CN111417384A - 用于治疗神经系统病况的方法和改进的神经保护性组合物 - Google Patents

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Abstract

通过施用改进的三萜系神经保护性组合物来治疗受试者的神经系统病况的方法。通过施用治疗有效量的组合物来治疗阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病和中风。

Description

用于治疗神经系统病况的方法和改进的神经保护性组合物
技术领域
本发明涉及用包括三萜的组合的改进的神经保护性组合物治疗神经系统病况的方法。特别地，本发明涉及通过向有需要的受试者施用所述组合物来治疗神经系统疾病或病症的方法。本发明还包括包含改进的神经保护性组合物的药物组合物。
背景技术
神经系统疾病和病症会影响大脑功能。已经做出许多努力来开发针对这些疾病和病症的治疗性或改善性疗法；然而，尽管存在许多已经证明对各种不同的疾病和病症有效的药物治疗方法，但是尚未开发出全面或普遍的治疗性疗法。
亨廷顿病(Huntington’s disease(HD))是影响神经系统的遗传性大脑疾病。它是由从父母传给孩子的有缺陷的基因引起的。HD基因干扰已知为“亨廷顿”的特殊蛋白质的制造，该蛋白质对于大脑的正常发育至关重要。HD的经典标志包括情绪、认知和运动障碍。亨廷顿病的特征在于剧烈的不自主运动(舞蹈症)，但有时会引起僵硬而无异常的运动、肢体使用的改变(失用症)、身体功能失控和痴呆，包括记忆力、思维速度、判断力的逐步恶化，以及缺乏问题和计划意识。尚无亨廷顿病的治疗方法。尽管有许多药物可以帮助控制与HD相关的症状，例如情绪和运动问题，但尚无可以阻止或逆转疾病进程的治疗。已认为亨廷顿病是具有一般膜异常的疾病。与正常人相比，在亨廷顿病患者的红细胞和基底神经节的膜中观察到Na,K-ATP酶的显著升高的水平和活性(增加10倍)(Butterfield DA,Oeswein JQ,Prunty ME,Hisle KC,Markesbery WR)。在亨廷顿病中，在红细胞膜中，钠、钾腺苷三磷酸酶活性增加Ann Neurology,4:60-62,1978)。从亨廷顿病患者的皮肤中获得的成纤维细胞膜(Schroeder F,Goetz IE,Roberts E,Membrane anomalies in Huntington's diseasefibroblasts.J.Neurochem.43:526-539,1984)。
阿尔茨海默病是痴呆的一种形式，其为损害大脑的智力功能(记忆、定向、计算等)，但通常保留其运动功能的神经退行性疾病。在阿尔茨海默病中，精神逐渐恶化，导致记忆力减退、混乱、迷失方向、判断力受损和其它影响人进行正常日常活动的能力的问题。精神变化的类型、严重程度、顺序和进程差异很大。尚无治疗阿尔茨海默病的方法，并且没有减慢其进程的方法。对于一些处于疾病早期或中期的人，例如他克林(tacrine)等药物会减轻一些认知症状。Aricept(多奈哌齐)和Exelon(利凡斯的明)是可逆的乙酰胆碱酯酶抑制剂，被指定用于治疗轻度至中度阿尔茨海默型痴呆。这些药物(称为胆碱酯酶抑制剂)通过增加大脑的神经递质乙酰胆碱的水平来起作用，有助于恢复大脑细胞之间的交流。一些药物可有助于控制行为症状，例如失眠、躁动、神经恍惚、焦虑和抑郁。这些治疗旨在使患者更加舒适。尽管尚无药物可以治疗阿尔茨海默病，但胆碱酯酶抑制剂可以改善日常活动的表现或者减轻行为问题。目前正在试验的用于治疗阿尔茨海默病的药物包括雌激素、非甾体抗炎药、维生素E、司来吉兰(Carbex,Eldepryl)和植物制品银杏。
已知三萜具有多种治疗活性。一些已知的三萜包括齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸、巴多索隆、和山楂酸等。对三萜的治疗活性主要进行了单独地评价，而不是作为三萜的组合来评价。
Rong等人(Pharm.Biol.(Jan 2011),49(1),78-85)提出齐墩果酸可以适用于减轻缺血性中风。So等人(Arch.Pharm.Res.(Jun 2009),32(6),923-932)提出齐墩果酸可以适用于预防和治疗中风的神经变性。Li等人(Brain Res.(Feb.2013),1497,32-39)提出熊果酸可以在小鼠脑缺血后提供神经保护作用。García-Morales等人(Arch.Pharm.Res.(Jul2015),38(7),1369-1379)提出应当进一步研究寒丁子(Bouvardia ternifolia)的提取物来治疗阿尔茨海默病。Zhang等人(Neuroscience Letters(2014),579,12-17)报道熊果酸降低实验性蛛网膜下腔出血后的氧化应激。Qian等人(Eur.J.Pharmacol.(2011),670(1),148-153)报道在大鼠中山楂酸保护皮质神经元免受氧糖剥夺所致的伤害。ConsejoSuperior de Investigaciones Científicas(Madrid,ES)的EP 2260851A1提出使用齐墩果酸来治疗多发性硬化症。Yoo等人(Molecules,(May 2012),17(3),3524-38)提出使用萜类作为抗阿尔茨海默病的疗法。Heo等人(Mol.Cells(Feb.2002),13(1),5-11)提出熊果酸减少淀粉样β蛋白诱导的氧化性细胞死亡。Chung等人(Mol.Cells(April 2001),11(2),137-143)提出熊果酸似乎是阿尔茨海默病中乙酰胆碱酯酶的有效抑制剂。Choi等人的US2007/0249711A1(公开日2007年10月25日)提出使用齐墩果酸和熊果酸来改善脑功能以预防和治疗轻度认知障碍和痴呆。
齐墩果酸是一类以例如巴多索隆等化合物为代表的三萜类化合物，其显示为先天性细胞2期解毒途径的有效激活剂，其中转录因子Nrf2的激活导致包含抗氧化转录反应元件(ARE)的下游抗氧化基因程序中的转录增加。已经在炎症条件下的临床试验中广泛地研究了巴多索隆本身；然而，由于可能与升高的浓度的某些三萜类化合物(包括巴多索隆)的已知细胞毒性有关的不良事件，终止了慢性肾脏疾病的3期临床试验。
发现包含三萜与其它治疗组分的组合的组合物是植物提取物。Fumiko等人(Biol.Pharm.Bull(2002),25(11),1485-1487)公开迷迭香(Rosmarimus officinalis L.)的甲醇提取物用于治疗锥虫病的评价。Addington等人(US8481086，US 9220778，US9358293，US 20160243143A1)公开包含夹竹桃苷和三萜的夹竹桃(Nerium oleander)的超临界流体提取物(SCF；PBI-05204)，用于治疗神经系统病况。Addington等人(US 9011937，US 20150283191A1)公开包含夹竹桃苷和三萜的夹竹桃的SCF提取物中的含三萜的级分(PBI-04711)，用于治疗神经系统病况。
Figure BDA0002423859780000031
等人(Molecules(2009),14,2016-2031)公开了包含齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸和其它组分的混合物的各种植物提取物。Mishra等人(PLoS One 2016 25；11(7):e0159430.Epub 2016 Jul 25)公开了包含齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸和其它组分的混合物的糙皮桦(Betula utilis)树皮的提取物。Wang等人(Molecules(2016),21,139)公开了包含齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸和其它组分的混合物的糖胶树(Alstonia scholaris)的提取物。L.e Silva等人(Molecules(2012),17,12197)公开了包含齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸和其它组分的混合物的Eriope blanchetti的提取物。Rui等人(Int.J.Mol.Sci.(2012),13,7648-7662)公开了包含齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸和其它组分的混合物的蓝桉(Eucaplyptus globulus)的提取物。Ayatollahi等人(Iran.J.Pharm.Res.(2011),10(2),287-294)公开了包含齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸和其它组分的混合物的Euphorbia microsciadia的提取物。Wu等人(Molecules(2011),16,1-15)公开了包含齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸和其它组分的混合物的女贞(Ligustrum)属的种(species)的提取物。Lee等人(Biol.Pharm.Bull(2010),33(2),330)公开了包含齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸和其它组分的混合物的金钟花(Forsythia viridissima)的提取物。
齐墩果酸(O或OA)、熊果酸(U或UA)和白桦脂酸(B或BA)是在PBI-05204(PBI-23；夹竹桃的超临界流体提取物)和PBI-04711(PBI-05204的含三萜的级分0-4)中发现的三种主要的三萜组分。我们(本发明的两个发明人)之前通过在相似的浓度下在脑切片氧糖剥夺(OGD)模型试验中比较三萜的神经保护活性来报道三萜对疗效的贡献(Van Kanegan等人，Nature Scientific Reports(May 2016),6:25626.doi:10.1038/srep25626)。我们发现PBI-05204(PBI)和PBI-04711(级分0-4)提供神经保护活性(图1)。然后，我们在等摩尔的基础上评价三种主要的单独的三萜和熊果醇(Uva)分别在OGD试验中的神经保护活性(图5)。我们发现OA提供比UA更高的活性；而BA和Uva(熊果醇)在试验浓度下几乎没有活性。我们发现在该试验中UA的活性以浓度依赖性的方式显示可变的活性。我们推测核因子红系2相关因子(Nrf2)依赖性的抗氧化基因的激活作为PBI-04711和单独的三萜的潜在的神经保护活性的潜在的机制。因此，我们采用ARE荧光素酶启动子-报告子试验，如在脑切片OGD试验中那样，使用由神经元和神经胶质细胞类型组成的皮质纹状体原代神经元共培养体系，确定这些组合物激活神经元中的Nrf2-ARE(抗氧化转录反应元件)基因途径的能力。我们发现(图2A-2D)PBI-04711经由介导细胞抗氧化防御途径的转录因子NRF2的激活增加典型的靶ARE基因(谷氨酸-半胱氨酸连接酶，催化亚基(Gclc)；NAD(P)H：醌氧化还原酶1(Nqo1)；硫氧还蛋白(Srx)；和血红素加氧酶1(Hmox1))的表达。然而，当将单独的三萜的该活性与PBI-04711的活性比较时(图3)，我们发现，与BA和OA相比，UA作为单一药剂在诱导ARE基因表达方面似乎显著地更有效，这意味着Srx和Hmox1的诱导更多是由于UA的活性而不是OA或BA的活性引起的，但是UA在神经保护OGD试验中仍然显示较低的活性。我们发现，虽然UA和BA在基因表达中最活跃，但是它们在仅比诱导基因表达所需的浓度高2-3倍的浓度下也是非常有毒的。我们先前的结果表明，UA和BA可能毒性太大，以致于无法达到在体内实现完全ARE诱导活性的剂量。我们先前的结果还表明OA相对没有活性，因此不可能的是三萜(在PBI-05204和PBI-04711中)在它们的摩尔比下的组合在细胞水平无毒的剂量下达到最佳的神经保护活性。
US 8481086、US 922078、US 9358293、和US 2016-0243143 A1公开了PBI-05204用于治疗神经系统病况的用途。US 9011937和US 2015-0283191 A1公开了PBI-04711用于治疗神经系统病况的用途。
现有技术中没有包含选自齐墩果酸、熊果酸和白桦脂酸的三种不同三萜的组合的神经保护性组合物的启示，也没有将该组合物用于治疗神经系统病况的用途，其中三萜以本文所定义的摩尔比存在。本领域没有人认识到与单独的三萜的施用或者三萜的其它组合的施用相比，通过三萜的此类组合的施用所提供的改进。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且描述一些现有技术和要求保护的发明的示例性实施方案。本领域技术人员根据这些附图和本文的描述，将能够在无需过度实验的情况下实践本发明。
图1(现有技术；Van Kanegan：同上)示出在脑切片氧糖剥夺(OGD)试验中PBI-05204(PBI)和PBI-04711(PBI-05204的级分0-4)的比较评价的结果。制备冠状脑切片外植体，并且进行5.5分钟的瞬时OGD。24小时后对各脑切片中健康的皮质锥体神经元的数量进行评分。图中的前3个条形图显示：未进行OGD的对照脑切片(“对照”)；进行OGD并且仅用DMSO载体处理的阴性对照脑切片(“OGD”)；以及进行OGD并且用23μg/ml的完整PBI-05204提取物处理的阳性对照脑切片(“PBI 23”)。在以μg/ml为单位表示的浓度下试验级分。级分0-4在试验浓度下提供显著的神经保护作用(10μg/ml以上的级分0-3的浓度显示毒性；数据未显示)。
图2A-2D(现有技术：Van Kanegan：同上)示出级分0-4(PBI-04711)的ARE基因表达试验的结果：a)Gclc表达(图2A)；b)Nqo1表达(图2B)；c)Srx表达(图2C)；和d)Hmox1表达(图2D)。将小鼠原代皮质纹状体共培养物用所示浓度的级分0-4处理6小时，然后收集并且处理，以用于所示ARE靶基因的qPCR分析。将定量RNA值相对于GAPDH参考对照进行标准化，并且相对于设定为值1的仅DMSO载体的条件(“0”)表示倍数表达变化。
图3(现有技术：Van Kanegan：同上)示出级分0-4与单独的三萜齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸和熊果醇(也称为uvalol)的ARE基因表达试验的结果。“X”符号表示诱导毒性并且残余mRNA的回收不足以支持qPCR分析的化合物浓度。将大鼠原代皮质纹状体共培养物用所示浓度的级分0-4(以μg/ml计)或者齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸或熊果醇(均以μM计)处理6h，然后收集并且处理，以用于所示ARE靶基因的qPCR分析。将定量RNA值相对于GAPDH参考对照进行标准化，并且相对于设定为值1的仅DMSO载体的条件(“--”)表示倍数表达变化。深色条形图表示通过p<0.05的学生t-检验相对于仅DMSO-载体对照的统计学显著差异。
图4示出在更紧密间隔的浓度范围内，级分0-4和单独的三萜熊果酸和白桦脂酸的表达试验的结果。将大鼠原代皮质纹状体共培养物用所示浓度的级分0-4(以μg/ml计)或者熊果酸和白桦脂酸(以μM计)处理6h，然后收集并且处理，以用于所示ARE靶基因的qPCR分析。将定量RNA值相对于GAPDH参考对照进行标准化，并且相对于设定为值1的仅DMSO载体的条件(“--”)表示倍数表达变化。深蓝色条形图表示通过p<0.05的学生t-检验相对于仅DMSO-载体对照的统计学显著差异。如同熊果酸，白桦脂酸也能诱导Srx和Hmox1的明显上调，尽管其在较高浓度下具有毒性。
