WO2015142117A1 - 강심 배당체를 이용한 stk11-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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cancer
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sodium
atp1a1
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윤석준
허닝닝
김나영
조용연
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숙명여자대학교산학협력단
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    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/01—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) in phosphorus-containing anhydrides (3.6.1)

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating STK11-mutant cancer comprising a substance that inhibits sodium-potassium transport function of Na + -K + ATPase (ATP1A1) as an active ingredient.
  • ATP1A1 sodium-potassium transport function of Na + -K + ATPase
  • Lung cancer is a tumor with an increasing incidence in the world, and can be classified into primary lung cancer, in which cancer cells first develop in the bronchus or alveoli, and metastatic lung cancer in which cancer cells are formed in other organs and travel through the blood vessels or lymphatic vessels to the lungs.
  • Non-small cell lung cancer accounts for 75% of the total lung cancer distribution.
  • the non-small cell lung cancer (NSCLC) is classified into adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, and large cell carcinoma, among which adenocarcinoma is gradually showing a high frequency.
  • lung cancer is rapidly increasing due to an increase in smoking population and air pollution, most lung cancers are difficult to treat by chemotherapy and radiotherapy. Chemotherapy and radiotherapy can be applied by reducing the size of small cell cancer, but it is impossible to expect complete treatment.
  • Non-small cell lung cancer is less effective than chemotherapy because it is less effective than chemotherapy.
  • Surgical removal is the only effective treatment.
  • less than 30% of lung cancer patients have tumors that cannot be completely excised at diagnosis, and less than one third of them survive only five years after surgical resection. Therefore, there is an urgent need for a way to treat lung cancer more effectively.
  • STK11 (or LKB1) in lung cancer has a high incidence of mutations and reports that the metastasis and differentiation of lung cancer in LKB1 mutant cells was promoted in the 2007 Nature Journal. It is known that In particular, SKT11 is distinct from other major gene mutations in lung cancer tissue samples, suggesting the development of anticancer drugs specific to the STK11 mutant lung cancer patient group.
  • anticancer drugs for gene mutations such as ALK, BRAF, and EGFR have been actively tried clinically, but the development of a target anticancer agent for the most frequent STK11-mutant cancer has not been reported.
  • STK11 encodes a serine-threonine kinase that functions as a tumor suppressor and regulates cell polarity. Function-lost somatic mutations of STK11 have been found in approximately 30% of lung cancers and have been suggested to promote metastasis.
  • Cardiac glycosides are a family of digoxin, digotoxin and wabain drugs, and have been used as a cardiovascular agent for the treatment of congestive heart failure and arrhythmia.
  • Cardiac glycosides inhibit the function of Na + -K + ATPase (ATPase, Na + -K + transporting, alpha 1 polypeptide) and regulate the concentration of sodium and potassium in cells.
  • ATPase ATPase, Na + -K + transporting, alpha 1 polypeptide
  • Proteins maintain the interior of cells with low levels of sodium and high levels of potassium, which are eletrogenic pumps that produce a potential difference between the two sides of the cytoplasmic membrane, and also identify polarization of excitable and contractile tissue.
  • cardiac glycosides when phosphorylated, bind to the extracellular portion of the enzyme, ie, potassium, to deliver potassium into the cell.
  • Extracellular potassium which induces dephosphorylation of the alpha subunit, reduces the effect of cardiac glycosides.
  • Cardiac glycosides inhibit Na + -K + ATPase (ATP1A1) in other tissues such as myocardium, cardiac conducting tissue, smooth muscle and red blood cells. They have little effect on Na + -K + ATPase (ATP1A1) in skeletal muscle.
  • Korean Patent Publication No. 10-2013-0137562 (published Dec. 17, 2013) includes APOO (Apolipoprotein O), ATP1A1 (ATPase, Na + -K + transporting, alpha 1 polypeptide), It describes a composition for diagnosing or treating lung cancer, comprising as an active ingredient a substance specifically binding to any target polypeptide selected from the group consisting of CANX (calnexin) and DDOST (dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase).
  • CANX calnexin
  • DDOST dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase
  • ATP1A1 ATPase, Na + -K + transporting, alpha 1 polypeptide
  • ATP1A1 ATPase, Na + -K + transporting, alpha 1 polypeptide
  • the present invention is a STK11 (serine / threonine kinase 11) -mutant comprising a substance that inhibits sodium-potassium transport function of Na + -K + ATPase (ATP1A1 protein, Sodium / potassium-transporting ATPase subunit alpha-1) as an active ingredient It provides a pharmaceutical composition for treating cancer.
  • STK11 serine / threonine kinase 11
  • the present invention is STK11 (Serine / threonine kinase 11) comprising a substance that inhibits the sodium-potassium transport function of Na + -K + ATPase (ATP1A1 protein, Sodium / potassium-transporting ATPase subunit alpha-1) Provides a composition for diagnosis of mutation cancer.
  • Na + -K + ATPase may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the Na + sodium -K + ATPase - a substance that inhibits potassium transport function may be a substance specifically binding to cardiac glycosides (Cardiac glycosides), and Na + -K + ATPase .
  • the Na + substance specifically binding to the Na + -K + ATPase ratio of the potassium binding competitive -K + ATPase of the present invention a substance that inhibits or competitive inhibition by intracellular potassium passed Can be.
  • the substance specifically binding to the Na + -K + ATPase can be selected from the group consisting of antisense oligonucleotides, siRNA and shRNA for gene Na + -K + ATPase.
  • the substance specifically binding to the cardiac glycoside may be digoxin, ouabain or digitoxin, most preferably digoxin. Can be.
  • the present invention also provides an anticancer agent comprising the composition as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for treating STK11-mutant cancer, comprising administering the composition to a subject in need thereof.
  • the subject may be a mammal, including humans, livestock, and the like.
  • the present invention also provides an information providing method for diagnosing STK11 (Serine / threonine kinase 11) -mutant cancer comprising the following steps:
  • the biological sample of step (1) may be selected from the group consisting of blood, skin cells, mucosal cells, urine, and hair.
  • the present invention further provides a method for screening a STK11-mutant cancer therapeutic agent comprising the following steps:
  • the cancer may be selected from the group consisting of prostate cancer, breast cancer, colon cancer, melanoma and lung cancer.
  • the present invention includes a substance that inhibits sodium-potassium transport function of Na + -K + ATPase (ATP1A1, Sodium / potassium-transporting ATPase subunit alpha-1) as an active ingredient, STK11 (Serine / threonine kinase 11)- It provides a therapeutic or diagnostic use of mutant cancer.
  • ATP1A1 sodium / potassium-transporting ATPase subunit alpha-1
  • STK11 Serine / threonine kinase 11
  • STK11-mutants which are frequently identified, have been shown to inhibit the growth of cancer cells by treating Cardiac glycosides, which have previously been used for cardiac agents in lung cancer. Therefore, Cardiac glycosides can be screened and used as a target for the treatment of STK11-mutant-derived cancer.
  • Figure 1 shows the structural formula of Cardiac glycosides proposed in the present invention to be effective in STK11 mutant cancer.
  • FIG. 2 shows the results of confirming the STK11 mutation in non-small cell lung cancer (NSCLC).
  • FIG. 2A shows genetic variation for seven major mutations in Lung adenocarcinoma patients, one of the largest subtypes of non-small cell lung cancer (NSCLC).
  • Figure 2b shows the rate of STK11 mutation according to the progression of lung adenocarcinoma.
  • FIG. 3a is a heat map of hierarchical clustering in about 60 cancer cell lines of three Cardiac glycosides compounds shown in FIG. 1, and FIG. 3b is a normal STK11 of non-small cell lung cancer (NSCLC) therapeutic agent and Cardiac glycosides. It is the result of measuring the drug effect (AUC value of -logGI50) relative to the STK11 mutant cell line to the expression cell line.
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • Figure 4 shows the enrichment of mutant cell lines compared to wild-type cell lines of the compounds having the respective structures (Digoxin, Digitoxin and Ouabain) shown in Figure 1 by -logGI50 watarfall plot (corresponding to each compound, Figure 4a, Figure 4b, FIG. 4c).
  • FIG. 5A shows the treatment of STK11-mutant lung cancer cell line and STK11-wild type lung cancer cell line (72 hours), respectively, with different concentrations of Digoxin, Digitoxin and Ouabain for 8 lung cancer cell lines
  • FIG. 5B is wild-type to STK11-mutant lung cancer cell line. It is a graph showing the expression of STK11 and the inhibition of cell growth.
  • FIG. 7A and 7B are results of evaluating cell viability obtained by treating ATP1A1 siRNA with lung cancer cell line (72 hours).
  • FIG. 7A is a Titer Blue treated with STK11-mutant lung cancer cell line and STK11-wild type lung cancer cell line, respectively.
  • 7b expresses wild type STK11 in STK11-mutated lung cancer cell line and evaluates cell viability with Titer Blue.
  • FIG. 8 is a graph comparing the results of cell growth inhibition obtained by knocking down both ATP1A1 and STK11 (72 hours) for two lung cancer cell lines having wild type STK11.
  • Figure 9 confirmed that the cardiac glycosides treatment specific cell migration and cell division inhibitory effect in STK11-mutated lung cancer cell line,
  • Figure 9a is a cell migration result,
  • Figure 9b is a cell division result.
