CN101704872B - 23-羟基白桦酸衍生物、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了三种新的23-羟基白桦酸衍生物，3-羧基-23-羟基白桦酸、3-羧基-23-羟基二氢白桦酸、23-羟基二氢白桦酸，还公开了三种新化合物的制备方法，该三种新化合物能广泛抑制多种类型的人肿瘤细胞系生长，并进一步诱导肿瘤细胞凋亡，在人肿瘤异种移植模型研究中，3-羧基-23-羟基白桦酸被证明是一种有效的抗肿瘤剂，能强烈抑制人黑色素瘤、白血病、恶性神经胶质瘤、前列腺癌、肺癌和结肠癌细胞在体内生长，3-羧基-23-羟基白桦酸具有被开发成为新的广谱抗肿瘤药物的巨大潜能。不仅如此，该三种新化合物还具有抗HIV病毒作用，特别是3-羧基-23-羟基二氢白桦酸抗HIV病毒作用最强并且强过临床上使用的抗艾滋病药物阳性对照组，因此说，3-羧基-23-羟基二氢白桦酸具有被开发成为新的抗艾滋病药物的巨大潜能。

Description

23-羟基白桦酸衍生物、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及具有抗肿瘤和抗艾滋病作用的23-羟基白桦酸衍生物、其制备方法及应用。
背景技术
白桦酸，又名桦木酸，是五环三萜类化合物，英文名称为Betulinicacid，化学名为3β-hydroxy-lup-20(29)-ene-28-oicacid，分子式为C30H48O3，分子量为456.71。白桦酸有几种生物来源，如从蒲桃树叶、白桦树皮乙醇萃取物进行重结晶提取；也可以用白桦脂醇为原料通过化学合成得到。可用作调香剂。白桦酸是一种无色结晶，熔点316～318℃，旋光度[α]D+8°，能溶于乙醚、乙醇、丙酮、氯仿、吡啶。白桦酸的性质和作用可参见下面三篇文献：周映霞，王振国，马莉，阎浩林，白桦酯酸及其衍生物的研究概况，中国药学杂志，2005年06期；徐萍，周金培，徐进宜，吴晓明，白桦酸类化合物抗肿瘤活性的研究进展，中国药师，2006年02期；李丹，周金培，吴晓明，白桦酸及其衍生物的研究进展，药学进展，2004年03期，白桦酸具有抗肿瘤、抗艾滋病病毒、抗炎和体外抗疟病作用等多种生物活性，并对肿瘤细胞具有一定的选择性细胞毒性及其较好的治疗指数，甚至达到500mg/kg时，也没有明显的毒性反应。九十年代中期经研究发现白桦脂酸可以选择性地杀死人类黑色素瘤细胞而不杀伤健康细胞；另外近期的研究表明白桦酸对脑瘤、神经外胚层瘤、白血病等恶性肿瘤细胞也有抑制作用。白桦酸抗肿瘤作用机制认为是降低肿瘤细胞线粒体膜电位，引起细胞内线粒体通透性改变，最后导致细胞凋亡，另外与其上调肿瘤细胞膜p53蛋白的表达，改变肿瘤细胞膜Ca2+、Mg2+-ATP酶活性有关，具体参见两篇文献，叶银英，何道伟，叶文才，张庆文，赵守训.23-羟基桦木酸体外和体内抗黑色素瘤作用的研究[J]中国肿瘤临床与康复，2000年01期；程燕，叶文才，石俊敏，姚新生，栗原博.23-羟基白桦酸诱导LoVo细胞凋亡与线粒体膜电位的变化[J].中国药理学通报，2007年03期。
传统中药白头翁，具清热解毒、活血化瘀功效，中医临床主要用于结肠癌、直肠癌等肠道肿瘤及子宫颈癌、脑垂体瘤、甲状腺瘤、肺癌的治疗，具体参见文献Ye w c，Zhang Q W，Hsiao W L，et a1.New lupane glycosides from pulsatilachinensis[J].P/anta Medwa，2002，68：183-6。23-羟基白桦酸是从白头翁中发现的三萜皂苷元，其含量高达2.5％，参见文献叶银英，何道伟，叶文才，等.23-羟基桦木酸体外和体内抗黑色素肿瘤作用的研究[J].中国肿瘤临床与康复，20007(1)：5-7。近年来的研究表明23-羟基白桦酸在体内、外均能够选择性抑制小鼠黑色素瘤B16细胞的增殖，其作用机制主要是通过诱导B16细胞凋亡，参见两篇文献Ye Y Y，He D W，Ye W C，et a1.The study of 23-hydroxybetulinicAcid against melanoma in vivo and in vitro[J].Chin J Clin OncolRehab.2000，7(1)：5-7；Wu W K，Ho J C，Cheung F W，et Apoptoticactivity of betulinic acid derivatives on murine melanoma B16 cellline[J].Eur J Pharmacol.2004，498(1-3)：71-8。