图5(现有技术：Van Kanegan：同上)示出齐墩果酸(OA)、熊果酸(UA)、白桦脂酸(BA)和熊果醇(Uva)在神经保护OGD试验中的比较评价结果。示出脑切片OGD试验中UA、BA和Uva(均以μg/ml计)的浓度-响应关系。对于各化合物包括的2个独立实验的平均值，其中将OGD阴性对照条件设定为100％，并且为了便于比较，在同一轴上绘制数据。阳性对照为4μg/ml齐墩果酸(O)。注意，除了为了显示的目的，在0.039、0.39和3.88μg/ml下试验的熊果醇四舍五入为一个有效数字以外，这些是各化合物的等摩尔浓度，因为所有化合物的分子量相同。深色条形图表示以0.05的置信度通过ANOVA随后杜纳法事后比较检验(Dunnett's posthoc comparison test)相对于OGD阴性对照的统计学显著差异。
图6A、6B、7A、7B、8A和8B示出根据以下实例评价的三萜对含有神经胶质的原代皮质纹状体神经元共培养物的细胞毒性的比较结果：熊果酸(图6A、6B)，白桦脂酸(图7A、7B)和齐墩果酸(图8A、8B)。对于图6A、7A和8A，添加碘化丙啶一小时，然后在CellomicsArrayScan VTI上在自动高含量分析下对PI阳性细胞的数量进行评分。对于图6B、7B和8B，添加MTS底物两小时，然后使用多孔读板器测量共培养孔在450nm处的吸光度。
图9A-9C示出根据实施例3在针对缺血性中风的脑切片试验中确定的三萜混合物(组合物I：与在PBI-04711中一样，O:U:B的摩尔比为3:2.2:1(Fxn 0-4；图9A)；组合物II：与在PBI-05204中一样，O:U:B的摩尔比为7.8:7.4:1(图9B)；和组合物III：根据本发明的改进的组合物，O:U:B的摩尔比为约10:1:1(PBI-01011；图9C))的神经保护的比较结果。相对于仅暴露于氧糖剥夺(OGD)和载体(DMSO)的脑切片的设定为100％(各图中的第二条)的阴性对照条件，显示各脑切片的健康皮质锥体神经元的数量。在各图的第一条中显示未暴露于OGD的阳性对照脑切片的值。对于各三萜混合物显示经3-5个独立实验平均化的平均值+SEM；浅蓝色条形图表示在p<0.05下通过ANOVA随后杜纳法事后比较检验相对于OGD阴性对照的统计学显著差异。
图10A和10B示出PBI-05204、PBI-04711(也称为Fxn 0-4)、齐墩果酸(O)、熊果酸(U)、白桦脂酸(B)和以指定的摩尔比存在的三萜的组合的Srx(图10A)和Hmox1(图10B)表达试验的比较结果。将定量RNA值相对于GAPDH参考对照进行标准化，并且相对于设定为值1的仅DMSO载体的条件显示倍数表达变化。深蓝色条形图表示通过p<0.05的学生t-检验相对于仅DMSO-载体对照的统计学显著差异。条纹的红色条形图表示引起ARE基因表达的过量水平，即大于10倍的条件。
发明内容
本发明的目的是提供改进的神经保护性组合物，其包含多种三萜作为其活性成分，其中在等摩尔基础上与其它紧密相关的三萜系组合物相比，该组合物提供增加的ARE基因表达、增强的神经保护和降低的细胞毒性。本发明的另一目的是提供三萜系神经保护性组合物，其提供ARE基因的平衡表达，以在宽的剂量范围内提供神经保护，而不会导致过度的细胞毒性。本发明的另一目的是提供改进的神经保护性组合物，其在等摩尔基础上与其它紧密相关的三萜系组合物相比，提供更宽的剂量反应曲线和更广(broader)(更宽(wider))的治疗窗口。改进的神经保护性组合物在等摩尔基础上与其它紧密相关的三萜系组合物相比，提供更广的治疗窗口，意味着更宽的剂量范围以及更低的毒性，尤其是在剂量范围的上限的更低的毒性。
本发明提供治疗神经系统病况的改进的方法，该方法包括向有需要的受试者施用改进的神经保护性组合物，该组合物包含至少三种三萜(基本上由其组成)。已经发现三萜的摩尔比影响一种或多种神经保护性组合物的疗效和安全性。本发明的实施方案包括其中三萜的摩尔比如本文所述的那些。改进的神经保护性组合物中三萜的摩尔比与在PBI-05204和PBI-04711中发现的摩尔比不同并且有所改进。在一些实施方案中，神经保护性组合物包含三萜作为唯一的药理活性成分(药剂)。该神经保护性组合物可以不包括类固醇、强心苷、生物/药理活性多糖、和/或非强心苷类固醇。
一方面，本发明提供在有需要的受试者中用包含至少两种或至少三种三萜的神经保护性组合物治疗神经系统疾病或病症的方法，该方法包括：
确定受试者遭受神经系统疾病或病症；和
指示向受试者施用治疗有效量的神经保护性组合物。
一方面，本发明提供在有需要的受试者中用神经保护性组合物治疗神经系统疾病或病症的方法，该方法包括：
确定受试者遭受神经系统疾病或病症；和
指示向受试者施用治疗有效量的神经保护性组合物。
本发明还提供在有需要的受试者中用神经保护性组合物治疗神经系统疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的神经保护性组合物。
本发明的一些实施方案包括如下那些，其中：1)给受试者指定并且施用治疗相关剂量的神经保护性组合物；2)根据规定的给药方案对受试者施用神经保护性组合物；3)神经保护性组合物不包括强心苷；4)神经保护性组合物不包括治疗有效量的强心苷；5)神经保护性组合物不包括夹竹桃苷；6)神经保护性组合物不包括黄夹次甙乙(neriifolin)；7)神经保护性组合物不包括由夹竹桃属的种或黄花夹竹桃属(Thevetia)的种获得的药理活性多糖；或者8)以上的任意的组合。
本发明还提供在有需要的受试者中治疗神经系统病况的方法，其包括：
确定受试者的神经系统病况是否为阿尔茨海默病、亨廷顿病、中风、帕金森氏病或其它神经系统病况；
指示施用神经保护性组合物；
根据规定的初始给药方案，向受试者施用初始剂量的神经保护性组合物一段时间；
定期地确定受试者对使用神经保护性组合物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当性；并且
如果受试者的临床反应和/或治疗反应是适当的，则按需继续用神经保护性组合物治疗，直至达到期望的临床终点；或者
如果受试者的临床反应和/或治疗反应在初始剂量和初始给药方案下不适当，则递增或递减神经保护性组合物的剂量，直至达到受试者中期望的临床反应和/或治疗反应。
本发明还提供预防或减少处于神经系统病况风险的受试者群体中神经系统病况的发病率的方法，该方法包括：
向处于遭受例如阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、中风或其它神经系统病况等神经系统病况风险的受试者群体中的一个或多个受试者在延长的时期内以重复方式施用有效剂量的神经保护性组合物，从而预防或减少群体中神经系统病况的发生。
本发明还包括以下实施方案，其中：a)该方法进一步包括指示向一个或多个受试者施用神经保护性组合物；b)该方法进一步包括根据规定的给药方案向受试者施用有效剂量的神经保护性组合物一段时间；c)该方法进一步包括定期地确定一个或多个受试者对使用神经保护性组合物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当性；d)如果受试者的临床反应和/或治疗反应是适当的，则该方法进一步包括按需继续用神经保护性组合物治疗，直至达到期望的临床终点；e)如果受试者的临床反应和/或治疗反应在初始剂量和初始给药方案下不适当，则该方法进一步包括递增或递减神经保护性组合物的剂量，直至达到受试者中期望的临床反应和/或治疗反应；f)向群体中的多个受试者施用神经保护性组合物；g)重复方式是指每天、每隔一天、每隔二天、每隔三天、每隔四天、每隔五天、每隔六天、每周、每隔一周、每隔二周、每隔三周、每月、每两月、每半月、每隔一个月、每隔两个月、每季度、每隔一个季度、每三个月、每季节、每半年和/或每年；h)延长的时期是指一周以上、一个月以上、一个季度以上和/或一年以上；i)一天一次或多次施用有效剂量；j)该方法进一步包括识别处于遭受例如阿尔茨海默病、亨廷顿病、帕金森病、中风或其它神经系统病况等神经系统病况风险的受试者群体；k)处于风险的受试者群体的特征在于受试者的年事渐高、神经系统病况的家族史、发生神经系统病况的遗传易感性、受试者中ApoE4基因的存在和表达、女性(罹患阿尔茨海默病的女性是男性的两倍)、心血管疾病(例如高血压和高胆固醇水平)、糖尿病(尤其是该疾病的2型或成人发病形式)、唐氏综合征、头部受伤、低水平的正规教育、吸烟、过量饮酒和/或药物滥用；或l)其组合。
本发明还提供治疗受试者的中风的延时方法，其包括：
在受试者遭受中风后的延迟时间内，根据初始给药方案施用初始剂量的神经保护性组合物；
确定受试者对使用神经保护性组合物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当性；并且
如果受试者的临床反应和/或治疗反应是适当的，则按需继续用神经保护性组合物治疗，直至达到期望的临床终点；或者
如果受试者的临床反应和/或治疗反应在初始剂量和初始给药方案下不适当，则递增或递减神经保护性组合物的剂量，直至达到受试者中期望的临床反应和/或治疗反应。
本发明的一些实施方案包括如下，其中：1)延迟时间为10小时以下、8小时以下、6小时以下、4小时以下、3小时以下、2小时以下、1小时以下、45分钟以下、30分钟以下、20分钟以下或10分钟以下；2)通过评估以下中的任意者，来确定受试者的临床和/或治疗反应的适当性：身体一侧的脸部、手臂和/或腿部的虚弱，身体一侧的脸部、手臂和/或腿部的麻木，不能理解所说的语言，不能说话或说清楚，不能书写，眩晕和/或步态不平衡，复视和异常严重的头痛；或3)其组合。
本发明还提供神经保护性组合物在制造用于治疗受试者的神经系统病况的药物中的用途。在一些实施方案中，此类药物的制造包括：提供神经保护性组合物；包括一定剂量的神经保护性组合物的药物剂型；和将药物剂型包装。本发明还提供药物组合物，其包含用于治疗受试者的神经系统病况的神经保护性组合物。制造还可以包括一个或多个另外的步骤，例如：将包装的剂型运送给供应商(零售商、批发商和/或分销商)；向患有神经系统病况的受试者出售或以其它方式提供包装的剂型；包括与药物一起的标签和包装插页，其中提供对剂型的用途、给药方案、施用、含量和毒理学特征的说明。在一些实施方案中，神经系统病况的治疗包括：确定受试者患有神经系统疾病或病症；根据给药方案指示向受试者施用神经保护性组合物；向受试者施用一种或多种包含神经保护性组合物的药物剂型，其中根据给药方案施用一种或多种药物剂型。
在一些实施方案中，患有神经系统病况的受试者，即有需要的受试者，是此类受试者群体的一部分。本发明提供用于改善患有神经系统病况的受试者群体中统计学上显著数量的受试者的临床状况的方法，该方法包括：向受试者群体施用如本文所述的神经保护性组合物；并且确定受试者的临床状况。在一些实施方案中，统计学上显著的数量是群体的至少5％。
在一些实施方案中，神经系统病况是阿尔茨海默病、亨廷顿病、中风、帕金森病、Tau蛋白病变(tauopathy)或其它神经系统病况，例如本文所述。
按需继续用神经保护性组合物治疗受试者。可以按需调整剂量或给药方案，直至患者达到期望的临床终点，例如与疾病相关的特定神经系统症状的减少或减轻。可以由熟悉所治疗的神经系统病况的临床医生进行临床反应和/或治疗反应的适当性的确定。
在一些实施方案中，神经系统病况选自由神经系统疾病、神经系统病症、Tau蛋白病变和中风组成的组。在一些实施方案中，神经系统疾病是神经退行性疾病。在一些实施方案中，神经退行性疾病选自由亨廷顿病、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、牛海绵状脑病、多发性硬化、糖尿病性神经病、自闭症和青少年型神经元蜡样脂褐质沉积症组成的组。在一些实施方案中，中风是中风介导的缺血性损伤。在一些实施方案中，神经系统病况是Tau蛋白病变，其是具有与受试者中Tau3R/Tau4R比例不平衡相关的病因的神经退行性疾病。Tau蛋白病变是由于人脑中tau蛋白的病理性聚集而引起的一类神经退行性疾病。在一些实施方案中，Tau蛋白病变是唐氏综合征、皮克氏病(Pick’s disease)、皮质基底节变性、朊病毒病的一些变体、阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹或额颞叶痴呆。本发明的方法的各个步骤可以在分开的设施或者在同一设施内进行。
在一些实施方案中，本发明提供当施用于受试者时显示如本文所述的治疗活性的神经保护性组合物。在一些实施方案中，本发明的方法采用如本文所述的神经保护性组合物。
在一些实施方案中，本发明的神经保护性组合物包含至少两种三萜(基本上由其组成)。在一些实施方案中，本发明的神经保护性组合物包含至少三种三萜(基本上由其组成)。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含齐墩果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)和熊果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)以及任选地至少一种其它三萜(基本上由上述组成)，其中三萜的摩尔比如本文所述。例如，组合物可以进一步包含白桦脂酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)或者至少一种其它三萜。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含齐墩果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)和白桦脂酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)以及任选地至少一种其它三萜(基本上由上述组成)，其中三萜的摩尔比如本文所述。例如，组合物可以进一步包含熊果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)或者至少一种其它三萜。
本发明的一些实施方案提供至少包含齐墩果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)、白桦脂酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)和熊果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)(基本上由上述组成)的神经保护性组合物。
药物剂型包括神经保护性组合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，神经保护性组合物包含三萜齐墩果酸、熊果酸和白桦脂酸(基本上由上述组成)，其中三萜的摩尔比如本文所述。在一些实施方案中，药物组合物中包含神经保护性组合物，进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，神经保护性组合物中的大多数药理活性组分是齐墩果酸。齐墩果酸以相对于熊果酸和相对于白桦脂酸摩尔过量存在。齐墩果酸和熊果酸可以一起(总和)或单独地以相对于白桦脂酸摩尔过量存在。齐墩果酸和白桦脂酸可以一起(总和)或单独地以相对于熊果酸摩尔过量存在。