  • FIG. 10 is a result confirming the preclinical effect of Cardiac glycosides in STK11-mutant lung cancer
  • Figure 10a confirms the growth of tumors in an animal model injected with A549 cell line
  • Figure 10b is a cell line injected with a cell line restored STK11 to wild type Tumor growth was confirmed in the animal model
  • Figure 10c, Figure 10d and Figure 10e are respectively 60ng / ind. (3 ⁇ g / kg) and 180 ng / ind.
  • This is a graph and photograph confirming the relative decrease in tumor growth in the animal model injected with STK11-mutant cells to the animal model injected with STK11 normal expression cell line by treatment with Cardiac glycosides (9 ⁇ g / kg).
  • the present invention is characterized by providing a pharmaceutical composition for treating STK11-mutant cancer comprising a substance that inhibits sodium-potassium transport function of Na + -K + ATPase (ATP1A1) as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for treating STK11-mutant cancer comprising a substance that inhibits sodium-potassium transport function of Na + -K + ATPase (ATP1A1) as an active ingredient.
  • ATP1A1 signaling pathways so far known are that activation of mTOR, that AICAR-induced AMPK activation promotes reduction of ATP1A1 activity, activation of mitogen activating protein (MAPK), mitochondrial reactive oxygen species (ROS) activation, as well as phospholipase And activation of inositol triphosphate (IP3) receptor (IP3R).
  • MAPK mitogen activating protein
  • ROS mitochondrial reactive oxygen species
  • IP3R inositol triphosphate
  • the present invention has identified a substance that inhibits the sodium-potassium transport function of ATP1A1 in STK11-mutant cancer, particularly a substance that specifically binds to ATP1A1 and inhibits intracellular potassium transport function as a therapeutic target for STK11-mutant-derived cancer. .
  • the cancer cell growth inhibitory effect when the cardiac glycosides are treated with a substance that inhibits the sodium-potassium transport function of ATP1A1 is a wild-type cancer cell (cancer cell without mutation of the STK11 protein). It was directly confirmed that it is remarkable in STK11 mutant cancer cells.
  • ATP1A1 knockdown inhibits cell proliferation of STK11-mutated cancer cell lines when ATP1A1 siRNA is treated with a substance that inhibits the sodium-potassium transport function of ATP1A1.
  • a substance that inhibits the sodium-potassium transport function of ATP1A1 can be used to treat STK11 mutant cancer. It also presents a possible route to therapeutic applications for controlling the progression of cancer (particularly STK11-mutated cancer).
  • the present invention confirmed that the knockdown of STK11 showed a similar effect on ATP1A1. Knockdown of ATP1A1 induced selective reduction of cell growth in STK11 mutants. This means that ATP1A1 expression is important for cell growth when normal STK11 signaling is lost.
  • most ATP1A1 inhibitors showed better cell growth inhibitory activity in STK11 mutant cancer cell lines than STK11 wild type cancer cell lines.
  • the results of the present invention suggest the therapeutic potential of STK11 mutant cancer with new therapies with substances that inhibit the sodium-potassium transport function of ATP1A1.
  • the approach of the present invention may provide useful clues to new effective treatment methods.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating STK11-mutant cancer comprising a substance that inhibits sodium-potassium transport function of Na + -K + ATPase (ATP1A1) as an active ingredient. It can be, and can provide a pharmaceutical composition for diagnosing STK11-mutant cancer comprising a substance that inhibits the sodium-potassium transport function of Na + -K + ATPase (ATP1A1) as an active ingredient.
  • STK11-mutations have been found in a range of cancers including prostate cancer, breast cancer, colon cancer, lymphoma, melanoma, lung cancer, and the like.
  • the present inventors have found that intracellular potassium transport function of ATP1A1 by competitively or non-competitively inhibiting ATP1A1 from inhibiting potassium binding to ATP1A1 by specifically binding to a substance that inhibits ATP1A1's sodium-potassium transport function. It was found that a substance that inhibits the specific inhibition of the growth of STK11-mutant cancer.
  • the ATP1A1 protein of the present invention may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO 1 derived from human, but is not limited thereto, and 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more with the amino acid sequence. Preferably it may include a protein represented by an amino acid sequence having at least 95% homology.
  • ATP1A1 Inhibition of ATP1A1 in the lung cancer cell line series confirmed a marked decrease in cell growth in STK11-mutant cancer cell lines, not wild-type cancer cell lines, and found that ATP1A1 plays an important role in cell survival or proliferation in STK11-mutant cancer cell lines. . These results suggest that ATP1A1 is involved in the progression of STK11-mutant cancer, and thus inhibiting the function of the ATP1A1 pump inhibits the proliferation of STK11-mutant cancer cells, thereby treating STK11-mutant cancer. It is.
  • the substance that inhibits the sodium-potassium transport function of ATP1A1 is a substance specifically binding to cardiac glycosides or ATP1A1, and the substance specifically binding to ATP1A1 is an antisense oligo of ATP1A1 gene. It may be selected from the group consisting of nucleotides, siRNA and shRNA, but is not limited thereto.
  • the antisense oligonucleotide refers to an oligomer that hybridizes with a target sequence in RNA by Watson-Crick base pairing to form an oligomeric heterodimer between mRNA and RNA in the target sequence.
  • Antisense oligonucleotides have complete or approximate sequence complementarity to the target sequence and can inhibit the expression of the target gene by altering the processing of mRNA that blocks or inhibits translation of the mRNA and produces splicing variants.
  • the antisense oligonucleotide that inhibits the expression of the ATP1A1 protein may be an oligomer having a sequence complementary to the mRNA of the gene encoding the ATP1A1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • siRNA refers to double-stranded RNA of about 20 nucleotides in length that can mediate RNA interference or gene silencing
  • shRNA refers to 5-9 bases of the sense and antisense sequences of the siRNA target sequence. It refers to the RNA of the short hairpin structure positioned between the configured loop (loop).
  • siRNAs or shRNAs are known to specifically bind to target mRNAs having complementary sequences to induce RNA interference (RNAi) through cleavage of mRNAs of target genes.
  • RNAi RNA interference
  • siRNA or shRNA that inhibits the expression of ATP1A1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be composed of a sequence complementary to the mRNA of the gene encoding ATP1A1.
  • Methods for preparing siRNA include, but are not limited to, a method of directly synthesizing siRNA chemically or synthesizing using in vitro transcription.
  • shRNAs are used to overcome the high synthesis cost of siRNA, short duration of RNA interference effect due to low transfection efficiency, and can be used as adenovirus, lentivirus, and plasmid expression vector systems from promoters of RNA polymerase III. It can be introduced into cells and expressed using.
  • shRNAs are known to be converted into siRNAs with the correct structure by siRNA processing enzymes (Dicer or RNase III) present in the cell to induce silencing of target genes.
  • the substance that inhibits the sodium-potassium transport function of ATP1A1 may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody that specifically binds to ATP1A1 and specifically inhibits pump function.
  • the antibody specifically binds to the ATP1A1 pump and can effectively inhibit the intracellular potassium transport function of ATP1A1.
  • Antibodies that specifically bind to ATP1A1 can be prepared by known methods known to those skilled in the art, or commercially available antibodies can be purchased and used.
  • antibodies that bind to ATP1A1 and inhibit potassium pump function include functional fragments of the antibody, in addition to the full form having the full length of two heavy and two light chains.
  • a functional fragment of an antibody means a fragment having at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • the substance that inhibits the sodium-potassium transport function of ATP1A1 may be known cardiac glycosides.
  • the known Cardiac glycosides may be known compounds, natural products, extracts, bioactive substances, etc. known to inhibit the pump function of ATP1A1, and include, for example, digoxin, ouabain, or digitoxin. Etc., but is not limited thereto.
  • Digoxin binds to sites on the extracellular side of the alpha-subunit of ATP1A1 (Na + -K + ATPase). Warbane is isolated from plants and is a compound widely used by scientists in in vitro studies to specifically block sodium pumps. Digitoxin is a cardiac glycoside, which has a structure and effect similar to digoxin, but lasts longer than digoxin. Such digoxin, wabain and digitoxin are compounds known to directly and specifically inhibit ATP1A1.
  • digoxin has been widely used for the treatment of various heart conditions. It has been suggested that digoxin may reduce the risk of certain cancers as well as beneficial effects on the heart, but digoxin only suggests the effect of reducing the risk of cancer at the therapeutic concentration of the drug.
  • wabain a cardiac glycosides
  • wabain a cardiac glycosides
  • digitoxins we have focused on the cytotoxicity of digitoxins and their analogs to cancer cells and conducted pharmacological studies in the development of chemotherapeutic drugs for which digitotoxins and analogs are potent, thereby reducing the effects of digitoxins in conventional ATP1A1.
  • the research which established the mechanism in influence as a new mechanism is known.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may preferably include 0.0001 to 50% by weight of the active ingredient based on the total weight of the composition, but is not limited thereto.
  • the composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier for use as a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is conventionally used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, Polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., a stearate, glycerol, glycerol, glycerol, glycerol, glycerol, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, glycerin, a glycerin, glycerol, sorbitol, glycerol, sorbitol, glycerol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, gly
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, topical injection, intraventricular injection, spinal cord injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like. .
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient, Usually a skilled practitioner can easily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prophylaxis.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition according to the invention may be 0.001-100 mg / kg.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. It can be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be provided as an anticancer agent for treating STK-11 mutant cancer.
  • the present invention may also provide a method of treating a STK-11 mutant cancer comprising administering the pharmaceutical composition or anticancer agent to a subject in need thereof.
