CN101909637B

CN101909637B - 确定用强心苷进行的癌症化疗中的治疗应答概率的方法

Info

Publication number: CN101909637B
Application number: CN2008801236156A
Authority: CN
Inventors: R·A·纽曼; P·杨; O·C·阿丁顿
Original assignee: Phoenix Biotechnology Inc
Current assignee: Phoenix Biotechnology Inc
Priority date: 2007-11-13
Filing date: 2008-11-06
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2028-11-06
Also published as: KR20100087730A; JP2011508184A; ES2414057T3; CA2705272C; WO2009064657A1; AU2008321225B2; RU2013151251A; KR101556805B1; US20170067897A1; RU2571687C2; BRPI0820564A2; EP2231165A1; RU2508114C2; US9494589B2; JP5358583B2; CN101909637A; AU2008321225A1; CA2705272A1; RU2010123795A; EP2231165A4

Abstract

本发明提供了预后测定和试剂盒及其使用方法。所述试剂盒和测定用于确定具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调的患病细胞或者组织对于强心苷治疗的治疗应答的可能性。所述试剂盒和测定用于确定得自患病细胞或者组织的Na，K-ATP酶的α亚基的同种型比率。所述试剂盒可用于预测对象中癌症或者肿瘤对于强心苷治疗的治疗应答。所述试剂盒和测定可以掺入用含有强心苷的组合物治疗具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调的方法中。

Description

确定用强心苷进行的癌症化疗中的治疗应答概率的方法

发明领域

本发明涉及确定用强心苷进行的癌症化疗的预后的方法。特别地，本发明涉及确定具有与过量细胞增殖相关的病因学的体外或体内细胞疾病或失调是否治疗应答于强心苷治疗的概率的方法。

发明背景

许多具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调是致命性的。最常见的是癌症和肿瘤。然而，非癌增生性疾病也可以是威胁生命的，或者导致生活质量下降。这些可以包括例如：1)自身免疫疾病如抗原诱导的关节炎和变应性脑脊髓炎，2)慢性炎性增生性疾病如类风湿性关节炎、全身发作幼年性慢性关节炎、骨质疏松和银屑病，3)乳腺增生性疾病包括囊性纤维病，4)前列腺增生性疾病包括良性前列腺增生(BPH)，5)眼增生性疾病包括增生性糖尿病视网膜病，和6)血管增生疾病包括动脉粥样硬化和冠状动脉狭窄。已进行许多努力以开发这些疾病和失调的治愈性或缓解性疗法；但是，没有开发出全面或通用治愈性疗法，即使许多化疗途径已证明对各种不同癌症、肿瘤和其它类型增生性疾病有效。

化疗剂由临床医生单独或联合开出处方以试图开发针对个体患者需要的方案。即使如此，开发这些个体化方案的一个关键障碍是化疗剂对特异癌症或肿瘤表型的功效的不可预测性。临床医生被迫使用击中或错过(hitor miss)途径对付这些致死疾病。他们必须依赖特定化疗剂的公认的或指示的应用的历史回顾，然后预测或猜想一特定单一化疗剂或化疗剂组合是否对临床医生试图治愈的癌症或肿瘤是治疗有效的。这种常规在临床中成功有限。

临床医生需要预后测定，以便可以以合理水平的确定性预测一特定癌症或肿瘤表型是否对特定单一化疗剂或治疗剂组合有治疗应答。这种类型的预后测定对于具有有限应用历史的化疗剂如刚刚进入临床环境的那些化疗剂非常有用。针对一或多种这样的化疗剂的预后测定对于临床医生是非常有益的。

临床前研究及患者数据的回顾性检查已提示强心苷(例如蟾毒灵、地高辛、毛地黄毒苷、乌本苷和夹竹桃苷)在治疗各种癌症包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌和白血病中的潜在价值。

强心苷的一个药理学作用机制涉及它们结合离子交换泵Na，K-ATP酶及抑制该特定酶活性的能力。Na，K-ATP酶是催化Na⁺和K⁺穿过质膜的主动转运的跨膜蛋白，是熟知的强心苷的药理学受体。这个酶水解ATP并利用自由能驱动K⁺转运进细胞及Na⁺转运出细胞，对抗它们的电化学梯度(Hauptman，P.J.，Garg，R.，and Kelly，R.A.Cardiac glycosides in the nextmillieum.Prog.Cardiovasc.Dis.41：247-254，1999)。

Na，K-ATP酶由两个异二聚体亚基催化α-亚基和糖基化β-亚基组成。还有γ亚基，但是其还未研究清楚。α-亚基具有ATP、Na⁺、K⁺和强心苷的结合位点。β-亚基功能是稳定催化α-亚基并且可能也起调节作用。4个不同α同种型(α1，α2，α3，α4)和3个不同β同种型(β1，β2，和β3)已在哺乳动物细胞中被鉴别。每种类型的相对表达在正常和疾病状态中显著改变。α同种型的表达是组织类型特异性的并且在啮齿类和人类组织中变化(Blanco，G.and Mercer，R.W.Isozymes of the Na，K-ATP酶：heterogeneity instructure，diversity in function.Am.J.Physiol.275(Renal Physiol.44)：F633-F650，1998)。Na，K-ATP酶同种型在人类癌症如肾癌、肺癌、肝细胞癌和结肠癌中的改变的表达已经被报道与在相应正常组织中的那些相反(Rajasekaran，S.A.，Ball，W.J.，Bander，N.H.，Pardee，J.D.and Rajasekaran，A.K.Reduced expression of beta subunit of Na/K-APTase in human clear cellrenal cell carcinoma.J.Urol.162：574-580，1999；Avila，J.，Lecuona，E.，Morales，M.，Soriano，A.，Alonso，T.，and Martin-Vasallo，P.Oppositeexpression pattern of the human Na/K-ATP酶beta-1isoform in stomach andcolon adenocarcinomas.Ann.N.Y.Acad.Sci.834：633-635，1997；Espineda，C.，Seligson，D.B.，Ball，W.J.，Rao，J.，Palotie，A.，Horvath，S.，Huang，Y.，Shi.T and Rajasekaran，A.K.Analysis of the Na，K-ATP酶α-and β-亚基expression profiles of bladder cancer using tissue microarrays.Cancer 97：1851868，2003；Jung，M.H.，Kim，S.C.，Jeon，G.A.，Kim，S.H.，Kim，Y.，Choi，K.S.，Park，S.I.，Joe，M.K.，and Kimm，K.Identification of differentiallyexpressed genes in normal and tumor human gastric tissue.Genomics 69：281-286，2000)。另外，强心苷对不同α同种型的表观亲和性相当不同。强心苷与α1同种型的结合比与α2和α3同种型的小，α2和α3同种型对这种类型药物的抑制更敏感250倍或更高(Blanco,G.and Mercer,R.W.Isozymes of the Na,K-ATP酶:heterogeneity in structure,diversity in function.Am.J.Physiol.275(Renal Physiol.44):F633-F650,1998)。Sakai et al.(FEBS Letters563:151-154,2004)报道α3亚基同种型的表达在人类结肠直肠癌细胞中相比于正常结肠直肠细胞增加。

夹竹桃苷和夹竹桃苷元通过诱导凋亡抑制人类前列腺癌细胞增殖，这至少部分由于通过抑制Na,K-ATP酶而增加细胞内Ca²⁺所致(McConkey,D.J.,Lin,Y..,Nutt,L.K.,Ozel,H.Z.,and Newman,R.A.Cardiac glycosides stimulate Ca²⁺increases and apoptosis in androgen-independent,metastatic human prostate adenocarcinoma cells.Cancer Res.60:3807-3812,2000)。夹竹桃苷和夹竹桃苷元还通过膜相互作用和抑制Na,K–ATP酶活性而抑制成纤维细胞生长因子-2的输出(Smith,J.A.,Madden,T.,Vijjeswarapu,M.,and Newman,R.A.Inhibition of export of fibroblast growth factor-2(EGF-1)from the prostate cancer cell lines PC3and DU145by Anvirzel and its cardiac glycoside component,oleandrin.Biochem.Pharmacol.62:469-472,2001)。

尽管因为α₁β₁复合物被认为是“管家基因”，Na,K-ATPAase亚基α1存在于许多组织中，但是α3主要在可激发组织、肾皮质、髓质和乳头以及神经组织中中检测到。

夹竹桃(Nerium oleander)是广泛分布于亚热带亚洲、美国西南部和地中海的装饰植物。其药学和毒理学性质已长久认可。其例如已用于治疗痔、溃疡、麻风病、蛇咬及甚至诱导流产。夹竹桃苷是夹竹桃提取物的重要组分，是人类肿瘤细胞生长的强抑制剂(Afaq F et al.Toxicol.Appl.Pharmacol.195:361-369,2004)。夹竹桃苷介导的细胞死亡与钙内向通量、细胞色素C从线粒体释放、caspases8和3的蛋白酶解过程、聚(ADP-核糖)聚合酶裂解及DNA片段化相关。

已证实夹竹桃苷是夹竹桃的主要细胞毒性成分(Newman,et al.,J.Herbal Pharmacotherapy,vol.13,pp.1–15,2001)。夹竹桃苷是外源强心苷，不正常存在于身体内。夹竹桃苷在人类中诱导凋亡，但是在鼠肿瘤细胞系中不诱导凋亡(Pathak et al.,Anti-Cancer Drugs,vol.11,pp.455-463,2000),抑制NF-κB的活化(Manna et al.,Cancer Res.,vol.60,pp.3838-3847, 2000),及部分通过钙介导的细胞色素C释放而介导细胞死亡(McConkey et al.,Cancer Res.,vol.60,pp.3807-3812,2000)。夹竹桃热水提取物(即Anvirzel^TM)的I期临床试验最近已完成(Mekhail et al.,Am.Soc.Clin.Oncol.,vol.20,p.82b,2001)。已经得出结论夹竹桃提取物可以以高达1.2ml/m²/d.的剂量安全给予。未发现剂量限制毒性。

乌本苷是身体内源强心苷，据报道增强A549人类肺腺癌细胞的体外放射敏感性，但是在修饰正常人肺成纤维细胞的放射应答中无效(Lawrence,Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.,vol.15,pp.953-958,1988)。乌本苷随后示出放射敏化不同组织学类型的人类肿瘤细胞包括鳞状细胞癌和黑素瘤(Verheye-Dua et al.,Strahlenther.Onkol.,vol.176,pp.186-191,2000)。强心苷夹竹桃苷也具有增强细胞对离子辐射的细胞毒性作用的敏感性的能力(U.S.Patent Application Serial No.10/957,875to Newman,et al.and Nasu et al.,Cancer Lett.Vol185,pp.145-151,2002)。Newman et al.的U.S.Pregrant Patent Application Publication No.20050112059揭示了通过给予夹竹桃苷增强癌症治疗中的放疗。

Chen et al.(Breast Cancer Research and Treatment(2006),96,1-15)提示强心苷如乌本苷和毛地黄可用于开发抗乳腺癌药物，作为Na⁺,K⁺-ATP酶抑制剂及ER拮抗剂。

Smith et al.(Biochemical Pharmacology(2000),62,1-4)报道了ANVIRZEL及其关键强心苷成分夹竹桃苷抑制肿瘤生长因子成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)从前列腺癌细胞系PC3和DU145的输出。

Newman et al.(J.Experimental Therapeutics and Oncology(2006),5,167-181)报道了人恶性黑素瘤BRO细胞与夹竹桃苷保温导致活性氧超氧化物阴离子的时间依赖性形成，其介导线粒体损伤、细胞谷胱甘肽(GSH)库丧失及最终肿瘤细胞死亡。

从夹竹桃属(Nerium)物种植物提取糖苷已提供来自夹竹桃的药理学/治疗学活性成分。它们是夹竹桃苷、nerine及其它强心苷化合物。植物提取物用于治疗动物中的细胞增生性疾病。以商标ANVIRZEL^TM出售的通过热水提取夹竹桃,获得的夹竹桃苷提取物是市售的，含有浓缩形式或粉末形式的夹竹桃热水提取物。

Huachansu是得自蟾蜍皮肤的提取物，其包含蟾蜍二烯羟酸内酯，如强心苷蟾毒灵。HuaChanSu在中国是治疗癌症的批准药物。其已用于治疗各种癌症，包括肝癌、胃癌、肺癌、皮肤癌和食道癌。

考虑到强心苷在治疗具有与细胞增殖相关病因学的疾病或失调中的重要用途，需要预测疾病或失调对强心苷的治疗应答的方法现有技术没有披露或提示这种方法。

发明概述

本发明提供了预测强心苷或者含有强心苷的组合物对抗具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调的特定表型的功效的方法。本发明人已发现这种疾病或失调对用强心苷进行的治疗的敏感性或者治疗应答依赖于具有该疾病或增生性失调的细胞或组织中Na，K-ATP酶亚基的α3同种型与α1同种型表达的比率。通常细胞或组织中Na，K-ATP酶的α3同种型与α1同种型表达的比率越高，那些细胞对强心苷更敏感(治疗应答型)。即，α3同种型(药物敏感性)与α1(药物不敏感性)同种型的比率越高，该细胞或者组织对被强心苷抑制增殖更敏感。

本发明一个方面提供用于预测具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调对用强心苷或包含强心苷的组合物治疗的体内治疗应答的体外预后测定，该测定包括：

确定样品中Na，K-ATP酶α-亚基的α3同种型与α1同种型的比率，所述样品直接或间接得自患有具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或者失调的对象的患病体内细胞组织，所述样品包含Na，K-ATP酶的α亚基的一或多种同种型；以及

确定如果对象用治疗相关剂量的强心苷治疗时对象中治疗应答的概率。

在一些实施方案中：1)所述测定进一步包括如果所述比率大于或等于至少1则预测所述细胞组织将对用强心苷治疗是治疗应答性的；2)所述测定进一步如果所述比率在0.5-1.0范围内则预测所述细胞组织将对用强心苷治疗至少是部分治疗应答性的；3)所述测定进一步包括如果所述比率小于0.3则预测所述细胞组织将对用强心苷治疗基本是无治疗应答性的；4)所述测定还进一步包括预测具有在1-100范围内的亚基比率的那些组织将比那些具有小于1的同种型比率的组织更具有治疗应答性的；5)所述测定进一步包括仅具有可检测的α3同种型而无可检测的α1同种型的那些组织将是对强心苷最具有治疗应答性的；和/或6)所述测定进一步包括预测如果所述比率≥2、≥3、≥4、≥5、≥7、≥9、≥10、≥15、≥20、≥25、≥40、≥50、≥75或≥100则所述细胞组织对用强心苷治疗是治疗应答性的。

