CN103080314A

CN103080314A - 显性突变基因表达抑制剂

Info

Publication number: CN103080314A
Application number: CN201180041884XA
Authority: CN
Inventors: 北条浩彦; 高桥理贵
Original assignee: National Center of Neurology and Psychiatry
Current assignee: LSIP LLC
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2011-09-28
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2031-09-28
Also published as: CN103080314B; EP2623600A1; US20130197061A1; EP2623600A4; JPWO2012043633A1; WO2012043633A1; US9238812B2; JP5996431B2

Abstract

本发明开发了容许野生型或期望的突变基因的表达、可仅选择性且有效地抑制特定的显性突变基因的表达的RNAi分子，其目的在于提供一种含有将该RNAi分子作为有效成分的显性突变基因表达抑制剂及该RNAi分子的设计指南。该显性突变基因表达抑制剂包含设定的RNAi分子，该RNAi分子为在转录产物上产生不连续接合点(接合点，connection point)的显性突变基因中，从与不连续接合点邻接的有义链区域的3’端的碱基至3’末端的碱基长度设定为规定的长度的RNAi分子。

Description

显性突变基因表达抑制剂

技术领域

本发明涉及一种包含可选择性且有效地抑制显性突变基因的表达的RNAi分子的显性突变基因的表达抑制剂、包含该表达抑制剂的药物组合物及所述RNAi分子的设计方法。

背景技术

近年来，作为与化合物及抗体并列的新型医药或诊断药，在生物体内控制特定的基因的表达的功能性核酸备受关注，在世界各国中正进行面向其医疗应用的各种研究及开发。

对功能性核酸而言，已知有利用经由RNAi(RNA interference：RNA干扰)的基因沉默在转录后抑制靶基因的表达的siRNA(small interferingRNA，小干扰RNA)、shRNA(short hairpin RNA，短发夹RNA)及miRNA(micro RNA，微小RNA)，或与转录因子等靶物质特异性结合来抑制其功能的核酸适体，与靶mRNA结合而抑制其翻译的反义核酸，含有作为陷阱序列的转录因子结合域等调节区域，并通过捕捉靶物质来抑制其转录因子引起的基因表达的陷阱DNA，特异性地阻碍靶基因的mRNA前体中的多聚腺苷酸化而使其不稳定化后，将其引入分解的U1接头等。这些均被期待作为下一代的医药或诊断药，其中，从其目标特异性、应用性的广度及作用效果的可靠性的方面考虑，利用siRNA或shRNA的RNAi作为可抑制期望的基因表达的强力的基因表达控制工具引人注目。

作为RNAi的应用，可以特异性地抑制期望的等位基因的表达的等位基因特异的基因沉默(allele-specific RNAi：ASP-RNAi)不会对野生型基因的表达造成影响，可特异性地抑制引起疾病的靶显性突变基因的表达，因此，一般认为是疾病治疗法上极其有用的方法。例如，作为常染色体显性遗传疾病之一已知的难治性的进行性骨化性纤维发育不良(FibrodysplasiaOssificans Progressiva：FOP)是由作为原因基因的ALK2(Activin-like kinase2：激活素样激酶2)基因上的第617位的G(鸟嘌呤)取代为A(腺嘌呤)的点突变或第1067位的G取代为A的点突变引起的。具有这些点突变的任一种的突变基因为显性，因此，即使为具有野生型ALK2基因的杂合体也会引发FOP(非专利文献1～3)。但是，现在还未知抑制FOP的发病及发展的有效方法。在此，若可利用ASP-RNAi仅抑制显性突变基因的表达且容许野生型基因的表达，则可以抑制以FOP为代表的常染色体显性遗传疾病的发病，另外，若为已发病的患者，则可以阻止其发展。这样，ASP-RNAi在RNAi中特别是作为药物或诊断用药的实用性极高。

但是，在如上所述的通过点突变的碱基置换的突变基因和野生型基因中，其基因间的碱基序列仅1～数个碱基不同，因此，基于现有的一般的设计方法的RNAi分子对于突变基因的特异性低，甚至抑制野生型基因的表达。另外，即使如产生含有不连续接合点(接合点，connection point)的转录产物的显性突变基因那样，在突变基因和野生型基因的碱基序列之间存在明显的不同的情况下，也未必能说利用现有方法设计的RNAi分子对于突变基因的特异性高，但却常常抑制野生型基因的表达。为了实现这样的ASP-RNAi，对于突变基因特异性极高的siRNA或shRNA的开发不可或缺。另一方面，在siRNA等的设计中，必须将含有突变位点(置换位点、缺失位点、插入位点等)周围的碱基序列作为靶区域，因此，设计区域必然受到限制。因此，即使应用公知的有效的siRNA的靶序列选择方法，也存在未必能够设计特异性高且有效的siRNA等的问题。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Shore EM.，et al.，2006，Nature Genetics，Vol.38：525-527

非专利文献2：Nakajima M.，et al.，2007，Journal of Human Genetics，Vol.52：473-475

非专利文献3：Furuya H.，et al.，2008，American Journal of MedicalGenetics Part A，Vol.146A：459-463