  • Primates including livestock (cows, horses, sheep, chickens, pigs, dogs, rabbits) and the like, but is not limited thereto.
  • STK11-mutant cancer by treating a substance that inhibits the sodium-potassium transport function of ATP1A1, if cell growth is inhibited compared to the normal control group, STK11-mutant cancer may be provided.
  • the present invention further provides a method of contacting STK11-mutant cancer cells and STK11-wild type cancer cells with a substance that inhibits the sodium-potassium transport function of ATP1A1 in vitro, and after contacting the STK11-mutant cancer cells and STK11- Comparing the growth rate of wild-type cancer cells and selecting a substance that specifically inhibits the growth of STK11-mutant cancer cells as a STK11-mutant cancer therapeutic agent provides a method for screening a STK11-mutant cancer therapeutic agent.
  • a substance that inhibits the sodium-potassium transport function of ATP1A1 was found to inhibit cell proliferation in comparison with STK11-wild type cancer cells in STK11-mutant cancer cells.
  • knockout of ATP1A1 in STK11-mutant cancer cells inhibited the proliferation of STK11-mutant cancer cells.
  • a substance that specifically binds to ATP1A1 and inhibits the function of the ATP1A1 pump may inhibit the proliferation of STK11-mutant cancer cells and exert a cancer treatment effect, wherein the cancer is prostate cancer, breast cancer, colon cancer, melanoma And it may be selected from the group consisting of lung cancer.
  • the step of contacting the STK11-mutant cancer cells and STK11-wild type cancer cells with a substance (test substance) that inhibits the sodium-potassium transport function of ATP1A1 may be transfected, transfected with a test substance. It may be carried out by conversion or infusion, and the contact with the test substance may be made in a medium capable of maintaining the growth of the cells.
  • the comparing of the growth rate of STK11-mutant cancer cells and STK11-wild type cancer cells may be performed by counting the number of cells, which may be photographed with the eyes or an image image and then using software. It may be counting, but is not limited thereto.
  • the test substance may be used for treating STK11-mutant cancer by inhibiting the ATP1A1 pump function. Can be screened for.
  • Example 1 Hierarchical clusturing of genotype-specific compounds
  • subsets of compounds were selected using the GI50 profile pattern on the CLEA map.
  • GI50 0.01 ⁇ M
  • enrichment scores were used to select genotype-specific compounds in CLEA analysis.
  • AUC value> 80 and P value ⁇ 0.01 were used as cutoff values to confirm that the compound had significant sensitivity to the particular genotype.
  • compounds containing strong potency ie, -logGI 50 value 8 were included in at least one cell line in the NCI60 panel.
  • FIG. 3B shows that Cardiac glycosides show higher sensitivity to STK11 mutant lung cancer than previously FDA approved lung cancer (NSCLC) therapeutics.
  • STK11 (LKB1) has a distinctive pattern of development from non-small cell lung cancer (NSCLC) patient tissues from the genetic variation shown in FIG. 2A. Seems necessary. In addition, it was confirmed from the graph of the rate of mutation of the STK11 mutation according to the progression stage of the cancer shown in FIG. 2B, the incidence of the STK11 mutation increased as lung cancer progressed.
  • anticancer drugs for gene mutations such as ALK, BRAF, and EGFR have been actively tried clinically, but no target anticancer drugs have been reported for STK11 mutations with a high frequency. Therefore, it is suggested that there is a need for the development of pharmaceutical compositions that exhibit specific therapeutic effects on STK11-mutant lung cancer.
  • STK11 also encodes a serine-threonine kinase that directly phosphorylates and activates AMPK, a central metabolic sensor.
  • AMPK regulates lipid, cholesterol and glucose metabolism in specialized metabolic tissues such as liver, muscle and adipose tissue.
  • STK11 protein participates in two biologically important pathways leading to cancer. First, STK11 helps maintain polarized epithelial cells, and second, STK11 activates AMPK, which controls cellular energy balance. This insight as an STK11 function suggests that regulation of AMPK activity may be a target of new therapeutic strategies.
  • the six cell lines of the STK11 mutant latency are shown in Table 1 below.
  • CDKN2A NOTCH1: NRAS: PTEN: TP53: STK11: CDKN2A A549 Lung CDKN2A: KRAS: STK11 NCI-H460 Lung CDKN2A: KRAS: PIK3CA: STK11: c-MYC-Amp NCI-H23 Lung KRAS: STK11: TP53: PTEN: CTNNB1 SK-MEL-5 Melanoma BRAF: CDKN2A: STK11 DU-145 Prostate CDKN2A: MLH1: RB1: STK11: TP53
  • Figure 4 shows the enrichment of mutant cell lines compared to wild-type cell lines of each structure (ouabain, digoxin, digitoxin) as shown in Figure 1 by -logGI50 watarfall plot (corresponding to each compound, Figure 4a, 4b and 4c).
  • Cardiac glycosides drugs can be defined as having STK11-mutant dependent activity.
  • NCI-60 lung cancer cell lines (NCI-H460, A549, NCI-H322M and NCI-H226) were obtained from the American National Cancer Center (NCI DTP). All cells were grown in RPMI medium (GIBCO) with 10% FBS (GIBCO) and penicillin / streptavidin (GIBCO) and maintained at 37 ° C. in a humidified atmosphere at 5% CO 2 .
  • a total of three Cardiac glycosides (chemicals) having a structure as shown in FIG. 1 were screened for lung cancer cell lines.
  • Digoxin, ouabain and digitoxin were purchased from Sigma, respectively.
  • the cells were seeded in 96-well plates at a density of 2,000 cells for 3 days culture per well, 1,000 cells for 7 days culture and 200 cells for 14 days culture. After 24 hours of seeding, cells were treated with chemicals diluted to 0.05 ⁇ M Digitoxin and 0.02 ⁇ M Ouabain working concentration. Cells were again cultured for 72 hours (3 days), 7 days, and 14 days, and then survival rate was measured using the CellTiterBlue assay kit.
  • FIG. 5B is a graph showing results of inhibiting cell growth by treating Digoxin, Digitoxin and Ouabain with respect to the cell lines (TiterBlue), and resistant to treated compounds in the case of STK11-recovered cell line compared to STK11-mutant cell line. It could be confirmed that obtained.
  • Figure 6 shows the difference in the growth change between the STK11-mutant cell line (A549) and STK11 cell line (A549-STK11) in the wild type after long-term treatment of Cardiac glycosides.
  • siRNA transfection 3,000 cells per well were plated in 96 well plates. After 24 hours of attachment, the target siRNA (ATP1A1: 1009769; Bioneer, STK11: L-005035-00, Non targeting: D-001810-10; Dharmacon) was transfected for 6 hours at 37 ° C. in a CO 2 incubator. (GIBCO) was added. After transfection, the cells were supplemented with RPMI containing FBS and incubated at 37 ° C. 5% CO 2 for 72 hours with collection.
  • FIG. 7A shows the results of evaluating cell viability obtained by treating ATP1A1 siRNA (72 hours) with four lung cancer cell lines.
  • FIG. 7A From the results of FIG. 7A, it can be seen that the growth of the STK11 mutant lung cancer cell lines A549 and H460 was significantly inhibited by the ATP1A1 siRNA treatment as compared to the STK11-wild type lung cancer cell lines H226 and H322. In other words, when knocking down ATP1A1 in the lung cancer cell line family, cell growth was significantly reduced in the STK11-mutant cell line rather than the STK11-wild type cell line. 7B is a result of expressing wild-type STK11 in the STK11-mutated lung cancer cell lines A549 and H460, indicating that the decrease in cell growth due to knockdown of ATP1A1 is less likely.
  • ATP1A1 appears to play an important role in cancer survival or proliferation in STK11-mutated lung cancer cell lines.
  • FIG. 8 is a result of cell growth inhibition obtained by knocking down both ATP1A1 and STK11 for two lung cancer cell lines with wild-type STK11 (72 hours), and in case of knocking down both ATP1A1 and STK11 in STK11-wild type lung cancer cell line, respectively. It was confirmed that synergistically inhibited cell growth as compared to the case of knock down.
  • a Transwell cell culture (Costar 3422, Cambridge, Mass.) With a filter of 12 ⁇ m pore size was used. More specifically, a cell suspension (5 ⁇ 10 4 cells / 500 ⁇ l culture medium) is added to the top and treated with Cardiac glycosides, followed by a phase-contrast microscope for the number of cells moved to the bottom after 24 hours. ) was counted in 10 random fields with a 100x magnification. In addition, cell division analysis was performed using BrdU assay.
  • inoculate cells at a density of 2,500 per well in a 96-well plate and after 24 hours, treated with Cardiac glycosides (Digoxin 100nM, Digitoxin 50nM, Ouabain 50 nM) and incubated again for 24 hours, followed by BrdU ( Bromodeoxyuridine) for 2 hours. And analysis was performed by detecting with an ELISA reader (Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric), Roche).
  • the tumor was extracted at the expense of the animals after monitoring until the tumor size reached 1 cm 3 .
  • FIG. 10A shows that oral administration of digoxin, a cardiac glycosides, decreased tumor growth in an animal model injected with A549 cell line depending on time
  • FIG. 10B is an animal model injected with a cell line in which STK11 was restored to wild type. The result can be confirmed that the above effects do not appear.