在一些实施方案中，有治疗应答的概率与根据下表的Na，K-ATP酶的α3同种型与α1同种型的比率相关：

比率	对象中有治疗应答的概率
		0.3至小于0.5	20至＜30％
0.5至小于1	30至50％
		＞/＝1	＞50％
＞10	＞75％

在上表中，治疗应答可以是部分或完全治疗应答或者进展延迟时间。

在一些实施方案中：1)确定步骤包括定量所述体外样品或生物活检样品中每个Na，K-ATP酶的α3亚基同种型和Na，K-ATP酶的α1亚基同种型的表达水平，并且计算其比率；2)确定步骤包括确定体外样品中每个Na，K-ATP酶的α3亚基同种型的量相对于Na，K-ATP酶的α1亚基同种型的量，并且计算其比率；3)所述测定进一步包括在来自确定比率的数据上进行统计学分析；4)所述样品是细胞组织、细胞团、细胞裂解物、从这些制备的膜制备物或者其固定的组织病理玻片；5)所述样品是体外样品；6)所述样品包括Na，K-ATP酶的α亚基的至少两种同种型；7)所述样品包括Na，K-ATP酶的α亚基的至少α1和α3同种型；8)所述方法进一步包括裂解或者破坏细胞或组织或生物活检样品或者固定来自患病体内细胞组织的用于进行组织病理学检验的组织切片以形成样品；9)所述方法进一步包括在样品上进行Western印迹测定或者免疫组织化学染色测定以确定样品中Na，K-ATP酶的α3亚基同种型相对于Na，K-ATP酶的α1亚基同种型的量和相对表达，以及计算其比率；10)所述方法进一步包括进行凝胶的放射分析或光密度分析以确定样品中Na，K-ATP酶的α3亚基同种型的含量相对于Na，K-ATP酶的α1亚基同种型的含量；11)所述方法进一步包括进行凝胶的放射分析或光密度分析以检测样品中Na，K-ATP酶的α3亚基同种型和Na，K-ATP酶的α1亚基同种型的存在及定量其含量；12)将样品中Na，K-ATP酶的α3亚基同种型和Na，K-ATP酶的α1亚基同种型的含量相对于阳性对照样品和/或阴性对照样品中Na，K-ATP酶的α3亚基同种型和/或Na，K-ATP酶的α1亚基同种型的含量进行比较；和/或13)比较组织样品中Na， K-ATP酶的α3亚基同种型和Na，K-ATP酶的α1亚基同种型的含量，其中已知发生仅α3和α1亚基同种型之一的表达，作为对照。

在一些实施方案中：1)疾病细胞组织得自对象如哺乳动物；2)疾病细胞组织得自人、牛、狗、猫、马、猪或其它有或无商业价值的家养底物；3)具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调是癌症或者肿瘤或者其它负面影响人类或动物生活质量的增生性疾病；和/或4)癌症或者肿瘤选自如下一组：结肠直肠癌、头颈部癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、骨肉瘤、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、非霍奇金淋巴瘤、直肠癌、食管癌、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾癌、喉和下咽癌、肝癌、肺癌(非小细胞癌及小细胞癌)、肺类癌肿瘤、恶性间皮瘤、转移癌、多发性骨髓瘤、骨髓发育异常综合征、鼻腔及副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、中枢神经系统肿瘤、口腔及口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、输尿管癌症；子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌或者Wilm’stumor。

在一些实施方案中：1)所述方法进一步包括鉴别患有具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调的对象；2)所述方法进一步包括从所述对象获得疾病细胞样品的步骤；3)所述方法包括提供信息，限定如何进行Na，K-ATP酶的α亚基的α3和α1同种型的分析；和/或4)所述方法包括提供信息，详述如何解释预后数据。

在一些实施方案中，增生性疾病包括但非限于：1)自身免疫疾病如抗原诱导的关节炎和变应性脑脊髓炎；2)慢性炎性增生性疾病如类风湿性关节炎、全身发作幼年性慢性关节炎、骨质疏松和银屑病；3)乳腺增生性疾病包括囊性纤维病；4)前列腺增生性疾病包括良性前列腺增生(BPH)；5)眼增生性疾病包括增生性糖尿病视网膜病；和6)血管增生性疾病包括动脉粥样硬化和冠状动脉狭窄。在一些实施方案中，两种或多种增生性疾病被同时治疗。

基于使用人类肿瘤细胞系的实验室研究据信特别应答强心苷治疗的癌症包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、成骨肉瘤、脑癌(多形性胶质母细胞瘤)和结肠癌。癌症可以是人、非人或动物来源的。

在一些实施方案中：1)强心苷选自由夹竹桃苷、乌本苷、蟾毒灵、毛地黄毒苷、地高辛、华蟾毒素(cinobufatalin)、华蟾毒配基和酯蟾毒配基(resibufogenin)组成的组;2)强心苷以纯形式存在，其可通过对植物或者动物来源进行提取而产生，通过化学修饰(例如衍生化)可利用的强心苷来合成或者生产；3)强心苷存在于提取物中；4)强心苷存在于药物配制品或者组合物中；5)强心苷得自夹竹桃植物物质(mass)；6)夹竹桃植物物质包括夹竹桃属物种，如夹竹桃，或者黄花夹竹桃属(Thevetia)物种如黄花夹竹桃(Thevetia nerifolia)(也已知为黄色夹竹桃)；和/或7)强心苷提取物通过任选在改性剂存在下超临界流体(SCF)提取制备。

在一些实施方案中：1)SCF提取物除强心苷之外还进一步包括至少一种其它药理学活性物质；2)当提取物被给予对象时所述其它活性物质可以有助于强心苷的治疗功效；3)所述其它活性物种起附加或者协同作用以有助于强心苷的治疗功效；和/或4)提取物得自蟾蜍皮肤或者其衍生的分泌物。

本发明另一方面提供适用于进行本发明预后测定的试剂盒。所述试剂盒包括：a)具有对Na,K-ATP酶的α3亚基同种型的结合亲和性的第一种第一抗体；和b)具有对Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的结合亲和性的第二种第一抗体。所述试剂盒可以适应以用于进行Western印迹凝胶电泳测定和/或用于进行免疫组织化学染色测定。

所述试剂盒任选进一步包括：a)裂解组合物；b)包含Na,K-ATP酶的α3亚基同种型的阳性对照样品；c)包含Na,K-ATP酶的α3亚基同种型和Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的阳性对照样品；d)包含Na,K-ATP酶的α1亚基同种型并排除Na,K-ATP酶的α3亚基同种型的阴性对照样品；e)第二抗体，山羊抗小鼠IgG–HRP(其可以用于例如显示感兴趣蛋白质)；f)适于凝胶电泳分析的凝胶形成材料；g)放射性标记的或着色的(染色的能够产生肉眼或仪器可检测信号)分子量标记；h)试剂盒使用及进行预后测定的说明；i)光密度计或放射计；j)水性液体介质；k)凝胶/膜制备试剂盒；l)封闭溶液；m)洗涤缓冲液；n)包含Western印迹分析试剂盒的材料；或者o)其组合。

在试剂盒的一些实施方案中：a)所述第一种第一抗体具有对Na,K-ATP酶的α3亚基同种型的特异性结合亲和性;b)所述第二种第一抗体具有对Na，K-ATP酶的α1亚基同种型的特异性结合亲和性；c)第二抗体是山羊α小鼠IgG辣根过氧化物酶或者包含来自小鼠以外的物种的其它第二抗体，其针对小鼠IgG产生，具有附着的合适标记如辣根过氧化物酶；和/或d)第一抗体是单克隆抗体。

在一些实施方案中，免疫组织化学染色试剂盒包括：a)抗原解掩蔽溶液(其抗原是高pH或者基于柠檬酸)；b)缓冲液；c)内源过氧化物活性猝灭材料(其可以包含过氧化氢，任选在甲醇中)；d)抗Na，K-ATP酶α3亚基同种型抗体和/或抗Na，K-ATP酶α1亚基同种型抗体；e)非免疫小鼠IgG1抗体；f)通用抗体试剂，包含抗兔IgG和抗小鼠IgG试剂的混合物；g)初级化学染色剂(primary chemical stain)，如二氨基联苯胺；h)通用复染化学染色剂，如苏木精或曙红；i)特异性细胞器染色剂，如用于染色细胞核的染色剂(例如溴乙锭、二苯并咪唑(bisbenzimidazol)或者硫酸钾铝)或者用于染色线粒体的染色剂(例如Mito tracker red，10-壬基吖啶橙)；j)包含免疫组织化学染色试剂盒的材料；或者k)其两种或多种的组合。使用组织或细胞的相邻切片，染色α1亚基同种型可以以类似于染色α3亚基同种型所用方式进行，其中使用针对α1亚基同种型和α3亚基同种型的合适特异性第一抗体。如本文所用，特异性细胞器染色剂是用于特异染色细胞(人、非人或动物)中的特定类型细胞器(线粒体、细胞核、核仁、高尔基体、空泡等)的试剂或者试剂组合。

在一些实施方案中，免疫组织化学染色测定包括步骤：a)提供哺乳动物组织样品；b)免疫化学染色存在于样品中的Na，K-ATP酶的α-亚基的α3同种型和α1同种型；c)确定样品中Na，K-ATP酶的α3亚基同种型的含量和Na，K-ATP酶的α1亚基同种型的含量；及d)确定样品中存在的α3同种型与α1同种型的比率。

在一些实施方案中，免疫组织化学染色测定包括步骤：a)提供哺乳动物组织样品；b)在组织上进行抗原提取程序；c)猝灭组织中的内源过氧化物活性；d)将猝灭的组织暴露于抗Na，K-ATP酶α3亚基同种型和/或抗Na，K-ATP酶α1亚基同种型第一抗体；e)将抗体处理的组织暴露于抗兔IgG、抗小鼠IgG第二抗体或其组合；f)将IgG处理的组织暴露于初级染色剂；g)将染色的组织暴露于复染色剂以形成免疫组织化学染色的组织；h)肉眼或者分光光度手段分析免疫组织化学染色的组织；和i)定量哺乳动物组织中存在的α3和/或α1同种型的量。例如，如果第二抗体是生物素化的，则可以进行同种型抗体染色的定量。然后，可以加入Vectastatin ABC染色剂并保温30分钟。洗涤染色切片后，它们然后与二氨基联苯胺底物保温以显色合适水平的染色。染色组织的定量然后可以通过分级染色剂强度手工进行或者用计算机化图像捕获和数字扫描感兴趣视野而电子进行。定量可以进一步用商业可得数字图像软件促进。在一些实施方案中，测定进一步包括步骤：j)洗涤从步骤a)获得的组织；k)洗涤从步骤c)获得的组织；l)提供阴性对照切片(不具有肿瘤或癌症的那些)作为“无一抗(noprimary)”对照；m)将阴性对照切片暴露于非免疫小鼠IgG1抗体；n)洗涤从步骤e)获得的组织；o)洗涤从步骤f)获得的组织；和/或洗涤从步骤g)获得的组织。洗涤可以用水、缓冲的水、和/或TBS(大约50mM Tris HCl，大约300mM NaCl，大约0.1％Tween 20，pH大约7.6)进行。

阳性对照样品可以是组织、细胞团、细胞裂解物或者从这些制备的膜制备物，它们可以通过生物活检或者其它外科手术切除方法获得。阴性对照样品可以是组织、细胞团或者细胞裂解物或者从这些制备的膜制备物，它们通过先前分析已知不含有Na，K-ATP酶的α-亚基的α3同种型。在一些实施方案中，阴性对照由啮齿类(小鼠或者大鼠)肿瘤组织的细胞团或者体外生长的小鼠或者大鼠细胞组成。

根据本发明可以采用分析方法，其是确定相对Na，K-ATP酶α亚基同种型组成和比率的替代手段，以确定α3与α1同种型的比率。这些可以例如包括使用在ELISA(酶联免疫吸附测定)中的抗体或者蛋白质组织或者细胞裂解物阵列。或者，可以使用Northern印迹分析和相关技术(例如rtPCR，实时聚合酶链反应)用于测量不同Na，K-ATP酶α-亚基同种型的mRNA。也可以使用免疫组织化学染色测定定量样品中存在的α-亚基的α3同种型和α1同种型的量。

本发明的另一方面提供用包含强心苷的组合物治疗患有具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调的对象的方法，所述方法包括：

确定样品中Na，K-ATP酶α-亚基的α3同种型与α1同种型的比率，所述样品直接或间接得自患有具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或者失调的对象的疾病体内细胞组织，所述样品包含Na，K-ATP酶的α亚基的一或多种同种型；以及

如果所述比率≥0.3，≥0.5，≥1或者≥10，则指示给予对象包含强心苷的组合物。

从所述对象获得疾病组织样品，所述疾病具有与过量细胞增殖相关的病因学，所述样品包含Na，K-ATP酶的α亚基的一或多种同种型；

请求确定样品中Na，K-ATP酶的α亚基的α3同种型与α1同种型的比率；以及

本发明的一些实施方案包括那些实施方案，其中：1)对象被开出处方或给予治疗相关剂量的包含强心苷的组合物；2)对象根据处方剂量方案被给予包含强心苷的组合物；3)对象被给予包含含有强心苷的提取物的组合物；4)所述提取物进一步包含一或多种其它治疗有效物质；5)组合物进一步包含一或多种其它治疗有效物质；6)对象被给予含有强心苷的植物或动物来源的热水提取物，每天2mg至22.5；或者7)从0.6至4.8mg范围的强心苷的植物或动物来源的浓缩提取物(例如超临界CO₂提取物)；或者8)10-500ug范围内的纯单化学形式强心苷。

本发明方法的各个步骤可以在独立设施中进行或者在相同设施中进行。

本发明包括本文披露的本发明的方面、实施方案和具体实施方案的所有组合。

附图简述

下述附图组成说明书一部分，描述了发明的举例实施方案。本领域技术人员根据这些附图和描述能够无需过度实验实施本发明。

图1A描述了作为用于相对定量Na，K-ATP酶的α-亚基的α1和α3同种型的人类和小鼠细胞系的Western印迹分析的一部分获得的凝胶电泳图的相关条带。

图1B描绘了夹竹桃苷浓度(nM)对人类和小鼠肿瘤的细胞生长抑制百分比的图。

图2描绘了作为正常及恶性人结肠细胞的Western印迹分析的一部分获得的凝胶电泳图的相关条带的照片。

图3A描绘了夹竹桃苷浓度(nM)对各种肿瘤细胞系的细胞生长抑制百分比的图，所述细胞系的Na，K-ATP酶亚基的α1和α3同种型的相对表达不同。

图3B描绘了夹竹桃苷在两组不同肿瘤细胞系中对细胞生长抑制的平均IC₅₀的条杆图：第一组具有大于1的α3与α1亚基同种型的比率；第二组具有小于1的α3与α1亚基同种型的比率。

图4A描绘了作为非转染及转染的人肿瘤细胞的Western印迹分析的一部分获得的凝胶电泳图的相关条带的照片。

图4B是证实在图4A的非转染及转染的细胞中α3同种型的相对表达的条杆图。

图4C描绘了夹竹桃苷浓度(nM)对图4A的细胞的癌症细胞生长抑制百分比的图。

图5A描绘了作为非转染及转染的Panc-1细胞的Western印迹分析的一部分获得的凝胶电泳图的相关条带的照片。

图5B是证实在图5A的非转染及转染的细胞中α3同种型的相对表达的条杆图。

图5C描绘了夹竹桃苷浓度(nM)对图5A的细胞的癌症细胞生长抑制百分比的图。

图6A-6F描绘了来自DI 13782的免疫组织化学染色的正常皮肤细胞的照片。

图7A-7H描绘了免疫组织化学染色的黑素瘤皮肤细胞的照片：图7A-7B描绘了DI 15041细胞；图7C-7D描绘了DI 15832细胞；图7E-7F描绘了DI 15833细胞；图7G-7H描绘了DI 15834细胞。