当齐墩果酸(或其盐、衍生物或前药)、熊果酸(或其盐、衍生物或前药)和白桦脂酸(或其盐、衍生物或前药)作为主要或仅有的三萜存在时，齐墩果酸(O):熊果酸(U):白桦脂酸(B)的摩尔比为约10:约1:约1、约9-11:约0.5-1.5:约0.5-1.5、约9.5-10.5:约0.75-1.25:约0.75-1.25、约9.5-10.5:约0.8-1.2:约0.8-1.2、约9.75-10.5:约0.9-1.1:约0.9-1.1、约9-12:约0.15-2.5:约0.15-2.5、约9-12:约0.2-2.5:约0.2-2.5、约9-12:约0.25-2.5:约0.25-2.5、约9-12:约0.35-2.5:约0.35-2.5、约9-12:约0.45-2.5:约0.45-2.5、约9-12:约0.5-5:约0.5-2.5、约9-12:约0.16-2:约0.16-2、约9-12:约0.2-2:约0.2-2、约9-12:约0.25-2:约0.25-2、约9-12:约0.25-2:约0.25-2、约9-12:约0.45-2:约0.45-2、约9-12:约0.5-2:约0.5-2、约9-12:约0.16-1.5:约0.16-1.5、约9-12:约0.2-1.5:约0.2-1.5、约9-12:约0.25-1.5:约0.25-1.5、约9-12:约0.7-1.5:约0.35-1.5、约9-12:约0.45-1.5:约0.45-1.5、约9-12:约0.5-1.5:约0.5-1.5、约9-12:约0.16-1:约0.16-1、约9-12:约0.2-1:约0.2-1、约9-12:约0.25-1:约0.25-1、约9-12:约0.35-1:约0.35-1、约9-12:约0.45-1:约0.45-1、约9-12:约0.5-1:约0.5-1、约10-1:约0.5-2.5:约0.5-2.5、约10-1:约0.1-1.5:约0.1-1.5、约9-12:约0.25-0.75:约0.25-0.75、约9.5-10.5:约0.35-0.7:约0.35-0.7、约9.5-10.5:约0.4-0.6:约0.4-0.6、或约9.75-10.5:约0.45-0.6:约0.45-0.6。
当齐墩果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)和熊果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)作为主要或仅有的三萜存在时，齐墩果酸:熊果酸的摩尔比为约9-12:约0.33-5、约9-12:约0.4-5、约9-12:约0.5-5、约9-12:约0.7-5、约9-12:约0.9-5、约9-12:约1-5、约9-12:约0.33-4、约9-12:约0.4-4、约9-12:约0.5-4、约9-12:约0.7-4、约9-12:约0.9-4、约9-12:约1-4、约9-12:约0.33-3、约9-12:约0.4-3、约9-12:约0.5-3、约9-12:约0.7-3、约9-12:约0.9-3、约9-12:约1-3、约9-12:约0.33-2、约9-12:约0.4-2、约9-12:约0.5-2、约9-12:约0.7-2、约9-12:约0.9-2、约9-12:约1-2、约10-1:约1-5、约10-1:约1-3、约9-12:约0.5-1.5、约9-11:约0.5-1.5、约9.5-10.5:约0.75-1.25、约9.5-10.5:约0.8-1.2、或约9.75-10.5:约0.9-1.1。
当齐墩果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)和白桦脂酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)作为主要或仅有的三萜存在时，齐墩果酸:白桦脂酸的摩尔比为约9-12:约0.33-5、约9-12:约0.4-5、约9-12:约0.5-5、约9-12:约0.7-5、约9-12:约0.9-5、约9-12:约1-5、约9-12:约0.33-4、约9-12:约0.4-4、约9-12:约0.5-4、约9-12:约0.7-4、约9-12:约0.9-4、约9-12:约1-4、约9-12:约0.33-3、约9-12:约0.4-3、约9-12:约0.5-3、约9-12:约0.7-3、约9-12:约0.9-3、约9-12:约1-3、约9-12:约0.33-2、约9-12:约0.4-2、约9-12:约0.5-2、约9-12:约0.7-2、约9-12:约0.9-2、约9-12:约1-2、约10-1:约1-5、约10-1:约1-3、约9-12:约0.5-1.5、约9-11:约0.5-1.5、约9.5-10.5:约0.75-1.25、约9.5-10.5:约0.8-1.2、或约9.75-10.5:约0.9-1.1。
本发明方法的各个步骤可以在分开的设施或在同一设施内进行。本文所述的本发明的任意方法可以与本文所述的本发明的任意组合物组合使用。
本发明包括本文公开的本发明的方面、实施方案和子实施方案的所有组合。
具体实施方式
如本文所使用的，单独命名的三萜可在每次出现时独立地选择其天然(未修饰、游离酸)形式、其盐形式、衍生物形式、前药形式、或其组合。含有氘化形式的三萜的组合物和采用氘化形式的三萜的方法也在本发明的范围内。
齐墩果酸衍生物、前药和盐在以下文献中公开：Gribble等人的US 20150011627A1(2015年1月8日公布)、Rong等人的US 20140343108 A1(2014年11月20日公布)、Xu等人的US 20140343064 A1(2014年11月20日公布)、Anderson等人的US 20140179928 A1(2014年6月26日公布)、Bender等人的US 20140100227 A1(2014年4月10日公布)、Jiang等人的US20140088188 A1(2014年3月27日公布)、Jiang等人的US 20140088163 A1(2014年3月27日公布)、Jiang等人的US 20140066408 A1(2014年3月6日公布)、Anderson等人的US20130317007 A1(2013年11月28日公布)、Gribble等人的US 20130303607 A1(2013年11月14日公布)、Anderson等人的US 20120245374(2012年9月27日公布)、Jiang等人的US20120238767 A1(2012年9月20日公布)、Shode等人的US 20120237629 A1(2012年9月20日公布)、Anderson等人的US 20120214814 A1(2012年8月23日公布)、Lee等人的US20120165279 A1(2012年6月28日公布)、Arntzen等人的US 20110294752 A1(2011年12月1日公布)、Majeed等人的US 20110091398 A1(2011年4月21日公布)、Arntzen等人的US20100189824 A1(2010年7月29日公布)、Jiang等人的US 20100048911 A1(2010年2月25日公布)、和Arntzen等人的US 20060073222 A1(2006年4月6日公布)，其全部公开内容通过引用结合在此。
熊果酸衍生物、前药和盐在以下文献中公开：Gribble等人的US 20150011627 A1(2015年1月8日公布)、Gribble等人的US 20130303607 A1(2013年11月14日公布)、Yoon等人的US 20150218206 A1(2015年8月6日公布)、Fritsche等人的US 6824811(2004年11月30日授权)、Ochiai等人的US 7718635(2010年5月8日授权)、Lin等人的US 8729055(2014年5月20日授权)、和Yoon等人的US 9120839(2015年9月1日授权)，其全部公开内容通过引用结合在此。
白桦脂酸衍生物、前药和盐在以下文献中公开：Gribble等人的US 20150011627A1(2015年1月8日公布)、Gribble等人的US 20130303607 A1(2013年11月14日公布)、Shode等人的US 20120237629 A1(2012年9月20日公布)、Regueiro-Ren等人的US 20170204133A1(2017年7月20日公布)、Nitz等人的US 20170096446 A1(2017年4月6日公布)、Parthasaradhi Reddy等人的US 20150337004 A1(2015年11月26日公布)、ParthasaradhiReddy等人的US 20150119373 A1(2015年4月30日公布)、Yan等人的US 20140296546 A1(2014年10月2日公布)、Swidorski等人的US 20140243298 A1(2014年8月28日公布)、Parthasaradhi Reddy等人的US 20140221328 A1(2014年8月7日公布)、Leunis等人的US20140066416 A1(2014年3月6日公布)、Durst等人的US 20130065868 A1(2013年3月14日公布)、Regueiro-Ren等人的US 20130029954 A1(2013年1月31日公布)、Zhang等人的US20120302530 A1(2012年11月29日公布)、Power等人的US 20120214775 A1(2012年8月23日公布)、Honda等人的US 20120101149 A1(2012年4月26日公布)、Bullock等人的US20110224182(2011年9月15日公布)、Hemp等人的US 20110313191 A1(2011年12月22日公布)、Pichette等人的US 20110224159 A1(2011年9月15日公布)、Parthasaradhi Reddy等人的US 20110218204(2011年9月8日公布)、Safe等人的US 20090203661A1(2009年8月13日公布)、Krasutsky等人的US 20090131714 A1(2009年5月21日公布)、Krasutsky等人的US20090076290(2009年3月19日公布)、Leunis等人的US 20090068257 A1(2009年3月12日公布)、Mukherjee等人的US 20080293682(2008年11月27日公布)、Pezzuto等人的US20070072835 A1(2007年3月29日公布)、Jansen等人的US 20060252733 A1(2006年11月9日公布)、和O’Neill等人的US 2006025274 A1(2006年11月9日公布)，其全部公开内容通过引用结合在此。
本发明提供通过向有需要的受试者施用有效剂量(治疗有效剂量)的神经保护性组合物来治疗神经系统病况的方法。根据最适合于受试者的给药方案、根据常规的临床实践和所治疗的神经系统病况的临床治疗终点在临床上确定剂量和给药方案的适宜性来施用神经保护性组合物。
在一些实施方案中，所治疗的神经退行性病症或神经系统病况具有与受试者中tau蛋白的过度表达和/或Tau3R/Tau4R比例不平衡相关的病因。此类病况称为Tau蛋白病变。示例性的Tau蛋白病变包括唐氏综合征、皮克氏病、朊病毒病的一些变体、阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹或额颞叶痴呆、皮质基底节变性、关岛帕金森病痴呆综合征、嗜银颗粒性痴呆、尼曼-匹克病C型、拳击员痴呆(dementia pugilistic)。
在一些实施方案中，所治疗的神经退行性病症或神经系统病况具有与如下相关的病因：淀粉样β前体蛋白的异常或非典型的蛋白水解、淀粉样β蛋白在神经元的突触中的累积、淀粉样纤维在神经元的突触中的形成或者淀粉样斑块在神经元的突触中的形成。此类病症或病况的实例是阿尔茨海默病。根据本发明治疗的受试者将显示治疗反应。“治疗反应”是指遭受疾病或病症的受试者由于使用神经保护性组合物治疗而将享有以下至少一项临床益处：疾病或病症的改善、减少与疾病或病症相关的症状的发生、疾病或病症的部分缓解、疾病或病症的完全缓解、或者进展时间的延长。换言之，治疗反应可以是全部或部分治疗反应。
治疗反应也可以描述为其中改善遭受神经退行性疾病的患者的生活质量的治疗反应。生活质量的改善可以例如，通过减少与疾病相关的症状(例如，震颤、不自主的肌肉运动、神经肌肉协调性丧失或部分丧失、记忆力保持等)的发生、频率或严重性而发生。
“防止在处于风险的受试者群体中神经系统病况的发生”是指在人口统计学上预定的处于罹患神经系统病况风险的受试者群体中，神经系统病况不会在预定的时间段期间发生。在预定时间段期间的预防是由于群体中的受试者施用了根据本发明的神经保护性组合物而发生的。作为一个实例，当向处于遭受中风风险的受试者群体中的受试者施用神经保护性组合物预定的时间段时，在预定的时间段期间在那些受试者中将不会发生中风。特别地，经一年的时间向处于遭受阿尔茨海默病或任意与Tau蛋白病变相关的疾病的风险的受试者群体长期施用神经保护性组合物，并且在该一年期间该群体中的受试者没有表现出与阿尔茨海默病相关的症状。
“减少处于风险的受试者群体中神经系统病况的发病率”在含义上与“防止发生”有关，除了“减少发病率”允许神经系统病况在人口统计学上预定的受试者群体中发生，但是与没有施用根据本发明的神经保护性组合物的、处于风险的其它人口统计学上相似的预定的受试者群体相比，其发生率或严重程度有所降低。
如本文所使用的，“进展时间”是在疾病被诊断(或治疗)之后直至疾病开始恶化的时间段、时间长度或持续时间。这是其中疾病的水平得以维持而无进一步的疾病进展的时间段，并且该时间段在疾病再次开始进展时结束。通过在治疗开始之前或开始时，将遭受神经系统病况的受试者“分阶段”来确定疾病的进展。例如，在治疗开始之前或开始时确定受试者的神经系统健康。然后用神经保护性组合物治疗受试者，并且定期地监测神经系统健康。在稍后的时间点，神经系统病况的症状可能恶化，由此标志着疾病的进展和“进展时间”的结束。期间疾病无进展或疾病的水平或严重程度没有恶化的时间段是“进展时间”。
给药方案包括根据给药计划施用的神经保护性组合物的治疗相关剂量(或治疗有效剂量)。因此，治疗相关剂量是其中观察到用神经保护性组合物治疗疾病或病症的治疗反应，并且可以向受试者施用神经保护性组合物而无过量的不期望或有害的副作用的治疗剂量。治疗相关剂量对于受试者是非致死的，尽管其在患者中可能导致一些副作用。其是其中施用神经保护性组合物的受试者的临床受益水平超过受试者由于施用神经保护性组合物而经历的有害副作用水平的剂量。根据各种确定的药理学、药效学和药代动力学原理，治疗相关剂量将因受试者而异。然而，治疗相关剂量通常为0.1至100μg范围内的固体、液体或半固体形式的神经保护性组合物。在本领域中已知根据药学的基本原理，在受试者中提供目标治疗结果所需的药理活性组分/药剂的实际量可因受试者而异。
可以根据通常用于治疗神经系统或神经退行性疾病或病症的任何给药方案来施用治疗相关(有效)剂量。治疗相关剂量可以每天施用一次、两次、三次或多次给药计划。其可以每隔一天、每隔三天、每隔四天、每隔五天、每半周、每周、每两周、每三周、每四周、每月、每两个月、每半月、每三个月、每四个月、每半年、每年施用，或根据上述的任意组合施用来达到合适的给药计划。例如，治疗相关剂量可以每天施用一次持续一周以上。
以下实施例包括神经保护性组合物在治疗例如神经系统疾病、神经系统病症和中风等神经系统病况中的疗效的证据。实施例7详述了用神经保护性组合物或者神经保护性组合物与一种或多种其它治疗剂的组合治疗阿尔茨海默病的方法。实施例8详述了用神经保护性组合物或神经保护性组合物与一种或多种其它治疗剂的组合治疗亨廷顿病的方法。实施例9详述了用神经保护性组合物或神经保护性组合物与一种或多种其它治疗剂的组合治疗中风介导的和非中风介导的缺血性脑损伤的方法。实施例10详述了用神经保护性组合物或者神经保护性组合物与一种或多种其它治疗剂的组合治疗帕金森病的方法。
通常，对具有神经系统病况的受试者如下进行治疗。对呈现神经系统病况的受试者进行评价，以确定该神经系统病况是否为阿尔茨海默病、亨廷顿病、中风、帕金森病或其它神经系统病况。如果受试者具有阳性诊断，则指示施用神经保护性组合物。根据规定的给药方案，向受试者施用初始剂量的组合物一段时间。定期地确定受试者的临床反应和治疗反应的水平。如果在一种剂量下的治疗反应的水平太低，则根据预定的剂量递增计划来递增剂量，直至达到受试者中期望的治疗反应水平。如果受试者表现出不期望的副作用或不可接受的副作用水平，则递减剂量直至达到受试者中治疗反应水平与副作用谱(sideeffect profile)的期望的平衡。按需继续用神经保护性组合物治疗受试者。可以按需调整剂量或给药方案，直至患者达到期望的一个或多个临床终点，例如疾病自身的终止、疾病相关症状的减轻、和/或疾病过程的进展的减少。
实施例3提供了用于评价神经保护性组合物用于治疗中风介导的缺血性神经元损伤的疗效的体外试验的详细描述。该试验是用于在24小时内诱导健康皮质神经元的≥50％丧失的氧糖剥夺(OGD)的基于脑切片的试验。样品载体用作阳性对照。