综上，白桦酸和23-羟基白桦酸具有抗肿瘤作用，因此可用作抗肿瘤的治疗药。目前，抗肿瘤药物应用于人体时，不同个体的药效作用是有很大差异的，抗肿瘤药物的分子作用机理现在也没有完全研究透彻，因此不同个体只能从不同的抗肿瘤药物中选择对自己药效作用大，副作用小的药物，则对开发更多的抗肿瘤药物或者具有抗肿瘤活性的化合物是很有需求的。基于白桦酸和23-羟基白桦酸具有的抗肿瘤作用，人们会期待从白桦酸或23-羟基白桦酸的衍生物中发现其他具有生物活性的化合物，这些化合物可以应用于抗肿瘤的治疗药，或者具有其他作用，如抗艾滋病。为达到上述目的，发明人对白桦酸或23-羟基白桦酸的很多衍生物进行了研究，结果发现了三种23-羟基白桦酸衍生物是具有抗肿瘤和抗艾滋病活性的，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的第一个目的是提供具有抗肿瘤和抗艾滋病作用的新化合物，该新化合物是属于23-羟基白桦酸的衍生物；本发明的第二个目的是提供新化合物的制备方法；本发明的第三个目的是说明新化合物的应用。
本发明提供了三种新的23-羟基白桦酸衍生物，化学名称为3-羧基-23-羟基白桦酸、3-羧基-23-羟基二氢白桦酸、23-羟基二氢白桦酸，化学式依次为
Figure G2009101865366D0000031
3-羧基-23-羟基白桦酸，英文名称为3-carbonyl-23-hydroxy betulinic acid，其分子式为C30H46O4，分子量为470.68，其制备方法如下：
(1)将500mg 23-羟基白桦酸溶解于1ml吡啶中，于零下5度下搅拌均匀，缓慢滴加醋酸酐0.15ml，而后反应于零下5度搅拌反应约24小时后处理反应。于该温度下缓慢滴加氯化铵饱和溶液，直至无气泡产生，乙酸乙酯萃取三次后合并有机层，饱和氯化钠水溶液洗有机层两次，再用无水硫酸钠干燥，旋干有机溶剂乙酸乙酯后上柱分离，除回收部分原料外，分别得到化合物3，23-二乙酰基-23-羟基白桦酸(定义为zhangnan-1)，23-二乙酰基-23-羟基白桦酸(定义为zhangnan-2)和3-二乙酰基-23-羟基白桦酸(定义为zhangnan-6)，化合物zhangnan-1、zhangnan-2、zhangnan-6分别占总产物的30％，60％和10％，该反应步骤的总收率为65％，反应式如下：
Figure G2009101865366D0000032
(2)将100mg化合物zhangnan-2溶解分散于30ml二氯甲烷中，于冰浴下加入氧化剂二环己基碳二亚胺58mg后，于室温搅拌反应4小时后处理，旋干溶剂二氯甲烷后用乙酸乙酯溶解后用粗硅胶进行柱分离，得到化合物3-羧基-23-二乙酰基-23-羟基白桦酸(定义为zhangnan-4)70mg，该反应步骤的收率80％，反应式如下；
Figure G2009101865366D0000041
(3)取50mg化合物zhangnan-4分散溶解于30ml甲醇中，加入5ml碳酸钾的饱和溶液后，于室温搅拌反应2小时后处理反应，乙酸乙酯萃取三次后合并有机层，饱和氯化钠水溶液洗有机层两次，再用无水硫酸钠干燥，旋干有机溶剂乙酸乙酯后上柱分离，得化合物3-羧基-23-羟基白桦酸(定义为zhangnan-5)40mg，该反应步骤的收率为90％，反应式如下：
Figure G2009101865366D0000042
化合物zhangnan-5
H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：0.963，0.969，0.992，1.015，1.690(各3H，s，5×CH3)，2.99(1H，m，H-19)，4.71(1H，d，J＝1.6Hz，29-H)，4.61(1H，d，J＝1.6Hz，29-H)。
C-NMR(400MHz，CDC13)δ：213.95，182.21，150.31，109.79，56.36，53.30，49.20，48.17，46.93，44.58，42.56，40.38，40.34，38.41，37.43，37.04，36.79，33.08，32.13，30.56，29.60，25.46，22.18，21.51，19.34，15.89，14.52，13.54。
MS(ESI)：m/z 440[M-2O]-。