  • tumor size changes were compared in STK11-mutated and STK11-recovered (wild-type STK11) cells, and as shown in FIGS. 10C, 10D, and 10E, STK11 compared to an animal model injected with wild-type STK11-expressing cells.
  • mutant cells were injected, tumor growth was selectively reduced by digoxin treatment.
  • the selective susceptibility to Cardiac glycosides was found to be high in drug dose [180 ng / ind. (9 ⁇ g / kg)] lower than [60 ng / ind.
  • the prescribed concentration of digoxin used in existing clinical trials was 250 mcg / day for adults, while the expected concentration for STK11-mutant lung cancer was 180 mcg / day for adults. It can be seen that it is very low.
  • the present invention can be applied to the diagnosis or treatment of STK11-mutant lung cancer, and can be usefully used for developing therapeutic agents for treating STK11-mutant lung cancer.

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Abstract

본 발명은 Na+-K+ ATPase (ATP1A1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 STK11-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물, 상기 조성물을 유효성문으로 포함하는 항암제 및 STK11-돌연변이 암 치료제의 스크리닝 방법 등에 관한 것이다. 암세포에서는 다양한 유전자의 돌연변이가 확인되는데 그 중 높은 빈도로 확인되는 STK11-돌연변이 암 세포주에 Na+-K+ ATPase (ATP1A1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질인 강심 배당체(Cardiac glycosides)를 처리함으로써 암 세포의 성장이 현저하게 저해됨을 최초로 규명하였다. 따라서 본 발명에 따른 Na+-K+ ATPase (ATP1A1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 STK11-돌연변이 유래 암의 치료 타겟이 될 수 있는 효과가 있다.

Description

강심 배당체를 이용한 STK11-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물
본 발명은 Na+-K+ ATPase(ATP1A1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 STK11-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물 등에 관한 것이다.
폐암은 전 세계적으로 발생율이 증가되고 있는 추세에 있는 종양으로, 크게 암세포가 기관지나 폐포에서 처음 발생한 원발성 폐암과 암세포가 다른 기관에서 생겨나 혈관이나 림프관을 타고 폐로 이동해 자라는 전이성 폐암으로 나눌 수 있다.
조직학적으로 크게 비소세포폐암(NSCLC, non small cell lung cancer)과 소세포폐암(SCLC, small cell lung cancer)으로 분류되고, 비소세포폐암이 전체 폐암분포의 75%를 차지하고 있다. 상기 비소세포폐암(NSCLC)은 다시 선암(adenocarcinoma), 편평상피세포암(squamous cell carcinoma), 대세포암(large cell carcinoma)으로 분류되고, 이 중 선암이 점차적으로 높은 빈도를 보이고 있다.
폐암은 흡연인구의 증가와 대기 오염 등의 원인으로 급속히 그 발생이 증가하고 있음에도 불구하고, 대부분의 폐암은 화학요법과 방사선요법에 의해서는 치료가 어렵다. 소세포암은 그 크기를 축소시킴으로써 화학요법 및 방사선요법이 적용될 수 있으나 이에 의해서는 완전한 치료를 기대할 수 없고, 비소세포폐암은 소세포폐암에 비해 항암제의 효과가 적어 화학요법만으로는 치료가 거의 불가능하므로, 종양을 외과적으로 완전히 제거하는 것이 유일한 효과적인 치료법이다. 그러나 폐암 환자의 30% 이하가 진단시 전부 절제할 수 없는 종양을 가지며, 이들 중의 1/3 이하만이 외과적 절제술 이후 5년간 생존할 뿐이다. 따라서 폐암을 더 효과적으로 치료할 수 있는 방법이 절실히 요망된다.
나아가, 최근 미국 FDA에서 승인된 약물들 중 암 치료제 약물 대부분이 특정 돌연변이형 암종을 타겟으로 한다. 이러한 항암제 시장의 변화와 함께 최근 암 치료제 개발은 돌연변이 암종을 특이적으로 조절할 수 있는 타겟 발굴에 초점이 맞추어져 있다.
특히, 폐암에서 STK11(또는 LKB1)은 돌연변이 발생빈도가 높다는 점과 함께 LKB1의 돌연변이 세포에서 폐암의 전이 및 분화가 촉진된다는 보고가 2007년 Nature 저널에 발표된 바 있어, 폐암에서 STK11이 매우 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있다. 특히, 폐암 환자 조직 샘플에서 SKT11은 다른 주요 유전자 돌연변이와는 뚜렷하게 구분되는 발생 양상을 나타내어 STK11 돌연변이형 폐암 환자군 특이적인 항암 약물 개발의 필요성을 보인다. 그러나 현재 폐암에서는, ALK, BRAF, EGFR 등의 유전자 돌연변이에 대한 항암 약물들이 임상적으로 활발히 시도되고 있으나, 가장 빈도가 높은 STK11-돌연변이 암에 대한 타겟 항암제 개발은 보고된 바 없다.
이전 연구는 STK11 시그널링 경로의 유전적 변형(variants)이 제2형 당뇨병과 같은 질환에서 치료적 효과에 영향을 줄 수 있을 것으로 보고되어 있다. STK11은 종양저해인자로서 기능을 하는 세린-트레오닌 키나아제를 암호화하고 세포 극성을 조절한다. STK11의 기능-소실 체세포 돌연변이는 폐암의 대략 30%에서 발견되어 왔고, 전이(metastasis)를 촉진하는 것으로 제안되어 왔다.
한편, 강심 배당체(Cardiac glycosides)는 디곡신 (Digoxin), 디지톡신 (Digitoxin), 와베인 (Ouabain) 약물의 패밀리로, 기존에 울혈심부전증과 부정맥 등의 치료에 강심제로 사용되어 왔던 약물이다. Cardiac glycosides는 Na+-K+ ATPase(ATP1A1 단백질(ATPase, Na+-K+ transporting, alpha 1 polypeptide)의 기능을 저해하는 물질로, 세포내부의 나트륨과 칼륨의 농도를 조절하는 역할을 한다. ATP1A1 단백질은 세포 내부를 저농도의 나트륨과 고농도의 칼륨으로 유지하는 기능을 하는데, 이는 세포질막의 양면 사이의 전위차를 생성하는 eletrogenic 펌프이다. 또한, 흥분과 수축성 조직의 편광화를 확인하는 기능을 하는데, 탈분극과 재분극은 각각 나트륨의 유입과 칼륨의 방출과 상응된다. Na+-K+ ATPase가 평형을 복원한다. 또한, 플라즈마 멤브레인의 양면 상에 이온 구배와 관련된 포텐셜 에너지를 생성하는 기능을 한다. 이 에너지는 특히 보조적인 활성 수송용으로 이용되는데, 일반적으로 나트륨의 그것과 커플링된다.
일반적으로 알려져 있는 Cardiac glycosides는 인산화 상태에 있을 때, 효소의 세포외 부분에 결합, 즉 칼륨을 결합하여 세포 내로 칼륨을 전달한다. 알파 서브 유닛의 탈 인산화를 유도하는 세포 외 칼륨은 심장 배당체의 효과를 감소시킨다. 심장 배당체는 심근, 심장 전도 조직, 부드러운 근육 및 적혈구와 같은 다른 조직들의 Na+-K+ ATPase(ATP1A1)을 저해한다. 그들은 골격근육의 Na+-K+ ATPase(ATP1A1)에는 거의 영향을 미치지 않는다.
이러한 ATP1A1과 암 질환과 관련된 종래 기술로, 국내특허공개 10-2013-0137562호(2013.12.17. 공개)에는 APOO(Apolipoprotein O), ATP1A1(ATPase, Na+-K+ transporting, alpha 1 polypeptide), CANX(calnexin) 및 DDOST(dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase)로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나의 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 폐암 진단 또는 치료용 조성물이 기재되어 있다. 구체적으로 여기에서는 ATP1A1(ATPase, Na+-K+ transporting, alpha 1 polypeptide)이 폐암 진단에 유효함을 개시하고 있기는 하지만, 그 치료적 효과에 대한 구체적인 언급이 없을 뿐만 아니라 돌연변이 암에 대한 치료적 유효성에 대해서도 전혀 언급된 바 없다.
본 발명의 목적은 STK11-돌연변이 암에 대해 특이적인 치료효과를 나타내는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 Na+-K+ ATPase (ATP1A1 단백질, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Na+-K+ ATPase (ATP1A1 단백질, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 Na+-K+ ATPase은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 Na+-K+ ATPase의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 강심 배당체(Cardiac glycosides) 및 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질은 Na+-K+ ATPase의 칼륨 결합을 비경쟁적- 또는 경쟁적 저해하여 세포 내 칼륨전달을 저해하는 물질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질은 Na+-K+ ATPase 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 강심 배당체에 특이적으로 결합하는 물질은 디곡신(digoxin), 와베인(ouabain) 또는 디기톡신(digitoxin)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 디곡신(digoxin)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공한다.