发明详述

本发明提供了预测患有具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调的对象是否接受通过用含有强心苷的组合物治疗该对象对抗该疾病或失调的临床益处。所述方法用于确定对象中的疾病或失调是否对用含有强心苷的组合物的治疗是治疗应答性的。换句话说，所述方法用于确定在用治疗相关剂量(或者有效剂量)的一或多种强心苷治疗后对象中的治疗应答的概率。

简而言之，样品得自对象中的疾病组织。样品包含来自疾病组织的Na，K-ATP酶的α亚基的一或多种同种型，并且如本文所述分析以确定Na，K-ATP酶的α亚基的α3和α1同种型的相对量或浓度。然后计算相对量或浓度的比率。如果α3同种型与α1同种型的比率大于或等于0.3，则该方法预测所述疾病或失调对强心苷治疗是治疗应答性的概率增加。例如，如果该比率从0.3至0.45+/-0.05，则有至少20％或者20％至小于30％的概率该疾病或失调应答强心苷治疗。如果该比率小于0.2或者小于0.3，则该方法预测小于20％概率该疾病或失调治疗应答于强心苷治疗。一般地，该比率越高，治疗应答概率越大。例如，如果该比率是从0.5至0.95+/-0.05，则有至少30％或者30％至50％的概率该疾病或失调应答强心苷治疗。如果该比率大于或等于1+/-0.05，则有至少50％概率该疾病或失调应答强心苷治疗。如果该比率大于10+/-0.05，则有至少75％概率该疾病或失调应答强心苷治疗。

“治疗应答(therapeutically responsive)”是指患有疾病或失调的对象将享有作为强心苷治疗结果的至少一种如下临床益处：疾病或失调改善、与疾病或失调相关的症状发生降低、疾病或失调的部分康复(remission)、疾病或失调的完全康复或者距进展时间增加。换句话说，治疗应答可以是完全或部分治疗应答，以及所述方法用于确定治疗应答的概率，而无论其是完全还是部分应答。

如本文所用，“距进展的时间(time to progression)”是指疾病被诊断(治疗)后直至疾病开始恶化(如直至肿瘤开始或者持续生长)的时间期间、长度或持续时间。其是疾病水平被保持而无疾病的进一步进展的时间期间，并且所述时间期间当疾病开始再次进展时终止。疾病的进展被定义为患有细胞增生性疾病的对象在治疗之前或者治疗开始时的“分期”。例如，对象具有的肿瘤的大小、位置和数目在治疗之前或者治疗开始时确定。对象然后用强心苷治疗，定期监测肿瘤大小及数目。在稍后时间点，肿瘤大小和/或数目可以增加，因此标记疾病进展及“距进展的时间”的终点。

应注意治疗应答可以是在给予对象的治疗相关剂量下的完全或者部分应答。换句话说，预测的治疗应答水平在对被给予强心苷的对象不致命的剂量下确定。因此，治疗相关剂量是这样的治疗剂量，在该剂量下疾病或失调对强心苷治疗的治疗应答被观测到以及在该剂量下对象可以被给予强心苷而不具有过量的不想要的或者有害的副作用。治疗相关剂量对对象是非致死的，尽管其可能在患者中导致一些副作用。其是对被给予强心苷的对象的临床益处水平超过该对象由于给予强心苷所经历的有害副作用的水平的剂量。根据各种已建立的药理学、药动学和药物代谢动力学原理，治疗相关剂量可以在对象之间变化。但是，治疗相关剂量(例如相对于夹竹桃苷)典型不超过25、100、250、500或者1000微克强心苷/天，或者其可以在25-500或者25-1000微克强心苷/天范围。因此，本发明方法用于当对象被给予治疗相关剂量时预测疾病或失调的治疗应答性。本领域已知在对象中提供靶治疗结果所需的药物的实际量可以根据药学基本原理在对象之间变化。

治疗相关剂量可以根据治疗具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调中典型使用的任何剂量方案而给予。治疗相关剂量可以每日给予1次、2次、3次或更多次。其可每隔1天、每隔2天、每隔3天、每半周、每周、每两周、每三周、每四周、每月、每两月、每半月、每三月、每四月、每半年、每年或者根据上述任意组合给予。例如，治疗相关剂量可以每日一次给予一或多周。

“裂解组合物”是指能裂解细胞的膜以形成细胞裂解物或者细胞成分的完全溶解的一或多种物质。裂解组合物可以包含下述一或多种物质：水性液体介质、缓冲剂、盐、螯合剂、表面活性剂、消泡剂、蛋白酶抑制剂及磷酸酶和ATP酶抑制剂。

如本文有关试剂盒所用，“阳性对照样品”包括Na，K-ATP酶的α3亚基同种型。阳性对照可以进一步包括Na，K-ATP酶的α1亚基同种型。每种亚基同种型的量或浓度可以独立地预先确定或者是已知的。亚基同种型的量或浓度足以提供关于亚基同种型存在的阳性应答，如根据其是阳性对照的测定中所用的特定方法确定。例如，在Western印迹测定中，阳性对照中的亚基同种型的量或浓度足以与相应抗体结合，以便当确定亚基存在时，例如通过光密度分析或放射分析确定时，将获得对于该亚基同种型存在的阳性应答。对于免疫组织化学染色测定(如在实施例27中详述)，当应用于凝胶，用电泳与其它蛋白质分离及然后用前述第一和第二抗体染色时或者当应用于使用数字图像捕获和定量图像分析软件的显微镜检查的定量分析时，阳性对照中的亚基同种型的量或浓度足以允许容易的显现。如果对照样品中的亚基同种型的量或浓度是已知的或者在在分析前预先确定的，阳性应答水平可以与所述量或浓度相关以提供该亚基同种型的校准曲线。

如果Na，K-ATP酶的α3亚基同种型存在于阳性对照样品中，α3同种型与α1同种型的比率通常在0.3-100或更大的范围内。合适的比率范围也包括0.3-0.5、0.5-1.0、1.0-20及20-100。

如本文有关试剂盒所用，“阴性对照样品”包括Na，K-ATP酶的α1亚基同种型但排除Na，K-ATP酶的α3亚基同种型。α1亚基同种型的量或浓度足以提供关于该同种型存在的阳性应答，如根据其用作阴性对照的测定如Western印迹测定中所用的特定方法确定。所述量或浓度可以是已知的或者预先确定的，如果如此，可以用于产生该同种型的校准曲线。

作为本发明方法和试剂盒的验证部分，本发明人进行了含有强心苷的组合物治疗各种癌症和肿瘤表型的临床前评估。评估用体内、离体、体外及在异种移植动物模型中进行。对于每种评估的表型，如本文所述分析组织或细胞团的细胞样品以确定Na，K-ATP酶的α3亚基同种型与Na，K-ATP酶的α1亚基同种型的比率。在许多人类肿瘤细胞系中观测到了应答强心苷治疗的表型与对于每种表型的Na，K-ATP酶的α3亚基同种型与Na，K-ATP酶的α1亚基同种型的比率之间的相关。结论是治疗应答性癌症或者肿瘤表型(或者具有增加概率的治疗应答的表型)具有的Na，K-ATP酶的α3亚基同种型与Na，K-ATP酶的α1亚基同种型的比率为至少0.3。

啮齿类(大鼠或者小鼠)癌细胞可以用作阴性对照样品。图1A描绘了啮齿类肿瘤细胞系的Western印迹分析凝胶的照片。发明人的数据证实目前测试的所有啮齿类(小鼠和大鼠)肿瘤细胞系均缺乏α3亚基同种型并且它们的体外增殖不被与强心苷(例如乌本苷，夹竹桃苷，蟾毒灵等)保温显著抑制。人类肿瘤细胞系通常对用含强心苷组合物治疗比鼠肿瘤细胞更敏感(图1B)。发明人相信这个治疗应答性中的差异是由于在两种不同物种中的α3与α1同种型的比率的差异所致，如上所述。

应注意抗α3同种型抗体可以衍生自许多不同销售商包括AffinityBioreagents(Golden，CO)，Novus(Littleton，CO)或者Sigma hemical Co.(StLouis，MO)，它们全部显示对阳性对照样品中的α3表位的相等的反应性(即结合)。

在人类中，对于Na，K-ATP酶的α亚基的α3与α1同种型的比率可以根据组织来源及恶性状态而变化。从总共14个个体对象中的每个对象取正常和恶性结肠组织的组织样品。如本文所述确定每个组织样品的α3与α1同种型的比率。图2数据和下表证实正常组织中相对缺乏α3同种型，在大约66-70％恶性组织中存在α3同种型。正常和恶性组织均含有α1亚基同种型。

对象	正常结肠组织	结肠肿瘤组织
				α3/α1比率	α3/α1比率
1	0.0	0.0
			2	0.02	0.64
3	0.03	0.07
			4	0.01	0.04
5	0.03	0.0
			6	0.0	0.56
7	0.0	3.4
			8	0.0	6.0
9	0.0	100.0
			10	0.0	0.0
11	0.0	6.2
			12	0.0	0.83
13	0.0	0.36
			14	0.0	0.00

确定了培养细胞系及实际肿瘤活检样品中各种不同人类癌症和肿瘤表型的Na，K-ATP酶的α亚基的α3toα1同种型的比率。另外，用来自体外细胞培养实验的数据确定了每种表型对用含有强心苷的组合物的治疗的相对敏感性。下表和图3A中详述了含有夹竹桃苷的组合物的数据。

细胞系	肿瘤表型	α3/α1	对夹竹桃苷体外应答？	IC₅₀(nM)
					MDA231	乳腺	0.01	无*	N/A
BXPC3	胰腺	0.29	无*	N/A
					MCF7	乳腺	0.2	无*	N/A
SUM149	乳腺	0.3	部分**	22.5
					HCT116	结肠	1.7	部分**	36.2
MiaPaca	胰腺	1.5	完全***	14.2
					CACO2	结肠	4.6	完全***	9.4
HT29	结肠	6.8	完全***	15.6
					LS174T	结肠	7.6	完全***	20.7
BRO	黑素瘤	11.5	完全***	8.2
					DOD-1	结肠	19.8	完全***	19.6
PANC1	胰腺	60	完全***	6.1

细胞系	肿瘤类型	α3/α1	对蟾毒灵体外应答？	IC₅₀(nM)
					BXPC3	胰腺	0.29	无*	N/A
MiaPaca	胰腺	1.5	完全***	2.1
					PANC1	胰腺	60	完全***	1.2

*代表在直至125nM浓度达到小于50％的生长抑制

**代表在62nM达到大于50％但小于75％的生长抑制

***代表在62nM达到大于75％的生长抑制

如上表定义，“体外应答”代表给定肿瘤细胞系的增殖在规定时间期间用指定浓度药物(强心苷)抑制的程度。“无应答”代表在测试的多种药物浓度的任一种下小于50％的生长抑制。即，没有浓度可以被鉴别为IC₅₀值(在所述实验时间期间产生50％细胞生长抑制的浓度)。因此，如果这个肿瘤细胞系在哺乳动物如人类中生长，则该药物可能对于产生显著的肿瘤生长抑制是无效的。上表中的“部分应答”代表给定强心苷如夹竹桃苷或蟾毒灵相对于未治疗肿瘤细胞生长抑制细胞增殖大于50％但小于75％的能力。因此，如果这个产物用于治疗哺乳动物如人类中的肿瘤生长，这等于肿瘤对强心苷的部分或小于完全的治疗应答。最后，上表中的“完全应答”代表相对于未治疗肿瘤细胞群大于75％的肿瘤细胞增殖抑制。因此，其可以完全抑制肿瘤生长(或者在哺乳动物中可以实现完全治疗应答)。

基于上述同种型比率数据，方法预测：1)MDA231、BXPC3和MCF7细胞系对用治疗相关量的强心苷治疗会是基本上非应答性的；2)SUM149和HCT116细胞系会显示对用治疗相关量的强心苷治疗的至少部分应答；及3)CACO2、HT29、LS 174T、BRO、DOD-1和PANC1细胞系会显示对用治疗相关量的强心苷治疗的完全治疗应答。

图3A描绘了夹竹桃苷(以夹竹桃苷提供)的浓度(nM)针对对照的生长百分比的图。数据证实评估的细胞系根据用人类肿瘤细胞系增殖的相对抑制确定的它们对强心苷治疗的应答可以分成三个不同组：组I-经历在直至125nM强心苷的浓度下达到的小于50％的生长抑制的细胞；组II-经在直至62nM强心苷浓度下达到的大于或等于50％生长抑制的细胞；组III-经历在直至62nM强心苷浓度下达到的大于或等于75％生长抑制的细胞。这些组的举例的细胞系是：组I-MDA231，BXPC3，MCF-7；组II-SUM149，BRO；组III-Panc-1，CaCo2。应答数据与根据同种型比率数据预测的相同。为了建立本发明的方法和试剂盒的鲁棒性，进行了细胞应答数据的统计学分析。图3B中的数据描述了含有夹竹桃苷的组合物体外抑制人肿瘤细胞增殖的相对能力。数据以平均值Mean±SD示出。夹竹桃苷介导的生长抑制在其中相对亚基含量α3/α1同种型比率＞1.0的10个细胞系(代表各种固体肿瘤)及其中α3/α1同种型比率＜1.0的6个细胞系中进行了检查。数据显示在这些组之间有8倍(800％)差异。即，与其中α3亚基同种型仅弱表达的那些细胞系相比，在其中α3/α1同种型比率≥1.0的那些细胞系中，发现夹竹桃苷是更有效得多的药物。数据证实α3/α1亚基同种型的比率可以用于预测癌症或肿瘤细胞系对用含强心苷的组织的治疗的应答性。

如下建立α3/α1同种型比率对靶恶性组织对强心苷治疗的治疗应答的可预测性的相对重要性的进一步证明。人胰腺癌细胞中α3同种型的表达的人工负调节，即Na，K-ATP酶的亚基同种型含量的操作，通过用特异于α3同种型的siRNA(沉默RNA)转染细胞而实现。数据证实α3同种型表达下降(如Western印迹确定(图4A))。图4B中详述了通过Western印迹定量α3的表达降低。图4C证实其中α3表达被降低的转染细胞丧失了它们对夹竹桃苷治疗的敏感性。

α3/α1同种型比率对靶恶性组织对强心苷治疗的治疗应答的可预测性的相对重要性的进一步证明通过用α1亚基同种型转染Panc-1细胞建立。Na，K-ATP酶α1亚基同种型转染至正常缺乏α1表达的Panc-1细胞。图5A中的对照样品是非转染的Panc-1细胞，图5A中的α1cDNA样品是用α1亚基同种型转染的Panc-1细胞。结果，在转染的Panc-1细胞中α3与α1的比率降低(图5B)。转染的Panc-1细胞对夹竹桃苷治疗的敏感性然后被评估。这些转染细胞对夹竹桃苷治疗的敏感性下降，证据为夹竹桃苷的IC50值从非转染Panc-1细胞的4.1nM转变为在α1转染细胞中的大于50nM(图5C)。因此，夹竹桃苷的抗增殖活性在用α1亚基同种型转染的Panc-1细胞中显著下降。