3-羧基-23-羟基二氢白桦酸，英文名称为3-carbonyl-23-hydroxyDihydrobetulinic acid，其分子式为C30H48O4，分子量为472.7，其制备方法如下：
取30mg化合物zhangnan-5分散溶解于30ml甲醇中，加入约10mg还原剂钯碳后密封反应体系，抽真空，充入氢气，并于氢气流中室温搅拌反应10小时后结束反应，滤除钯碳后旋干溶剂，得到产物3-羧基-23-羟基二氢白桦酸(定义为zhangnan-7)25mg，该反应的收率为85％，反应式如下：
Figure G2009101865366D0000051
化合物zhangnan-7
H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：0.755(3H，d，J＝7.2Hz)，0.963(3H，d，J＝7.2Hz)，0.894，0.936，1.048，1.301(各3H，s，4×CH3)，2.243(4H，m)。
C-NMR(400MHz，CDC13)δ：212.69，177.79，56.29，52.98，48.52，47.65，44.19，44.12，42.71，37.87，37.33，37.22，36.78，33.16，32.12，29.82，29.59，27.02，23.45，22.93，22.19，21.59，16.12，14.99，14.58，13.63，12.04。
MS(ESI)：m/z 442[M-2OH]-。
23-羟基二氢白桦酸，英文名称为23-hydroxy Dihydrobetulinicacid，其分子式为C30H40O4，分子量为474.72，其制备方法如下：
取30mg化合物23-羟基白桦酸分散溶解于30ml甲醇中，加入约10mg还原剂钯碳后密封反应体系，抽真空，充入氢气，并于氢气流中室温搅拌反应10小时后结束反应，滤除钯碳后，旋干溶剂得到产物23-羟基二氢白桦酸(定义为zhangnan-8)20mg，该反应的收率为70％，反应式如下：
化合物zhangnan-8
H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：0.727(3H，d，J＝6.4Hz，CH3)，0.816(3H，d，J＝6.8Hz，CH3)，0.790，0.853，0.910，1.289(各3H，s，4×CH3)，2.243(4H，m)。
C-NMR(400MHz，CD3OD)δ：70.58，64.82，56.33，50.39，48.98，47.09，44.37，42.68，42.49，39.38，38.76，37.64，36.90，34.26，29.96，27.37，27.18，23.62，23.23，21.17，17.99，16.81，16.66，15.22，14.78，12.89。
MS(ESI)：m/z 444[M-2OH]-。
三种新的23-羟基白桦酸衍生物，3-羧基-23-羟基白桦酸、3-羧基-23-羟基二氢白桦酸、23-羟基二氢白桦酸，其制备方法可参考文献Hashimoto F，Kashiwada Y，Cosentino LM，Chen CH，Garrett PE，Lee KH.，Anti-AIDS agents--XXVII.Synthesis and anti-HIV activity of betulinic acid and dihydrobetulinic acidderivatives.Bioorg Med Chem.1997 Dec；5(12)：2133-43。该三种新化合物能广泛抑制多种类型的人肿瘤细胞系生长，并进一步诱导肿瘤细胞凋亡。在人肿瘤异种移植模型研究中，3-羧基-23-羟基白桦酸被证明是一种有效的抗肿瘤剂，能强烈抑制人黑色素瘤、白血病、恶性神经胶质瘤、前列腺癌、肺癌和结肠癌细胞在体内生长。3-羧基-23-羟基白桦酸具有被开发成为新的广谱抗肿瘤药物的巨大潜能。本发明还发现3-羧基-23-羟基白桦酸、3-羧基-23-羟基二氢白桦酸和23-羟基二氢白桦酸还具有抗HIV病毒作用，特别是3-羧基-23-羟基二氢白桦酸抗HIV病毒作用最强并且强过临床上使用的抗艾滋病药物阳性对照组。因此说，3-羧基-23-羟基二氢白桦酸具有被开发成为新的抗艾滋病药物的巨大潜能。
附图说明
附图1为化合物zhangnan-5或对照组治疗皮下接种的人前列腺癌(LnCAP)肿瘤细胞的肿瘤体积-移植后天数曲线图；