이에 더하여, 본 발명은 상기 조성물을 STK11-돌연변이 암 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 STK11-돌연변이 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 개체는 인간, 가축 등을 포함하는 포유류일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(1) 환자로부터 생물학적 시료를 채취하여 세포를 분리하는 단계;
(2) 상기 세포와 ATP1A1(Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송을 저해하는 물질을 접촉시키는 단계; 및
(3) 상기 세포의 성장이 무처리군에 비해 저해되면 STK11-돌연변이 암일 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 (1) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 피부 세포, 점막 세포, 소변, 및 모발로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
나아가 본 발명은 하기 단계를 포함하는 STK11-돌연변이 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
a) 시험관 내(in vitro)에서 STK11-돌연변이 암 세포 및 야생형 암 세포와 ATP1A1(Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송을 저해하는 물질을 접촉시키는 단계;
b) 상기 접촉 후 STK11-돌연변이 암 세포와 야생형 암 세포의 성장률을 비교하는 단계; 및
c) STK11-돌연변이 암 세포의 성장을 저해하는 물질을 STK11-돌연변이 암 치료제로 선정하는 단계.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 암은 전립선암, 유방암, 대장암, 흑색종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
나아가 본 발명은 Na+-K+ ATPase(ATP1A1, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는, STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암의 치료 또는 진단 용도를 제공한다.
본 발명에 따르면 암세포에서는 다양한 유전자 돌연변이가 확인되는데 그 중 높은 빈도로 확인되는 STK11-돌연변이 폐암에서 기존에 강심제의 용도로 사용되었던 Cardiac glycosides 물질을 처리함으로써 암 세포의 성장이 저해됨을 확인하였다. 따라서 Cardiac glycosides 물질을 스크리닝하여 STK11-돌연변이 유래 암 치료를 위한 타겟으로 활용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에서 STK11 돌연변이 암에 있어서 유효한 것으로 제안하는 Cardiac glycosides의 구조식을 도시한 것이다.
도 2는 비소세포폐암(NSCLC)에서의 STK11 돌연변이 양상을 확인한 결과이다. 도 2a는 비소세포폐암(NSCLC) 중 가장 높은 비중을 차지하는 하위유형 중 하나인 폐 선암종(Lung adenocarcinoma) 환자에서의 주요 7종의 돌연변이에 대한 유전적 변이 양상을 나타낸 것이다. 도 2b는 폐 선암종의 암 진행에 따른 STK11 변이 비율을 나타낸 것이다.
도 3a는 도 1로 도시한 3개의 Cardiac glycosides 화합물에 대해 60여 암 세포주에서 계층적 클러스터링을 수행한 Heat map이고, 도 3b는 기존에 쓰이고 있는 비소세포폐암(NSCLC) 치료제와 Cardiac glycosides의 STK11 정상발현 세포주에 대한 STK11 돌연변이 세포주에의 상대적인 약물효과(-logGI50의 AUC값)를 측정한 결과이다.
도 4는 도 1로 도시한 각각의 구조를 갖는 화합물들(Digoxin, Digitoxin 및 Ouabain)의 야생형 세포주 대비 돌연변이 세포주들의 enrichment를 -logGI50 watarfall plot으로써 나타낸 것(각각의 화합물에 대응하여, 도 4a, 도 4b, 도 4c)이다.
도 5a는 8종의 폐암 세포주에 대하여 Digoxin, Digitoxin 및 Ouabain을 농도를 달리하면서 STK11-돌연변이 폐암 세포주 및 STK11-야생형 폐암 세포주에 각각 처리(72시간)하여, 도 5b는 STK11-돌연변이 폐암 세포주에 야생형 STK11을 발현시키고 세포 성장 저해를 확인한 결과 그래프이다.
도 6은 STK11 돌연변이 세포주(A549)와 STK11가 회복된 세포주(A549-STK11)에 대하여 Digoxin, Digitoxin 및 Ouabain을 장시간 각각 처리하고, 3일, 7일, 14일차에 세포 성장 저해를 확인(TiterBlue), STK11 정상발현 세포주에 대한 STK11 돌연변이 세포주에의 상대적인 세포 성장 저해 효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 7a 및 7b는 폐암 세포주에 ATP1A1 siRNA를 처리(72시간)하여 얻어진 cell viability를 평가한 결과들로, 도 7a는 STK11-돌연변이 폐암 세포주 및 STK11-야생형 폐암 세포주에 각각 처리하여 Titer Blue로, 도 7b는 STK11-돌연변이 폐암 세포주에 야생형 STK11을 발현시키고 Titer Blue로 cell viability를 평가한 결과이다.
도 8은 야생형 STK11를 갖는 두 개의 폐암 세포주에 대하여 ATP1A1 및 STK11를 모두 넉다운(72시간)시켜 얻어진 세포 성장 저해 결과를 비교한 결과 그래프이다.
도 9는 Cardiac glycosides 처리로 인해 STK11-돌연변이 폐암세포주에서 특이적인 세포이동 및 세포분열 억제 효과가 나타남을 확인한 것으로, 도 9a는 세포이동 결과이고, 도 9b는 세포분열 결과이다.
도 10은 STK11-돌연변이 폐암에서 Cardiac glycosides의 전임상적 효과를 확인한 결과로, 도 10a는 A549 세포주가 주입된 동물모델에서 종양의 성장을 확인한 것이고, 도 10b는 STK11를 야생형으로 회복시킨 세포주가 주입된 동물모델에서 종양의 성장을 확인한 것이며, 도 10c와 도 10d 및 도 10e는 각각 60ng/ind. (3 μg/kg)와 180 ng/ind. (9 μg/kg) 농도의 Cardiac glycosides 처리에 의해 STK11 정상발현 세포주가 주입된 동물모델에 대한 STK11-돌연변이 세포가 주입된 동물모델에서의 상대적인 종양 성장 감소를 확인한 그래프 및 사진이다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 Na+-K+ ATPase(ATP1A1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 STK11-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서는 인간 세포주와 조직 데이터의 유용성이 증가되고 있는 상황에서 다양한 데이터셋을 이용하여 암 치료법에 새로운 이해를 제공하는 돌연변이-특이적 암 특징을 분석함으로써, STK11-돌연변이 암 세포에서 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질 처리시 야생형 암 세포주에 비해 암 세포의 성장이 저해된다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
지금까지 알려져 있는 ATP1A1 시그널링 경로는 mTOR의 활성화, AICAR-유도 AMPK 활성화가 ATP1A1 활성의 감소를 촉진시킨다는 것, 미토겐 활성화 단백질(MAPK)의 활성화, 미토콘드리아 활성 산소종(ROS) 활성화 뿐만 아니라 포스포리파제 및 이노시톨 트리포스페이트(IP3) 수용체(IP3R)의 활성화 등을 들 수 있다.
본 발명은 STK11-돌연변이형 암에서 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질, 특히 ATP1A1에 특이적으로 결합하여 세포 내 칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 STK11-돌연변이 유래 암의 치료 타겟으로 확인하였다.
또한, 본 발명의 일실시예에서는 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질로 강심 배당체(Cardiac glycosides)를 처리하였을 때의 암세포 성장 저해 효과가 야생형 암 세포(STK11 단백질의 돌연변이가 나타나지 않은 암 세포)에 비해 STK11 돌연변이형 암 세포에서 현저하게 나타나는 것을 직접 확인하였다.
이에 더하여, 본 발명의 일실시예에서는 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질로 ATP1A1 siRNA를 처리하였을 때 ATP1A1 넉다운이 STK11-돌연변이된 암 세포주의 세포 증식을 저해시킨다는 것을 실험적으로 확인하였다.
상기 결과로부터 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질이 STK11 돌연변이 암 치료에 사용될 수 있음을 될 수 있음을 알 수 있다. 이는 또한 암(특히, STK11-돌연변이된 암)의 진행을 조절하기 위한 치료적 적용에 대한 가능성 있는 수단(route)을 제시한다. 또한, 본 발명은 STK11의 넉다운이 ATP1A1에 대한 유사한 효과로 나타남을 확인하였다. ATP1A1의 넉다운은 STK11 돌연변이체에서 세포 성장의 선택적 감소를 유도하였다. 이는 ATP1A1 발현이 정상적인 STK11 시그널링이 소실되었을 때, 세포의 성장에 중요하다는 것을 의미한다. 이에 더하여, 대부분의 ATP1A1 저해제들은 STK11 야생형 암 세포주보다 STK11 돌연변이 암 세포주에서 우수한 세포 성장 저해 활성을 나타냈다.
종합하면, 본 발명의 결과들은 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 이용한 새로운 치료법을 이용한 STK11 돌연변이형 암의 치료적 가능성을 제시한다. 따라서 본 발명의 접근법은 새로운 효과적 치료 방법에 대한 유용한 실마리를 제공할 수 있다.
이에, 본 발명의 실험결과에 기초하여, 본 발명은 Na+-K+ ATPase(ATP1A1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 STK11-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있으며, Na+-K+ ATPase(ATP1A1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 STK11-돌연변이 암 진단용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
STK11-돌연변이는 전립선암, 유방암, 대장암, 림프종, 흑색종, 폐암 등을 포함한 포괄적인 암에서 발견되었다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질, 특히 ATP1A1 펌프에 특이적으로 결합하여 ATP1A1에 칼륨이 결합하지 못하도록 경쟁적- 또는 비경쟁적으로 억제함으로써 ATP1A1의 세포 내 칼륨 수송 기능을 저해하는 역할을 하는 물질이 STK11-돌연변이 암의 성장을 특이적으로 저해시킴을 규명하였다. 가장 바람직하게는 상기 암 중 STK11-돌연변이의 발생 비율이 다른 암에 비해 높게 나타나는 폐암에서 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 이용하여 STK11-돌연변이 폐암을 치료하는 데 효과적으로 적용할 수 있음을 밝혀내었다.
본 발명의 ATP1A1 단백질은 인간에서 유래된 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으나 이에 한정되지 않고 상기 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 포함할 수 있다.