发明内容

发明要解决的课题

本发明开发了容许野生型基因或期望的显性突变基因的表达、可仅选择性且有效地抑制在转录产物上产生不连续接合点的特定的靶显性突变基因的表达的RNAi分子，其目的在于提供一种含有将该RNAi分子作为有效成分的显性突变基因的表达抑制剂及该RNAi分子的设计方法。

本发明的目的在于提供一种治疗由于显性突变基因的表达而发病的遗传性疾病的治疗剂。

用于解决课题的手段

本发明人等为了解决所述课题重复进行了潜心研究，结果发现可选择性且有效地抑制在转录产物上产生不连续接合点的特定的靶显性突变基因的表达的siRNA等的RNAi分子结构的一般规则。即，明确从与不连续接合点邻接的有义链区域的3’端的碱基至其3’末端的碱基长度设定为规定的长度的RNAi分子选择性且有效地抑制显性突变基因的表达，另一方面，对于野生型基因的表达，几乎不显示抑制效果或降低其表达。本发明是基于上述见解而完成的，提供以下发明。

(1)一种显性突变基因的表达抑制剂，含有将ASP得分值为0.4以上的RNAi分子作为有效成分，其中，

所述ASP得分由以下公式算出，

ASP得分＝[(由所述RNAi分子处理的正常型基因的标准化表达量相对于由对照RNAi分子处理的正常型基因的标准化表达量的相对比)-(由所述RNAi分子处理的突变基因的标准化表达量相对于由对照RNAi分子处理的突变基因的标准化表达量的相对比)]×(1-由所述RNAi分子处理的突变基因的标准化表达量相对于由对照RNAi分子处理的突变基因的标准化表达量的相对比)，

(式中，对照RNAi分子为不影响所述正常型基因和突变基因的表达的RNAi分子)；

所述RNAi分子包含含有在作为靶的显性突变基因的转录产物上产生至少一个不连续接合点及与该转录产物的连续的16～30个碱基序列一致的碱基序列的RNAi有义链区域，以及含有与所述RNAi有义链区域互补的碱基序列的RNAi反义链区域，且

从与所述RNAi有义链区域上的任一不连续接合点邻接的3’端的碱基朝向下游侧第4～15位中的任一碱基构成该RNAi有义链区域的3’末端碱基。

(2)一种显性突变基因的表达抑制剂，含有将编码ASP得分值为0.4以上的RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体作为有效成分，其中，

所述ASP得分由以下公式算出，

(3)如(1)或(2)所述的抑制剂，其中，在RNAi有义链区域和RNAi反义链区域上进一步附加TT或UU。

(4)如(1)～(3)中任一项所述的抑制剂，其中，RNAi分子为siRNA。

(5)如(1)～(3)中任一项所述的抑制剂，其中，RNAi分子为shRNA。

(6)如(1)～(5)中任一项所述的抑制剂，其中，显性突变基因中的突变从由碱基缺失、碱基插入、破坏剪接位点得到的碱基置换、基因重复、基因易位、以及染色体倒位构成的组中选出。

(7)如(1)～(6)中任一项所述的抑制剂，其中，显性突变基因为功能获得型。

(8)如(1)～(7)中任一项所述的抑制剂，其中，显性突变基因参与疾病的发病。

(9)如(8)所述的抑制剂，其中，疾病为恶性新生物。

(10)如(9)所述的抑制剂，其中，恶性新生物为非小细胞肺癌，且成为其靶的所述显性突变基因为突变型EGFR基因；恶性新生物为大肠癌，且成为其靶的所述显性突变基因为突变型CTNNB1基因；恶性新生物为胃癌，且成为其靶的所述显性突变基因为突变型CDH1基因；恶性新生物为乳腺癌，且成为其靶的所述显性突变基因为突变型BRCA1基因或突变型BRCA2基因；恶性新生物为自身免疫性多内分泌腺病综合征I型，且成为其靶的所述显性突变基因为突变型AIRE基因；恶性新生物为自身免疫性淋巴细胞增生综合征，且成为其靶的所述显性突变基因为突变型TNFRSF6/APT1/FAS基因；恶性新生物为慢性骨髓性白血病或急性淋巴性白血病，且成为其靶的所述显性突变基因为BCR-ABL嵌合基因；恶性新生物为伯基特淋巴瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为c-myc-IgH-嵌合基因；恶性新生物为间变性大细胞淋巴瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为NPM-ALK-嵌合基因；恶性新生物为肺癌，且成为其靶的所述显性突变基因为EML4-ALK-嵌合基因；恶性新生物为隆突性皮肤纤维肉瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为PDGFB-COL1A1嵌合基因；恶性新生物为先天性纤维肉瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为ETV6-NTRK3嵌合基因；恶性新生物为低度恶性纤维粘液性肉瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为FUS-CREB3L2嵌合基因；恶性新生物为骨外黏液样软骨肉瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为EWS-CHN嵌合基因；恶性新生物为尤因肉瘤或促纤维增生性小细胞肿瘤(線維形成性小細胞腫瘍)，且成为其靶的所述显性突变基因为将EWSR1基因作为易位伙伴的嵌合基因；恶性新生物为腺泡状横纹肌肉瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为将SYT基因或SSX基因作为易位伙伴的嵌合基因；恶性新生物为炎性肌纤维母细胞肿瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为将ALK基因作为易位伙伴的嵌合基因；恶性新生物为脂肪肉瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为将CHOP基因作为易位伙伴的嵌合基因；或者恶性新生物为透明细胞肉瘤或恶性纤维组织细胞瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为将ATF1基因作为易位伙伴的嵌合基因。