在OGD处理的脑切片(中风模型)和未经OGD处理的(即对照)脑切片(非中风模型)中试验各种组合物。获得组合物I(三萜摩尔比类似于PBI-04711)、组合物II(三萜摩尔比类似于PBI-05204)和组合物III(三萜摩尔比类似于PBI-01011)的数据(图9A-9C)。数据表明各组合物均提供神经保护，但是改进的神经保护性组合物(组合物III)在更宽的剂量范围(更宽的浓度范围)内提供神经保护。例如，组合物I在10μM下提供神经保护，但是在1μM以下的浓度下不提供神经保护。组合物II在1μM和10μM下提供神经保护，但是在0.1μM以下的浓度下不提供神经保护。另一方面，组合物III在0.1μM(100Nm)、1μM和10μM下提供神经保护。
因此，在总等摩尔基础上，改进的神经保护性组合物与其它三萜系组合物相比，提供更宽的剂量范围或更宽的剂量响应。改进的组合物允许施用更高剂量的三萜的组合，而基本上不增加由单独的三萜引起的不期望的不良事件(副作用)。在实践基础上，临床医生可以施用高剂量或低剂量的三萜混合物，并且仍然期望与三萜相关的不良事件的低发生率。
本发明提供保护神经元免受由缺氧或缺氧缺糖引起的活动性丧失的方法，该方法通过使缺氧和/或缺糖的神经元暴露于有效量的改进的三萜系神经保护性组合物，从而最小化活动性丧失、降低活动性丧失的速度、停止活动性丧失、减慢活动性丧失的发作、和/或保护由暴露于缺氧和/或缺糖的条件引起的神经元的功能。
我们确定是否组合物I和II的降低的神经保护活性是由一种或多种单独的三萜的细胞毒性引起的。我们使用两种独立的细胞死亡测量方法：用于核裂解的碘化丙啶(PI)染色和用于细胞代谢活性的MTS试验，对齐墩果酸(OA)、熊果酸(UA)和白桦脂酸(BA)的细胞毒性进行直接研究。PI进入具有受损膜的细胞并且染色DNA，从而在Cellomics ArrayscanVTI上使用基于图像的高含量试验检测死亡/即将死亡的细胞。MTS试验是一种良好基础的试验(well-based assay)，其中四唑鎓报告基因被线粒体酶裂解，产生比色读数，并且报告健康细胞的相对数量。数据(对于UA为图6A和6B，对于BA为图7A和7B；对于OA为图8A和8B)证实UA和BA可以是剂量依赖方式的高度毒性化合物，各自在5-15μM范围内导致代谢活性的50％丧失，而在试验的OA最高浓度75μM内未观察到OA的MTS活性的显著降低。
三萜的混合物的潜在累加和协同性能通过基因表达试验分析它们单独的性能和在不同混合物中的性能来确定。我们确定了各种组合物在各种不同的浓度(μM)下诱导Hmox1和Srxn的ARE基因表达的相对活性。使用更紧密间隔的浓度步长检验熊果酸和白桦脂酸对ARE基因的激活。白桦脂酸如同熊果酸，能够诱导Srx和Hmox1的明显上调，尽管其在较高浓度下具有毒性(图4)。数据(图10A和10B)表明OA作为单一药剂在任何试验浓度下均不能诱导明显的ARE基因表达。即使在低浓度下，UA和BA也会引起细胞毒性。OA+UA和OA+UA+BA的多种组合确实诱导显著程度的ARE基因表达，但在该条件试验的最高浓度下达到远>10倍的程度(Srxn1的条纹的红色条形图)。此类过度诱导与24小时治疗后的长期细胞毒性有关。这包括在9μM下作为单一药剂试验的UA。在试验的混合物中，仅10:1:1的OA:UA:BA诱导ARE基因的显著诱导，但是在所试验的整个浓度范围内达到<5-10倍的程度。因此，10:1:1的OA:UA:BA混合物满足提出的目标特征的两个标准，即：1)对于该比例，没有单一组分会因毒性而受到剂量限制；2)显著地诱导ARE靶基因，但是最高不超过5至10倍。在本文所述范围内的其它紧密相关的摩尔比也提供实质的神经保护，而没有过度的细胞毒性。在OGD、APP和tau脑切片神经保护试验中提供神经保护的相似浓度范围内，可以看到ARE荧光素酶报告基因的显著诱导。
本文的结果是令人惊讶和出乎意料的。因此，我们确定改进的组合物III和其它紧密相关的组合物(齐墩果酸的摩尔含量较高，并且熊果酸和白桦脂酸的摩尔含量显著较低的那些)同时在较高剂量下提供相对降低的细胞毒性，并且在非常低的浓度下提供相对提高的疗效。
在一些实施方案中，本发明的神经保护性组合物包含至少两种三萜(其游离酸、盐、衍生物或前药)。例如，本发明提供神经保护性组合物，其包含至少熊果酸和齐墩果酸的组合或者至少白桦脂酸和齐墩果酸的组合，其中齐墩果酸以分别相对于熊果酸和白桦脂酸显著摩尔过量存在。
在一些实施方案中，本发明的神经保护性组合物包含至少三种三萜(其游离酸、盐、衍生物或前药)。在一些实施方案中，本发明的神经保护性组合物包含齐墩果酸、熊果酸和至少一种其它三萜。例如，组合物可以进一步包含白桦脂酸或至少一种其它三萜。
神经保护性组合物不包括强心苷、药理活性多糖、和类固醇。例如，神经保护性组合物不包括从夹竹桃属植物获得的夹竹桃苷、黄夹次甙乙或药理活性多糖。
当齐墩果酸(O；其游离酸、盐、衍生物或前药)和熊果酸(U；其游离酸、盐、衍生物或前药)作为主要或仅有的三萜存在于组合物中时，O:U的摩尔比可以变化并且范围可以为约9-12:约0.33-5、约9-12:约0.4-5、约9-12:约0.5-5、约9-12:约0.7-5、约9-12:约0.9-5、约9-12:约1-5、约9-12:约0.33-4、约9-12:约0.4-4、约9-12:约0.5-4、约9-12:约0.7-4、约9-12:约0.9-4、约9-12:约1-4、约9-12:约0.33-3、约9-12:约0.4-3、约9-12:约0.5-3、约9-12:约0.7-3、约9-12:约0.9-3、约9-12:约1-3、约9-12:约0.33-2、约9-12:约0.4-2、约9-12:约0.5-2、约9-12:约0.7-2、约9-12:约0.9-2、约9-12:约1-2、约10-1:约1-5、约10-1:约1-3、约9-12:约0.5-1.5、约9-11:约0.5-1.5、约9.5-10.5:约0.75-1.25、约9.5-10.5:约0.8-1.2、或者约9.75-10.5:约0.9-1.1。
当齐墩果酸(O；其游离酸、盐、衍生物或前药)和白桦脂酸(B；其游离酸、盐、衍生物或前药)作为主要或仅有的三萜存在于组合物中时，O:B的摩尔比可以变化并且范围可以为约9-12:约0.33-5、约9-12:约0.4-5、约9-12:约0.5-5、约9-12:约0.7-5、约9-12:约0.9-5、约9-12:约1-5、约9-12:约0.33-4、约9-12:约0.4-4、约9-12:约0.5-4、约9-12:约0.7-4、约9-12:约0.9-4、约9-12:约1-4、约9-12:约0.33-3、约9-12:约0.4-3、约9-12:约0.5-3、约9-12:约0.7-3、约9-12:约0.9-3、约9-12:约1-3、约9-12:约0.33-2、约9-12:约0.4-2、约9-12:约0.5-2、约9-12:约0.7-2、约9-12:约0.9-2、约9-12:约1-2、约10-1:约1-5、约10-1:约1-3、约9-12:约0.5-1.5、约9-11:约0.5-1.5、约9.5-10.5:约0.75-1.25、约9.5-10.5:约0.8-1.2、或者约9.75-10.5:约0.9-1.1。
当齐墩果酸(O；其游离酸、盐、衍生物或前药)、熊果酸(U；其游离酸、盐、衍生物或前药)和白桦脂酸(B；其游离酸、盐、衍生物或前药)作为主要或仅有的三萜存在于组合物中时，齐墩果酸:熊果酸:白桦脂酸的摩尔比为约10:约1:约1、约9-11:约0.5-1.5:约0.5-1.5、约9.5-10.5:约0.75-1.25:约0.75-1.25、约9.5-10.5:约0.8-1.2:约0.8-1.2、约9.75-10.5:约0.9-1.1:约0.9-1.1、约9-12:约0.15-2.5:约0.15-2.5、约9-12:约0.2-2.5:约0.2-2.5、约9-12:约0.25-2.5:约0.25-2.5、约9-12:约0.35-2.5:约0.35-2.5、约9-12:约0.45-2.5:约0.45-2.5、约9-12:约0.5-5:约0.5-2.5、约9-12:约0.16-2:约0.16-2、约9-12:约0.2-2:约0.2-2、约9-12:约0.25-2:约0.25-2、约9-12:约0.25-2:约0.25-2、约9-12:约0.45-2:约0.45-2、约9-12:约0.5-2:约0.5-2、约9-12:约0.16-1.5:约0.16-1.5、约9-12:约0.2-1.5:约0.2-1.5、约9-12:约0.25-1.5:约0.25-1.5、约9-12:约0.7-1.5:约0.35-1.5、约9-12:约0.45-1.5:约0.45-1.5、约9-12:约0.5-1.5:约0.5-1.5、约9-12:约0.16-1:约0.16-1、约9-12:约0.2-1:约0.2-1、约9-12:约0.25-1:约0.25-1、约9-12:约0.35-1:约0.35-1、约9-12:约0.45-1:约0.45-1、约9-12:约0.5-1:约0.5-1、约10-1:约0.5-2.5:约0.5-2.5、约10-1:约0.1-1.5:约0.1-1.5、约9-12:约0.25-0.75:约0.25-0.75、约9.5-10.5:约0.35-0.7:约0.35-0.7、约9.5-10.5:约0.4-0.6:约0.4-0.6、或者约9.75-10.5:约0.45-0.6:约0.45-0.6。
实施例11提供用于评价用于治疗阿尔茨海默病的神经保护性组合物的疗效的体外试验的详细描述。该试验是基于脑切片的试验，用于APP/Aβ诱导的皮质锥体神经元的变性(APP：淀粉样前体蛋白)。经分泌酶裂解后，APP被还原成Aβ肽，其被认为是β-淀粉样斑块形成的原因。Aβ蛋白与β-淀粉样斑块形成有关，并且即使不是阿尔茨海默病的病因，也认为Aβ蛋白是标志。生物射弹转染用于引入例如YFP(标志物黄色荧光蛋白(yellowfluorescent protein))等重要标志物，并且将疾病基因构建体引入脑切片的相同神经元群体中。YFP与APP同种型共转染，导致脑切片制备和转染后经三至四天的过程皮质锥体神经元的逐渐变性。数据表明，神经保护性组合物为APP转染的脑切片提供浓度依赖性的神经保护。组合物III(O:U:B摩尔比为10:1:1，如在PBI-01011中一样)与组合物II(O:U:B摩尔比为7.8:7.4:1，如在PBI-05204中一样)和组合物I(O:U:B摩尔比为3:2.2:1，如在PBI-04711中一样)相比，提供更好的神经保护。该数据的重要意义在于文献中很少有化合物或治疗策略在代表阿尔茨海默病的该体外试验中显示对神经元的任何显著保护。
本发明的神经保护性组合物在两个另外的脑切片模型中也提供强的神经保护，其中皮质神经元变性由涉及CNS神经变性的基因，即淀粉样前体蛋白(APP)和tau的表达构建体的基因枪转染(biolistic transfection)驱动。在这些模型中，APP和tau转染经3-4天的过程诱导皮质神经元的进行性神经变性，这与在脑切片模型中经24小时发生的由OGD引起的神经元损伤和死亡相反。
数据表明神经保护性组合物在该试验中提供神经保护，即使它不包含任何强心苷。神经保护性组合物在APP和tau脑切片神经变性模型两者中提供明显的浓度依赖性神经保护。
除了使用Tau构建体以外，用类似于APP试验的基于tau4R脑切片的阿尔茨海默试验评价神经保护性组合物(实施例11)。确定健康的皮质神经元的数量。在该试验中的疗效定义为或者基于在不同量的神经保护性组合物的存在下，健康神经元相对于不健康神经元的相对总数和变性神经元的百分比。这些实验中的阴性对照由未暴露于OGD的脑切片组成，而暴露于OGD但是未用神经保护性组合物处理的脑切片用作内部阳性对照。神经保护性组合物在该试验中提供神经保护。
因此，本发明提供保护神经元免受由阿尔茨海默病引起的活动性丧失的方法，该方法包括：将表现出阿尔茨海默病的特征的神经元暴露于有效量的三萜系神经保护性组合物，从而最小化活动性的丧失、降低活动性丧失的速度、停止活动性的丧失、减慢活动性丧失的发作、和/或由阿尔茨海默病引起的神经元的关键功能。在一些实施方案中，该方法采用有效量的神经保护性组合物。
实施例6提供用于评价用于治疗亨廷顿病的神经保护性组合物的疗效的试验的详细描述。突变的htt蛋白经由电穿孔引入皮质神经元、纹状体神经元和神经胶质细胞的高密度混合共培养物中。纹状体和皮质神经元用不同颜色的荧光蛋白转染，从而有助于在共培养物中分别识别不同类型的神经元。有色荧光蛋白是发荧光的，并且在用适当波长的光源激活后“发出”颜色。数据表明该神经保护性组合物可以用于治疗亨廷顿病。
因此，本发明提供保护神经元免受由亨廷顿病引起的活动性丧失的方法，该方法包括：将表现出亨廷顿病的特征的神经元暴露于有效量的神经保护性组合物，从而最小化活动性的丧失、降低活动性丧失的速度、停止活动性的丧失、减慢活动性丧失的发作、和/或由亨廷顿病引起的神经元的正常功能。
实施例3、4和12详述了示例性脑切片试验，其可以用于在中风后的延迟时间结束后的受试者中评价神经保护性组合物在治疗中风时的疗效。如本文所述进行具有氧糖剥夺的脑切片试验；然而，不是用组合物预防性地处理脑切片，而是在0、1、2、4和6小时的延迟时间后用组合物处理它们。数据应当表明神经保护性组合物在中风后长达1小时、长达2小时、长达3小时、长达4小时、长达5小时、长达约6小时的延迟时间内有效地提供显著的神经保护。
因此，本发明提供在受试者遭受中风之后通过向受试者施用一定剂量的神经保护性组合物来治疗受试者的中风的延时方法。在受试者遭受中风后的可接受的延迟时间内，根据初始给药方案施用初始剂量的神经保护性组合物。确定受试者对使用神经保护性组合物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当性。如果受试者的临床反应和/或治疗反应是适当的，则按需继续用组合物治疗，直至达到期望的临床终点。可选地，如果受试者的临床反应和/或治疗反应在初始剂量和初始给药方案下不适当，则递增或递减剂量，直至达到受试者中期望的临床反应和/或治疗反应。可以与给药方案的改变，例如剂量频率或剂量施用的总时间的改变一起进行剂量递增或递减。
本文的一些脑切片试验是在其中在OGD之前用神经保护性组合物处理脑组织的条件下进行的。在那些条件下，数据建立了神经保护性组合物在针对由中风引起的损伤预防性地提供神经保护的效用。
发明人发现，本发明的神经保护性组合物使用一种或多种三萜提供通过抗氧化转录反应元件(ARE)介导的神经保护。一种或多种三萜还诱导核因子红系2相关因子2(Nrf2)依赖性抗氧化基因，以提供神经保护。当将神经保护性组合物施用于有需要的受试者时，组合物经由至少两种机制提供神经保护。当将神经保护性组合物施用于有需要的受试者时，组合物至少通过ARE上调来提供神经保护。
如果临床医生打算用三萜系神经保护性组合物和一种或多种其它治疗剂的组合来治疗患有神经系统病况的受试者，并且已知受试者患有的特定的神经系统病况至少部分地对用所述一种或多种其它治疗剂的治疗产生治疗反应，则本发明的方法包括：向有需要的受试者施用治疗相关剂量的三萜系神经保护性组合物和治疗相关剂量的所述一种或多种其它治疗剂，其中根据第一给药方案施用神经保护性组合物，并且根据第二给药方案施用一种或多种其它治疗剂。在一些实施方案中，第一和第二给药方案相同。在一些实施方案中，第一和第二给药方案不同。
如果所治疗的神经系统病况为阿尔茨海默病，则一种或多种其它治疗剂可以选自由BACE抑制剂或乙酰胆碱酯酶抑制剂组成的组。在一些实施方案中，一种或多种其它治疗剂可以选自由NamendaTM(盐酸美金刚)、AriceptTM(多奈哌齐)、RazadyneTM(加兰他敏)、ExelonTM(利凡斯的明)和CognexTM(他克林)组成的组。