폐암 세포주 계열에서 ATP1A1의 저해는 야생형 암 세포주가 아닌 STK11-돌연변이 암 세포주에서 세포 성장이 현저히 감소되는 것을 확인하고, ATP1A1가 STK11-돌연변이 암 세포주에서 세포의 생존 또는 증식에 중요한 역할을 하는 것임을 알아내었다. 이와 같은 결과는 ATP1A1이 STK11-돌연변이 암의 진행에 관여한다는 것을 시사하는 것이며, 따라서 ATP1A1 펌프의 기능을 억제하면 STK11-돌연변이 암 세포의 증식이 저해되고 이에 의해 STK11-돌연변이 암을 치료할 수 있음을 의미하는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 강심 배당체(Cardiac glycosides) 또는 ATP1A1에 특이적으로 결합하는 물질로서, 상기 ATP1A1에 특이적으로 결합하는 물질은 ATP1A1 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적 서열 내에서 mRNA와 RNA 간의 올리고머 헤테로이중체를 형성하는 올리고머를 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적서열에 대해 완전하거나 또는 근사한 서열 상보성을 가지며, mRNA의 번역을 차단하거나 저해하고 스플라이싱 변이체를 생성하는 mRNA의 가공 과정을 변화시켜 표적유전자의 발현을 저해할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, ATP1A1 단백질의 발현을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 ATP1A1 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 올리고머일 수 있다.
상기 siRNA는 RNA 간섭 또는 유전자 침묵(gene silencing)을 매개할 수 있는 약 20개의 뉴클레오티드로 구성된 길이의 이중가닥 RNA를 의미하며, shRNA는 siRNA 표적 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5개 내지 9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 구조의 RNA를 의미한다. siRNA나 shRNA는 상보적인 서열을 갖는 표적 mRNA에 특이적으로 결합하여 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭(RNAi: RNA interference)을 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 ATP1A1 단백질의 발현을 저해하는 siRNA 또는 shRNA는 ATP1A1을 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적인 서열로 구성될 수 있다.
siRNA를 제조하는 방법은 siRNA를 직접 화학적으로 합성하거나, 시험관 내(in vitro) 전사를 이용하여 합성하는 방법이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, shRNA는 siRNA의 고가의 합성비용, 낮은 형질감염 효율에 따른 RNA 간섭 효과의 짧은 지속시간 등을 극복하기 위해 이용되며, RNA 중합효소 III의 프로모터로부터 아데노바이러스, 렌티 바이러스, 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있다. shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 가공 효소(Dicer 또는 RNaseIII)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 표적 유전자의 침묵을 유도하는 것으로 알려져 있다.
또한, 상기 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 ATP1A1에 특이적으로 결합하여 펌프 기능을 특이적으로 저해하는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 ATP1A1 펌프에 특이적으로 결합하여 ATP1A1의 세포 내 칼륨 수송 기능을 효과적으로 저해할 수 있다. ATP1A1에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법에 의해 제조하거나, 또는 상업적으로 이용가능한 항체를 구입하여 사용할 수 있다. 또한, ATP1A1에 결합하여 칼륨 펌프 기능을 저해하는 항체는, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 갖는 완전한 형태 외에도, 항체의 기능성 단편을 포함한다. 항체의 기능성 단편은 적어도 항원 결합기능을 보유하는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
이에 더하여, 상기 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 공지의 강심 배당체(Cardiac glycosides)일 수 있다. 상기 공지의 Cardiac glycosides는 ATP1A1의 펌프 기능을 억제하는 것으로 알려진 공지의 화합물, 천연물, 추출물, 생리활성물질 등일 수 있으며, 예를 들면, 디곡신(digoxin), 와베인(ouabain) 또는 디기톡신(digitoxin) 등일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
디곡신은 ATP1A1(Na+-K+ ATPase)의 알파-서브유닛의 세포외 측면 상의 사이트에 결합한다. 와베인은 식물로부터 분리된 것으로 특이적으로 나트륨 펌프를 블록킹하기 위해 시험관 내(in vitro) 연구에 있어서 과학자들에 의해 널리 사용되는 화합물이다. 디기톡신은 심장 배당체로서 디곡신과 유사한 구조 및 효과를 나타내나 디곡신보다 효과가 더 오래 유지된다. 상기와 같은 디곡신, 와베인 및 디기톡신은 직접적이고 특이적으로 ATP1A1을 저해하는 것으로 공지된 화합물들이다.
지금까지 알려진 이들 화합물의 연구에 있어서, 디곡신은 다양한 심장 상태의 치료에 널리 사용되어 왔다. 디곡신이 심장에 유익한 효과뿐만 아니라 특정 암 종의 위험을 줄일 수 있음을 제안되었으나 디곡신이 약물의 치료농도에서 암 위험을 줄이는 효과를 제안했을 뿐이다.
와베인과 관련하여서는, Cardiac glycosides인 와베인이 폐암에 유력한 치료 표적이며 폐암 세포의 침입을 지연시키는 것을 확인한 연구와, 안드로겐 독립적인 전립선암에 있어서 심장 배당체의 치료 가능성 확인을 위해 와베인에 의한 세포독성 효과 뿐만 아니라 PC-3 세포의 신호 전달 경조를 조사한 연구 등이 알려져 있다.
디기톡신과 관련하여서는, 디기톡신과 그 유사체의 암세포에 대한 세포독성에 초점을 맞추고 디기톡신과 유사체가 강력한 화학요법 약물을 개발하는데 있어서의 약리학적 연구를 수행하여, 종래의 ATP1A1에서의 디기톡신의 영향에 있어서의 기전을 새로운 기전으로 정립한 연구가 알려져 있다.
그러나 이와 같은 Cardiac glycosides가 STK11-돌연변이 암에 특이적으로 세포성장을 저해함에 대한 연구들은 없었다.
본 발명의 약학적 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 유효성분을 0.0001 내지 50중량%로 포함하는 것이 바람직할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 약학적 조성물로 이용하기 위하여 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 국소 주입, 뇌실내 주입, 척수강 주입, 피하 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 바람직하게 본 발명에 따른 약학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기로부터, 본 발명의 약학적 조성물은 STK-11 돌연변이 암을 치료하기 위한 항암제로서 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물 또는 항암제를 STK-11 돌연변이 암의 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 STK-11 돌연변이 암을 치료하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 개체는 인간을 포함한 영장류, 가축(소, 말, 양, 닭, 돼지, 개, 토끼) 등일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
이에 더하여, ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 처리하여 정상대조군에 비해 세포성장이 저해되면 STK11-돌연변이 암으로 판정하는 단계를 포함하는 STK11-돌연변이 암의 진단방법을 제공할 수 있다.
나아가 본 발명은 시험관 내(in vitro)에서 STK11-돌연변이 암 세포 및 STK11-야생형 암 세포와 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 접촉시키는 단계, 상기 접촉 후 STK11-돌연변이 암 세포와 STK11-야생형 암 세포의 성장률을 비교하는 단계 및 STK11-돌연변이 암 세포의 성장을 특이적으로 저해하는 물질을 STK11-돌연변이 암 치료제로 선정하는 단계를 포함하는 STK11-돌연변이 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서, ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 STK11-돌연변이 암세포에서 STK11-야생형 암세포 대비 세포 증식을 저해하는 것으로 확인되었다. 또한, STK11-돌연변이 암세포에서 ATP1A1을 넉아웃 시키면 STK11-돌연변이 암세포의 증식이 저해되는 것으로 나타났다.
따라서, ATP1A1에 특이적으로 결합하여 ATP1A1 펌프의 기능을 억제하는 물질은 STK11-돌연변이 암세포의 증식을 저해하여 암 치료 효과를 발휘할 수 있으며, 이때, 상기 암은 전립선암, 유방암, 대장암, 흑색종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 STK11-돌연변이 암 세포 및 STK11-야생형 암 세포와 ATP1A1의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질(시험 물질)을 접촉시키는 단계는 시험 물질의 형질감염, 형질전환 또는 주입에 의해 수행될 수 있으며, 상기 시험 물질과의 접촉은 상기 세포의 성장을 유지할 수 있는 배지 중에서 이루어질 수 있다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, STK11-돌연변이 암 세포와 STK11-야생형 암 세포의 성장률을 비교하는 단계는 세포 수를 계수함으로써 수행될 수 있으며, 상기 계수는 눈으로 또는 화상 이미지로 촬영한 뒤 소프트웨어를 이용하여 계수하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 스크리닝 방법에서 시험 물질의 처리 후 STK11-돌연변이 암 세포의 세포 성장률이 야생형 암 세포의 세포 성장률에 비해 저해되었을 경우, 상기 시험 물질은 ATP1A1 펌프 기능을 억제하여 STK11-돌연변이 암 치료를 위해 이용될 수 있는 물질로 선별될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: STK11 유전자형 특이적 화합물의 계층적 클러스터링(Hierarchical clusturing of genotype-specific compounds)
유전자형 특이적 화합물 감응의 패턴을 식별하기 위해, CLEA map 상의 GI50 프로파일 패턴을 사용하여 화합물들의 부분집합을 선택하였다.
우선, -logGI50 값 8(즉, GI50=0.01μM)은 화합물이 NCI60 패널에 있어서 어떤 세포주들에 대해 그 화합물이 민감한지 여부를 결정하는 bipartite cutoff로써 채택되었는데, 그 값이 8보다 크면 그 화합물이 민감한 것이고 8보다 작으면 그렇지 않은 것이다.