(11)如(10)所述的抑制剂，其中，恶性新生物为非小细胞肺癌，且成为其靶的所述显性突变基因为突变型EGFR基因。

(12)如(11)所述的抑制剂，其中，RNAi分子的有义链区域由序列号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、53、55、59、61、63、65、67、129、131、133、135、137、139、141、143或145所示的核苷酸构成。

(13)如(10)所述的抑制剂，其中，恶性新生物为慢性骨髓性白血病或急性淋巴性白血病，且成为其靶的所述显性突变基因为BCR-ABL嵌合基因。

(14)如(13)所述的抑制剂，其中，RNAi分子的有义链区域由序列号97、99、101、103、105、107、109、111或113所示的核苷酸构成。

(15)如(8)所述的抑制剂，其中，疾病为人常染色体显性突变疾病。

(16)如(15)所述的抑制剂，其中，人常染色体显性突变疾病为先天性夜盲症，且成为其靶的所述显性突变基因为RHO基因；人常染色体显性突变疾病为耳聋基因区域DFNA2，且成为其靶的所述显性突变基因为KCNQ4基因或GJB基因；人常染色体显性突变疾病为瓦登伯革氏综合征，且成为其靶的所述显性突变基因为MITF基因；人常染色体显性突变疾病为非综合征耳聋，且成为其靶的所述显性突变基因为DIAPH1/DFNA1基因或POU4F3基因；人常染色体显性突变疾病为肥厚型心肌病，且成为其靶的所述显性突变基因为TNNT2基因；人常染色体显性突变疾病为家族性肥厚型心肌病，且成为其靶的所述显性突变基因为MYBPC3基因；人常染色体显性突变疾病为心尖肥厚型心肌病，且成为其靶的所述显性突变基因为TNNI3基因；人常染色体显性突变疾病为腓骨肌萎缩症1A型，且成为其靶的所述显性突变基因为PMP22基因；人常染色体显性突变疾病为腓骨肌萎缩症1B型，且成为其靶的所述显性突变基因为MPZ基因；人常染色体显性突变疾病为长QT综合征，且成为其靶的所述显性突变基因为KCNQ1基因或KCNH2基因或SCN5A基因或ANK2基因或KCNE1基因或KCNE2基因或KCNJ2或CAV3基因或SCN48或AKAP9基因或ANTA1基因；人常染色体显性突变疾病为短QT综合征，且成为其靶的所述显性突变基因为KCNH2基因或KCNJ2基因；人常染色体显性突变疾病为布鲁格达氏综合征，且成为其靶的所述显性突变基因为SCN5A基因或GPD1L基因或CACNA1C基因或CACNB2B或SCN1B基因；人常染色体显性突变疾病为儿荼酚胺敏感型多形性室速，且成为其靶的所述显性突变基因为RYR2基因；人常染色体显性突变疾病为心脏传导障碍，且成为其靶的所述显性突变基因为SCN5A基因或SCN1B基因；人常染色体显性突变疾病为肌萎缩侧索硬化症，且成为其靶的所述显性突变基因为TDP43基因；人常染色体显性突变疾病为奴南氏综合征，且成为其靶的所述显性突变基因为PTPN11基因；或者人常染色体显性突变疾病为低钙血症，且成为其靶的所述显性突变基因为CaR基因。

(17)如(8)所述的抑制剂，其中，疾病为强直性肌营养不良，且成为其靶的所述显性突变基因为DMPK基因；疾病为脊髓性肌萎缩症，且成为其靶的所述显性突变基因为SMN1基因；疾病为先天性肌无力综合征，且成为其靶的所述显性突变基因为CHRNE基因；疾病为额颞痴呆症，且成为其靶的所述显性突变基因为MAPT基因；或者疾病为单纯性生长激素缺乏症II型，且成为其靶的所述显性突变基因为GH1基因，

(18)一种药物组合物，至少含有一种(1)～(17)中任一项所述的抑制剂作为有效成分。

(19)如从属于(11)或(12)的(18)所述的药物组合物，进一步含有有义链区域由序列号83或85所示的核苷酸构成的RNAi分子、和/或将编码该RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体，以及/或者有义链区域由序列号89所示的核苷酸构成的RNAi分子、和/或将编码该RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体作为有效成分。