附图2为化合物zhangnan-5或对照组治疗皮下接种的人肺癌(NCI-H23)肿瘤细胞的肿瘤体积-移植后天数曲线图；
附图3为化合物zhangnan-5或对照组治疗皮下接种的人结肠癌(HCT-116)肿瘤细胞的肿瘤体积-移植后天数曲线图；
附图4为化合物zhangnan-5或对照组治疗皮下接种的人黑色素瘤(G-361)肿瘤细胞的肿瘤体积-移植后天数曲线图；
附图5为化合物zhangnan-5或对照组治疗皮下接种的人恶性神经胶质瘤(U-251)肿瘤细胞的肿瘤体积-移植后天数曲线图。
具体实施方式
下面结合附图来进一步阐述本发明。
本发明涉及三种新的23-羟基白桦酸衍生物，化合物zhangnan-5、zhangnan-7和zhangnan-8，它们的化学名称、化学式、表征化学结构的各种参数以及制备方法已在发明内容部分公开，这里通过实验来说明三种新化合物的生物活性。
(1)化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8广泛抑制人体肿瘤细胞株，但对正常细胞株没有作用：(可参考文献Carmichael J，DeGraff WG，Gazadar AF，Minna JD，Mitchell JB；Evaluation of a tetrazolium-basedsemiautomated colormeteric assay：assessment of chemosensitivity testing.Cancer Research，1987，47：943-946。)
我们使用人肿瘤细胞系进行细胞毒性分析。在含有不同化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8的正常培养基中培养31种人肿瘤细胞株，人肿瘤细胞系购自ATCC和NCI，用含10％FBS的DMEM培养液，在含5％CO2的37℃孵箱中培养。用胰蛋白酶消化汇合的细胞，经培养液洗涤后计数。向96孔培养板的每孔中加入3000～6000个细胞，孵育16小时或24小时。然后向孔内加入不同浓度的化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8。继续培养72小时后，对药物处理组细胞和对照组细胞进行MTT试验，测定细胞存活情况。结果如表1所示，表1显示化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8广泛抑制人体肿瘤细胞株，大多数人体肿瘤细胞尤其对化合物zhangnan-5敏感。有些肿瘤细胞对这种化合物的EC50低于0.1μm。但是，正常人乳腺上皮细胞(MCF-10a)和正常小鼠成纤维细胞(MEF)对化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8不敏感，即便化合物的浓度高达30μm，这些细胞仍然生长良好。
表1化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8体外抑制人肿瘤细胞生长
人肿瘤细胞株   细胞类型   zhangnan-5EC50(uM)   zhangnan-7EC50(uM)   zhangnan-8EC50(uM)
  LnCAP   前列腺   0.69   15.6   7.8
  D145   前列腺   0.85   14.8   8.4
  PC3   前列腺   0.91   16.2   8.9
  HCT-116   结肠   0.09   15.1   7.8
  Widr   结肠   0.28   14.8   8.1
  HT29   结肠   0.47   13.9   8.9
  LoVo   结肠   0.15   15.2   9.6
  CCL-225   结肠   0.23   16.1   8.6
  CCL-247   结肠   0.52   15.6   8.2
  NCI-H23   肺   0.32   12.8   6.7
  A549   肺   0.54   13.1   6.9
  MDA-MB-231   乳腺   0.47   17.5   7.2
  MDA-MB-435   乳腺   0.55   19.3   7.9
  AU-565   乳腺   0.59   18.2   6.8
  BT-549   乳腺   0.67   17.4   7.4