다음으로, CLEA 분석에 있어서 enrichment score(AUC 값)를 유전자형-특이적 화합물을 선택하기 위해 사용하였다.
AUC value > 80와 P value < 0.01 들이 화합물이 특정 유전자형에 대한 유의적인 감도를 갖는 가짐을 확인하기 위한 컷오프 값으로 사용되었다. 본 실시예에서는 NCI60 패널에 있어서 적어도 하나의 세포주에 대하여 강한 포텐시(즉, -logGI50값 8)를 보이는 화합물을 포함시켰다.
결과에 따라, 전술한 필터링을 만족한 총 3개의 비중복 화합물들이 컴파일링되었다. STK11 유전자형 카테고리에 대하여 이들 선택된 화합물들에 대해 계층적 클러스터링을 수행하여 이를 도 3a로 나타내었다. 본 실시예에서는 돌연변이 유전형에 기초하여 균일한 감도를 나타내는 세 개의 주요 화합물군을 규명하였다. 이러한 화합물 클러스터는 STK11 유전자에 있어서 유전적 돌연변이에 대해 민감하였다. 이러한 결과는 유사한 응용을 갖는 다양한 화합물들 사이의 거동의 메카니즘(mechamisms of action, MOA)을 이해하는 데 있어서의 직접적인 단서를 제공한다.
또한, 도 3b는 기존에 FDA 승인된 폐암(비소세포폐암; NSCLC) 치료제들보다 Cardiac glycosides이 STK11 돌연변이형 폐암에 더 높은 민감도를 나타냄을 보여주는 것이다.
실시예 2: 화합물의 STK11 유전자형 의존성 감도(Genotype-dependent sensitivity of compounds)
도 3a로 도시한 클러스트들로부터, 세 개의 대표 화합물(ouabain, digoxin, digitoxin)을 선택하여 추가적으로 유전형 특이적 세포반응을 분석하였다.
STK11(LKB1)은 도 2a로 도시한 유전적 변이 양상으로부터, 비소세포성폐암(NSCLC) 환자 조직에서 다른 주요 유전자 돌연변이와는 뚜렷하게 구분되는 발생 양상을 나타내어 STK11 돌연변이형 폐암 환자군 특이적인 항암 약물 개발의 필요성을 보인다. 또한, 도 2b로 도시한 암의 진행 단계 별 STK11 돌연변이의 변이 비율 그래프로부터, 폐암이 진행될수록 STK11 돌연변이의 발생 비율이 증가하는 양상을 확인하였다. 그러나 현재 폐암에서는, ALK, BRAF, EGFR 등의 유전자 돌연변이에 대한 항암 약물들이 임상적으로 활발히 시도되고 있으나, 분별적으로 높은 빈도를 보이는 STK11 돌연변이에 대한 타겟 항암제 개발은 보고된 바 없다. 따라서, STK11-돌연변이 폐암에 대해 특이적인 치료효과를 나타내는 약학적 조성물 개발이 필요함을 제안한다.
또한, STK11은 central 신진대사 센서인 AMPK를 직접적으로 인산화하고 활성화하는 세린-트레오닌 키나제를 인코딩한다. AMPK는 간, 근육과 지방 조직같은, 전문적인 대사 조직에 있어서 지질, 콜레스테롤 및 글루코오스 대사를 조절한다. STK11단백질은 암을 초래하는 생물학적으로 중요한 두 가지 경로에 참여하고 있다. 첫째는, STK11은 편광된 상피세포를 유지하는 것을 돕고, 둘째로는 STK11은 세포에너지 균형을 제어하는 AMPK를 활성화한다. STK11 기능으로써의 이러한 통찰은 AMPK 활성의 조절을 통해 새로운 치료전략의 타겟이 될 수 있다는 것을 암시함을 제안한다.
본 실시예에서는 도 3a로 나타낸 것과 같이, ouabain, digoxin 및 digitoxin은 STK11 돌연변이와 연관된 클러스터에서 확인되었고, STK11 돌연변이 잠복의 6개 세포주에서 이들 화합물들이 비교적 높은 감도를 나타내었다.
STK11 돌연변이 잠복의 6개 세포주는 다음 표 1과 같다.
표 1
MOLT-4 Leukemia CDKN2A: NOTCH1: NRAS: PTEN: TP53: STK11: CDKN2A
A549 Lung CDKN2A: KRAS: STK11
NCI-H460 Lung CDKN2A: KRAS: PIK3CA: STK11: c-MYC-Amp
NCI-H23 Lung KRAS: STK11: TP53: PTEN: CTNNB1
SK-MEL-5 Melanoma BRAF: CDKN2A: STK11
DU-145 Prostate CDKN2A: MLH1: RB1: STK11: TP53
한편, 도 4는 도 1로 나타낸 것과 같은 각각의 구조를 갖는 화합물들(ouabain, digoxin, digitoxin)의 야생형 세포주 대비 돌연변이 세포주들의 enrichment를 -logGI50 watarfall plot으로써 나타낸 것(각각의 화합물에 대응하여, 도 4a, 도 4b, 도 4c)이다.
도 3 내지 4의 결과로부터 3가지의 Cardiac glycosides 약물들 모두가 STK11 특이적 감응을 명확히 나타냄을 확인하였다.
이로써, Cardiac glycosides 약물들은 STK11-돌연변이 의존적 활성을 갖는 것으로 정의할 수 있다.
실시예 3: Cardiac glycosides의 처리에 따른 STK11 돌연변이 폐암 세포 특이 성장저해효과 분석
(1) 세포주 배양
NCI-60 폐암세포주(NCI-H460, A549, NCI-H322M 및 NCI-H226)는 미국국립암센터(NCI DTP)로부터 입수하였다. 모든 세포는 10% FBS(GIBCO) 및 페니실린/스트렙트아비딘(GIBCO)이 첨가된 RPMI 배지(GIBCO)에서 성장시키고 5% CO2에서 가습된 대기에서 37℃로 유지하였다.
(2) 세포 생존능 분석
도 1로 도시한 것과 같은 구조를 갖는 총 3개의 Cardiac glycosides(chemicals)를 폐암 세포주에 대해 스크리닝하였다. 디곡신(digoxin), 와베인(ouabain) 및 디기톡신(digitoxin)은 각각 Sigma사로부터 구입하였다.
세포는 웰 당 3일 배양을 위해 2,000 세포, 7일 배양을 위해 1,000 세포, 14일 배양을 위해 200세포의 밀도로 96웰 플레이트에 씨딩하였다. 씨딩 24시간 후, 세포를 0.05 μM Digitoxin 및 0.02 μM Ouabain 농도(working concentration)로 희석된 화학제(chemicals)로 처리하였다. 세포는 다시 72시간(3일), 7일, 14일 동안 배양한 후 CellTiterBlue 분석키트를 이용하여 생존율을 측정하였다.
Cardiac glycosides인 Digoxin, Digitoxin 및 Ouabain을 농도를 달리하면서 4종의 STK11-돌연변이 폐암 세포주(A549, H460, H1993, H1395) 및 4종의 STK11-야생형 폐암 세포주(H226, H322M, H82, H524)에 처리(72시간)하여 세포 성장 저해를 확인하여 이를 각각 도 5a에 나타내었다.
도 5a의 결과로부터 각각의 화합물에 대해 감응하는 감도는 STK11-돌연변이 폐암세포주가 STK11-야생형 폐암세포주 대비 높음을 알 수 있다.
이에, 96 well plate를 이용하여, Digoxin, Digitoxin 및 Ouabain의 처리에 따른 세포성장 저해를 확인하였다. 이때, 폐암세포주로는 STK11-돌연변이 세포주(A549)와 STK11를 야생형으로 회복시킨 세포주(A549-STK11)를 각각 사용하였다.
도 5b는 상기 세포주들에 대하여 Digoxin, Digitoxin 및 Ouabain을 각각 처리하여 세포 성장 저해를 확인(TiterBlue)한 결과 그래프로, STK11-돌연변이 세포주와 대비하여 STK11이 회복된 세포주의 경우 처리 화합물들에 대해 내성을 얻었음을 확인할 수 있었다.
또한, 도 6은 Cardiac glycosides들의 장시간 처리에 따른 STK11-돌연변이 세포주(A549)와 STK11를 야생형으로 회복시킨 세포주(A549-STK11)간의 생장 변화량 차이를 나타낸다.
도 6에서, Cardiac glycosides들의 장시간 처리 (3일, 7일, 14일)에 따라 STK11을 야생형으로 회복시킨 세포주 대비 돌연변이형 세포주에 대한 성장 억제 효과가 증가하는 양상을 확인하였다. 따라서 효과적인 약제를 이용한 ATP1A1 저해는 STK11 돌연변이를 포함하는 환자 종양의 효능이 있는 처치를 제공할 수 있다.
이러한 결과들은 Digoxin, Digitoxin이나 Ouabain이 STK11 돌연변이 암에 특이적으로 성장을 저해한다는 것을 보여주는 결과라 할 수 있다.