(20)一种点突变型EGFR基因表达抑制剂，含有有义链区域由序列号89所示的核苷酸构成的RNAi分子、和/或将编码该RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体。

(21)一种选择性地抑制在转录产物上具有不连续接合点的显性突变基因的表达的RNAi分子的设计方法，其中，包括：

(a)将与该转录产物上的不连续接合点邻接的5’端和3’端的碱基分别作为第1和第2基准碱基进行设定的工序；

(b)在所述转录产物中，从对应所述第2基准碱基的碱基朝向下游侧第4～15位中的碱基设定为对应RNAi有义链的3’末端的碱基的工序；

(c)在所述显性突变基因中，将含有包括该转录产物的第1和第2基准碱基的连续的16～30个碱基的碱基序列作为RNAi有义链区域进行设定的工序；

(d)将含有与设定的有义链区域的碱基序列互补的碱基序列的碱基序列作为RNAi反义链区域进行设定的工序。

(22)一种如(21)所述的设计方法，其中，进一步含有(e)将ASP得分值为0.4以上的RNAi分子进行筛选的工序，

所述ASP得分由以下公式算出，

(式中，对照RNAi分子为不影响所述正常型基因和突变基因的表达的RNAi分子)。

(23)如(21)或(22)所述的抑制剂，其中，在RNAi有义链区域和RNAi反义链区域上进一步附加TT或UU。

本说明书含有作为本申请的优先权的基础的日本专利申请2010-222847号、2011-044347号的说明书及/或附图中所记载的内容。

发明效果

根据本发明的显性突变基因表达抑制剂，不会对野生型基因或除靶之外的显性突变基因的表达造成大的影响，可选择性且有效地抑制靶显性突变基因的表达。

根据作为本发明的显性突变基因表达抑制剂的有效成分的RNAi分子的设计方法，可以针对成为疾病的原因的所有转录产物上具有不连续接合点的显性突变基因进行设计，且可提供一种应用性高的设计方法。

根据本发明的药物组合物，可以通过在遗传性疾病中维持野生型基因的表达，同时选择性地抑制成为疾病原因的靶显性突变基因的表达，而治愈该疾病。

附图说明

图1为说明缺失突变的种类的概念图，实线空白方块(0102、0103)表示基因(0101)的外显子内编码区域(0102)或外显子的全部或一部分(0103)，实线斜线方块(0104、0105)表示基因的非编码区域(5’非编码区域：0104；3’非编码区域：0105)，插到方块上的实线(0106、0107)表示内含子的全部(0106)或一部分(0107)，虚线所表示的区域为在缺失区域(0108、0109、0110、0111)中，虚线空白方块表示基因的外显子内编码区域的缺失区域(0108)或缺失外显子(0112)，方块间的虚线(0113、0114)表示缺失内含子的全部(0113)或一部分(0114)，箭头(0115)表示转录起始点；

图2为说明缺失突变中的不连续接合点的概念图(1)，分别A表示野生型基因，A’表示其野生型基因的转录产物，B表示突变基因，B’表示其突变基因的转录产物，另外，C中用虚线表示的为突变基因B与野生型基因A对比时的缺失区域(b区域)，在该图中，B’上的a区域和c区域的接合点(J)形成不连续接合点；

图3为说明缺失突变中的不连续接合点的概念图(2)，分别A表示野生型基因，A’表示其野生型基因的转录产物，B表示突变基因，B’表示其突变基因的转录产物，实线空白方块(0301、0302)表示外显子，方块间的实线(0303、0304)表示内含子的全部(0303)或一部分(0304)，星符号(0305)表示5’剪接位点，虚线所表示的区域(0306)为在突变基因中的缺失区域，在该图中，突变基因的转录产物B’上，来自第一外显子(0301)的一部分(0307)的区域与来自内含子的一部分(0304)的区域的接合点(J1)，以及来自内含子的一部分(0304)的区域和来自第二外显子(0302)的区域的接合点(J2)的两个位置形成不连续接合点；

图4为说明缺失突变中的不连续接合点的概念图(3)，分别A表示野生型基因，A’表示其野生型基因的转录产物，B表示突变基因，B’表示其突变基因的转录产物，另外，C中用虚线表示的为突变基因B与野生型基因A对比时的缺失区域(0406)，在该图中，突变基因的转录产物B’中，第一外显子(0401)和第三外显子(0403)的接合点(J)形成不连续接合点；

图5为说明插入突变中的不连续接合点的概念图，分别A表示野生型基因，A’表示其野生型基因的转录产物，B表示突变基因，B’表示其突变基因的转录产物，图中的a区域和b区域中，分别空白方块表示外显子内的编码区域，斜线方块表示外显子内的非编码区域，c区域(网状方块)表示突变基因中的插入部分，在该图中，突变基因的转录产物B’上，来自野生型外显子a区域的区域和来自c区域的插入部分的区域的两处接合点(J1、J2)形成不连续接合点；