  MCF-7   乳腺   0.58   16.9   7.8
  Caki-1   肾   0.98   20.1   9.2
  ACHN   肾   1.2   18.3   8.9
  786-O   肾   3.1   16.8   8.1
  SN12C   肾   1.3   17.5   7.6
  SKOV3   卵巢   1.5   16.9   6.9
  IGROV1   卵巢   2.1   17.4   7.2
  Mid PaCa-2   胰腺   0.93   18.9   9.4
  U-251   恶性胶质瘤   0.089   17.8   5.6
  SK-MEL-5   皮肤(黑色   0.093   18.5   4.9
  G-361   皮肤(黑色   0.087   19.3   5.3
MCF-10a   正常乳腺上皮细胞   ＞30 ＞30 ＞30
  SGC-7901   胃   0.89   18.5   8.9
  EC109   食管   0.78   17.9   9.5
  CNE-2Z   鼻咽   1.3   19.2   10.2
  Raji   淋巴瘤   0.098   20.5   6.9
  Jurkat   白血病T细   0.14   21.3   7.1
MEF   正常小鼠成纤维细胞 ＞30 ＞30 ＞30
化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8或其各种形式形成的盐可作为抗肿瘤药物的原料药，该形成的盐是由衍生物与碱反应生成的，碱可采用各种形式的碱，可以是无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾等，也可以是有机碱如碱金属醇盐等，化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8或其各种形式形成的盐可与药用载体和/或赋形剂制成口服制剂或注射剂制的抗肿瘤药物，药用载体和/或赋形剂包括谷物油，羧甲基纤维素钠等。
(2)化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8对C8166和PBMC细胞的毒性：
取对数生长期的C8166(人T淋巴细胞系)和PBM(用淋巴细胞分离液自正常人外周血分离，贴壁的单个核细胞从PBMC中分离)细胞，离心(1000r·min-1，10min)后将细胞重悬，浓度分别调至4×105/ml和2×106/ml。在96孔细胞培养板上将被检样品2倍倍比稀释，共设6个梯度，每个梯度设3个重复孔，另设阳性对照组及细胞对照组。分别加细胞悬液后，置37℃、5％CO2培养箱中孵育。第7天用MTT法测定样品对细胞的毒性。按下列公式计算被检样品对细胞生长的抑制率，并计算IC50(50％inhibition concentration)值。
细胞生长抑制率(％)＝(1-实验孔OD值/对照孔(OD值)×100％
23-羟基白桦酸、化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8对C8166细胞的IC50值分别为15.1±3.57uM、2.3±0.47uM、25±5.2uM和10.3±2.9uM，而阳性对照AZT在3.437mM时对50％C8166细胞产生毒性。23-羟基白桦酸、化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8对正常人PBMC的IC50值分别为14.9±3.46uM、2.4±0.38uM、25.8±4.9uM和11.6±3.5uM。阳性对照药物SCH-C(治疗艾滋病的抗逆转录病毒药物，是CCR的拮抗剂，只能阻止R型病毒与细胞结合，对x型病毒无效。分子量(MW)为557。将184.1mg的SCH-C溶解到3.3ml DMSO中，得到100ummol的贮存液，于4℃或-20℃保存。)对PBMC的IC50为82.667ummol。
(3)化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8对病毒HIV-1IIIB诱导C8166细胞形成合胞体的抑制作用：(可参考文献姜海鸥；汪旭，李汝润，陈大刚，贲昆龙.复方三黄散胶囊体外抗艾滋病病毒的实验研究，[J].山东中医杂志，2005.8(1)：21-26.)