Na，K-ATP酶亚基的α3和α1同种型的检测和定量还可以用免疫组织化学染色完成，如实施例27详述。细胞用免疫组织化学染色，从而α3和α1同种型被差示染色。每种同种型类型的含量被定量，α3与α1同种型的含量比率被确定。同种型的差示免疫组织化学染色可以通过各种手段完成。在一些实施方案中，组织样品用两种不同染色剂染色，一种染色剂选择性或特异性用于α3同种型，另一种染色剂选择性或特异性用于α1同种型。在一些实施方案中，两个接近但不相同样品样品得自同一组织并被染色，以便第一个样品被处理以染色α3同种型，第二个样品被处理以染色α1同种型。α3和α1同种型的量然后被定量，α3同种型与α1同种型的比率然后被确定。基于所述比率，对所述组织对强心苷治疗的治疗应答的可能性进行预测。

免疫组织化学染色的样品(细胞或组织玻片)中Na，K-ATP酶亚基的α3同种型和α1同种型的定量可以通过手工或自动化程序完成。这些包括但非限于合适染色的玻片的设定区域的染色强敌的个体分级(grading)(例如使用相对染色强度的目视观察(例如0-5的密度，其中0是无可检测染色，5代表强染色))，然后汇总设定数目的检查区域的平均染色强度并比较α3染色相对于针对α1染色的玻片的相对染色，及计算样品中的α3与α1的比率。另一种方式是其中α1和α3的相对染色(即样品中存在的α3与α1的比率)的定量可以通过使用显微镜检查染色玻片的设定区域及使用数字分析软件以确定相对染色强度。类似地，也可以进行计算机辅助数字摄像分析以确定相对同种型染色及计算α3与α1染色强度的比率，由此确定样品中α3同种型与α1同种型含量的比率。

例如，图6A-6F示出了来自DI 13782正常皮肤细胞的照片。图6A、6C和6E示出Na⁺/K⁺ATP酶的α亚基免疫反应性(免疫组织化学染色的)。图6B、6D和6F显示了相应的非免疫(对照)IgG保温的切片的照片。在所用正常皮肤供体中可见强2+或3+水平的免疫反应性。鳞状上皮、毛囊上皮、皮脂腺基底膜、汗腺曲管(sweat coils)及血管中的单个核淋巴细胞全部阳性染色。Pyloerector肌肉呈弱免疫反应性。

图7A-7H示出黑素瘤细胞的照片。图7A、7C、7E和7G示出Na⁺/K⁺ATP酶的α亚基免疫反应性(免疫组织化学染色的)。图7B、7D、7F和7H显示了相应的非免疫(对照)IgG保温的切片。图7A和7B示出DI15838细胞。图7C和7D示出DI 15840细胞。图7E和7F示出DI 15842细胞。图7G和7H示出DI 15844细胞。所用BCC样品对于Na⁺/K⁺ ATP酶的α亚基均是阳性的，强度程度有变化。所有免疫反应性均位于肿瘤细胞的细胞核及细胞质。在组织的差示免疫组织化学染色后，可以确定α3亚基同种型与α1亚基同种型的比率，可以进行对强心苷治疗的治疗应答性的预测。

评估了本发明的方法对另一种强心苷的相关性。华蟾素(Huachansu)是蟾蜍皮肤提取物，含有已知为蟾蜍二烯羟酸内酯的强心苷。两种人胰腺细胞系(SW1990和Panc-1)对华蟾素治疗的治疗应答被评估。基于上表的数据，人们会预测SW1990细胞对华蟾素没有治疗应答，但是Panc-1细胞有。应答数据提供了预期结果。

下述实施例包括强心苷在治疗癌症和肿瘤相关疾病和失调中的功效的证据。实施例21包括治疗具有转移性胰腺胃泌素瘤(metastatic pancreatic gastrinoma)患者的病史。本发明的预后测定、方法及试剂盒可以与本领域已知的具有与过量细胞组织相关的病因学的疾病或失调的一或多种其它预后或诊断测定、方法及试剂盒联合应用。例如，如果临床医生要用强心苷与另一种化疗剂或放疗联合治疗具有癌症或肿瘤的对象，以及已知对象具有的癌症或肿瘤的特定表型对于用所述其它化疗剂或放疗是至少部分应答的，则可以使用本发明确定当用强心苷治疗时对象中的癌症或肿瘤的至少部分治疗应答的概率。如果结果指示癌症或肿瘤对强心苷治疗的治疗应答的概率增加，则临床医生可以处方和/或给予强心苷和其它治疗剂或者放疗或其组合治疗所述癌症或肿瘤。

强心苷可以是已知在具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调的治疗中具有治疗活性的任何强心苷。强心苷可以以纯的形式存在，或者可以作为与一或多种其它化合物的混合物存在。强心苷可以作为提取物存在。提取物可以通过超临界液体(SCF)二氧化碳(CO₂)提取制备或者是这种提取物的化学修饰形式(例如包括乙醇的提取物或者用SCF CO₂和乙醇制备)。提取物可以从植物或动物材料获得。动物材料可以是蟾蜍(例如Bufo bufo)的溢泌物。植物材料可以是植物物质，如得自夹竹桃属物种，如夹竹桃,或者黄花夹竹桃属物种，如黄花夹竹桃(Thevetia nerifolia或Thevetia puruviana)(也已知为黄色夹竹桃)。提取方法可以在夹竹桃叶的干粉上进行，所述干粉根据如下申请所述方法制备，Addington于2005年2月15日提交的目前在审美国临时申请系列号60/653,210，或Addington于2006年1月26日提交的美国申请系列号11/340,016，Addington于2006年7月28日提交的美国申请系列号11/191,650(现在的美国专利7,402,325，2008年7月22日公开),或者2006年7月26日提交的PCT国际专利申请 PCT/US06/29061，其全部内容援引加入本文作参考，或者用本文所述方法制备。

如本文所用，术语“夹竹桃苷”是指所有已知形式的夹竹桃苷，除非另有说明。夹竹桃苷可以外消旋、光学纯的或者光学富集形式存在。夹竹桃植物材料可以得自例如商业植物供应商如Aldridge Nursery,Atascosa,Texas。

提取物可以得自含有强心苷的植物材料的修饰的(例如乙醇)或未修饰的超临界流体提取。超临界流体提取物可以包括至少一种其它药理学活性成分，当提取物被给予对象时其有助于强心苷的治疗功效。其可以加合或者协同帮助强心苷的治疗功效。

提取物可以通过各种不同方法制备。提取物可以根据Dr.Huseyin Ziya Ozel开发的方法制备(美国专利5,135,745),其描述了在水中制备植物提取物的程序。所述水提取物据报道含有一些分子量从2KD到30KD的多糖、夹竹桃苷和夹竹桃苷元、奥多诺甙(odoroside)和夹竹桃它罗苷(neritaloside)。多肽据报道包括酸性均聚半乳糖醛酸(homopolygalacturonans)或者阿拉伯半乳糖醛酸(arabinogalaturonans)。Selvaraj et al.的U.S.Patent No.5,869,060披露了夹竹桃属物种的热水提取物及其生产方法。所得提取物然后可被冻干以产生粉末。美国专利6,565,897(U.S.Pregrant Publication No.20020114852和PCT国际出版物No.WO2000/016793，Selvaraj et al.)披露了用于制备基本上无菌提取物的热水提取方法。Erdemoglu et al.(J.Ethnopharmacol.(2003)Nov.89(1),123-129)披露了基于其抗疼痛和抗炎活性对植物包括夹竹桃的水和乙醇提取物的比较。夹竹桃的有机溶剂提取物披露于Adome et al.(Afr.Health Sci.(2003)Aug.3(2),77-86;乙醇提取物),el-Shazly et al.(J.Egypt Soc.Parasitol.(1996),Aug.26(2),461-473;乙醇提取物),Begum et al.(Phytochemistry(1999)Feb.50(3),435-438;甲醇提取物),Zia et al.(J.Ethnolpharmacol.(1995)Nov.49(1),33-39;甲醇提取物),和Vlasenko et al.(Farmatsiia.(1972)Sept.-Oct.21(5),46-47;醇提取物)。Singh et al.的U.S.Pregrant Patent Application Publication No.20040247660披露了用于治疗癌症的夹竹桃苷的蛋白质稳定化脂质体配制物的制备。Singh et al.的U.S.Pregrant Patent Application Publication No.20050026849披露了含有环糊精的夹竹桃苷的水溶性配制物。Singh et al.的U.S.Pregrant Patent Application Publication No.20040082521披露了来自热水提取物的夹竹桃苷的蛋白质稳定化纳米颗粒配制物的制备。

SCF提取可以在超临界流体中的改性剂如乙醇存在下进行，以增强从植物材料中提取希望的化合物。改性剂通常在超临界流体和被提取化合物之间具有挥发性，它们必须可与超临界流体混溶。在一些实施方案中，改性剂在室温条件下是液体。作为非限制性例子，改性剂可以选自由乙醇、甲醇、丙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等组成的组。

提取物是药理学活性化合物的混合物，如夹竹桃苷或者其它强心苷，oleaside及其它植物材料。来自超临界流体方法的夹竹桃苷含有理论范围为0.9％-2.5％(重量)的夹竹桃苷。已获得包含不同量的夹竹桃苷的SCF提取物。在一个实施方案中，SCF提取物包含大约2％(重量)的夹竹桃苷。

如本文数据证实，SCF提取物包含各种成分的混合物。这些成分的一些包括夹竹桃苷、oleaside A、夹竹桃苷元、夹竹桃它罗苷、奥多诺甙(Wang X，Plomley JB，Newman RA and Cisneros A.LC/MS/MS analyses of anoleander extract for cancer treatment，Analytical Chem.72：3547-3552，2000)，以及其它未鉴别成分。SCF提取物的SCF可提取的未鉴别成分看起来包括有助于SCF提取物中的夹竹桃苷功效的至少一种其它药理学活性成分。即，至少一种其它SCF可提取成分与夹竹桃苷加性或协同作用以提供观测到的功效。

提取物的相对性能还可以不同，如根据对一些肿瘤细胞系的功效所确定。即使如此，如果强心苷以足够高的量或浓度存在于提取物中以能制备治疗相关剂量，则该提取物被认为是本发明的一部分。下表总结了强心苷夹竹桃苷的三种不同形式的一些相对关功效数据。

药物	人黑素瘤BRO细胞 (IC₅₀，μM)	人胰腺癌PANC-1细胞 (IC₅₀，μM)
			纯夹竹桃苷	0.017*	0.01
包含夹竹桃苷和复杂多糖的热水提取物	0.052	0.03
			包含夹竹桃苷和相关强心苷的超临界CO₂提取物	0.007	0.004

*测试的化合物的IC₅₀以那些提取物中的微摩尔(μM)夹竹桃苷当量浓度表示。即，数据表示与未治疗细胞相比抑制50％肿瘤细胞生长或增殖所需的作为游离化合物或者作为提取物部分的夹竹桃苷的浓度。

如上表所示，在Panc-1和BRO细胞中，超临界CO₂提取物的IC₅₀值仅为仅用夹竹桃苷的IC₅₀值的50％，提示夹竹桃的超临界CO₂提取物在抑制Panc-1或BRO细胞生长中比仅用夹竹桃苷强至少2倍。相比之下，热水提取物是这三种测试实体中强度最差的。数据证实夹竹桃苷及提取物抗人类肿瘤细胞系的强细胞毒性，相对强度如下：超临界CO₂提取物＞夹竹桃苷＞热水提取物。这些数据暗示超临界CO₂提取物的细胞毒性可能是由于在SCF提取物中除了夹竹桃苷外还存在至少一种其它药理学活性成分，以及超临界CO₂提取物的强度比热水提取物大得多(7.4倍)。数据清楚证实SCF提取物在功效上比热水提取物甚至夹竹桃苷单独显著改良。功效改良超过仅基于SCF提取物中的夹竹桃苷的增加浓度可以获得的预期改良。

本发明还提供了通过用本发明的有效量的提取物如SCF或水提取物治疗细胞而抑制癌症或肿瘤细胞增殖的方法。

强心苷可以配制成任何合适药物学可接受剂型。肠胃外、耳、眼、鼻、吸入、颊、舌下、肠道、局部、口服、经口及注射剂型是特别有用的。特定剂型包括固体或液体剂型。举例的合适剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、囊片、锭剂(troche)、sache及药物学领域技术人员已知的其它此类剂型。

掺入本发明单位剂量中的夹竹桃苷的量是至少一或多个剂型并且可以根据已知药物原理选择。特别涉及有效量或者治疗相关量的治疗化合物。术语“有效量”应理解是针对例如药物，涉及药物学有效量。药物学有效量是活性成分的量或者数量对于所需的或者希望的治疗应答是足够的，或者换句话说，当给予患者时所述里那个足以引起可观的生物学应答。所述可光的生物学应答可以作为单个或多个单位剂量的活性物质的给予结果而发生。单位剂量可以包含一或多个剂型。应理解对于任一患者的具体剂量水平取决于各种因素，包括被治疗的适应症、适应症严重性、患者健康状况、年龄、性别、体重、饮食、药理学应答、采用的具体剂型及其它此类因素。

口服给予的希望剂量高至是5剂型，当然少如1剂型多达10剂型是可以被给予的。举例的剂型含有0.6mg SCF提取物/剂型，总共0.6-60mg(1-10剂水平)/剂。

强心苷可以存在于剂型中，量足以提供给对象12-1200微克或更多或更少的初始剂量夹竹桃苷。

对于用于治疗哺乳动物，强心苷可以包括在剂型中。一些实施方案的剂型不是肠溶包衣的并且在0.5-1小时或更短时间内释放它们携带的强心苷。一些实施方案的剂型是肠溶包衣的并且在胃下游例如从空肠、回肠、小肠和/或大肠(结肠)释放它们携带的强心苷。肠溶包衣的剂型在口服给予后1-10小时内将强心苷释放进系统循环中。

基于临床前动物剂量数据，预期50-75％给予剂量的夹竹桃提取物是口服可生物利用的，因此每剂型提供0.25至0.4mg、0.1至50mg、0.1至40mg、0.2至40mg、0.2至30mg、0.2至20mg、0.2至10mg、0.2至5mg、0.2至2.5mg、0.2至2mg、0.2至1.5mg、0.2至1mg、0.2至0.8mg、0.2至0.7或者0.25至0.5mg夹竹桃苷。鉴于成年人平均血液体积是5升，预期的夹竹桃苷血浆浓度将在0.05至2ng/ml、0.005至10ng/mL、0.005至8ng/mL、0.01至7ng/mL、0.02至7ng/mL、0.03至6ng/mL、0.04至5ng/mL或者0.05至2.5ng/mL范围内。存在于SCF提取物中的夹竹桃苷的推荐日剂量通常是大约0.25至大约50mg每日二次或者大约0.9至5mg每日二次或者大约每12小时。所述剂量可以是大约0.5至大约100mg/日、大约1至大约80mg/日、大约1.5至大约60mg/日、大约1.8至大约60mg/日、大约1.8至大约40mg/日。最大耐受剂量可以是大约100mg/日、大约80mg/日、大约60mg/日、大约40mg/日、大约38.4mg/日或者大约30mg/日含有夹竹桃苷的夹竹桃提取物，最小有效剂量可以是大约0.5mg/日、大约1mg/日、大约1.5mg/日、大约1.8mg/日、大约2mg/日或者大约5mg/日。