图6表示RNAi分子结构的概念图，分别(A)表示双链RNAi分子(siRNA)的情况及(2)表示单链RNAi分子(shRNA)的情况；

图7表示实施方式1中RNAi分子的设计方法的流程；

图8-1的A表示野生型EGFR基因和缺失突变型EGFR基因del(E764-A750)中的缺失位点周围的碱基序列及氨基酸序列的对比的图，在野生型EGFR基因的碱基序列中，黑框圈出的区域为该突变型EGFR基因的缺失区域，用箭头表示相当于该突变基因的转录产物上的不连续接合点的位置，B为将EGFR-siRNA针对野生型的非靶EGFR基因和缺失突变型EGFR基因del(E764-A750)的表达抑制效果作为在各自的siControl的萤光素酶活性为1.0时的相对值算出，萤光素酶活性通过未受到RNAi引起的表达抑制的作为外来对照的β-半乳糖苷酶的表达量进行校正；

图8-2的C表示EGFR-siRNA针对野生型的非靶EGFR基因和缺失突变型EGFR基因del(E764-A750)的ASP得分值，用虚线表示ASP得分值0.4的边界线；

图9-1的A表示野生型EGFR基因和缺失突变型EGFR基因del(L747-T751)-L747S中的缺失位点周围的碱基序列及氨基酸序列的对比的图，在野生型EGFR基因的碱基序列中，黑框圈出的区域为该突变型EGFR基因的缺失区域，用箭头表示相当于该突变基因的转录产物上的不连续接合点的位置，B为将EGFR-siRNA针对野生型的非靶EGFR基因和缺失突变型EGFR基因del(L747-T751)-L747S的表达抑制效果作为在各自的siControl的萤光素酶活性为1.0时的相对值算出，各样品的萤光素酶活性通过未受到RNAi引起的表达抑制的作为外来对照的β-半乳糖苷酶的表达量进行校正；

图9-2的C表示EGFR-siRNA针对野生型的非靶EGFR基因和缺失突变型EGFR基因del(L747-T751)-L747S的ASP得分值，用虚线表示ASP得分值0.4的边界线；

图10-1的A表示野生型EGFR基因和缺失/插入突变型EGFR基因del(L747-E749)-A750P(G)中的缺失位点周围的碱基序列及氨基酸序列的对比的图，在野生型EGFR基因的碱基序列中，黑框圈出的区域为该突变型EGFR基因的缺失区域，另外，在突变型EGFR基因中黑体字所表示的碱基为插入碱基，用箭头表示相当于该突变基因的转录产物上的不连续接合点的位置，在该缺失/插入突变型中存在两处不连续接合点，B为将EGFR-siRNA针对野生型的非靶EGFR基因和缺失/插入突变型EGFR基因del(L747-E749)-A750P(G)的表达抑制效果作为在各自的siControl的萤光素酶活性为1.0时的相对值算出，各样品的萤光素酶活性通过未受到RNAi引起的表达抑制的作为外来对照的β-半乳糖苷酶的表达量进行校正；

图10-2的C表示EGFR-siRNA针对野生型的非靶EGFR基因和缺失/插入突变型EGFR基因del(L747-E749)-A750P(G)的ASP得分值，用虚线表示ASP得分值0.4的边界线；

图11-1的A表示野生型EGFR基因和缺失/插入突变型EGFR基因del(L747-E749)-A750P(A)中的缺失位点周围的碱基序列及氨基酸序列的对比的图，在野生型EGFR基因的碱基序列中，黑框圈出的区域为该突变型EGFR基因的缺失区域，另外，在突变型EGFR基因中黑体字所表示的碱基为插入碱基，用箭头表示相当于该突变基因的转录产物上的不连续接合点的位置，在该缺失/插入突变型中存在两处不连续接合点，B为将EGFR-siRNA针对野生型的非靶EGFR基因和缺失/插入突变型EGFR基因del(L747-E749)-A750P(A)的表达抑制效果作为在各自的siControl的萤光素酶活性为1.0时的相对值算出，各样品的萤光素酶活性通过未受到RNAi引起的表达抑制的作为外来对照的β-半乳糖苷酶的表达量进行校正；

图11-2的C表示EGFR-siRNA针对野生型的非靶EGFR基因和缺失/插入突变型EGFR基因del(L747-E749)-A750P(A)的ASP得分值，用虚线表示ASP得分值0.4的边界线；

图12-1的A表示由费城染色体(位于9号染色体长臂(9q34)上的ABL基因与位于22号染色体长臂(22q11)上的BCR基因互相易位)表现的BCR-ABL嵌合基因和野生型ABL基因中易位位点周围序列的碱基序列及氨基酸序列的对比的图，在野生型ABL基因的碱基序列中，黑框圈出的区域为易位的区域，在BCR-ABL嵌合基因的碱基序列中，黑框圈出的区域为通过易位与BCR基因连接的ABL基因的区域，用箭头表示相当于该嵌合基因的转录产物上的不连续接合点的位置，B为将BCR-ABL-siRNA针对野生型的非靶ABL基因和BCR-ABL嵌合基因的表达抑制效果作为在各自的siControl的萤光素酶活性为1.0时的相对值算出，萤光素酶活性通过未受到RNAi引起的表达抑制的作为外来对照的β-半乳糖苷酶的表达量进行校正；