在96孔平底培养板上，将待测物用培养基进行2倍稀释，共8个稀释度，每孔100ul设2个重复孔，同时设置阳性对照组、细胞对照组和病毒对照组。每孔加4×105/ml的C8166细胞80ul，然后每孔加入20ul病毒HIV-1IIIB上清，每孔的终末体积为200ul，置37℃，5％CO2培养箱内培养。感染后第3天观察化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8对合胞体形成的影响。在倒置显微镜下，计数病毒HIV-1IIIB诱导C8166细胞形成的合胞体数。EC50为抑制合胞体形成达50％时的化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8的浓度。以下列公式计算样品对合胞体形成的抑制率：
合胞体形成的抑制率(％)＝(1-实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)×100％阳性对照AZT显示出有效的抑制HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体，其EC50为1.39uM，治疗指数TI值为2473。23-羟基白桦酸、化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8的EC50值分别为1.2±0.23uM、0.5±0.07uM、0.0019±0.0002uM、和1.1±0.09uM；其治疗指数分别为13、4.6、13158、9.4。化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8对HIV-1IIIB诱导合胞体形成的抑制作用随其浓度的增加而增强，与阳性对照药物AZT相比，zhangnan-7治疗指数(TI)最高，对合胞体的形成显示出明显的抑制作用。
(4)定量酶联免疫吸附法(EIISA)检测化合物对病毒HIV-1Ada-M p24表达的抑制作用：(可参考文献姜海鸥；汪旭，李汝润，陈大刚，贲昆龙.复方三黄散胶囊体外抗艾滋病病毒的实验研究，[J].山东中医杂志，2005.8(1)：21-26.)
在96孔培养板上，用多头加样器对样品进行3倍倍比稀释，设6个稀释度，每个稀释度设三个重复孔，每孔100ul。同时设阳性对照组SCH-C(治疗艾滋病的抗逆转录病毒药物，是CCR的拮抗剂，只能阻止R型病毒与细胞结合，对x型病毒无效。分子量(MW)为557。将184.1mg的SCH-C溶解到3.3mlDMSO中，得到100ummol的贮存液，于4℃或-20℃保存。)、病毒对照组和细胞+病毒对照组。在96孔平底培养板上每孔分别加入含有1000～5000Pg/well P24抗原的病毒贮存液25ul，充分混匀，加入单个核细胞PBMC悬液75ul(3×105细胞数/孔)，置37℃，5％CO2培养箱中培养到第3天时每孔补加100ul培养基，第7天时收集细胞培养上清供p24抗原测定，按p24试剂盒说明用EILSA法检测各样品细胞培养孔上清的病毒HIV-l p24抗原浓度，以下列公式计算样品对病毒的抑制率：
样品对病毒p24抗原的抑制率(％)＝(1-实验孔OD值/细胞加病毒对照孔OD值)×100％，以Reed and Mueneh法计算出被测样品的EC50，并进一步计算出治疗指数(TI)(TI＝IC50/EC50)。
当以试剂盒测定HIVp24抗原的含量时，发现加入的病毒量(V)为896.3pg/ml，而病毒增值对照(病毒加细胞，V+C)的病毒p24含量为1452.9pg/ml。阳性对照SCH-C、23-羟基白桦酸、化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8在所测定的范围内都达到了50％以上的抑制率，阳性对照SCH-C抑制HIV-1Ada-M p24抗原表达，其EC50为0.032ummol，治疗指数为2583。23-羟基白桦酸、化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8EC50值分别为1.9±0.39uM、0.7±0.19uM、0.0026±0.0005uM、和1.6±0.23uM，其治疗指数分别为7.8、3.4、9923和7.3。23-羟基白桦酸、化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8都具有对HIV-1Ada-M的抑制作用，其中化合物zhangnan-7对HIV-1Ada-M的抑制活性最强，并且明显强于阳性对照化合物SCH-C，而且对HIV-1Ada-M的抑制作用与其浓度存在着明显的量效关系。
化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8或其各种形式形成的盐可作为抗艾滋病药物的原料药，该形成的盐是由衍生物与碱反应生成的，碱可采用各种形式的碱，可以是无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾等，也可以是有机碱如碱金属醇盐等，化合物zhangnan-5、zhangnan-7、和zhangnan-8或其各种形式形成的盐可与药用载体和/或赋形剂制成口服制剂或注射剂制的抗艾滋病药物，药用载体和/或赋形剂包括谷物油，羧甲基纤维素钠等。
(5)化合物zhangnan-5在小鼠体内的药代动力学研究：(可参考文献Singh SS，Shah H，Gupta S，Jain M，Sharma K，Thakkar P，Shah R.Liquidchromatography--electrospray ionisation mass spectrometry method for thedetermination of escitalopram in human plasma and its application inbioequivalence study.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.2004Nov 25；811(2)：209-15.)