本发明的试剂盒或者组合物可以包括适于分析学或者药学应用的任何赋形剂。

应注意本文的化合物可具有在本发明配制中的一或多种功能。例如，化合物可以同时用作表面活性剂和水混溶溶剂或者同时用作表面活性剂和水不混溶溶剂。

液体组合物可以包含一或多种药物学或分析学可接受的液体载体。液体自体可以是水性、非水性、极性、非极性和/或有机载体。液体载体包括例如但非限于水混溶溶剂、水不混溶溶剂、水、缓冲液及其混合物。

如本文所用，可互换使用的术语“水溶性溶剂”或者“水混溶溶剂”是指不与水形成双相混合物或者在水中足够可溶而提供含有至少5％溶剂的水性溶剂混合物而不液相分离的有机液体。所述溶剂适于给予人或动物。举例的水溶性溶剂包括例如但非限于PEG(聚(乙二醇))、PEG 400(具有大约400的大约分子量的聚(乙二醇))、乙醇、丙酮、烷醇、醇、醚、丙二醇、甘油、醋精(triacetin)、聚(丙二醇)、PVP(聚(乙烯吡咯烷酮))，二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、哌啶、丙醇、N-甲基乙酰胺、丁醇、soluphor(2-吡咯烷酮)、pharmasolve(N-甲基-2-吡咯烷酮)。

如本文所用，可互换使用的术语“水不溶性溶剂”或“水不混溶溶剂”是指与水形成双相混合物或者当溶剂在水中的浓度超过5％时提供相分离的有机液体。所述溶剂适于给予人或动物。举例的水不溶性溶剂包括例如但非限于中/长链甘油三酯、油、蓖麻油、玉米油、维生素E、维生素E衍生物、油酸、脂肪酸、橄榄油、sofiisan 645(二甘油辛酸酯/癸酸酯/硬脂酸酯/羟基硬脂酸己二酸酯)，miglyol，captex(Captex 350：甘油三辛酸酯/癸酸酯/月桂酸甘油三酯；Captex 355：甘油三辛酸酯/癸酸甘油三酯；Captex 355EP/NF：甘油三辛酸酯/月桂酸中链甘油三酯)。

合适溶剂列于“International Conference on Harmonisation of TechnicalRequirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use(ICH)guidance for industry Q3C Impurities：Residual Solvents”(1997)，其推荐何种量的残余溶剂被认为是药物安全的。举例的溶剂列为2类或3类溶剂。3类溶剂包括例如乙酸、丙酮、茴香醚、1-丁醇、2-丁醇、醋酸丁酯、叔丁基甲基醚、枯烯、乙醇、乙醚、醋酸乙酯、甲酸乙酯、甲酸、庚烷、醋酸异丁酯、醋酸异丙酯、醋酸甲酯、甲基-1-丁醇、甲基乙基酮(methylethylketone)、甲基异丁基酮、2-甲基-1-丙醇、戊烷、1-戊醇、2-戊醇或者醋酸丙酯。

可以在本发明中用作水不混溶溶剂的其它材料包括：Captex 100：丙二醇二癸酸酯；Captex 200：丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯；Captex 200P：丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯；丙二醇二辛酸(Dicaprylo)癸酸酯；Captex 300：甘油三辛酸酯/癸酸酯；Captex 300EP/NF：甘油三辛酸酯/癸酸酯中链甘油三酯；Captex350：甘油三辛酸酯/癸酸酯/月桂酸酯；Captex 355：甘油三辛酸酯/癸酸酯； Captex 355EP/NF：甘油三辛酸酯/癸酸酯中链甘油三酯中链甘油三酯；Captex 500：醋酸甘油；Captex 500P：醋酸甘油(药物级)；Captex 800：丙二醇二(2-Ethythexanoate)；Captex 810D：甘油三辛酸酯/癸酸酯/亚油酸酯；Captex1000：甘油三癸酸酯；Captex CA：中链甘油三酯；Captex MCT-170：中链甘油三酯；Capmul GMO：甘油单油酸酯；Capmul GMO-50EP/NF：甘油单油酸酯；Capmul MCM：中链甘油一酯&甘油二酯；Capmul MCM C8：甘油单辛酸酯；Capmul MCM C10：甘油单癸酸酯；Capmul PG-8：丙二醇单辛酸酯；CapmulPG-12：丙二醇单月桂酸酯；Caprol 10G10O：十甘油十油酸酯；Caprol 3GO：三甘油单油酸酯；Caprol ET：混合脂肪酸的聚甘油酯；Caprol MPGO：六甘油二油酸酯；Caprol PGE 860：十甘油单、二油酸酯。

如本文所用，“表面活性剂”是指包含极性或者带电荷的亲水性成分以及非极性疏水性(亲脂性)成分的化合物，即表面活性剂是两性分子。术语表面活性剂可以是指一种化合物或者化合物混合物。表面活性剂可以是增溶剂、乳化剂或者分散剂。表面活性剂可以是亲水性或者疏水性的。

亲水性表面活性剂可以是适用于药物组合物中的任何亲水性表面活性剂。这种表面活性剂可以是阴离子、阳离子、两性离子或者非离子表面活性剂，优选非离子亲水性表面活性剂。如上所述，这些非离子表面活性剂通常具有高于大约10的HLB值。亲水性表面活性剂的混合物也包含在本发明范围内。

相似地，疏水性表面活性剂可以是适用于药物组合物中的任何疏水性表面活性剂。通常地，合适的疏水性表面活性剂具有低于大约10的HLB值。疏水性表面活性剂的混合物也包含在本发明范围内。

举例的其它合适的增溶剂包括：醇和多元醇，如乙醇、异丙醇、丁醇、苯甲醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇及其异构体、甘油、季戊四醇、山梨醇、甘露醇、transcutol、二甲基异山梨醇(dimethyl isosorbide)、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素及其它纤维素衍生物、环糊精及环糊精衍生物；平均分子量为大约200-6000的聚乙二醇醚，如四氢化糠基醇PEG醚(glycofurol，可商购自BASF，商品名为Tetraglycol)或者甲氧基PEG(Union Carbide)；酰胺，如2-吡咯烷酮、2-哌啶酮、己内酰胺、N-烷基吡咯烷酮、N-羟烷基吡咯烷酮、N-烷基哌啶酮、N-烷基己内酰胺、二甲基乙酰胺、和聚乙烯吡咯烷酮；酯，如丙酸乙酯、柠檬酸三丁酯、柠檬酸乙酰基三乙酯、乙酰基柠檬酸三丁酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸甘油酯、丙二醇一乙酸酯、丙二醇二乙酸酯、己内酯及其异构体、戊内酯及其异构体、丁内酯及其异构体；及本领域已知的其它增溶剂如二甲基乙酰胺、二甲基异山梨醇酯(Arlasolve DMI(ICI))、N-甲基吡咯烷酮(Pharmasolve(ISP))、单辛精(monooctanoin)、二乙二醇单乙醚(可得自Gattefosse，商品名为Transcutol)和水。增溶剂的混合物也包含在本发明范围内。

除非另有说明，本文所述化合物可易于得自标准商业来源。

所述清澈的液体组合物在目测是清澈的，其含有基于组合物总重量低于5％、低于3％或者低于1％重量的悬浮固体。

尽管不是必需的，本发明的组合物或者试剂盒可包含螯合剂、防腐剂、抗氧化剂、吸附剂、酸化剂、碱化剂、防沫剂、缓冲剂、着色剂、电解质、盐、稳定剂、张力改性剂、稀释剂、其它药物赋形剂，或者这些材料的组合。

如本文所用，术语“抗氧化剂”是指抑制氧化的物质，因此用于防止制备物由于氧化而变质。这种化合物包括例如但不限于抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、维生素E、维生素E衍生物、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、次磷酸、硫代甘油、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、次硫酸氢钠甲醛、偏亚硫酸氢钠及本领域技术人员已知的其它这种材料。

如本文所用，术语“螯合剂”是指螯合溶液中金属离子的化合物。举例的螯合剂包括EDTA(乙二胺四乙酸四钠)、DTPA(二乙烯三胺五乙酸五钠)、HEDTA(N-(羟乙基)-乙撑二胺三乙酸的三钠盐)、NTA(次氮基三乙酸钠)、羟乙基亚氨基二乙酸二钠(Na₂EDG)、二(2-羟乙基)甘氨酸钠(DEGNa)、柠檬酸以及本领域技术人员已知的其它化合物。

如本文所用，术语“吸附剂”是指能通过物理或者化学(化学吸附)方式使其它分子保持在其表面上的物质。这种化合物包括例如但不限于粉末状和活性炭以及本领域技术人员已知的其它材料。

如本文所用，术语“碱化剂”是指用于提供碱性基质的化合物。这种化合物包括例如但不限于氨水溶液、碳酸铵、二乙醇胺、单乙醇胺、氢氧化钾、硼酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、三乙醇胺(triethanolamine)和三乙醇胺(trolamine)以及本领域技术人员已知的其它碱化剂。

如本文所用，术语“酸化剂”是指用于提供酸性基质的化合物。这种化合物包括例如但不限于乙酸、氨基酸、柠檬酸、反丁烯二酸及其它α羟酸、盐酸、抗坏血酸和硝酸以及本领域技术人员已知的其它酸化剂。

如本文所用，术语“防沫剂”是指防止或者减少在充填组合物的表面上形成的泡沫量的化合物。合适的防沫剂包括例如但不限于二甲硅油、SIMETHICONE、辛苯昔醇及本领域技术人员已知的其它防沫剂。

如本文所用，术语“缓冲剂”是指在稀释或者加入酸或者碱时用于抵抗pH改变的化合物。这种化合物包括例如但不限于偏磷酸钾、磷酸钾、一价乙酸钠(monobasic sodium acetate)及无水和脱水柠檬酸钠以及本领域技术人员已知的其它这种材料。

如本文所用，术语“稀释剂”或者“充填剂”是指用作充填剂以在片剂和胶囊的制备中产生的希望的体积(bulk)、流体性质和压缩特性的惰性物质。这种化合物包括例如但不限于磷酸氢钙、高岭土、乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素、粉末状纤维素、沉淀的碳酸钙、山梨醇和淀粉以及本领域技术人员已知的其它材料。

如本文所用，术语“防腐剂”是指用于防止微生物生长的化合物。这种化合物包括例如但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、西吡氯铵、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯基汞、乙酸苯汞、硫柳汞、间甲酚、肉豆蔻酰gamma氯化甲基吡啶鎓(myristylgamma picolinium chloride)、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠、山梨酸、麝香草酚及甲基、乙基、丙基或者丁基对羟苯甲酸酯以及本领域技术人员已知的其它防腐剂。

如本文所用，术语“着色剂”是指用于使药物制备物着色的化合物。这种化合物包括例如但不限于FD&C Red No.3、FD&C Red No.20、FD&C Yellow No.6、FD&C Blue No.2、FD&C Green No.5、FD&COrange No.5、FD&C Red No.8、焦糖和氧化铁(黑色、红色、黄色)，其它FD&C染料以及天然着色剂如葡萄皮提取物、红甜菜粉末、β-胡萝卜素、胭脂树萃、胭脂红、姜黄、红辣椒粉、这些材料和组合以及本领域技术人员已知的其它这种材料。

如本文所用，术语“稳定剂”是指用于使活性成分在降低所述活性成分的治疗活性的物理、化学或者生物化学过程中处于稳定的化合物。合适的稳定剂包括例如但不限于白蛋白、硅酸、肌酸酐、甘氨酸及其它氨基酸、烟酰胺、乙酰色氨酸钠、氧化锌、蔗糖、葡萄糖、乳糖、山梨醇、甘露醇、甘油、聚乙二醇、辛酸钠和糖精钠及本领域技术人员已知的其它稳定剂。

如本文所用，术语“张力改性剂”是指可用于调节液体配制物张力的化合物。合适的张力改性剂包括甘油、乳糖、甘露醇、葡萄糖、氯化钠、硫酸钠、山梨醇、海藻糖及本领域技术人员已知的其它改性剂。

实施例3和实施例6描述了举例的胶囊剂型。实施例12描述了举例的片剂剂型。

本发明的组合物也可以包括油如不挥发油、花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油；脂肪酸如油酸、硬脂酸和异硬脂酸；以及脂肪酸酯如油酸乙酯、豆蔻酸异丙酯、脂肪酸甘油酯和乙酰脂肪酸甘油酯。所述组合物也可以包含醇如乙醇、异丙醇、棕榈醇、甘油醇和丙醇；甘油缩酮如2，2-二甲基-1，3-二氧戊烷-4-甲醇；醚如聚乙二醇450；石油烃如矿物油和矿脂；水；药物合适的表面活性剂、悬浮剂或者乳化剂；或者这些材料的混合物。

应理解药物配制领域中使用的化合物通常有多种功能或者目的。因此，如果在本文指定的化合物仅提及一次或者用于定义一个以上的术语，其目的或者功能不应仅限于指定的目的或者功能。

所述配制物的一或多种成分可以其游离碱或者药物学或者分析学可接受的盐形式存在。如本文所用，“药物学或者分析学可接受的盐”是指这样的化合物，其已经根据需要通过与酸反应形成离子化结合对而被修饰。举例的可接受的盐包括例如从无毒性无机酸或者有机酸中形成的常规的无毒性盐。合适的无毒性盐包括得自无机酸的那些盐，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磺酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸及本领域技术人员已知的其它无机酸。从有机酸中制备的盐如氨基酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、顺丁烯二酸、羟基顺丁烯二酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、反丁烯二酸、甲基苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙基磺酸及本领域技术人员已知的其它有机酸。其它合适的盐可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，17^th.ed.，Mack PublishingCompany，Easton，PA，1985，p.1418所示，相关揭示在此并入本文作参考。

如本文所用，短语“药物学可接受的”是指那些化合物、材料、组合物和/或剂型在合理的医生判断范围内适用于与人和动物组织接触，而无过分的毒性、刺激、变态反应或者任何其它问题或者并发症，与合理的益处/危险比率相称。

鉴于上述描述和下文实施例，本领域技术人员能不用过度实验而根据要求实施本发明。参考如下详细描述本发明实施方案的制备程序的实施例可以更好地理解前文所述内容。所有这些实施例只是为举例说明之目的。如下实施例不应被理解为是详尽的，而只是举例说明本发明涵盖的一小部分实施方案。