图12-2的C表示BCR-ABL-siRNA针对野生型的非靶ABL基因和BCR-ABL嵌合基因的ASP得分值，用虚线表示ASP得分值0.4的边界线；

图13-1的A表示由费城染色体(位于9号染色体长臂(9q34)上的ABL基因与位于22号染色体长臂(22q11)上的BCR基因互相易位)产生的BCR-ABL嵌合基因和野生型BCR基因中易位位点周围序列的碱基序列及氨基酸序列的对比的图，在野生型BCR基因的碱基序列中，黑框圈出的区域为易位的区域，在BCR-ABL嵌合基因的碱基序列中，黑框圈出的区域为通过易位与ABL基因连接的BCR基因的区域，用箭头表示相当于该嵌合基因的转录产物上的不连续接合点的位置，B为将BCR-ABL-siRNA针对野生型的非靶BCR基因和BCR-ABL嵌合基因的表达抑制效果作为在各自的siControl的萤光素酶活性为1.0时的相对值算出，萤光素酶活性通过未受到RNAi引起的表达抑制的作为外来对照的β-半乳糖苷酶的表达量进行校正；

图13-2的C表示BCR-ABL-siRNA针对野生型的非靶BCR基因和BCR-ABL嵌合基因的ASP得分值，用虚线表示ASP得分值0.4的边界线；

图14表示在导入时，EGFR-siRNA(si747/49-3D19)针对源自人非小细胞肺癌的细胞系(PC3细胞)的EGFR del(L747-E749)-A750P突变的突变基因特异的RNAi效果的电泳图；

图15表示在导入时，EGFR-siRNA(si747/49(A)-8D19)针对PC3细胞的突变基因特异的RNAi效果的电泳图；

图16为利用PC3细胞的细胞总数表示将EGFR-siRNA(si747/49-3D19)导入到PC3细胞时的其细胞增殖抑制作用的图；

图17表示将EGFR-siRNA(si747/49-3D19)导入到PC3细胞时的siRNA的细胞毒性作用的图；

图18表示将EGFR-siRNA(si747/49-3D19)导入到PC3细胞时的PC3细胞的细胞增殖及生存活性的图(1)；

图19为利用PC3细胞的细胞总数表示将EGFR-siRNA(si747/49(A)-8D19)导入到PC3细胞时的其细胞增殖抑制作用的图；

图20表示将EGFR-siRNA(si747/49-3D19)导入到PC3细胞时的PC3细胞的细胞增殖及生存活性的图(2)；

图21表示将EGFR-siRNA(si747/49-3D19)导入到PC3细胞时的PC3细胞的细胞死亡(细胞凋亡)的图；

图22的A表示野生型EGFR基因和针对点突变型(置换突变型)EGFR基因T790M突变设计的siRNA的有义链区域中的置换位点周围的碱基序列和氨基酸序列的对比的图，在突变型EGFR基因的碱基序列中，黑体字所示的碱基为该突变型EGFR基因的置换位点，B为将EGFR-siRNA针对野生型的非靶EGFR基因和置换突变型EGFR基因T790M的表达抑制效果作为在各自的siControl的萤光素酶活性为1.0时的相对值算出，萤光素酶活性通过未受到RNAi引起的表达抑制的作为外来对照的β-半乳糖苷酶的表达量进行校正；

图23表示将具有突变型EGFR del(L747-E749)-A750P的源自人非小细胞肺癌细胞系的PC3细胞、具有突变型EGFR del(E746-A750)的源自人非小细胞肺癌细胞系的PC9细胞、以及具有野生型EGFR的源自人子宫颈癌细胞系的HeLa细胞在各种浓度的抗癌试剂吉非替尼中暴露时的各细胞的细胞增殖及生存活性的图，A表示PC3细胞，B表示PC9细胞，C表示HeLa细胞，各图的值分别利用在未处理的细胞的细胞生存活性为100％时的相对值进行表示；

图24表示向PC3细胞、PC9细胞、以及HeLa细胞给药各种浓度的EGFR-siRNA时的各细胞的细胞增殖和生存活性的图，A表示利用siRNA对PC3细胞进行处理时的结果，B表示利用siRNA对PC9细胞进行处理时的结果，C表示利用siRNA对HeLa细胞进行处理时的结果，各图的值分别利用在未处理的细胞的细胞生存活性为100％时的相对值进行表示；

图25的A表示向皮下移植的源自PC3细胞的肿瘤(箭头)给药siRNA等后第三周(9周龄)的裸鼠，a表示未给药siRNA的个体，b表示给药siControl的个体，c表示给药EGFR-siRNA(si747/49-3D19)的个体，B表示在给药siRNA等后第三周(9周龄)时，从未给药siRNA的个体组(a1～a3)、给药siControl的个体组(b1～b3)以及给药EGFR-siRNA(si747/49-3D19)的个体组(c1～c3)中取出的源自PC3细胞的肿瘤；