실시예 4: ATP1A1 넉다운에 따른 STK11 돌연변이 폐암 특이 세포 성장저해효과 분석
(1) siRNA 트랜스펙션
siRNA 트랜스펙션을 위해, 웰 당 3,000 세포를 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 동안 부착시킨 후, 타겟 siRNA(ATP1A1: 1009769 ; Bioneer, STK11: L-005035-00, Non targeting: D-001810-10 ;Dharmacon)를 CO2 인큐베이터에서 37℃로 6시간 동안 트랜스펙션 배지(GIBCO)에 첨가하였다. 트랜스펙션 후, 세포에 FBS를 포함하는 RPMI를 보충하고 수집과 72시간까지 37℃ 5% CO2에서 배양하였다.
(2) 폐암에서 STK11-돌연변이와 ATP1A1 발현의 상관관계 분석
도 7a는 4종의 폐암 세포주에 대하여 ATP1A1 siRNA를 처리(72시간)하여 얻어진 세포 생존(viability)을 평가한 결과들로, Titer Blue결과이다.
도 7a의 결과로부터, ATP1A1 siRNA 처리에 의해 STK11-야생형 폐암세포주인 H226 및 H322과 대비하여 STK11 돌연변이 폐암 세포주인 A549 및 H460의 성장이 현저히 저해됨을 확인할 수 있다. 즉, 폐암 세포주 계열에서 ATP1A1을 넉다운시키는 경우, 세포 성장은 STK11-야생형 세포주가 아닌 STK11-돌연변이 세포주에서 현저히 감소되었다. 그리고 도 7b는 STK11-돌연변이 폐암 세포주인 A549 및 H460에서 야생형 STK11을 발현시킨 결과로서, ATP1A1의 넉다운으로 인한 세포 성장의 감소가 덜 나타남을 알 수 있다.
따라서 ATP1A1은 STK11-돌연변이된 폐암 세포주에서 암 생존 또는 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다.
다음으로, 도 8은 야생형 STK11를 갖는 두 개의 폐암 세포주에 대하여 ATP1A1 및 STK11를 모두 넉다운(72시간)시켜 얻어진 세포 성장 저해 결과로, STK11-야생형 폐암 세포주에서 ATP1A1과 STK11을 모두 넉다운시키는 경우 각각만을 넉다운시키는 경우와 대비하여 상승적으로 세포 성장을 저해함을 확인할 수 있었다.
실시예 5: Cardiac glycosides의 STK11-돌연변이형 특이적 세포이동 및 세포분열 억제 효과
STK11-돌연변이 폐암 세포주인 A549 및 H460 (STK11 mutant)와 STK11를 야생형으로 회복시킨 세포주 A549-STK11 및 H460-STK11 (STK11 restored)에 대하여, Cardiac glycosides인 Digoxin, Digitoxin 또는 Ouabain을 처리하여 세포이동(cell migration)과 세포분열(cell division)에 대한 효과를 평가하였다.
세포이동 분석을 위해, 12 μm의 공극사이즈인 필터가 든 Transwell 세포배양기(Costar 3422, Cambridge, MA)를 사용하였다. 보다 상세하게는, 세포 부유액(5×104 cells/500 μl culture medium)을 상부에 첨가하고 Cardiac glycosides를 처리한 다음, 24시간 후 하부의 바닥에 이동된 세포수를 위상차현미경(phase-contrast microscope)을 이용하여 100x확대율로 10 random fields에서 계수하였다. 또한, 세포분열 분석은 BrdU 분석법을 이용하였다. 보다 상세하게는, 96-well plate에 well당 2,500의 밀도로 세포를 접종하고, 24시간 후 Cardiac glycosides를 처리(Digoxin 100nM, Digitoxin 50nM, Ouabain 50 nM)하여 다시 24시간을 배양한 다음, BrdU(Bromodeoxyuridine)로 2시간동안 라벨링하였다. 그리고 ELISA 리더기(Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric), Roche)로 검출함으로써 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 9a의 세포이동 및 도 9b의 세포분열에 대한 분석 결과에서 확인되는 바와 같이, STK11-돌연변이 폐암세포주에 Cardiac glycosides를 처리함으로써 세포이동 및 분열이 현저하게 감소되는 것을 알 수 있다. 상기 결과는 Cardiac glycosides가 STK11-돌연변이 폐암세포의 이동 및 분열을 억제한다는 것을 의미한다.
실시예 6: 동물모델에서 Cardiac glycosides의 STK11-돌연변이 특이적 항암 효과
ATP1A1 저해제가 STK11-돌연변이 폐암에서 전임상적 효과를 가지는지 알아보기 위해, A549 폐암세포주 또는 STK11를 야생형으로 회복시킨 세포주 (A549-LKB1wt)를 이식한 동물모델(mouse tumor xenograft model)을 이용하여 실험을 행하였다. 동물모델은, 무흉선 누드마우스(Oriental Bio Inc)를 구입하여 가톨릭대학교-동물실험 관련 위원회(Catholic University of Korea- Institutional Animal Care and Use Committee; CUK-IACUC)의 표준 가이드라인에 따라 준비하였다. 동물모델은 A549 또는 A549-LKB1wt를 각각 피하주입(3X106)하였으며, 다음과 같이 세 개의 그룹으로 나누었다: (1) 무처리 대조군(n = 10); (2) digoxin 60 ng/kg of body weight 처리군(n = 10); (3) digoxin 180 ng/kg of body weight 처리군(n = 10). Digoxin 또는 vehicle (1.9% DMSO/10% polyethyleneglycol 400/1X PBS: total volume 200ul)은 일주일에 3번씩 5주 동안 경구투여하였으며, 종양 크기는 다음의 식을 통해 각 종양 베이스의 2 직경을 측정하여 계산하였다: 종양 크기 (mm3) = (length × width × height × 0.52). 또한, 종양 크기가 1 cm3에 도달할 때까지 모니터한 후, 동물을 희생시켜 종양을 추출하였다.
도 10a는 Cardiac glycosides인 digoxin의 경구투여가 시간에 의존적으로 A549 세포주가 주입된 동물모델에서 종양의 성장을 저하시킴을 나타내는 결과이고, 도 10b는 STK11를 야생형으로 회복시킨 세포주가 주입된 동물모델에서는 상기와 같은 효과가 나타나지 않음을 확인할 수 있는 결과이다.
이에, STK11-돌연변이형 및 STK11이 회복된 경우(야생형 STK11)에서 종양 크기 변화를 비교분석하였으며, 도 10c, 도 10d 및 도 10e에 나타낸 바와 같이, 야생형 STK11 발현 세포가 주입된 동물모델에 비해 STK11-돌연변이 세포가 주입된 동물모델에서 digoxin의 처리에 의해 종양 성장이 선택적으로 감소함을 알 수 있다. 흥미롭게도 Cardiac glycosides에 대한 선택적인 민감성은 높은 약물량[180 ng/ind. (9 μg/kg)] 보다 낮은 약물량[60 ng/ind. (3 μg/kg)]의 처리 시 현저하게 나타났으며, 기존 임상에서 사용되는 digoxin의 처방 농도가 성인 평균 250mcg/day인 반면, STK11-돌연변이형 폐암에 처방 가능한 기대 농도는 성인 평균 180mcg/day 이하로 매우 낮다는 것을 알 수 있다.
상기 결과는 Cardiac glycosides가 STK11-돌연변이 폐암에 특이적으로 전임상적 항암효과를 나타낸다는 것을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 STK11-돌연변이 폐암 진단 또는 치료에 적용될 수 있으며, STK11-돌연변이 폐암을 치료하기 위한 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (16)

  1. Na+-K+ ATPase(ATP1A1, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는, STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 암은 전립선암, 유방암, 대장암, 흑색종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 Na+-K+ ATPase은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 Na+-K+ ATPase 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질은 강심 배당체(Cardiac glycosides) 또는 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 Na+-K+ ATPase에 특이적으로 결합하는 물질은 Na+-K+ ATPase 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 및 shRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 강심 배당체는 디곡신(digoxin), 와베인(ouabain) 및 디기톡신(digitoxin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 항암제.
  8. Na+-K+ ATPase(ATP1A1, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는, STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암 진단용 조성물.
  9. 하기 단계를 포함하는 STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암의 진단을 위한 정보제공방법:
    (1) 환자로부터 생물학적 시료를 채취하여 세포를 분리하는 단계;
    (2) 상기 세포와 Na+-K+ ATPase (ATP1A1, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 접촉시키는 단계; 및
    (3) 상기 세포의 성장이 무처리군에 비해 저해되면 STK11-돌연변이 암일 가능성이 높은 것으로 판정하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 피부 세포, 점막 세포, 소변, 및 모발로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 암은 전립선암, 유방암, 대장암, 흑색종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  12. 하기 단계를 포함하는 STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암 치료제의 스크리닝 방법:
    a) STK11-돌연변이 암 세포 및 STK11-야생형 암 세포와 Na+-K+ ATPase (ATP1A1, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 접촉시키는 단계;
    b) 상기 접촉 후 STK11-돌연변이 암 세포와 STK11-야생형 암 세포의 성장률을 비교하는 단계; 및
    c) STK11-돌연변이 암 세포의 성장을 저해하는 물질을 STK11-돌연변이 암 치료제로 선정하는 단계.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 암은 전립선암, 유방암, 대장암, 흑색종 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. Na+-K+ ATPase(ATP1A1, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암 치료방법.
  15. Na+-K+ ATPase(ATP1A1, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는, STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암 치료 용도.
  16. Na+-K+ ATPase(ATP1A1, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1)의 나트륨-칼륨 수송 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는, STK11(Serine/threonine kinase 11)-돌연변이 암 진단 용도.
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