夹竹桃苷和MTT购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。BODIPY-夹竹桃苷、Mito-Tracker Red CM-H2Xros、钙荧光素乙酰氧基甲酯(CAM)和4’-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)得自Molecular Probes-Invitrogen Corporation(Carlsbad，CA)。抗-β-肌动蛋白抗体也购自Sigma。

人胰腺癌细胞：Panc-1，BxPC3，MiaPaca；人结肠癌细胞系：CaCO-2，DOD-1，HCT-116，HT29，RKO和LST174；啮齿动物黑素瘤B16细胞；人乳腺癌细胞：SUM149，MCF-7和MDA231；人口腔癌细胞：SCC9和CAL-27；人卵巢癌ES3，TOV1120和SKOV细胞及人非小细胞肺癌A549和H1299细胞得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，在37℃保持在含有5％CO₂的湿润环境中。人黑素瘤BRO细胞由StehlinFoundation(Houston，TX)惠赠。将得自不同上皮来源的细胞系在补加10％热失活的胎牛血清(FBS)Hyclone Laboratories Inc.，Logan，UT)、50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素以及得自GIBCO(Invitrogen)的2mM L-谷氨酰胺的组织培养基(Invitrogen Corp.，Grand Island，NY)(表1)中常规培养。

实施例1：对粉末状夹竹桃叶的超临界流体提取

方法A：使用二氧化碳

通过收获、洗涤和干燥夹竹桃叶材料，然后利用如在美国专利No.5,236,132、5,598,979、6,517,015和6,715,705中描述的那些粉碎和脱水设备处理所述夹竹桃叶材料，由此制备粉末状夹竹桃叶。使用的起始材料的重量为3.94kg。

将所述起始材料与纯CO₂在300巴(30MPa，4351psi)压力和50℃(122°F)温度下在提取装置中组合。使用共197kg的CO₂，以提供溶剂与原材料比率为50∶1。然后将CO₂与原材料的混合物经过分离装置，该装置改变混合物的压力和温度，并且从二氧化碳中分离提取物。

获得褐色的、粘稠的具有芳香气味的提取物(65g)。所述颜色可能是由于叶绿素所致。对于提取物产量确定，将试管和分离仪器用丙酮冲洗，并且使丙酮蒸发，提供另外的9g提取物。提取物总量为74g。基于起始材料的重量，提取物的产量为1.88％。通过使用高压液相层析和质谱分析计算出提取物中夹竹桃苷的含量为560.1mg，或者产量为0.76％。

方法B：使用二氧化碳与乙醇的混合物

通过收获、洗涤和干燥夹竹桃叶材料，然后利用如在美国专利No.5,236,132、5,598,979、6,517,015和6,715,705中描述的那些粉碎和脱水设备处理所述夹竹桃叶材料，由此制备粉末状夹竹桃叶。使用的起始材料的重量为3.85kg。

将所述起始材料与纯CO₂和作为改性剂的5％乙醇在280巴(28MPa，4061psi)压力和50℃(122°F)温度下在提取装置中组合。使用共160kg的CO₂和8kg乙醇，以提供溶剂与原材料比率为43.6∶1。然后将CO₂、乙醇与原材料的混合物经过分离装置，该装置改变混合物的压力和温度，并且从二氧化碳中分离提取物。

在除去乙醇后，获得墨绿色的、粘稠的明显含有一些叶绿素的提取物(207g)。基于起始材料的重量，提取物的产量为5.38％。通过使用高压液相层析和质谱分析计算出提取物中夹竹桃苷的含量为1.89g，或者产量为2.1％。

实施例2：粉末状夹竹桃叶的热水提取

热水提取典型用于从夹竹桃叶中提取夹竹桃苷及其它活性成分。举例的热水提取方法可见于美国专利No.5,135,745和5,869,060所述。

使用5g粉末状夹竹桃叶进行热水提取。向粉末状夹竹桃叶中加入10体积的沸水(基于夹竹桃起始材料的重量)，将该混合物持续搅拌6小时。然后过滤该混合物，收集叶片残渣，在相同条件下再次提取。组合过滤物并冻干。提取物的外观为褐色。干燥的提取物材料重量为大约1.44g。将34.21mg所述提取物材料溶解于水中，使用高压液相层析和质谱分析进行夹竹桃苷含量分析。确定夹竹桃苷的量为3.68mg。基于提取物的量，计算出夹竹桃苷产量为0.26％。下表示出实施例1的两种超临界二氧化碳提取与热水提取之间的夹竹桃苷产量对比。

产量对比

提取介质	基于总提取物重量的夹竹桃苷产量
		超临界二氧化碳：实施例1，方法A	0.76％
超临界二氧化碳：实施例1，方法B	2.1％
		热水提取：实施例2	0.26％

实施例3：细胞系

人胰腺癌细胞：Panc-1，BxPC3，MiaPaca；人结肠癌细胞系：CaCO-2，DOD-1，HCT-116，HT29，RKO和LST174；啮齿动物黑素瘤B16细胞；人乳腺癌细胞：SUM149，MCF-7和MDA231；人口腔癌细胞：SCC9和CAL-27；人卵巢癌ES3、TOV1120和SKOV细胞，或者人非小细胞肺癌A549和H1299细胞得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，将这些细胞维持在37℃含有5％CO₂的湿润环境中。人黑素瘤BRO细胞由Stehlin Foundation(Houston，TX)惠赠。将衍生自不同上皮来源的细胞系在补加了10％热失活的胎牛血清(FBS)(Hyclone Laboratories Inc.，Logan，UT)、50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素以及得自GIBCO(Invitrogen)的2mM L-谷氨酰胺的组织培养基(Invitrogen Corp.，Grand Island，NY)(表1)中常规培养。

实施例4：细胞毒性的体外确定

将细胞在如下表所示其相应培养基中以1×10⁴个细胞/孔的密度生长。在保温24小时后，用不同浓度的夹竹桃苷(1-500nM)处理细胞。再过72小时后，通过MTT测定法(23)评定细胞增殖抑制情况。使用V-Max Micro-plate Reader by Molecular Devices，Inc.(Sunnyvale，CA)，在570nm波长及650nm参考波长读取吸光度。通过在使细胞生长一段时间(例如24-72小时)之后对比经处理和未处理的细胞数目，可以获得相对的细胞增殖的抑制程度，所述抑制是由于存在指定浓度的夹竹桃提取物或者含有强心苷化合物的其它植物提取物所致。

细胞名称	表型描述	细胞培养基
			PANC-1	人胰腺癌	DMEM/10％FBS
BXPC3	人胰腺腺癌	RPMI 164/10％FBS/丙酮酸钠(NaP)
			MiaPaca	人胰腺腺癌	DMEM/10％FBS/2％马血清
MDA 231	乳腺癌	DMEM/10％FBS
			SUM 149	乳腺癌	F12/5％FBS/HEPES/胰岛素/氢化可的松
CaCO2	结肠癌	RPMI 1640/10％FBS
			DOD-1	结肠癌	RPMI 1640/10％FBS
HCT 116	结肠癌	RPMI 1640/10％FBS
			HT 29	结肠癌	RPMI 1640/10％FBS
LIS-174t	结肠癌	MEM/10％FBS/NaP/NEAA
			BRO	急性淋巴细胞性白血病	MEM/10％FBS/NaP
SCC-9	口腔鳞鳞状细胞癌	DMEM/10％FBS
			CAL27	口腔鳞鳞状细胞癌	DMEM/10％FBS
MCF-7	乳腺癌	MEM/10％FBS/胰岛素/氢化可的松/EGF

注意：DMEM＝Dulbecco’s修改的Eagle’s培养基；MEM＝极限必需培养基；FBS＝胎牛血清；NEAA＝非必需氨基酸；EGF＝表皮生长因子。

实施例5：细胞吸收强心苷的确定

在用夹竹桃苷的荧光类似物BODYPI-夹竹桃苷处理之后，通过荧光显微镜确定Panc-1(最高比率α3∶α1同种型)细胞和BxPC3细胞(较低比率α3∶α1)中夹竹桃苷和乌本苷的吸收情况。将96孔平板中的细胞用0、5、20和50nM夹竹桃苷处理2小时或者24小时。在具有0.5％胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行处理。将细胞与MitoTracker Red CM-H₂XRos(1μM)和选择性核染料DAPI(1ng/ml)(Molecular Probes)同时保温。使用Olympus IX-70倒置显微镜，通过荧光显微镜方法评定核形态、DNA和线粒体染料吸收情况。使用Quantix电荷耦合器相机和IP Labs软件(Scanalytics，Inc.，Fairfax，VA)获得图像。在培养层粘连蛋白包被细胞培养玻片上培养的以及用BODIBY-夹竹桃苷处理1小时的细胞中确定野生型及用α3siRNA转染的Panc-1细胞中夹竹桃苷吸收情况的改变。

实施例6：Na，K-ATP的α3和α1同种型表达的确定

将细胞用冷却的PBS洗涤，及在存在裂解缓冲液(20mM MOPS，2mM EGTA，5mM EDTA，30mM NaF，40mM β-甘油磷酸，20mM丙酮酸钠，0.5％Triton X-100和1mM原钒酸钠与蛋白酶抑制剂混合物)的条件下刮下。然后将细胞裂解物在冰上超声处理3分钟，在4℃再保温10分钟，之后在14,000×g(10分钟，4℃)离心。通过BioRad Dc蛋白质测定(BioRad，Inc.，Hercules，CA)量化蛋白质水平。将等水平的蛋白质(50μg)应用于预制凝胶(BioRad)，然后根据标准方法移至聚偏二氟乙烯膜上。在具有0.1％Tween 20的Tris-缓冲盐水中制备的5％脱脂乳封闭缓冲液中保温1-2小时之后，用在封闭缓冲液中1∶2,000稀释的α3(Affinity Bioreagents，Golden，CO)和α1(Upstate，Lake Placid，NY)同种型的一抗探查所述膜。使用ECL+检测试剂盒和hyper-film(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)通过化学发光观测蛋白质条带。通过Western印迹举例说明相等荷载的样品的β-肌动蛋白的存在。使用Alpha DigiDoc 1000软件(Alpha Innotech Corp.，San Leandro，CA)量化蛋白质条带。

实施例7：皮肤相关疾病如癌症的治疗，包括但不限于黑素瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌，以及非癌炎症性皮肤病，包括但不限于光化性角化病、银屑病和湿疹的预防性治疗。

将SCF提取物给予患有恶性或者非恶性增殖性皮肤病如上述皮肤病的对象。所述SCF提取物作为乳液或者软膏或者包含于皮肤贴片中给予对象，每单位剂量含有0.01mg-10mg的SCF提取物。给予对象每日三次单位剂量，共给予1-14天，或者直至所述皮肤病好转。预期这种治疗明显减轻或者消除炎症和导致疾病进展的恶性过程。所述对象可能经历皮肤损害的严重性降低以及其自身皮肤疾病可能解决。预期恶性疾病的生长速度降低或者疾病的严重性的增加得以抑制。预期已确定的恶性损害实际上得以消退。

实施例8：皮肤相关疾病如皮肤癌的预防

将SCF提取物给予具有易患皮肤癌倾向的对象，所述对象如经常暴露于紫外光(日光)或者化学致癌物质的那些对象。所述SCF提取物作为乳液或者软膏或者包含于皮肤贴片中给予对象，每单位剂量含有0.01-10mg的SCF提取物。每当预计暴露于促进致癌的环境(暴露于日光)时，每天三次给予所述对象单位剂量。这种给予可例如制成遮光剂以阻断日光UV暴露，且SCF提取物可用于防止皮肤组织中肿瘤诱导。预期SCF在护肤品中的这种应用将阻断恶性皮肤疾病或者非恶性皮肤疾病的形成和/或进展，在这些疾病中，增殖导致疾病恶化(例如光化性角化病、银屑病和/或湿疹)。

实施例9：人或者其它脊椎动物中实体肿瘤的治疗

含有强心苷的植物或者动物的SCF提取物可用于治疗直肠癌、肛门癌、结肠直肠癌、头颈癌、食管组织癌、肺癌(非小细胞癌及小细胞癌)、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、输尿管癌、卵巢癌、类癌瘤、骨肉瘤、间皮瘤和中枢神经系统肿瘤。

将SCF提取物给予患有如上述那些实体瘤的对象。所述SCF提取物以口服剂型给予，每单位剂量含有1-50mg的SCF提取物。每日两次给予所述对象单位剂量，每个治疗周期为28天。也许需要三个治疗周期。所述对象将经历肿瘤生长增殖速度减慢或者消退。可能出现肿瘤完全消退。SCF提取物治疗可用作唯一治疗剂或者与细胞毒性化疗或者放疗组合，或者可以与合适的免疫治疗组合，而不导致不适当地干扰常规治疗的预期抗肿瘤效力。

实施例10：在两个人肿瘤细胞系中使用超临界CO₂制成的夹竹桃(Nerium oleander)热水提取物与SCF提取物的细胞毒性对比

直接对比这两种提取物的夹竹桃苷的细胞毒性潜力。尽管由于提取物中存在的夹竹桃苷浓度而导致其夹竹桃苷浓度不同，但是样品含有相同量的夹竹桃苷。

将BRO(人黑素瘤)和Panc-1(人胰腺癌)细胞(8×10³/孔)铺板于96孔平板中，使其生长过夜。然后向细胞中加入药物或者提取物。在保温72小时后，通过结晶紫染色法评定相对细胞增殖情况(相对于对照的未处理细胞)。

实施例11：含有夹竹桃苷的溶液的HPLC分析

使用如下条件在HPLC(Waters)上分析样品(夹竹桃苷标准，SCF提取物和热水提取物)：Symmetry C18column(5.0μm，150×4.6mm I.D.；Waters)；流动相MeOH:water=54:46(v/v)，流速=1.0ml/分钟。检测波长设为217nm。通过将所述化合物或者提取物溶解于固定量的HPLC溶剂中制备样品，达到适当的夹竹桃苷靶浓度。

实施例12：SCF提取物的抗病毒活性评估

该检测包括确定夹竹桃提取物或者阳性对照物(AZT)抑制人周围血单核细胞(PBMC)中HIV-1的ROJO毒株增殖的相对能力。将感染的细胞暴露于所述药物或者提取物48小时。该检测用于确定相对于所述提取物能杀死人PBMC的浓度的夹竹桃提取物的IC₅₀(提取物产生的使病毒增殖抑制50％的浓度)。实际上也就是确定所述提取物的治疗指数。这主要是确定所述提取物是否能杀死HIV-1而不杀死PBMC细胞自身。

观测到针对病毒增殖的IC₅₀为大约5.0μg/ml或更低，而杀死细胞需要的浓度在甚至高如100μg/ml的浓度还未达到，获得的数据提示夹竹桃提取物应可用于抑制HIV-1病毒增殖或者PBMC细胞内病毒的感染性。

实施例13：用α3siRNA转染Panc-1细胞

将Panc-1细胞铺板于6孔和48孔平板中，使其生长过夜。根据厂商指导，使用siPORT^TM Amine Transfection Agent(Ambion Austin，TX)和0.4μMα3沉默RNA(Santa Cruz Biotech.)进行α3siRNA分子的瞬时转染。在转染24小时后，将细胞用10-50nM夹竹桃苷处理48小时。从6孔平板中收集蛋白质进行Western印迹分析，通过Calcien AM染色进行细胞生存力评定。