图26表示向裸鼠给药针对皮下移植的PC3细胞的EGFR-siRNA(si747/49-3D19)时的肿瘤体积的时间变化图，★符号表示与未给药siRNA个体的肿瘤体积相比有显著性差异(p＜0.05)，另外，#符号表示与给药siControl的个体的肿瘤体积相比有显著性差异(p＜0.05)；

图27表示向裸鼠给药针对皮下移植的PC3细胞的EGFR-siRNA(si747/49-3D19)时的肿瘤湿重的图，★符号表示与未给药siRNA个体的肿瘤体积相比有显著性差异(p＜0.05)，另外，#符号表示与给药siControl的个体的肿瘤体积相比有显著性差异(p＜0.05)；

图28的A表示向皮下移植的源自PC3细胞的肿瘤(箭头)给药siRNA等后第三周(9周龄)的裸鼠，B表示在给药siRNA等后第三周(9周龄)时，从各个体组(1组5只)中取出的源自PC3细胞的肿瘤；

图29表示向裸鼠给药针对皮下移植的PC3细胞的EGFR-siRNA(si747/49(A)-8D19)时的肿瘤体积的时间变化图，★符号表示与未给药siRNA个体的肿瘤体积相比有显著性差异(p＜0.05)，另外，#符号表示与给药siControl的个体的肿瘤体积相比有显著性差异(p＜0.05)；

图30表示向裸鼠给药针对皮下移植的PC3细胞的EGFR-siRNA(si747/49-8D19)时的肿瘤湿重的图，★符号表示与未给药siRNA个体的肿瘤体积相比有显著性差异(p＜0.05)，另外，#符号表示与给药siControl的个体的肿瘤体积相比有显著性差异(p＜0.05)；

图31表示EGFR-siRNA的针对小鼠个体的副作用影响，A表示血浆中胆红素总量，B表示血浆中直接胆红素量，C表示血浆中间接胆红素量，以及D表示血浆中碱性磷酸酶的量，siEgfr为具有现有siRNA结构的EGFR-siRNA。

具体实施方式

1.显性突变基因表达抑制剂

1-1.概要

本发明的第1实施方式为显性突变基因表达抑制剂。本发明的抑制剂的特征在于，含有RNAi分子和/或编码其的表达载体作为有效成分，并选择性地抑制显性突变基因的表达。

1-2.RNAi分子的构成和定义

在本说明书中，“RNAi分子”是指在生物体内诱导RNA干扰(RNAinterference)，可以经由作为目标显性突变基因的转录产物的分解在转录后翻译前抑制(沉默)其基因的表达的分子。若为可经由RNAi机制抑制基因的表达的分子，则可以为单链分子或双链分子中的任一种。例如可以举出如siRNA(small interfering RNA)之类的双链分子、如shRNA(short hairpinRNA)或miRNA(micro RNA)之类的单链分子。关于RNA干扰，例如希望参照Bass B.L.，2000，Cell，101，235-238；Sharp P.A.，2001，Genes Dev.，15，485-490；Zamore P.D.，2002，Science，296，1265-1269；Dernburg，A.F.&Karpen，G.H.，2002，Cell，111，159-162。予以说明，在本说明书中，以下，将经由RNAi机制的转录后的基因沉默作为“基因的表达抑制”表示。

在本说明书中，RNAi分子由核酸构成。在此所谓的“核酸”是指天然型核酸、非天然型核酸及/或核酸类似物。

在本说明书中，“天然型核酸”是指以核苷酸作为构成单元，它们通过磷酸二酯键连接而成的存在于自然界的生物体高分子。通常，具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶中任一碱基的核糖核苷酸连接而成的RNA及/或具有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶中的任一碱基的脱氧核糖核苷酸连接而成的DNA符合。在本发明的RNAi分子中，特别优选RNA为主要的构成成分。

在本说明书中，“非天然型核酸”是指含有非天然型核苷酸的或由其构成的核酸。在此，“非天然型核苷酸”是指人工构建或人工化学修饰的在自然界不存在的核苷酸，即包含具有与上述天然存在的核苷酸类似的性质及/或结构的核苷酸或具有与天然存在的核苷或碱基类似的性质及/或结构的核苷或碱基的核苷酸。例如可以举出：脱碱基核苷酸、阿拉伯核苷酸、2’-脱氧尿核苷、α-脱氧核糖核苷酸、β-L-脱氧核糖核苷酸、具有其它的糖修饰的核苷酸。进而，含有取代戊糖(2’-O-甲基核糖、2’-脱氧-2’-氟核糖、3’-O-甲基核糖、1’，2’-脱氧核糖)、阿拉伯糖、取代阿拉伯糖；取代己糖及具有α-端基异构体的糖修饰的核苷酸。另外，非天然型核苷酸也含有包含人工构建的碱基类似物或人工化学修饰的碱基(修饰碱基)的核苷酸。在对“碱基类似物”而言，例如可以举出：2-氧代(1H)-吡啶-3-基、5位取代-2-氧代(1H)-吡啶-3-基、2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基、2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤-9-基、2-氨基-6-(2-噁唑基)嘌呤-9-基等。对“修饰碱基”而言，例如可以举出：修饰的嘧啶(例如，5-羟基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶)、修饰的嘌呤(例如，6-甲基腺嘌呤、6-硫代鸟嘌呤)及其它的杂环碱基等。也可以含有甲基磷酸酯型DNA/RNA、硫代磷酸酯型DNA/RNA、磷酰胺酯型DNA/RNA、2’-O-甲基型DNA/RNA等化学修饰核酸及核酸类似物。