如果所治疗的神经系统病况是亨廷顿病，则一种或多种其它治疗剂可以选自由天然产物、抗惊厥药、NMDA(n-甲基d-天冬氨酸)受体拮抗剂和钠通道阻滞剂组成的组。示例性药剂包括维生素E、巴氯芬(CoQ10的衍生物)、拉莫三嗪(抗惊厥药)、瑞马西胺(麻醉药，它是低亲和力的NMDA拮抗剂)和利鲁唑(钠通道阻滞剂)。这些药剂中的每一种单独使用时的疗效被认为是低的(Mestre T.等人，Chochrane Database Systematic Reviews July 8,2009；8(3):CD006455)；然而，期望向接收一种或多种这些其它药剂的受试者施用含有神经保护性组合物的剂型，与施用不含神经保护性组合物的这些药剂相比，将为患有神经系统病症的受试者提供改善的临床效果。
如果所治疗的神经系统病况是中风介导的缺血性脑损伤(缺血性中风)，则除了神经保护性组合物以外，还可以采用在文献(Gutierrez M.等人“Cerebral protection,brain repair,plasticity and cell therapy in ischemic stroke”Cerebrovasc.Dis.2009；27Suppl 1:177-186)中公开的治疗方法，例如静脉内溶栓治疗。在一些实施方案中，一种或多种其它治疗剂可以选自由例如阿替普酶(溶栓剂)等药物组成的组。
如果所治疗的神经系统病况是帕金森病，则一种或多种其它治疗剂包括卡比多巴和左旋多巴的组合、雷沙吉兰、普拉克索、罗平尼洛、金刚烷胺、美金刚、恩他卡朋、罗替高汀、苯甲托品、司来吉兰、比哌立登、卡比多巴和左旋多巴和恩他卡朋的组合、苯海索、利凡斯的明、阿扑吗啡、左旋多巴、卡比多巴、溴隐亭、颠茄、托卡朋，或者其组合。
一种或多种其它治疗剂可以选自由以下组成的组：BACE(β-分泌酶1；β-位淀粉样前体蛋白裂解酶1、β-位APP裂解酶1、膜相关天冬氨酸蛋白酶2、memapsin-2、天冬氨酰蛋白酶2和ASP2)抑制剂，AZD3293，乙酰胆碱酯酶抑制剂，NamendaTM(盐酸美金刚)，AriceptTM(多奈哌齐)，RazadyneTM(加兰他敏)，ExelonTM(利凡斯的明)，CognexTM(他克林)，抗惊厥药，NMDA(n-甲基d-天冬氨酸)受体拮抗剂，钠通道阻滞剂，维生素E，巴氯芬(CoQ10的衍生物)，拉莫三嗪(抗惊厥药)，瑞马西胺(麻醉药，它是低亲和力的NMDA拮抗剂)，利鲁唑(钠通道阻滞剂)，阿替普酶(溶栓剂)，左旋多巴，卡比多巴，金刚烷胺，COMT(儿茶酚O-甲基转移酶)抑制剂，托卡朋，恩他卡朋，奥比卡朋，多巴胺激动剂，溴隐亭，培高利特，普拉克索，罗匹尼罗，吡贝地尔，卡麦角林，阿扑吗啡，利舒利特，MAO-B(单胺氧化酶-B)抑制剂(选择性和非选择性MAO-B抑制剂)，抗胆碱剂，胆碱酯酶抑制剂，异卡波肼，烟肼酰胺，苯乙肼，肼卡巴嗪，雷沙吉兰，司来吉兰，利奈唑胺，或其组合。
可以根据临床医生认为治疗有效的剂量和给药方案，或者以临床医生认为亚治疗有效的剂量施用一种或多种其它治疗剂。通过施用神经保护性组合物和一种或多种其它治疗剂的组合所提供的临床益处和/或治疗效果可以是累加的或协同的，通过将施用组合与施用单独的神经保护性组合物和一种或多种其它治疗剂比较来确定此类益处或效果的水平。一种或多种其它治疗剂可以按照以下组织建议或描述的剂量和给药方案施用：美国食品药品管理局(U.S.F.D.A.)、世界卫生组织(W.H.O)、欧洲药品管理局(E.M.E.A.)、药品管理局(TGA，澳大利亚)、泛美卫生组织(PAHO)、药品和医疗器械安全局(Medsafe，新西兰)或者世界各地的卫生部。
本发明的神经保护性组合物可以通过将其各个组分混合成混合物来制备(实施例1-2)。例如，根据本文所述的摩尔比，可以通过将至少齐墩果酸和熊果酸、以及任选的白桦脂酸混合来制备神经保护性组合物。
我们已经确定三萜在本文所述的神经保护OGD试验中表现出不同的活性水平。因此，各个三萜对包含它们的神经保护性组合物的疗效和细胞毒性的贡献的水平。我们发现必须适当地平衡三萜系神经保护性组合物中三萜的摩尔比，以在维持降低的细胞毒性水平的同时，提供最大水平的神经保护疗效。
在神经保护OGD试验中UA的较低活性是令人惊讶的。从表达试验获得的数据表明，级分0-4诱导Nrf2、Srx和Hmox1的显著表达，以及Gclc和Nqo1的较低表达；然而，数据还表明，Srx和Hmox1的诱导更多是由于UA的活性而不是OA或BA的活性。包含多种三萜的组合物的疗效(特别是宽的剂量反应曲线和低浓度下的高水平的疗效)显然是由于各种不同的机制协同作用以提供神经保护。
我们发现，可以通过采用具有适当摩尔比的O:U或O:U:B或O:B的组合物，来提高由本发明的组合物提供的神经保护水平。制备包含以下摩尔比的一种或多种三萜的溶液(实施例1-2)，并且如本文所述对神经保护活性和ARE基因诱导活性进行评价。
在一些实施方案中，改进的神经保护性组合物至少包含以如本文所述的OA与UA的摩尔比存在的齐墩果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)和熊果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)。OA以相对于UA大的摩尔过量存在。
在一些实施方案中，改进的神经保护性组合物至少包含以如本文所述的OA与BA的摩尔比存在的齐墩果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)和白桦脂酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)。OA以相对于BA大的摩尔过量存在。
在一些实施方案中，改进的神经保护性组合物至少包含以如本文所述的OA与UA与BA的摩尔比存在的齐墩果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)、熊果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)和白桦脂酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)。OA以相对于UA和BA两者大的摩尔过量存在。
改进的神经保护性组合物分别与单独的三萜相比，提供更宽的剂量反应曲线，并且当在总等摩尔基础上比较时，尤其是当在剂量范围的较高端比较时，提供降低的细胞毒性。
神经保护性组合物可以配制成任意适当的药学上可接受的剂型。肠胃外、耳、眼、鼻、可吸入的、颊部、舌下、肠内、局部的、口服(oral)、经口(peroral)、以及可注射剂型为特别有用的。特定剂型包括固体或液体剂型。示例性合适的剂型包括片剂、胶囊剂、渗透装置、丸剂、囊片、锭剂、冲剂、溶液剂、悬浮剂、分散剂、小瓶、袋装、瓶装、可注射液体，i.v.(静脉内)、i.m.(肌肉内)或i.p.(腹腔内)可施用液体和药学领域普通技术人员已知的其它此类剂型。
可以通过将神经保护性组合物和药学上可接受的赋形剂相混合来制备含有神经保护性组合物的合适的剂型，如本文或以下文献中所述：Pi等人(“Ursolic acidnanocrystals for dissolution rate and bioavailability enhancement:influenceof different particle size”，Curr.Drug Deliv.(Mar 2016),13(8),1358-1366)，Yang等人(“Self-microemulsifying drug delivery system for improved oralbioavailability of oleanolic acid:design and evaluation”，Int.J.Nanomed.(2013),8(1),2917-2926)，Li等人(Development and evaluation of optimized sucroseester stabilized oleanolic acid nanosuspensions prepared by wet ball millingwith design of experiments”，Biol.Pharm.Bull.(2014),37(6),926-937)，Zhang等人(“Enhancement of oral bioavailability of triterpene through lipidnanospheres:preparation,characterization,and absorption evaluation”，J.Pharm.Sci.(June 2014),103(6),1711-1719)，Godugu等人(“Approaches to improvethe oral bioavailability and effects of novel anticancer drugs berberine andbetulinic acid”，PLoS One(Mar 2014),9(3):e89919)，Zhao等人(“Preparation andcharacterization of betulin nanoparticles for oral hypoglycemic drug byantisolvent precipitation”，Drug Deliv.(Sep 2014),21(6),467-479)，Yang等人(“Physicochemical properties and oral bioavailability of ursolic acidnanoparticles using supercritical anti-solvent(SAS)process”，Food Chem.(May2012),132(1),319-325)，Cao等人(“Ethylene glycol-linked amino acid diesterprodrugs of oleanolic acid for PEPT1-mediated transport:synthesis,intestinalpermeability and pharmacokinetics”，Mol.Pharm.(Aug.2012),9(8),2127-2135)，Li等人(“Formulation,biological and pharmacokinetic studies of sucrose ester-stabilized nanosuspensions of oleanolic acid”，Pharm.Res.(Aug 2011),28(8),2020-2033)，Tong等人(“Spray freeze drying with polyvinylpyrrolidone and sodiumcaprate for improved dissolution and oral bioavailablity of oleanolic acid,aBCS Class IV compound”，Int.J.Pharm.(Feb 2011),404(1-2),148-158)，Xi等人(Formulation development and bioavailability evaluation of a self-nanoemulsified drug delivery system of oleanolic acid”，AAPS PharmSciTech(2009),10(1),172-182)，Chen等人(“Oleanolic acid nanosuspensions:preparation,in-vitro characterization and enhanced hepatoprotective effect”，J.Pharm.Pharmacol.(Feb 2005),57(2),259-264)，其全部公开内容通过引用结合在此。
还可以根据Addington的US 8187644B2(2012年5月29日授权)、Addington的US7402325 B2(2008年7月22日授权)、Addington等人的US 8394434 B2(2013年3月12日授权)来制备合适的剂型，其全部内容通过引用结合在此。还可以如实施例13-15中所述来制备合适的剂型。
口服施用的期望剂量为至多5种剂型，尽管最少1种和最多10种剂型可以作为单一剂量施用。示例性剂型可以包括0.01-5mg或0.01-10mg的神经保护性组合物/剂型，总计0.1至500mg(1至10剂量水平)/剂量。将根据可预先确定的和/或定制的给药方案来施用剂量，以在受试者中实现特定治疗反应或临床益处。
剂型的一些实施方案为没有肠溶衣的并且在0.5至1小时或更短的时间内释放其携带的神经保护性组合物。剂型的一些实施方案为有肠溶衣的并且在胃的下游释放其携带的神经保护性组合物，例如从空肠、回肠、小肠、和/或大肠(结肠)。有肠溶衣的剂型将在口服给药后1-10小时内将神经保护性组合物释放至体循环。
神经保护性组合物可以包含在快速释放、立即释放、受控释放、缓释、延长释放、延迟释放、突释、连续释放、缓慢释放、或脉冲释放剂型中，或者在显示两种以上的那些释放类型的剂型中。来自剂型的三萜的释放曲线可以为零级、伪零级、一级、伪一级或S型释放曲线。其中施用神经保护性组合物的受试者中的三萜的血浆浓度曲线可以显示一个或多个极大值(maxima)。
引入本发明的剂量中的神经保护性组合物的量将处于至少一种或多种剂型中，并且可以根据药学的已知原理来进行选择。特别考虑治疗化合物的有效量或治疗相关量。通过术语“有效量”，应当理解，关于例如药物，考虑药学有效量。药学有效量是当向患者施用时足以用于所需或期望的治疗反应的有效成分的量(amount或quantity)，或者换言之，足以产生可觉察的生物反应的量。可觉察的生物反应可以由于活性物质的单一或多个剂量的施用而产生。剂量可以包括一种或多种剂型。应理解的是，任何患者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括治疗的适应症、适应症的严重程度、患者健康、年龄、性别、体重、饮食、药理反应、采用的特定剂型、和其它此类因素。
由于存在的三萜和它们存在时的摩尔比的改进的组合，可以以低至高的剂量施用神经保护性组合物。用于人类的治疗有效剂量为约100-1000mg的神经保护性组合物/kg体重。可以在24小时内施用此剂量高达10次。
应注意的是，本文中的化合物在本发明的制剂中可以具有一种或多种功能。例如，化合物可以用作表面活性剂和水混溶性溶剂，或者用作表面活性剂和水不混溶性溶剂两者。
液体组合物可以包括一种或多种药学上可接受的液体载体。液体载体可为水性、非水性、极性、非极性、和/或有机载体。液体载体包括，例如但不限于，水混溶性溶剂、水不混溶性溶剂、水、缓冲液、及其混合物。
如本文所使用的，可交换使用的术语“水溶性溶剂”或“水混溶性溶剂”是指与水不形成两相混合物的有机液体，或者充分溶于水中以提供含有至少5％的溶剂且无液相分离的水性溶剂混合物的有机液体。溶剂适用于施用给人类或动物。示例性水溶性溶剂包括，例如但不限于，PEG(聚(乙二醇))、PEG400(聚(乙二醇)具有约400的分子量)、乙醇、丙酮、烷醇、醇、醚、丙二醇、甘油、三乙酸甘油酯、聚(丙二醇)、PVP(聚(乙烯基吡咯烷酮))、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、吡啶、丙醇、N-甲基乙酰胺、丁醇、soluphor(2-吡咯烷酮)、pharmasolve(N-甲基-2-吡咯烷酮)。
如本文所使用的，可交换使用的术语“水不溶性溶剂”或“水不混溶性溶剂”是指其与水形成两相混合物的有机液体，或者当水中的溶剂的浓度超过5％时形成相分离的有机液体。溶剂适用于施用给人类或者动物。示例性水不溶性溶剂包括，例如但不限于，中/长链甘油三酯、油、蓖麻油、玉米油、维生素E、维生素E衍生物、油酸、脂肪酸、橄榄油、softisan645(二甘油辛酸酯/癸酸酯/硬脂酸酯/羟基硬脂酸酯己二酸酯)、miglyol、captex(Captex350：甘油三辛酸酯/癸酸酯/月桂酸甘油三酯；Captex 355：甘油三辛酸酯/癸酸甘油三酯；Captex 355EP/NF：甘油三辛酸酯/癸酸中链甘油三酯)。