实施例14：正常结肠组织和结肠生物活检组织中α3和α1表达的确定

获得新鲜冷冻的正常结肠粘膜和肿瘤组织生物活检组织，使用液氮冷却研钵研磨成粉。将样品暴露于上述裂解缓冲液。然后将裂解物在冰上进行超声处理3分钟，在4℃保温10分钟，及在14,000rpm(10分钟，4℃)离心，随后如先前所述对α-亚基的α3和α1同种型进行Western印迹分析。

实施例15：统计学分析

使用Student’s t检验确定各个实验组之间的统计学差异；P＜0.05被认为有统计学意义。

实施例16：α3抗体敏感性确定

为了对比不同的α3抗体的敏感性，根据标准方法将阳性和阴性对照样品的等量相同裂解物加样于3个预制凝胶上(BioRad，Inc.，Hercules，CA)，然后移至聚偏二氟乙烯膜上。在具有0.1％Tween 20的Tris-缓冲盐水(TBS-T)中制备的5％脱脂乳封闭缓冲液中保温1-2小时之后，用在封闭缓冲液中1∶2,000稀释的α3抗体探查所述膜，所述α3抗体得自Sigma(StLuoise，MO)、Affinity Bioreagents(Golden，CO)和Novus(Littleton，CO)。使用Chemiglow West检测试剂盒和Alpha Imager(Alpha InnotechCorp.，SanLeandro，CA)，通过化学发光观测蛋白质条带。使用Alpha DigiDoc 1000软件(Alpha Innotech Corp.，San Leandro，CA)，量化并对比三个抗体之间的蛋白质条带。通过针对β--肌动蛋白的Western印迹举例说明每种加样的样品。数据表明每种选择的α3抗体的敏感性基本相同。

α3单克隆抗体的来源	平均密度*
		Affinity Bioreagents	45174
Novus	41110
		Sigma	44572

*平均密度基于每个条带的绝对密度除以通过Alpha DigiDoc 1000量化的指定区域计算。

实施例17：进行预后测定的试剂盒

根据本发明的方法，这个试剂盒可用于通过使用Western印迹技术进行预后测定，如实施例18详细描述。

1.裂解组合物

	5ml	来自原液浓度
			20mM Tris HCL pH 8.0	100ul	1M
137mM NaCl	685ul	1M
			10％甘油	500ul
5mMEDTA	25ul	1M
			1％NP-40	50ul
蛋白酶抑制剂混合物 (Sigma，Cat#P8340)	50ul
			1mM原钒酸钠	50ul	100mM
H₂O	3540ul

2.一抗：(在封闭溶液中1∶2000稀释)

α3(Affinity Bioreagents Cat#MA3-915)

α1(Upstate Cat#05-369)

3.二抗：山羊抗小鼠IgG HRP(Santa Cruz Cat#sc-2005)

4.凝胶/膜制备：

7.5-10％凝胶(BioRad Precast)

BioRad Laemmli样品缓冲液(Cat#161-0737)

分子量标记(Cat#161-0318)

运行缓冲液(BioRad 10X Tris/glycine/SDS)(Cat#161-0732)

膜(Biorad PVDF)

转移缓冲液：

3.03g Tris(终浓度-25mM)

14.4g 甘氨酸(终浓度-0.192mM)

200ml甲醇(20％)

直至1L H₂O

5.封闭溶液：于TBS(20mM Tris HCl，150mM NaCl)中5％乳

6.洗涤缓冲液：TBS-T(20mM Tris HCl，150mM NaCl，0.05％Tween-20)

8.阳性对照细胞：人胰腺癌Panc-1细胞的细胞裂解物

9.阴性对照细胞：小鼠黑素瘤B16细胞

10.包括详细描述α-亚基同种型的western印迹分析方案的说明书。

实施例18：细胞组织的制备

方法A：从细胞团中制备

获得含有2-4百万个细胞的细胞团。用生理平衡溶液(PBS)冲洗以除去培养基。加入100μl裂解缓冲液。总是保持冷却(在冰上)。继续在实施例18中的超声步骤。

方法B：从平板上的细胞中制备

使1.2-1.5百万个细胞在100mm组织培养平板上生长24小时。小心地轻轻倒出及弃去细胞生长培养基。将该平板用1ml PBS冲洗2次。加入100μl裂解缓冲液，从平板刮下细胞，收集在试管中。总是保持冷却(在冰上)。继续实施例18中的超声步骤。

方法C：从组织中制备

研磨冷冻的组织。将经研磨的组织置于试管中。在最小的5mg研磨的组织中加入100μl冷却的裂解缓冲液。总是保持冷却(在冰上)。继续实施例18中的超声步骤。

实施例19：通过Western印迹确定样品中α-亚基同种型的含量

如下程序只是其中本发明的方法可用于检测和量化样品中Na，K-ATP酶的α-亚基同种型含量的一种方式。可以根据需要修改步骤顺序。Western印迹分析：

1.冷却的同时对细胞裂解物进行超声处理，如使用冰浴保持冷却。

2.在4℃以14,000rpm旋转裂解物10分钟。

3.收集上清，总是保持在冰上。

4.通过蛋白质测定确定蛋白质水平。(见

蛋白质分析试剂盒说明书)

5.制备样品，基于蛋白质分析加样于凝胶上(50μg蛋白质/孔)。

a.与样品一起制备阳性和阴性对照裂解物。

i.阳性对照物：Panc-1蛋白质裂解物

ii.阴性对照物：Panc-2或者B16蛋白质裂解物。

b.向样品和对照物中加入laemmli样品缓冲液(LSB)(见LSB说明书)

c.在95℃加热样品与对照物5分钟。

d.旋转样品。

6.加样凝胶

7.在200伏特电压下运行凝胶，直至染料从凝胶底部去除。

8.在100伏特转移1-2小时。

9.在室温在封闭缓冲液中使膜封闭30分钟至1小时。

10.将该膜在4℃保温过夜。

11.用洗涤缓冲液洗涤该膜：

3次快速洗涤，1-15分钟洗涤，2-10分钟洗涤

12.将该膜在室温在II°抗体中保温45分钟至1小时。

13.用洗涤缓冲液洗涤该膜：

3次快速洗涤，1-15分钟洗涤，2-10分钟洗涤

14.将该膜在ECL+(Amersham Cat#RPN2132)中保温5分钟。

15.将该膜曝光于胶片(Amersham Cat#RPN3114k)，在胶片冲洗装置上成像。

16.使用Alpha成像仪使用Alpha Digi Doc软件(或者你目前的成像仪)获取曝光的胶片图像。

17.使用Spot Denso application of the Analysis tools in Alpha Digi Doc，选择α1和α3图像的相应条带。

18.获得每个条带的累积光密度值(IDV)。

19.计算α3同种型与α1同种型的比率。

实施例20：确定Na，K-ATP酶特定α亚基的mRNA的RT-PCR方法

RNA STAT-60试剂(Tel-Test，Inc.，Friendswood，TX)用于提取总RNA，将其用DNase I处理，之后用于逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)中。将1μg RNA用小鼠乳腺肿瘤病毒RT(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)逆转录。通过引物系列α3-NKA3VSAS-2-F 5′-NNNNNNNNNN-3′(正向)(SEQ ID NO.3)和-R 5′-NNNNNNNN-3′(反向)扩增α3-371bp序列。设计这些引物系列以及额外的引物系列，并且使用Oligo 6.7Molecular BiologyInsights(Cascade，CO)核实。引物对(5′-CAGCTCTGGAGAACTGCTG-3′(SEQ ID NO.1)和5′-GTGTACTCAGTCTCCACAGA-3′(SEQ ID NO.2))用于RT-PCR分析中，以检测GAPDH mRNA。

实施例21：含有强心苷的提取物与其它抗癌药物联合治疗转移的胰腺胃泌素瘤的临床评估

下文是用含有强心苷的提取物治疗转移的胰腺胃泌素瘤患者的病历。

2002年8月30日在M.D.Anderson Cancer Center就诊的怀疑患有胰腺疾病的63岁老年男性。CT扫描显示胰尾肿块。在2002年9月17日患者开始自己服用含有强心苷-主要是夹竹桃苷-的实验药物。在2002年10月9日，患者被诊断为患有高分化的胰腺胰岛细胞肿瘤。建议患者进行8个周期的阿霉素、streptozocin和5-FU化疗，随后进行3个周期streptozocin和5-FU化疗。在2002年11月13日，患者开始建议的治疗同时继续自己服用含有夹竹桃苷的药物。在2003年7月23日，患者结束建议的化疗方案。其原始诊断无改变。在2003年7月23日之后，患者不再接受化疗。在化疗方案结束后，患者继续自己服用含有强心苷的提取物。在2007年2月16日，患者被描述为具有放射学稳定疾病(radiologically stable disease)。患者继续自己服用含有强心苷如夹竹桃苷的提取物，Karnofsky评分结果为无症状及评分100分。

实施例22：含有强心苷的提取物治疗腺癌的临床评估

一名35岁男性在进食规律饮食之后出现腹部疼痛和腹胀。他在私人诊所就诊，对其进行螺旋腹部计算机辅助X断层扫描(CAT)。结论是其胰头体积增大，胰腺实质密度不均匀，以及在胰头前方有多个病变淋巴结。磁共振成像(MRI)检查证实这些发现。同一天进行超声辅助的细针穿刺活检。超声检查证实在胰头的39×33mm肿瘤。对生物活检样品进行的组织病理学检验显示诊断为腺癌。建议进行化疗，但是患者拒绝。

一个月后，患者开始自己服用含有极少量夹竹桃苷的植物提取物治疗剂。在一个月内获得的上腹部MR图像证实对比之下胰头上剩余的损害为35×25mm。也显示出在胰头前方以及胃窦背侧的多个病变淋巴结，最大一个为5mm。

在随后三个月获得的MRI图像示出胰腺内的肿瘤经测量为30×25mm。此时增加含有少量夹竹桃苷的提取物的剂量。三周后进行骨闪烁扫描。无明显转移肿瘤。七周后获得的上腹部和下腹部MRI图像证实胰头内的肿瘤和所有病变淋巴结均有消退迹象。两个月后获得的上腹部和下腹部MRI无明显胰腺腺癌和/或淋巴结病变。四个月后进行上腹部和下腹部MRI。持续表明无明显胰腺腺癌和转移肿瘤迹象。

在2007年3月，患者持续表现为肿瘤消退。

实施例23：癌症和肿瘤细胞的培养

可以根据需要修改如下程序，以优化特定癌症和肿瘤细胞的培养。Panc-1人胰腺癌细胞购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。将细胞在补加10-15％胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)、100U/ml青霉素(Invitrogen)和2.5μg/ml抗真菌剂(antimycotic)(Fungizone；Invitrogen)的 DMEM培养基中在37℃在5％CO₂中培养。在持续暴露于系列浓度的每种药物72小时之后，确定夹竹桃苷和Adriamycin对于细胞增殖的相对抑制作用。如先前所述使用MTT测定(Mosmann，1983)，用以评定相对于未处理的Panc-1细胞增殖的细胞生长情况。将细胞暴露于未处理状态(对照组)、夹竹桃苷或者多柔比星(Adriamycin)，72小时之后评定细胞生长情况。

实施例24：细胞染色

如下程序用于使用吖啶橙染色细胞。

将细胞用1μg/ml吖啶橙在37℃染色15分钟。用PBS洗涤细胞，从平板中用胰蛋白酶消化，收集在具有FBS的PBS中，以及通过流式细胞计量术分析。

实施例25：细胞周期分析

使用如下程序确定细胞周期。

将Panc-1细胞用夹竹桃苷(0、20和40μM)处理72小时，经胰蛋白酶消化，在4℃用70％乙醇固定，使用细胞DNA流式细胞计量术试剂系列(Roche)用碘化丙啶染色，然后通过FACScan(Becton Dickinson，San Jose，CA)分析DNA含量。通过Cell Quest软件(Becton Dickinson)分析数据。每个样品至少分析100,000个细胞。

实施例26：含有强心苷的提取物治疗非小细胞肺癌的临床评估

一名81岁男性被诊断为患有肺左上叶非小细胞肺癌。建议患者进行放疗，随后进行化疗。七周之后，患者开始放疗，24天内完成治疗。然后患者开始进行5次化疗，每次化疗6天内完成，8个月后完成化疗。在完成化疗之前27天，重现(restaging)先前左上叶非小细胞肺癌诊断。进行全身PET扫描，确定大面积异常过度代谢活性涉及左上叶，与患者已知恶性一致。此外，涉及右肺门和前纵隔的敏感(subtle)过度代谢活性区域很可能反映累及淋巴结。胸部CT扫描证实左上叶中5cm的软组织密度影像。随后开始化疗方案。在一个月内，由于患者的不耐受而停止化疗。一周后，进行胸部CT扫描以进行对比。在左上叶背侧肺段中存在大约4cm的软组织团块。左上叶肿瘤团块总体体积间歇减小。在五周内，患者开始自己服用含有夹竹桃苷的植物提取物。三个月后，继续将胸部PA&Lateral与先前的扫描结果进行对比，左上叶中肿瘤团块密度无变化。一年后，将胸部PA&Lateral与三个月前的扫描结果进行对比，确定在肺门上方左上叶中测量大约4em的肿瘤团块密度无变化。

患者继续自己服用含有夹竹桃苷的植物提取物。在四个月内，使用静脉内注射造影剂进行胸部CT扫描。观测到左上叶中心团块(central mass)大小缩小大约20％。目前患者继续自己服用含有夹竹桃苷的植物提取物，且报道高Karnofsky评分。临床数据提示所述植物提取物具有治疗益处，因为在患者最后的化疗之后几个月出现中心团块大小改变。

实施例27：通过免疫组织化学染色确定样品中α-亚基同种型含量

如下程序只是其中本发明的方法可用于检测和量化样品中Na，K-ATP酶的α亚基同种型含量的另一种方式。可以根据需要改变步骤顺序。这个测定中使用的材料可以得自Vector Laboratories(Burlingame，CA orPeterborough，England)。

免疫组织化学分析

使用新鲜冷冻的人体组织。将切片用二甲苯脱蜡3次(每次5分钟)，在递减乙醇系列中再水合(99％×2，90％×2，每次5分钟)，在蒸馏水中彻底冲洗。通过将切片在沸腾的载体抗原显示溶液(Vector antigenunmasking solution)(Vector-AMS)中在高pH(Vector Laboratories Catalog#H-3301)下保温3×5分钟完成加热介导的抗原修复。

在抗原修复之后，将切片在50mM Tris HCl、300mM NaCl、0.1％、pH 7.6(TBS)中洗涤2×5分钟。将切片在于甲醇中0.3％9v/v)过氧化氢中保温20分钟及随后在TBS中洗涤10分钟，由此猝灭内源过氧化物活性。