取4只8周龄BlebC小鼠(2只雄性和2只雌性)，单次剂量100mg/kg给予化合物zhangnan-5。分别于口饲给药后0.5、1、3、6、12、24、48、72小时，经眼静脉取血并制得血浆，以测定给予化合物zhangnan-5的血浆浓度。
表2.化合物zhangnan-5在小鼠体内的药代动力学参数
  药代动力学参数   均数+/-标准差
  T1/2(hour)   11.5+/-0.8
  Tmax(min)   85+/-7
  Cmax(uM)   65+/-9
(6)给药后化合物zhangnan-5对小鼠的急性毒性研究：(可参考文献Gol′dberg LE，Stepanova ES，Vertogradova TP，Shevniuk LA，ShepelevtsevaNG.Preclinical toxicological study of the new antibiotic eremomycin.Itsacute toxicity for laboratory animals，Antibiot Med Biotekhnol.1987，32(12)：910-5.)
取两组8周龄的BlabC小鼠，每组10只(5只雄性和5只雌性)，分别以单次剂量500mg/kg和多次剂量200mg/kg(QDX15)给予化合物zhangnan-5(用玉米油或载体配制)，然后分别观察1周和4周。每两天称体重。试验结束后，将受试小鼠处死，进行病理分析。结果显示，以单次剂量500mg/Kg和多次剂量200mg/kg(QDX15)给予化合物zhangnan-5，均未观察到毒性，所有受试小鼠生长良好，无一死亡。因此给予化合物zhangnan-5是具有很大开发前景的广谱抗肿瘤新药，化合物zhangnan-5可作为抗肿瘤药物的原料药，优先作为抗恶性实体瘤药物的原料药，化合物zhangnan-5也可与药用载体和/或赋形剂制成抗肿瘤药物。所述药用载体和/或赋形剂例如谷物油，羧甲基纤维素钠等。
化合物zhangnan-5一般口服推荐剂量为每天165mg/体表面积m2，连续三周，休息一周为一疗程。化合物zhangnan-5每天总剂量一次于早餐后半小时口服，具体病例可由医师根据病情调整。
(7)人肿瘤异种移植模型和裸小鼠肿瘤移植模型的给药：(可参考文献Harrison SD Jr；Growth of human tumor cells in athymic mice；J Natl Cancer Inst.1991 Oct 16；83(20)：1509.)
T细胞缺陷裸小鼠(nu/nu)，雄性，6周龄，购自Charles River实验室，按照大学动物饲养和使用委员会指南饲养于无病原体环境。将5×106个LNCaP、NCI-H23、HCT-116、G-361、U-251细胞分别悬浮于0.2mlHBSS或基质胶(50∶50，v/v)中，皮下接种到小鼠的侧腹部区域。当肿瘤平均直径达7～8mm时，选出肿瘤大小为100～200mm3的小鼠，分为给予玉米油配制的化合物zhangnan-5的处理组和只给予空载体(玉米油)的对照组。为保证化合物zhangnan-5处理组和对照组在处理开始时肿瘤体积分布大致相等，将小鼠分成三类：肿瘤体积小(长度＜4mm)，肿瘤体积中等(4～8mm)，肿瘤体积大(＞8mm)。对照组，化合物zhangnan-5处理组中来自相同类别的小鼠数目大致相等。
在口服给药试验中，将化合物zhangnan-5(30mg/kg)溶解于玉米油中。每日管饲给予单次剂量200μl药液(用玉米油配制，含0.75mg化合物zhangnan-5)，每周5次，持续3周；对照组按同样方法给予安慰剂(玉米油)。小鼠单独饲养，允许自由采食。
抗肿瘤效应评价：