在“International Conference on Harmonisation of TechnicalRequirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use(ICH)guidancefor industry Q3C Impurities:Residual Solvents”(1997)中列出合适的溶剂，这对于在药物中多少量的残留溶剂被视为安全的提出了建议。将示例性溶剂列为2类或3类溶剂。3类溶剂包括，例如，乙酸、丙酮、苯甲醚、1-丁醇、2-丁醇、乙酸丁酯、叔丁基甲基醚、异丙苯、乙醇、乙醚、乙酸乙酯、甲酸乙酯、甲酸、庚烷、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、甲基-1-丁醇、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、2-甲基-1-丙醇、戊烷、1-戊醇、1-丙醇、2-丙醇、或乙酸丙酯。
可在本发明中用作水不混溶性溶剂的其它材料包括：Captex 100：丙二醇二癸酸酯；Captex 200：丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯；Captex 200P：丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯；丙二醇二辛酸癸酸酯(Propylene Glycol Dicaprylocaprate)；Captex 300：甘油三辛酸酯/癸酸酯；Captex 300EP/NF：甘油三辛酸酯/癸酸中链甘油三酯；Captex 350：甘油三辛酸酯/癸酸酯/月桂酸酯；Captex 355：甘油三辛酸酯/癸酸酯；Captex 355EP/NF：甘油三辛酸酯/癸酸中链甘油三酯；Captex 500：三乙酸甘油酯；Captex 500P：三乙酸甘油酯(医药级)；Captex 800：丙二醇二(2-乙基己酸酯)；Captex 810D：甘油三辛酸酯/癸酸酯/亚油酸酯；Captex 1000：甘油三癸酸酯；Captex CA：中链甘油三酯；Captex MCT-170：中链甘油三酯；Capmul GMO：甘油单油酸酯；Capmul GMO-50EP/NF：甘油单油酸酯；Capmul MCM：中链甘油一酯&中链甘油二酯(Medium Chain Mono-&Diglycerides)；Capmul MCM C8：甘油单辛酸酯；Capmul MCM C10：甘油单癸酸酯；Capmul PG-8：丙二醇单辛酸酯；Capmul PG-12：丙二醇单月桂酸酯；Caprol 10G10O：十油酸十甘油酯；Caprol 3GO：三聚甘油单油酸酯；Caprol ET：混合的脂肪酸的聚甘油酯；Caprol MPGO：六聚甘油二油酸酯；Caprol PGE 860：十聚甘油单、二油酸酯(Decaglycerol Mono-,Dioleate)。
如本文所使用的，“表面活性剂”是指含有极性或带电的亲水性部分以及非极性疏水性(亲脂性)部分的化合物；即，表面活性剂是两亲性的。术语表面活性剂可指一种化合物或多种化合物的混合物。表面活性剂可以是增溶剂、乳化剂、或分散剂。表面活性剂可为亲水性的或疏水性的。
亲水性表面活性剂可以是任何适用于药物组合物的亲水性表面活性剂。此类表面活性剂可以是阴离子型、阳离子型、两性离子型或非离子型，尽管目前优选非离子型亲水性表面活性剂。如上所述，这些非离子型亲水性表面活性剂通常将具有大于约10的HLB值。亲水性表面活性剂的混合物也在本发明的范围内。
类似地，疏水性表面活性剂可以是任何适用于药物组合物的疏水性表面活性剂。通常，合适的疏水性表面活性剂将具有小于约10的HLB值。疏水性表面活性剂的混合物也在本发明的范围内。
其它合适的增溶剂的实例包括：醇类和多元醇类，例如乙醇、异丙醇、丁醇、苯甲醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇及其异构体、甘油、季戊四醇、山梨醇、甘露醇、卡必醇(transcutol)、异山梨醇二甲醚、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素及其它纤维素衍生物、环糊精及环糊精衍生物；平均分子量为约200至约6000的聚乙二醇的醚类，例如四氢糠醇PEG醚(三缩四乙二醇，可商购自BASF，商品名为Tetraglycol)或甲氧基PEG(Union Carbide)；酰胺类，例如2-吡咯烷酮、2-哌啶酮、己内酰胺、N-烷基吡咯烷酮、N-羟基烷基吡咯烷酮、N-烷基哌啶酮、N-烷基己内酰胺、二甲基乙酰胺、和聚乙烯吡咯烷酮；酯类，例如丙酸乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、乙酰柠檬酸三丁酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、三乙酸甘油酯、丙二醇单乙酸酯、丙二醇二乙酸酯、己内酯及其异构体、戊内酯及其异构体、丁内酯及其异构体；以及其它本领域已知的增溶剂，例如二甲基乙酰胺、异山梨醇二甲醚(Arlasolve DMI(ICI))、N-甲基吡咯烷酮(Pharmasolve(ISP))、单辛酸甘油酯(monooctanoin)、二甘醇单乙醚(可购自Gattefosse，商品名Transcutol)、和水。增溶剂的混合物也在本发明的范围内。
除非另外指出，本文提及的化合物可容易地从标准商业来源获得。
澄清的液体组合物对于肉眼是清晰可见的，基于组合物的总重量，其将包含小于5重量％、小于3重量％或小于1重量％的悬浮固体。
尽管不是必需的，本发明的组合物或试剂盒可以包括螯合剂、防腐剂、抗氧化剂、吸附剂、酸化剂、碱化剂、消泡剂、缓冲剂、着色剂、电解质、盐、稳定剂、张力调节剂(tonicity modifier)、稀释剂、其它药物赋形剂、或其组合。
如本文所用，术语“抗氧化剂”旨在表示抑制氧化并因此用于防止由于氧化过程而导致的制剂的劣化的试剂。此类化合物包括例如但不限于，抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、维生素E、维生素E衍生物、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、次磷酸、硫代甘油、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠(sodium metalbisulfite)和本领域普通技术人员已知的其它此类材料。
如本文所用，术语螯合剂旨在表示螯合溶液中的金属离子的化合物。示例性螯合剂包括EDTA(乙二胺四乙酸四钠)、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸五钠)、HEDTA(N-(羟基乙基)-乙二胺三乙酸三钠盐)、NTA(次氮基三乙酸三钠)、乙醇二甘氨酸二钠(Na2EDG)、二乙醇甘氨酸钠(DEGNa)、柠檬酸和本领域普通技术人员已知的其它化合物。
如本文所用，术语“吸附剂”旨在表示能够通过物理或化学(化学吸附)手段将其它分子保持在其表面上的试剂。此类化合物包括例如但不限于，粉末状和活化的炭以及本领域普通技术人员已知的其它材料。
如本文所用，术语“碱化剂”旨在表示用于提供碱性介质的化合物。此类化合物包括例如但不限于，氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、单乙醇胺、氢氧化钾、硼酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、三羟乙基胺(triethanolamine)和三乙醇胺(trolamine)以及本领域普通技术人员已知的其它物质。
如本文所用，术语“酸化剂”旨在表示用于提供酸性介质的化合物。此类化合物包括例如但不限于，乙酸、氨基酸、柠檬酸、富马酸和其它α-羟基酸、盐酸、抗坏血酸、和硝酸以及本领域普通技术人员已知的其它化合物。
如本文所用，术语“消泡剂”旨在表示防止或减少在填充组合物的表面上形成的泡沫量的一种或多种化合物。合适的消泡剂包括例如但不限于，二甲聚硅氧烷、SIMETHICONE、辛基酚聚醚和本领域普通技术人员已知的其它消泡剂。
如本文所用，术语“缓冲剂”旨在表示用于在稀释或者添加酸或碱时抵抗pH变化的化合物。此类化合物包括，例如但不限于，偏磷酸钾、磷酸钾、一元乙酸钠、和无水和脱水柠檬酸钠、以及本领域普通技术人员已知的其它此类材料。
如本文所用，术语“稀释剂”或“填料”是指用作填料以在片剂和胶囊剂的制备中产生期望的体积、流动性和压缩特性的惰性物质。此类化合物包括例如但不限于，磷酸氢钙、高岭土、乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素、粉状纤维素、沉淀碳酸钙、山梨糖醇和淀粉以及本领域普通技术人员已知的其它材料。
如本文所用，术语“防腐剂”旨在表示用于防止微生物的生长的化合物。此类化合物包括例如但不限于，苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、乙酸苯汞、硫柳汞、间甲酚、肉豆蔻基γ-甲基吡啶鎓氯化物、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠、山梨酸、百里酚和对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、或对羟基苯甲酸丁酯以及本领域普通技术人员已知的其它物质。
如本文所用，术语“着色剂”旨在表示用于赋予药物制剂以颜色的化合物。此类化合物包括例如但不限于，FD&C Red No.3，FD&C Red No.20，FD&C Yellow No.6，FD&C BlueNo.2，FD&C Green No.5，FD&C Orange No.5，FD&C Red No.8，焦糖、和铁氧化物(黑色、红色、黄色)，其它FD&C染料和天然着色剂，例如葡萄皮提取物、甜菜红粉、β-胡萝卜素、胭脂树橙色素(annatto)、胭脂红、姜黄、辣椒粉、其组合以及本领域普通技术人员已知的其它此类材料。
如本文所用，术语“稳定剂”旨在表示用于稳定活性剂，来抵抗将以其它方式降低药剂的治疗活性的物理、化学或生化过程的化合物。合适的稳定剂包括，例如但不限于，白蛋白、唾液酸、肌酸酐、甘氨酸和其它氨基酸、烟酰胺、乙酰色氨酸钠、氧化锌、蔗糖、葡萄糖、乳糖、山梨糖醇、甘露醇、甘油、聚乙二醇、辛酸钠和糖精钠以及本领域普通技术人员已知的其它物质。
如本文所用，术语“张力调节剂”旨在表示可用于调节液体制剂的张力的一种或多种化合物。合适的张力调节剂包括甘油、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化钠、硫酸钠、山梨糖醇、海藻糖和本领域普通技术人员已知的其它物质。
本发明的组合物还可以包括油类，例如固定油、花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油；脂肪酸类，例如油酸、硬脂酸和异硬脂酸；以及脂肪酸酯类，例如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、脂肪酸甘油酯和乙酰化脂肪酸甘油酯。组合物还可以包括醇类，例如乙醇、异丙醇、十六烷醇、甘油和丙二醇；甘油缩酮类，例如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇；醚类，例如聚(乙二醇)450；石油烃类，例如矿物油和凡士林；水；药学上适合的表面活性剂、悬浮剂或乳化剂；或者其组合。
应理解的是，用于药物制剂领域的化合物通常具有多种功能或用途。因此，如果本文所述的化合物仅被提及一次或者被用于定义大于一个的本文的术语，其用途或功能不应为解释为仅限于所述的用途(一个或多个)或功能(一种或多种)。
制剂的一种或多种组分可以其游离碱、或者药学上或分析上可接受的盐形式存在。如本文所使用的，“药学上或分析上可接受的盐”是指已经按需通过将其与酸或碱反应来形成离子键对来改性的化合物。可接受的盐的实例包括例如由无毒无机或有机酸形成的常规无毒盐。适合的无毒盐类包括源自例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磺酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等无机酸的那些盐，和本领域普通技术人员已知的其它盐。由有机酸制备的盐，和本领域普通技术人员已知的其它盐，所述有机酸为例如氨基酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、帕莫酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲基磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸。其它合适的盐的列表见于Remington′s Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,PA,1985，第1418页，相关公开内容通过引用结合在此。
本文采用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而无过多的毒性、刺激、过敏反应、或者任何其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。
可以通过制药工厂中公知的任意常规手段来制造剂型。可以通过在容器中提供至少一种液体载体和神经保护性组合物来制备液体剂型。一种或多种其它赋形剂可包含在液体剂型中。可以通过提供至少一种固体载体和神经保护性组合物来制备固体剂型。一种或多种其它赋形剂可包含在固体剂型中。
可以使用常规包装设备和材料来包装剂型。其可包含在包装、瓶、小瓶、袋、注射器、包膜(envelope)、小包(packet)、泡罩包装、盒、安瓿瓶、或其它此类容器中。
本发明包括用于改善患有神经系统病况的受试者群体中统计学上显著数量的受试者的临床状况的方法，该方法包括：向受试者群体施用神经保护性组合物；并且确定受试者的临床状况以建立改善的临床状况。在一些实施方案中，统计学上显著的数量为群体的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些实施方案中，神经保护性组合物包含一种或多种其它药理活性化合物。
如本文所用，“衍生物”是：a)在结构上与第一化学物质有关并且理论上可从其衍生的化学物质；b)如果第一化合物的一个原子被其它原子或原子团代替，则由相似的第一化合物或者可以想象由其它第一化合物产生的化合物而形成的化合物；c)源自或获自母体化合物并且包含母体化合物的基本元素的化合物；d)可以在一个或多个步骤中由相似结构的第一化合物生产的化合物。例如，衍生物可以包括其氘代形式、氧化形式、脱水形式、不饱和形式、聚合物缀合形式或糖基化形式，或者可以包括其酯、酰胺、内酯、同系物、醚、硫醚、氰基、氨基、烷基氨基、巯基、杂环、杂环稠合、聚合、聚乙二醇化、亚苄基、三唑基、哌嗪基或氘代形式。
鉴于以上描述和以下实施例，本领域普通技术人员将能够实践所要求保护的本发明而无需过度实验。参考以下详述用于制备本发明的实施方案的某些过程的实施例将更好地理解前述内容。对于这些实施例做出的所有参考都是为了说明的目的。以下实施例不应被认为是详尽的，仅说明了本发明所预期的许多实施方案的少数。
三萜可以购自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)。
实施例1
三萜混合物的制备
通过将指定的三萜以所示的近似摩尔比混合来制备以下组合物。
Figure BDA0002423859780000401
对于各组合物，制备三种不同的各自的溶液，由此各溶液中的三萜的总浓度为约9μM、18μM、或36μM。
Figure BDA0002423859780000402
Figure BDA0002423859780000411
实施例2
神经保护性组合物的制备
可以通过将其单独的三萜组分混合以形成混合物来制备神经保护性组合物。将提供神经保护的上述制备的三萜混合物配制成神经保护性组合物。具有齐墩果酸和熊果酸的神经保护性组合物