将切片与在于TBS中的2.5％(v/v)正常马血清(2.5％NHS)中稀释的4μg/ml抗-Na，K-ATP酶α3亚基同种型抗体(Sigma-Aldrich Cat#A273)保温1小时。阴性对照切片与4μg/ml非免疫小鼠IgGl抗体(Biostat Diagnostics，Cat#093101)或者在2.5％NHS(无一抗对照物)中保温。

在TBS中洗涤2×5分钟后，将切片与Vector ImmPress^TM通用抗体试剂(抗兔IgG与抗小鼠IgG试剂的混合物；Vector Laboratories Ltd.，Cat #MP-7500)保温30分钟。然后将切片洗涤2×5分钟，并且与二氨基联苯胺(DAB)底物保温，监测直至产生合适水平染色。通过将该切片浸入蒸馏水中而终止生色反应。

在生色之后，将切片用苏木精复染，在递增乙醇系列(90-99-100％)中脱水，经过两次二甲苯澄清，在DePeX下盖玻片。

包括证实结肠粘膜中cytokeratin免疫反应性的分析对照物，以确认ImmPress^TM和生色试剂。包括“无一抗(no primary)”对照物以评定二抗与其它分析试剂的非特异性结合。分析染色的切片，使用具有Leica DFC290相机的Olympus BX51显微镜获取合适的数字图像。

免疫组织化学染色的细胞的照片在图6A-6F和7A-7H中示出。可以如本文所述对所述亚基同种型进行量化。在确定样品中α3同种型与α1同种型的比率之后，确定对于强心苷治疗的治疗应答的可能性。

上文详细描述了本发明的特殊实施方案。应意识到尽管在此举例描述了本发明的特定实施方案，但是在不偏离本发明精神和范围内可以对本发明进行各种修改。因此，本发明除了所附权利要求书限制之外不受其它限制。根据本文揭示，可以不用过分实验而制成和实施本文揭示和要求的所有实施方案。

Claims

1.具有对Na,K-ATP酶的α3亚基同种型的结合亲和性的第一种一抗和具有对Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的结合亲和性的第二种一抗在制备用于通过如下方法预测具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调对于强心苷或者包含强心苷的组合物治疗的体内治疗应答的试剂盒的应用，所述方法包括：

确定样品中Na,K-ATP酶α-亚基的α3同种型与α1同种型的比率，所述样品直接或者间接得自患有具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调的对象的患病体内细胞组织，所述样品包含Na,K-ATP酶的α亚基一或多个同种型；以及

确定如果对象用治疗相关剂量的强心苷治疗时对象中治疗应答的概率，

其中所述对象是人，且其中具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调是肿瘤，其中具有治疗应答的概率如下表所示与Na,K-ATP酶的α3同种型与α1同种型的比率相关：

比率对象中治疗应答概率 0.3-<0.5 20-<30% 0.5-<1 30-50% ≥1 >50% >10 >75%

。

2.权利要求1的应用，其中确定比率的步骤包括量化体外样品或者生物活检组织样品中Na,K-ATP酶的α3亚基同种型和Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的每一种的表达水平，并计算其比率，或者确定比率的步骤包括确定体外样品中Na,K-ATP酶的α3亚基同种型相对于Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的每一种的量，并计算其比率。

3.权利要求1或2的应用，其中所述样品是细胞组织、细胞团、细胞裂解物；从细胞组织、细胞团、细胞裂解物制备的膜制备物，或者细胞组织、细胞团、细胞裂解物的固定的组织病理学切片。

4.权利要求1或2的应用，其中所述样品包含Na,K-ATP酶的α亚基的至少两个同种型。

5.权利要求1或2的应用，其中所述样品包含Na,K-ATP酶的α亚基的至少α1和α3同种型。

6.权利要求1或2的应用，其进一步包括：裂解或者破坏细胞、组织或者生物活检组织样品；或者固定来自患病体内细胞组织的用于进行组织病理学检验的组织切片以形成样品，或者对样品进行Western印迹分析和/或免疫组织化学染色分析以确定样品中Na,K-ATP酶的α3亚基同种型相对于Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的量和相对表达水平；并计算其比率。

7.权利要求6的应用，包括：对凝胶进行放射分析或光密度分析以确定样品中Na,K-ATP酶的α3亚基同种型相对于Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的含量，或者对凝胶进行放射分析或光密度分析以检测样品中Na,K-ATP酶的α3亚基同种型和Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的存在并定量其含量。

8.权利要求1或2的应用，进一步包括：对比所述样品中Na,K-ATP酶的α3亚基同种型和Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的含量相对于阳性对照样品和/或阴性对照样品中Na,K-ATP酶的α3亚基同种型和/或Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的含量，或者对比组织样品中Na,K-ATP酶的α3亚基同种型的含量和Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的含量，其中已知仅存在α3和α1亚基之一的表达作为对照。

9.权利要求1或2的应用，进一步包括：鉴别具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调的对象并从对象获得患病细胞的样品。

10.权利要求1或2的应用，进一步包括：具体说明如何进行Na,K-ATP酶的α-亚基的α1和α3同种型分析的信息，和/或进一步包括详细描述如何解释预后数据的信息。

11.权利要求1或2的应用，其中所述强心苷以纯的形式存在，其可通过对植物或者动物来源进行提取而产生或是通过化学修饰可利用的强心苷生产的。

12.权利要求1或2的应用，其中所述强心苷以提取物形式存在。

13.权利要求12的应用，其中所述强心苷提取物是通过超临界流体提取技术任选在存在改性剂的条件下制备的。

14.权利要求13的应用，其中超临界流体提取物进一步包含除了强心苷之外的至少一种其它的药物学活性剂。

15.权利要求14的应用，其中当将所述提取物给予对象时，所述其它药物学活性剂可有助于强心苷的治疗效力。

16.权利要求15的应用，其中所述其它药物学活性剂附加性或协同地有助于强心苷的治疗效力。

17.权利要求1或2的应用，其中所述强心苷存在于药物配制物或者组合物中。

18.权利要求1或2的应用，其中所述强心苷选自夹竹桃苷、乌本苷、蟾毒灵、毛地黄毒苷、地高辛、华蟾毒素、华蟾毒配基和酯蟾毒配基。

19.权利要求1或2的应用，其中所述强心苷得自夹竹桃植物。

20.权利要求19的应用，其中所述夹竹桃植物包括夹竹桃属(Nerium)的物种或者黄花夹竹桃属(Thevetia)的物种。

21.权利要求12的应用，其中所述提取物得自蟾蜍皮肤或者其分泌物。

22.适用于进行预测具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调对于强心苷治疗的体内治疗应答的预后测定的试剂盒，所述试剂盒包含：

a)第一种一抗，其具有Na,K-ATP酶的α3亚基同种型结合亲和性；

b)第二种一抗，其具有Na,K-ATP酶的α1亚基同种型结合亲和性，

c)使用试剂盒和进行预后测定的说明，

其中具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调是肿瘤，

其中所述预后测定包括：

确定如果对象用治疗相关剂量的强心苷治疗时对象中治疗应答的概率，其中所述对象是人，且其中具有治疗应答的概率如下表所示与Na,K-ATP酶α-亚基的α3同种型与α1同种型的比率相关：

。

23.权利要求22的试剂盒，其中所述试剂盒适用于进行Western印迹凝胶电泳分析，或者所述试剂盒适用于进行免疫组织化学染色分析。

24.权利要求22或者23的试剂盒，其进一步包含：d)裂解组合物；e)包含Na,K-ATP酶的α3亚基同种型的阳性对照样品；f)包含Na,K-ATP酶的α3亚基同种型和Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的阳性对照样品；g)包含Na,K-ATP酶的α1亚基同种型及排除Na,K-ATP酶的α3亚基同种型的阴性对照样品；h)二抗；i)适于凝胶电泳分析的凝胶形成材料；j)放射标记的标记物；k)光密度计或者辐射计；l)水性液体介质；m)凝胶/膜制备试剂盒；n)封闭溶液；o)洗涤缓冲液；p)包含Western印迹分析试剂盒的材料；或者q)上述材料的组合。

25.权利要求22或者23的试剂盒，其中第一种一抗对于Na,K-ATP酶的α3亚基同种型具有特异性结合亲和性。

26.权利要求22或者23的试剂盒，其中第二种一抗对于Na,K-ATP酶的α1亚基同种型具有特异性结合亲和性。

27.权利要求24的试剂盒，其中所述二抗是山羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶，或者包含来自除小鼠之外的其它物种的附着有适合的标记的抗小鼠IgG的其它二抗。

28.权利要求27的试剂盒，其中所述二抗是山羊抗小鼠IgG–HRP。

29.权利要求22或者23的试剂盒，其中所述一抗是单克隆抗体。

30.权利要求24的试剂盒，其中阳性对照样品选自组织、细胞团、细胞裂解物以及从通过生物活检或者其它手术切除方式可以获得的组织、细胞团、细胞裂解物中制备的膜制备物。

31.权利要求24的试剂盒，其中阴性对照样品选自组织、细胞团或者细胞裂解物以及从不含有Na,K-ATP酶的α-亚基的α3同种型的组织、细胞团或者细胞裂解物制备的膜制备物。

32.权利要求31的试剂盒，其中阴性对照样品包含啮齿动物肿瘤组织或者在体外生长的小鼠或大鼠细胞的细胞团。

33.权利要求22或者23的试剂盒，包含确定相对Na,K-ATP酶α-亚基组合物和同种型比率的可选方式，其中所述可选方式包括：在ELISA或者蛋白质组织或者细胞裂解物阵列中使用抗体；使用Northern印迹分析及实时聚合酶链反应测量不同Na,K-ATP酶亚基同种型的mRNA；或者使用免疫组织化学染色分析。

34.具有对Na,K-ATP酶的α3亚基同种型的结合亲和性的第一种一抗和具有对Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的结合亲和性的第二种一抗在制备用于使用包含强心苷的组合物通过如下方法治疗具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调的对象的试剂盒中的应用，所述方法包括：

a)体外确定样品中Na,K-ATP酶的α亚基的α3同种型与α1同种型的比率，所述样品直接或者间接得自患有具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调的对象的患病体内细胞组织，所述样品包含Na,K-ATP酶的α亚基的一或多个同种型；及

b)如果所述比率≥0.3，则提示给予该对象包含强心苷的组合物，

其中所述对象是人，且其中具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调是肿瘤。

35.具有对Na,K-ATP酶的α3亚基同种型的结合亲和性的第一种一抗和具有对Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的结合亲和性的第二种一抗在制备用于使用包含强心苷的组合物通过如下方法治疗具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调的对象的试剂盒中的应用，所述方法包括：

a)从对象中获得患病组织的体外样品，所述疾病具有与过量细胞增殖相关的病因学，所述样品包含Na,K-ATP酶的α亚基的一或多个同种型；

b)确定样品中Na,K-ATP酶的α亚基的α3同种型与α1同种型的比率；

c)如果所述比率≥0.3，则提示给予该对象包含强心苷的组合物，

36.权利要求34或35的应用，其中开出处方并给予所述对象治疗相关剂量的包含强心苷的组合物。

37.权利要求36的应用，其中根据处方剂量给药方案给予所述对象包含强心苷的组合物。

38.权利要求37的应用，其中给予所述对象含有包含强心苷的提取物的组合物。

39.权利要求38的应用，其中所述提取物进一步包含一或多种其它治疗有效的药剂。

40.权利要求34或35的应用，其中所述组合物进一步包含一或多种其它治疗有效的药剂。

41.权利要求34或35的应用，其中给予所述对象包含强心苷的植物或者动物来源的热水提取物。

42.权利要求41的应用，其中给予所述对象2mg-22.5mg强心苷/天。

43.权利要求34或35的应用，其中给予所述对象包含0.6-4.8mg强心苷的植物或者动物来源的超临界流体提取物。

44.权利要求34或35的应用，其中给予所述对象包含10-500μg纯强心苷的组合物。

45.权利要求34或35的应用，其中所述方法进一步包括：裂解或者破坏细胞、组织或者生物活检组织样品；或者固定来自患病体内细胞组织的用于进行组织病理学检验的组织切片以形成样品。

46.权利要求45的应用，其中所述方法包括：对所述样品进行Western印迹分析或者免疫组织化学染色分析，以确定样品中Na,K-ATP酶的α3亚基同种型和Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的量及相对表达水平；并计算其比率。

47.权利要求46的应用，其中所述方法进一步包括：对比所述样品中Na,K-ATP酶的α3亚基同种型和Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的含量与阳性对照样品和/或阴性对照样品中Na,K-ATP酶的α3亚基同种型和/或Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的含量。

48.权利要求47的应用，其中所述方法进一步包括：鉴别患有具有与过量细胞增殖相关的病因学的疾病或失调的对象。

49.权利要求48的应用，其中所述方法进一步包括提供阐明如何进行Na,K-ATP酶的α-亚基的α1同种型和α3同种型分析的信息。

50.权利要求49的应用，其中所述方法进一步包括：提供详细说明如何解释预后数据的信息。

51.权利要求47的应用，其中所述方法进一步包括：进行凝胶放射分析或光密度分析，以确定样品中Na,K-ATP酶的α3亚基同种型和Na,K-ATP酶的α1亚基同种型的含量；确定所述样品中存在的α3同种型与α1同种型的比率。

52.权利要求1、34或35的应用，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：结肠直肠癌、头颈部癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌肿瘤、霍奇金病、肾癌、肝癌、肺癌、肺类癌肿瘤、恶性间皮瘤、转移癌、骨髓发育异常综合征成神经细胞瘤、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、输尿管癌症；阴道癌、外阴癌和Wilm’s瘤。

53.权利要求1、34或35的应用，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：直肠癌、人结肠癌、骨转移、骨肉瘤、多发性骨髓瘤、人脑癌、垂体癌、卡波西肉瘤和子宫肉瘤。

54.权利要求1、34或35的应用，其中所述强心苷选自夹竹桃苷、乌本苷、蟾毒灵、毛地黄毒苷、地高辛、华蟾毒素、华蟾毒配基和酯蟾毒配基组成的组。

55.权利要求1、34或35的应用，其中所述肿瘤选自喉和下咽癌、鼻腔及副鼻窦癌、鼻咽癌、口腔及口咽癌和唾液腺癌。

56.权利要求22的试剂盒，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：结肠直肠癌、头颈部癌、肾上腺皮质癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、非霍奇金淋巴瘤、食管癌、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌肿瘤、霍奇金病、肾癌、肝癌、肺癌、肺类癌肿瘤、恶性间皮瘤、转移癌、骨髓发育异常综合征、成神经细胞瘤、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、输尿管癌症；阴道癌、外阴癌和Wilm’s瘤。

57.权利要求22的试剂盒，其中所述肿瘤选自由以下组成的组：直肠癌、人结肠癌、骨转移、骨肉瘤、多发性骨髓瘤、人脑癌、垂体癌、卡波西肉瘤和子宫肉瘤。

58.权利要求22的试剂盒，其中所述肿瘤选自喉和下咽癌、鼻腔及副鼻窦癌、鼻咽癌、口腔及口咽癌和唾液腺癌。

59.权利要求22的试剂盒，其中所述强心苷选自夹竹桃苷、乌本苷、蟾毒灵、毛地黄毒苷、地高辛、华蟾毒素、华蟾毒配基和酯蟾毒配基组成的组。