每3～4天沿两个垂直方向对肿瘤进行测量。肿瘤体积根据以下公式计算：
V＝(a2×b)/2
其中a是肿瘤宽度(较小直径)，b是长度(较大直径)。每个肿瘤的相对肿瘤体积(RTV)定义为给定时间点的肿瘤体积与处理开始时肿瘤体积的比值。每个处理组均计算平均值。根据以下公式计算肿瘤生长抑制值(TGI)，判断抗肿瘤活性：
TGI(％)＝T/C×100
其中T是处理组试验终点(4周)RTV的平均值，C是对照组试验终点RTV的平均值。采用美国国立癌症研究所的最小抗肿瘤活性标准(T/C≤42％)。
在化合物zhangnan-5有效抑制多种肿瘤细胞体外增殖的基础上，应用人肿瘤移植裸鼠(皮下接种)评价化合物zhangnan-5的抗肿瘤作用，受试的肿瘤细胞包括人前列腺癌细胞LnCAP，人肺癌细胞NCI-H23，人结肠癌细胞HCT-116，人黑色素瘤细胞G-361和人恶性胶质瘤细胞U-251。结果如图1-5所示，化合物zhangnan-5强烈抑制这三种肿瘤生长，其TGI值分别为5％，0％，6.9％，10.8％，和12.5％。同时未发现化合物zhangnan-5具有明显的副作用，包括体重的变化。这些数据强烈提示，化合物zhangnan-5是开发新的抗肿瘤药物的一个很好的候选化合物。

Claims (7)

1.制备化学式为
Figure FSB00000571691200011
化学名称为3-氧代-23-羟基白桦酸的方法，包括以下步骤：
(1)将23-羟基白桦酸溶解于吡啶中，搅拌均匀，缓慢滴加醋酸酐，搅拌进行反应，然后缓慢滴加氯化铵饱和溶液，直至无气泡产生，乙酸乙酯萃取后合并有机层，饱和氯化钠水溶液洗有机层，再用无水硫酸钠干燥，旋干有机溶剂乙酸乙酯后上柱分离，除回收部分原料外，分别得到化合物3，23-二乙酰氧基-白桦酸，3-羟基-23-乙酰氧基-白桦酸和3-乙酰氧基-23-羟基白桦酸；
(2)将3-羟基-23-乙酰氧基-白桦酸溶解分散于二氯甲烷中，于冰浴下加入氧化剂二环己基碳二亚胺后，于室温搅拌进行反应，旋干溶剂二氯甲烷后用乙酸乙酯溶解后用粗硅胶进行柱分离，得到化合物3-氧代-23-乙酰氧基-白桦酸；
(3)取3-氧代-23-乙酰氧基-白桦酸分散溶解于甲醇中，加入碳酸钾的饱和溶液后，于室温搅拌进行反应，乙酸乙酯萃取后合并有机层，饱和氯化钠水溶液洗有机层，再用无水硫酸钠干燥，旋干有机溶剂乙酸乙酯后上柱分离，得化合物3-氧代-23-羟基白桦酸。
2.一种23-羟基白桦酸衍生物，该衍生物的化学名称为3-氧代-23-羟基二氢白桦酸，化学式为
Figure FSB00000571691200012
3.制备权利要求2所述的23-羟基白桦酸衍生物的方法，包括：
取3-氧代-23-羟基白桦酸分散溶解于甲醇中，加入还原剂钯碳后密封反应体系，抽真空，充入氢气，并于氢气流中室温搅拌进行反应，在结束反应后滤除钯碳，然后旋干溶剂，得到产物3-氧代-23-羟基二氢白桦酸。
4.权利要求2所述的23-羟基白桦酸衍生物或其各种形式形成的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.权利要求2所述的23-羟基白桦酸衍生物或其各种形式形成的盐在制备抗艾滋病药物中的应用。
6.药物组合物，其中含有权利要求2所述的23-羟基白桦酸衍生物或其各种形式形成的盐作为有效成分，并含有常规药用载体和/或赋形剂。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，该药物组合物制成口服制剂或注射剂，其中所述药用载体和/或赋形剂包括谷物油，羧甲基纤维素钠。
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