根据本文所定义的组分的预定摩尔比，混合已知量的齐墩果酸和熊果酸。将组分以固体形式混合，或者在一种或多种以下溶剂中混合：例如甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丙醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水、或其混合物。所得混合物含有如本文所述的相对摩尔比的组分。
对于药学上可接受的神经保护性组合物，将至少一种药学上可接受的赋形剂与药理活性剂混合。配制神经保护性组合物以用于施用于哺乳动物。具有齐墩果酸和白桦脂酸的神经保护性组合物
根据本文所定义的组分的预定摩尔比，混合已知量的齐墩果酸和白桦脂酸。将组分以固体形式混合，或者在一种或多种以下溶剂中混合：例如甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丙醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水、或其混合物。所得混合物含有如本文所述的相对摩尔比的组分。
对于药学上可接受的神经保护性组合物，将至少一种药学上可接受的赋形剂与药理活性剂混合。配制神经保护性组合物以用于施用于哺乳动物。具有齐墩果酸、熊果酸和白桦脂酸的神经保护性组合物
根据本文所定义的组分的预定摩尔比，混合已知量的齐墩果酸、熊果酸和白桦脂酸。将组分以固体形式混合，或者在一种或多种以下溶剂中混合：例如甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丙醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水、或其混合物。所得混合物含有如本文所述的相对摩尔比的组分。
对于药学上可接受的神经保护性组合物，将至少一种药学上可接受的赋形剂与药理活性剂混合。配制神经保护性组合物以用于施用于哺乳动物。
实施例3
基于脑切片的OGD试验中的组合物的评价
从出生后10天的任意性别的Sprague-Dawley幼鼠(Charles River)制备冠状脑切片(250μm厚)，并且在器官型培养中建立。根据NIH指南并且在Duke IACUC的批准和监督下处死动物。简而言之，将脑组织切片在冰冷的人工脑脊液(ACSF)中切割，并且以界面配置(interface configuration)铺在放置在0.5％试剂级琼脂糖中的培养基(补充有15％热灭活的马血清、10mM KCl、10mM HEPES、100U/ml青霉素/链霉素、1mM丙酮酸钠和1mM L-谷氨酰胺的Neurobasal A培养基)的上部。为了模拟缺血性损伤，通过将脑切片暴露于无葡萄糖、含低O2(<0.5％)的N2鼓泡ACSF中5.5分钟，来使其进行氧糖剥夺(OGD)。
一小时后，用编码黄色荧光蛋白(YFP)的DNA将对照和OGD处理的脑切片进行基因枪转染。对于模拟AD或FTD中的神经变性的试验，将脑切片分别与YFP以及WT淀粉样前体蛋白(APP)的表达构建体一起共转染，或者与YFP以及在内部编码的人Tau4R0N(与NCBI参考序列NM_016834相同)中构建的cDNA一起共转染。然后将脑切片外植体在5％CO2下在37℃温育24h以用于OGD试验；或者对于APP和tau4R0N诱导的神经变性试验温育3天。在脑切片移植时，将指定浓度的组合物添加至培养基中。
对于所有脑切片试验，在Leica MZIIIFL荧光立体显微镜上对各脑切片的皮质区域中的健康锥体神经元的数量进行成像。皮质锥体神经元通过其在皮质板中的特征性位置和取向，以及通过它们沿径向朝向软脑膜表面的单个顶树突的显著延伸来容易地识别。健康的皮层锥体神经元被认为是如下那些：1)呈现出位于皮质的锥体神经元层内的粗壮且明亮标记的细胞体；2)保持沿径向朝向切片的软脑膜表面延伸的清晰的顶树突；3)直接从神经元胞体表达>2个长度>2个细胞体直径的清晰的基底树突；和4)在胞体和遍及所有神经元突起中显示具有YFP视觉标记物的清晰且连续的细胞质标记。在每个条件N＝12个脑切片的情况下，以0.05的置信水平使用ANOVA随后杜纳法事后比较检验确定相对于阴性对照条件(仅用DMSO载体处理的OGD、APP转染的、或tau4R转染的)的统计学显著差异。各实验进行至少两次。
实施例4
用于神经保护的确定的延时脑切片试验
除了进行以下改变以外，根据实施例3进行该试验。在OGD和引入被评价的组合物之间允许指定长度的时间。如果相对于OGD处理的时间延迟处理，则确定组合物向脑切片提供神经保护的能力。
实施例5
用于Nrf2激活和ARE基因表达的组合物的评价
Nrf2激活
由任意性别的E18 Sprague-Dawley大鼠或C57Bl/6小鼠胚胎制备原代皮质纹状体神经元共培养物。对于萤光素酶报告基因试验，使用Cignal Antioxidant ResponseReporter试剂盒(Qiagen)。使用Amaxa电穿孔装置(Lonza)将40:1荧光素酶:Renilla质粒的5xARE荧光素酶报告基因混合物分别转染至皮质和纹状体神经元中。电穿孔后，将神经元合并并且立即铺板至包含成熟神经胶质细胞培养物的96孔板中。培养96小时后，在使用Dual-Glo荧光素酶试验系统方案和试剂(Promega)收集之前，以指定的浓度添加组合物持续7或24小时。使用SpectraMax L酶标仪(Molecular Devices)检测双波长发光。将萤光素酶值相对于内部Renilla对照进行标准化，并且计算相对于仅DMSO处理的对照的倍数表达。使用4-6个生物学重复实验进行至少3次独立实验。
ARE基因表达
对于ARE靶基因表达水平的qPCR定量，将皮质和纹状体神经元铺板在含有成熟神经胶质细胞培养物的96孔板上，并且培养96小时。将组合物以指定的浓度添加至培养物中持续6小时。在处理期结束时，裂解细胞，并且使用Absolutely RNA mini-prep试剂盒(Agilent Technologies/Stratagene)分离总RNA。使用寡聚dT引物和Superscript II逆转录酶(Invitrogen)生成cDNA。使用SYBR Green Real-Time PCR Master Mix(LifeTechnologies)和以下小鼠引物，将所得cDNA用于基因转录产物的定量PCR：Gclc(正向-5’TGGCCACTATCTGCCCAATT-3’和反向-5’-GTCTGACACGTAGCCTCGGTAA-3’)、Nqo1(正向-5’-GCCCGCATGCAGATCCT-3’和反向5’-GGTCTCCTCCCAGACGGTTT3’)、Srx(正向-5’-GCTTCCTCTCGGGAGTCCTT-3’和反向-5’-CAGCAACAGCGACTACGAAGTAA-3’)、以及Hmox1(正向-5’-CCTCACTGGCAGGAAATCATC-3’和反向-5’-CCTCGTGGAGACGCTTTACATA-3’)(IntegratedDNA Technologies)。对于大鼠皮质纹状体共培养样品，使用的qPCR引物如前所述(vanRoon-Mom，W.M.等人，Mutant huntingtin activates Nrf2-responsive genes andimpairs dopamine synthesis in a PC12 model of Huntington's disease.BMCMolecular Biology(2008),9,1-13,doi:10.1186/1471-2199-9-84)。在ViiA 7实时PCR仪(Applied Biosystems)上一式三份地测量各生物样品；在标准化至相应的对照GAPDH水平后，计算倍数表达。
实施例6
在用于亨廷顿病的体外皮质纹状体共培养试验中的组合物的评价
在该试验中，不是使用完整的脑切片，而是通过电穿孔将突变型htt引入排列在96孔板中的皮质神经元、纹状体神经元和神经胶质细胞的高密度、混合共培养物中。该试验平台的目标是将概括疾病相关的神经元群体在体内的互连性的关键方面的复杂的原代培养系统的生物学/临床相关性，与进行大规模全自动筛查活动的能力组合。在该试验中，经体外1-2周的过程，转染的突变型htt构建体诱导了纹状体和皮质神经元两者的进行性变性，随后使用Cellomics Arrayscan VTI平台上的自动图像采集和对象检测算法进行定量。各数据点从6个孔中提取，其中使用与Cure Huntington's Disease Initiative联合开展的大规模筛选活动期间制定的方案，在Cellomics Arrayscan上对各孔中的16张图像自动捕获、处理和分析。总体而言，在每个周期(每周4个周期)收集并分析大约25,000张图像。
皮质纹状体共培养试验平台。
在神经元铺板之前制备纯的神经胶质细胞培养物以建立具有融合的神经胶质细胞床的96孔板。然后分别分离皮质和纹状体组织，并且用适当的DNA构建体“核转染”，随后通过例如YFP、CFP和mCherry等不同的荧光蛋白的表达来区分。然后将这些分别转染的皮质和纹状体神经元充分混合，并且铺板至含有之前铺板的神经胶质细胞单层的96孔板上。组合物在该皮质-纹状体共培养平台上试验。
实施例7
包括但不限于阿尔茨海默病的神经系统病况的治疗
方法A.神经保护性组合物疗法
对呈现阿尔茨海默病的受试者指定神经保护性组合物，并且根据指定的给药方案向受试者施用治疗相关剂量一段时间。定期确定受试者的治疗反应水平。如果一个剂量下的治疗反应水平过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至达到受试者中期望的治疗反应水平。按需继续用神经保护性组合物治疗受试者，并且可以按需调整剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点。
方法B.组合疗法：神经保护性组合物与其它治疗剂
除了对受试者指定并且施用神经保护性组合物与一种或多种其它治疗剂的组合来治疗阿尔茨海默病或其症状以外，遵循以上方法A。然后可以在神经保护性组合物之前、之后或与之一起施用一种或多种其它治疗剂。也可以进行一种或多种其它治疗剂的剂量递增(或递减)。合适的一种或多种其它治疗剂包括NamendaTM(美金刚HCl)、AriceptTM(多奈哌齐)、RazadyneTM(加兰他敏)、ExelonTM(利凡斯的明)、CognexTM(他克林)、和金刚烷胺。
实施例8
包括但不限于亨廷顿病的神经系统病况的治疗
方法A.神经保护性组合物疗法
对呈现亨廷顿病的受试者指定神经保护性组合物，并且根据指定的给药方案向受试者施用治疗相关剂量一段时间。定期确定受试者的治疗反应水平。如果一个剂量下的治疗反应水平过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至达到受试者中期望的治疗反应水平。按需继续用神经保护性组合物治疗受试者，并且可以按需调整剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点。施用的剂量可以类似于本文所述的剂量。
方法B.组合疗法：神经保护性组合物与其它治疗剂
除了对受试者指定并且施用神经保护性组合物与一种或多种其它治疗剂的组合来治疗亨廷顿病或其症状以外，遵循以上方法A。然后可以在神经保护性组合物之前、之后或与之一起施用一种或多种其它治疗剂。也可以进行一种或多种其它治疗剂的剂量递增(或递减)。合适的一种或多种其它治疗剂包括维生素E、巴氯芬(CoQ10的衍生物)、拉莫三嗪(抗惊厥药)、瑞马西胺(麻醉药，它是低亲和力的NMDA拮抗剂)和利鲁唑(Na通道阻滞剂)。
实施例9
包括但不限于缺血性中风的神经系统病况的治疗
方法A.神经保护性组合物疗法
对呈现缺血性中风的受试者指定神经保护性组合物，并且根据指定的给药方案向受试者施用治疗相关剂量一段时间。定期确定受试者的治疗反应水平。如果一个剂量下的治疗反应水平过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至达到受试者中期望的治疗反应水平。按需继续用神经保护性组合物治疗受试者，并且可以按需调整剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点。施用的剂量可以类似于本文所述的剂量。
方法B.组合疗法：神经保护性组合物与其它治疗剂
除了对受试者指定并且施用神经保护性组合物与一种或多种其它治疗剂的组合来治疗缺血性中风或其症状以外，遵循以上方法A。然后可以在神经保护性组合物之前、之后或与之一起施用一种或多种其它治疗剂。也可以进行一种或多种其它治疗剂的剂量递增(或递减)。
实施例10
包括但不限于帕金森病的神经系统病况的治疗
方法A.神经保护性组合物疗法
对呈现帕金森病的受试者指定神经保护性组合物，并且根据指定的给药方案向受试者施用治疗相关剂量一段时间。定期确定受试者的治疗反应水平。如果一个剂量下的治疗反应水平过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至达到受试者中期望的治疗反应水平。按需继续用神经保护性组合物治疗受试者，并且可以按需调整剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点。施用的剂量可以类似于本文所述的剂量。
方法B.组合疗法：神经保护性组合物与其它治疗剂
除了对受试者指定并且施用神经保护性组合物与一种或多种其它治疗剂的组合来治疗帕金森病或其症状以外，遵循以上方法A。然后可以在神经保护性组合物之前、之后或与之一起施用一种或多种其它治疗剂。也可以进行一种或多种其它治疗剂的剂量递增(或递减)。合适的一种或多种其它治疗剂包括卡比多巴和左旋多巴的组合、雷沙吉兰、普拉克索、罗平尼洛、金刚烷胺、美金刚、恩他卡朋、罗替高汀、苯甲托品、司来吉兰、比哌立登，卡比多巴和左旋多巴和恩他卡朋的组合、苯海索、利凡斯的明、阿扑吗啡、左旋多巴、卡比多巴、溴隐亭、颠茄、托卡朋，或者其组合。
实施例11
在用于阿尔茨海默病的体外试验中的神经保护性组合物的评价
(tau4R和APP)
在APP/Aβ诱导的皮质锥体神经元变性的大鼠脑切片模型中，基因枪转染不仅用于引入例如YFP等重要标志物，而且还将疾病基因构建体引入脑切片中的相同神经元群体。因此，APP/Aβ脑切片模型将YFP与APP同种型共转染，导致在脑切片制备和转染后经3-4天的过程的皮质锥体神经元的进行性变性。数据表明神经保护性组合物将为APP转染的脑切片提供浓度依赖性的神经保护。
实施例12
在用于中风和未中风的体外试验中的神经保护性组合物的评价
方法A.中风：皮质脑切片和OGD的制备。
从PND 7Sprague-Dawley幼鼠制备新皮质脑切片。将大脑皮层解剖，切成400μ厚的切片，并且在铺板前转移至含有具有1μM MK-801的冷人工脑脊液的容器中；MK-801未包含在任意后续过程中。为了使用短暂性氧糖剥夺(OGD)模拟缺血性损伤，在低O2(0.5％)环境下将来自每个大脑的一个半球的切片暴露于无葡萄糖、N2鼓泡的人工脑脊液7.5分钟。然后将OGD切片与除了没有OGD以外相同地制备的、来自对侧半球的对照切片并排铺板在硝酸纤维素膜或Millicell(Millipore)渗透膜上。铺板30分钟后，将脑切片对转染，转移至24孔板中，并且在5％的CO2和37℃的潮湿室内培养。在各实验中，使用5-6分钟的氧糖剥夺(OGD)来诱导24小时内健康皮质神经元的>50％丧失。设定浓度的对照材料用作内部阳性对照。评价各种浓度的组合物。
方法B.未中风：脑切片试验。
在“未中风”的脑切片中试验组合物；即，切片并且用YFP转染但未经由OGD遭受其它创伤的脑切片试验。参见以上概述的实验过程。
实施例13
含有神经保护性组合物的剂型的制备
方法A.基于Cremophor的药物递送系统
以指定的量提供以下成分。
Figure BDA0002423859780000481
Figure BDA0002423859780000491
将赋形剂分配至广口瓶中并且在60℃下在New Brunswick Scientific C24KC冷冻培养箱摇床(Refrigerated Incubator shaker)中摇动24小时来确保均匀。然后拉出样品并目视检查是否溶解。
