不同浓度的7ββ-羟基白桦脂酸(0-100μg/mL)预处理2小时。然后在这些孔中加入1μg/mL LPS额外培养24小时，将每个孔的100μL上清液与等体积的Griess试剂(Griess A:Griess B，1:1，v/v)混合。冲击和反应10分钟后，立即在540nm处测定吸光度。根据NaNO2标准曲线计算NO的释放。
3.实验结果：
评估不同浓度的7β-羟基白桦脂酸的细胞毒性。将对照组细胞视为100％细胞存活，并与其他组进行比较。结果(图4)表明，在浓度(6.25-25μg/mL)下的7ββ-羟基白桦脂酸具有较高的细胞活力，并且没有明显的细胞毒性。而50-100μg/mL下显示7ββ-羟基白桦脂酸对细胞具有一定的毒性。还研究了不同浓度的7ββ-羟基白桦脂酸对RAW264.7β细胞NO释放的影响，如图5所示，LPS组的NO释放量显著高于空白组，表明LPS可以成功刺激RAW264.7β细胞的炎症反应。当用7β-羟基白桦脂酸处理RAW264.7β细胞时，NO释放量均显著减少，并且NO的产生呈剂量依赖性关系。实验结果充分说明7ββ-羟基白桦脂酸具有显著的抗炎作用，可广泛应用在食品和保健品等产品中。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种从龙脑樟中提取 7β-羟基白桦脂酸的方法，其特征在于，龙脑樟枝叶提取挥发油后，残渣为龙脑樟去油枝叶，取龙脑樟去油枝叶粉碎，加入有机溶剂提取，过滤，减压浓缩成提取后的浸膏；采用脱脂溶剂对浸膏进行脱脂；脱脂的浸膏用复溶溶剂进行溶解，复溶溶剂为甲醇、乙醇和丙酮中的任意一种；进行柱色谱分离，先用二氯甲烷与甲醇=（70-90）:1进行冲洗，再用二氯甲烷与甲醇=50:1进行冲洗，收集二氯甲烷与甲醇=50:1段馏分作为特征馏分，将特征馏分浓缩至干，得到特征馏分浓缩物；向特征馏分浓缩物中加入结晶溶剂，结晶溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、氯仿、正丁醇与异丙醇、水中的任意两种，其比例为1:1，室温静置，离心过滤后，反复结晶，得白色粉末状物质，即为7β-羟基白桦脂酸。
2.根据权利要求1所述的一种从龙脑樟中提取7β-羟基白桦脂酸的方法，其特征在于，提取龙脑樟去油枝叶的有机溶剂为50%-90%的乙醇水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种从龙脑樟中提取7β-羟基白桦脂酸的方法，其特征在于，龙脑樟去油枝叶与乙醇水溶液的料液比为1:1-30kg/L。
4.根据权利要求1所述的一种从龙脑樟中提取7β-羟基白桦脂酸的方法，其特征在于，所述龙脑樟挥发油的提取方式为水蒸气蒸馏、超临界CO2提取、亚临界提取和有机溶剂提取的其中一种。
5.根据权利要求1所述的一种从龙脑樟中提取7β-羟基白桦脂酸的方法，其特征在于，柱色谱分离前进行脱色处理，脱色采用的脱色材质为硅藻土、活性炭、氧化铝的一种或任意组合。
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