方法B.基于GMO/Cremophor的药物递送系统
以指定的量提供以下成分。
Figure BDA0002423859780000492
遵循方法A的步骤。
方法C.基于Labrasol的药物递送系统
以指定的量提供以下成分。
试剂名 功能 制剂的百分比(％w/w)
PBI-01011 活性剂 3.7
维生素E 抗氧化剂 0.1
Labrasol 表面活性剂 86.6
乙醇 共溶剂 9.6
遵循方法A的步骤。
方法D.基于维生素E-TPGS的胶束形成系统
以指定的量提供以下成分。
Figure BDA0002423859780000501
遵循方法A的步骤。
方法E.多组分药物递送系统
以指定的量提供以下成分。
组分 重量(g) 重量％(w/w)
维生素E 10.0 1.0
Cremophor ELP 580.4 55.9
Labrasol 89.0 8.6
甘油单油酸酯 241.0 23.2
乙醇 80.0 7.7
PBI-01011 38.5 3.7
总计 1038.9 100
遵循方法A的步骤。
实施例14
肠溶衣胶囊的制备
步骤I：充液胶囊的制备
用实施例13的液体组合物填充硬明胶胶囊(50只，00尺寸)。将这些胶囊用800mg的制剂填充，然后用50％乙醇/50％水溶液手工密封。然后用含有指定量的以下成分的22％明胶溶液手工环封(band)胶囊。
Figure BDA0002423859780000502
使明胶溶液充分混合并且使其溶胀1-2小时。溶胀期后，将溶液盖紧并且置于55℃烘箱中并且使其液化。一旦全部明胶溶液变为液体，则进行环封。使用尖圆头3/0绘画画笔(artist brush)将明胶溶液涂在胶囊上。使用由Shionogi提供的环封工具。环封后，将胶囊在环境条件下保持12小时以使环封固化。
步骤II：充液胶囊的包衣
由下表中列出的成分制备包衣分散液。
成分 重量％ 固体％ 固体(g) g/批
Eudragit L30D55 40.4 60.5 76.5 254.9
TEC 1.8 9.0 11.4 11.4
AlTalc 500V 6.1 30.5 38.5 38.5
水 51.7 不适用 不适用 326.2
总计 100.0 100.0 126.4 631.0
如果使用根据步骤I的环封的胶囊，将分散液以20.0mg/cm2的涂覆水平施涂于胶囊。以下条件用于包衣胶囊。
Figure BDA0002423859780000511
*设置喷雾喷嘴使得喷嘴和喷雾路径两者在进气流路的下方。
实施例15
含有神经保护性组合物的片剂的制备
3％Syloid 244FP和97％微晶纤维素(MCC)的初始制片混合物混合。然后，经由湿法造粒将根据实施例13 1s制备的组合物的现有批次混入Syloid/MCC混合物中。该混合物在下表中标记为"初始制片混合物)。颗粒外添加另外的MCC来增加压缩性。向初始制片混合物的该添加标记为"颗粒外添加"。来自颗粒外添加的所得混合物与"最终制片混合物"为相同的组合物。
组分 重量(g) 重量％(w/w)
初始制片混合物
微晶纤维素 48.5 74.2
组分 重量(g) 重量％(w/w)
胶态二氧化硅/Syloid 244FP 1.5 2.3
来自实施例13的制剂 15.351 23.5
总计 65.351 100.0
颗粒外添加
组分 重量(g) 重量％(w/w)
初始制片混合物 2.5 50.0
微晶纤维素 2.5 50.0
总计 5 100.0
Figure BDA0002423859780000521
最终制片混合物：
缩略的
组分 重量(g) 重量％(w/w)
微晶纤维素 4.36 87.11
胶态二氧化硅/Syloid 244FP 0.06 1.15
来自实施例13的制剂 0.59 11.75
总计 5.00 100
最终制片混合物：
详细的
组分 重量(g) 重量％(w/w)
微晶纤维素 4.36 87.11
胶态二氧化硅/Syloid 244FP 0.06 1.15
维生素E 0.01 0.11
Cremophor ELP 0.33 6.56
Labrasol 0.05 1.01
甘油单油酸酯 0.14 2.72
乙醇 0.05 0.90
PBI-01011 0.02 0.44
总计 5.00 100.00
Syloid 244FP是由Grace Davison制造的胶态二氧化硅。胶态二氧化硅通常用于提供各种功能，例如吸附剂、助流剂、和片剂崩解剂。选择Syloid 244FP因其在油中吸收3倍其重量的能力并且因其5.5微米的粒径。
如本文所使用并且除非另有说明，否则术语“约(about)”或“近似(approximately)”是指特定值的±10％、±5％、±2.5％或±1％。如本文所使用并且除非另有说明，否则术语“基本上”是指“在很大程度上”、“至少大部分”、大于70％、大于85％、大于90％、大于95％、大于98％或大于99％。
当在本文中指定范围时，该范围包括其中的所有数值。
以上是本发明的特定实施方案的详细描述。应理解的是，尽管出于说明的目的，本文已描述了本发明的特定实施方案，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种修改。因此，除所附权利要求以外，本发明不受限制。根据本公开内容，可在不过度实验的情况下，制造并且实施本文公开的和要求保护的所有实施方案。

Claims (23)

1.一种神经保护性组合物，其包含如下作为主要药理活性组分：
为齐墩果酸的第一三萜；和
选自由a)熊果酸；和b)白桦脂酸组成的组中的至少一种第二三萜；
其中第一三萜:至少一种第二三萜的摩尔比为约9-12:约0.33-5；和
所述第一三萜和所述至少一种第二三萜在每次出现时独立地选自其游离酸、盐、衍生物或前药。
2.根据权利要求1所述的神经保护性组合物，其中第一三萜:至少一种第二三萜的摩尔比为9-12:约0.33-5、约9-12:约0.4-5、约9-12:约0.5-5、约9-12:约0.7-5、约9-12:约0.9-5、约9-12:约1-5、约9-12:约0.33-4、约9-12:约0.4-4、约9-12:约0.5-4、约9-12:约0.7-4、约9-12:约0.9-4、约9-12:约1-4、约9-12:约0.33-3、约9-12:约0.4-3、约9-12:约0.5-3、约9-12:约0.7-3、约9-12:约0.9-3、约9-12:约1-3、约9-12:约0.33-2、约9-12:约0.4-2、约9-12:约0.5-2、约9-12:约0.7-2、约9-12:约0.9-2、约9-12:约1-2、约10-1:约1-5、约10-1:约1-3、约9-12:约0.5-1.5、约9-11:约0.5-1.5、约9.5-10.5:约0.75-1.25、约9.5-10.5:约0.8-1.2、或约9.75-10.5:约0.9-1.1。
3.根据权利要求1或2所述的神经保护性组合物，其中
所述第一三萜为齐墩果酸或其盐；和
至少一种第二三萜选自由：a)熊果酸或其盐；和b)白桦脂酸或其盐组成的组。
4.根据权利要求1所述的神经保护性组合物，其包含如下作为主要药理活性组分：
齐墩果酸，或其盐、衍生物或前药(OA)；
熊果酸，或其盐、衍生物或前药(UA)；和
白桦脂酸，或其盐、衍生物或前药(BA)；
其中OA:UA:BA的摩尔比为约9-12:约0.2-2.5:约0.2-25。
5.根据权利要求4所述的神经保护性组合物，其中OA:UA:BA的所述摩尔比为约10:约1:约1、约9-11:约0.5-1.5:约0.5-1.5、约9.5-10.5:约0.75-1.25:约0.75-1.25、约9.5-10.5:约0.8-1.2:约0.8-1.2、约9.75-10.5:约0.9-1.1:约0.9-1.1、约9-12:约0.15-2.5:约0.15-2.5、约9-12:约0.2-2.5:约0.2-2.5、约9-12:约0.25-2.5:约0.25-2.5、约9-12:约0.35-2.5:约0.35-2.5、约9-12:约0.45-2.5:约0.45-2.5、约9-12:约0.5-5:约0.5-2.5、约9-12:约0.16-2:约0.16-2、约9-12:约0.2-2:约0.2-2、约9-12:约0.25-2:约0.25-2、约9-12:约0.25-2:约0.25-2、约9-12:约0.45-2:约0.45-2、约9-12:约0.5-2:约0.5-2、约9-12:约0.16-1.5:约0.16-1.5、约9-12:约0.2-1.5:约0.2-1.5、约9-12:约0.25-1.5:约0.25-1.5、约9-12:约0.7-1.5:约0.35-1.5、约9-12:约0.45-1.5:约0.45-1.5、约9-12:约0.5-1.5:约0.5-1.5、约9-12:约0.16-1:约0.16-1、约9-12:约0.2-1:约0.2-1、约9-12:约0.25-1:约0.25-1、约9-12:约0.35-1:约0.35-1、约9-12:约0.45-1:约0.45-1、约9-12:约0.5-1:约0.5-1、约10-1:约0.5-2.5:约0.5-2.5、约10-1:约0.1-1.5:约0.1-1.5、约9-12:约0.25-0.75:约0.25-0.75、约9.5-10.5:约0.35-0.7:约0.35-0.7、约9.5-10.5:约0.4-0.6:约0.4-0.6、或约9.75-10.5:约0.45-0.6:约0.45-0.6。
6.根据权利要求4或5所述的神经保护性组合物，其包含如下作为主要药理活性组分：
齐墩果酸或其盐；
熊果酸或其盐；和
白桦脂酸或其盐。
7.根据前述权利要求中任一项所述的神经保护性组合物，其中所述神经保护性组合物不包括强心苷、类固醇、和药理活性多糖。
8.根据前述权利要求中任一项所述的神经保护性组合物，其进一步包含一种或多种其它治疗有效的药剂。
9.根据权利要求8所述的神经保护性组合物，其中所述一种或多种其它治疗有效的药剂选自由以下组成的组：BACE(β-分泌酶1；β-位淀粉样前体蛋白裂解酶1、β-位APP裂解酶1、膜相关天冬氨酸蛋白酶2、memapsin-2、天冬氨酰蛋白酶2和ASP2)抑制剂，AZD3293，乙酰胆碱酯酶抑制剂，NamendaTM(盐酸美金刚)，AriceptTM(多奈哌齐)，RazadyneTM(加兰他敏)，ExelonTM(利凡斯的明)，CognexTM(他克林)，抗惊厥药，NMDA(n-甲基d-天冬氨酸)受体拮抗剂，钠通道阻滞剂，维生素E，巴氯芬(CoQ10的衍生物)，拉莫三嗪(抗惊厥药)，瑞马西胺(麻醉药，它是低亲和力的NMDA拮抗剂)，利鲁唑(钠通道阻滞剂)，阿替普酶(溶栓剂)，左旋多巴，卡比多巴，金刚烷胺，COMT(儿茶酚O-甲基转移酶)抑制剂，托卡朋，恩他卡朋，奥比卡朋，多巴胺激动剂，溴隐亭，培高利特，普拉克索，罗匹尼罗，吡贝地尔，卡麦角林，阿扑吗啡，利舒利特，MAO-B(单胺氧化酶-B)抑制剂(选择性和非选择性MAO-B抑制剂)，抗胆碱剂，胆碱酯酶抑制剂，异卡波肼，烟肼酰胺，苯乙肼，肼卡巴嗪，雷沙吉兰，司来吉兰，利奈唑胺，或其组合。
10.一种药物剂型，其包含至少一种药物赋形剂和根据权利要求1-8或9中任一项所述的神经保护性组合物。
11.一种治疗受试者的神经系统病况的方法，所述方法包括：以治疗所述神经系统病况的有效量向有需要的受试者施用根据权利要求1-8或9中任一项所述的神经保护性组合物或者一种或多种根据权利要求10所述的药物剂型。
12.根据权利要求11所述的方法，其包括：
确定所述受试者的神经系统病况是否为阿尔茨海默病、帕金森病、中风、亨廷顿病、Tau蛋白病变或者具有与如下相关的病因的病况：淀粉样β前体蛋白的过度的蛋白水解、淀粉样β蛋白在受试者的神经元的突触中的累积、淀粉样纤维在受试者的神经元的突触中的形成、或者淀粉样斑块在受试者的神经元的突触中的形成；
指示施用所述神经保护性组合物；
根据规定的初始给药方案，向所述受试者施用初始剂量的所述神经保护性组合物一段时间；
定期地确定受试者对使用所述神经保护性组合物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当性；并且
如果所述受试者的临床反应和/或治疗反应是适当的，则按需继续用所述神经保护性组合物治疗，直至达到期望的临床终点；或者
如果所述受试者的临床反应和/或治疗反应在所述初始剂量和初始给药方案下不适当，则递增或递减剂量，直至达到所述受试者中期望的临床反应和/或治疗反应。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述方法进一步包括识别处于遭受所述神经系统病况风险的受试者的群体。
14.根据权利要求13所述的方法，其中处于风险的所述受试者的群体的特征在于所述受试者的年事渐高、所述神经系统病况的家族史、发生神经系统病况的遗传易感性、所述受试者中ApoE4基因的存在和表达、女性、心血管疾病(例如高血压和高胆固醇水平)、糖尿病(尤其是该疾病的2型或成人发病形式)、唐氏综合征、头部受伤、低水平的正规教育、吸烟、过量饮酒和/或药物滥用。
15.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经保护性组合物在延长的时期内以重复方式施用，其中：a)所述重复方式是指每天、每隔一天、每隔二天、每隔三天、每隔四天、每隔五天、每隔六天、每周、每隔一周、每隔二周、每隔三周、每月、每两月、每半月、每隔一个月、每隔两个月、每季度、每隔一个季度、每三个月、每季节、每半年和/或每年；b)所述延长的时期是指一周以上、一个月以上、一个季度以上和/或一年以上；和/或c)一天一次或多次施用有效剂量。
16.一种治疗受试者的中风的延时方法，其包括：
在受试者遭受中风后的延迟时间内，根据初始给药方案施用初始剂量的神经保护性组合物，其中所述神经保护性组合物是根据权利要求1-9中任一项所述的神经保护性组合物；
确定受试者对使用所述神经保护性组合物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当性；和
如果所述受试者的临床反应和/或治疗反应是适当的，则按需继续用所述神经保护性组合物治疗，直至达到期望的临床终点；或者
如果所述受试者的临床反应和/或治疗反应在所述初始剂量和初始给药方案下不适当，则递增或递减剂量，直至达到所述受试者中期望的临床反应和/或治疗反应。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述延迟时间为10小时以下、8小时以下、6小时以下、4小时以下、3小时以下、2小时以下、1小时以下、45分钟以下、30分钟以下、20分钟以下或10分钟以下。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中通过评估以下中的任意者，来确定受试者的临床和/或治疗反应的适当性：身体一侧的脸部、手臂和/或腿部的虚弱，身体一侧的脸部、手臂和/或腿部的麻木，不能理解所说的语言，不能说话或说清楚，不能书写，眩晕和/或步态不平衡，复视和异常严重的头痛。
19.根据上述权利要求中任一项所述的发明，其中所述组合物进一步包含一种或多种其它治疗有效的药剂。
20.一种在有需要的受试者中治疗神经系统病况的方法，所述方法包括施用包含至少两种三萜作为主要药理活性剂的神经保护性组合物，其中
第一三萜是齐墩果酸；和
至少一种第二三萜选自由：a)熊果酸；和b)白桦脂酸组成的组；
所述第一三萜和所述至少一种第二三萜在每次出现时独立地选自其游离酸、盐、衍生物或前药；并且
所述第一三萜以相对于所述至少一种第二三萜为至少四倍摩尔过量存在。
21.根据权利要求20所述的方法，其中存在所述齐墩果酸、熊果酸和白桦脂酸，并且齐墩果酸以分别相对于每一种熊果酸和白桦脂酸为至少四倍摩尔过量存在。
22.根据权利要求21所述的方法，其中熊果酸的摩尔含量近似于白桦脂酸的摩尔含量。
23.根据上述权利要求中任一项所述的发明，其中所述神经保护性组合物不包括强心苷、类固醇、和药理活性多糖。
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