在本说明书中，“核酸类似物”是指具有与天然型核酸类似的结构及/或性质的人工构建的化合物。例如可以举出：肽核酸(PNA：Peptide NucleicAcid)、具有磷酸酯基的肽核酸(PHONA)、交联化核酸(BNA/LNA：BridgedNucleic Acid，桥接核酸/Locked Nucleic Acid，锁核酸)、吗啉代核酸等。

另外，构成本发明的RNAi分子的核酸可以根据需要用核酸用标记物质标记磷酸基、糖及/或碱基。核酸用标记物质可以利用该领域中公知的所有物质。例如可以举出：放射性同位元素(例如，³²p、³H、¹⁴C)、DIG、生物素、荧光色素(例如，FITC、Texas、cy3、cy5、cy7、FAM、HEX、VIC、JOE、Rox、TET、Bodipy493、NBD、TAMRA)或发光物质(例如。吖啶酯(アクリジニウム工スタ一))。

在本说明书中，“突变”是指在基因上或染色体上产生的碱基序列的物理的或结构的突变。虽然有在基因上产生的基因突变和在染色体上产生的染色体突变，但在本说明书中，若为在靶显性突变基因的转录产物上产生后述的不连续接合点的突变，则可以为任一种。另外，突变不仅为在自然界中产生的突变，也包含使用甲磺酸乙酯(EMS)或1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍的突变诱变剂等所人为诱发的突变和使用分子遗传学的方法所导入的突变。

突变的种类，可举例基于基因中的碱基缺失、插入或置换、基因重复或易位、或者染色体倒位的突变。

“缺失”是指野生型基因的碱基序列的一部分缺失的突变。在此，“野生型基因”是指在同种基因的等位基因集合(集団)内，在自然界存在较多，且其编码的蛋白质或功能性核酸具有该原本功能的基因。所谓“功能性核酸”也称为非编码RNA，即不编码蛋白质且其自身具有各种功能的RNA。例如，符合的有转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、以及微小RNA(miRNA)。在本发明中，一个基因中的缺失位点只要为在其缺失基因的转录产物上引起不连续接合点的位点，则不特别限定其缺失碱基的数量或位置。一般有1～50个碱基、1～40个碱基、1～30个碱基、或1～20个碱基左右的缺失，但只要为利用缺失产生的转录产物结果在具有其突变基因的个体上引起显性突变的范围，例如野生型基因的碱基序列的70％以上、80％以上、或90％以上的缺失也是可以的。作为一个基因中的缺失位点的例子，可以举出，如图1A所示，在一个外显子(0101)的编码区域(0102)中，不含转录起始点(0115)的虚线所表示的一部分区域(0108)缺失的情况，如图1B所示，在含有一个以上内含子的基因中，不含转录起始点(0115)的含有一个以上的外显子的完整区域(全領域)(0112)的区域(0109)缺失的情况(可以含有一个以上内含子的完整区域和/或一部分区域；在图1B中，缺失位点除一个外显子的完整区域(0112)之外，还含有位于其两侧的两个内含子的一部分(0114))，如图1C所示，在含有一个以上的内含子的基因中，含有至少一个内含子的完整区域(0113)的两个外显子的一部分(即，上游外显子的3’端的一部分和下游外显子的5’端的一部分)之间的区域(0110)缺失的情况，如图1D所示，含有上游外显子的3’端的一部分和位于其外显子下游的内含子的5’端的一部分的区域缺失的情况(可包含位于其间的一个以上的其他外显子和内含子的完整区域，在图1D中，包含一个外显子的完整区域(0112)、以及位于其两端的一端的内含子的完整区域(0113)和另一端的内含子的一部分区域(0114))。另一方面，不含剪接位点的内含子的一部分区域的缺失或一个以上的完整区域的缺失由于在转录产物上不产生不连续接合点，因此不符合本发明的缺失。

“插入”是指在野生型基因的碱基序列中插入有一个以上的碱基的突变。在本发明中，基因内的碱基插入的位置只要在外显子内就没有特别限定。另一方面，插入到内含子内的情况下，通常，在基因表达后，其内含子通过剪接除去，在转录产物上不产生不连续接合点。因此，原则上内含子内的碱基插入并不包含于本发明的插入。但是，即使是内含子内的插入，通过插入而使后述的剪接位点被破坏时，由插入使得碱基的数量增加、其内含子不能通过剪接正常被除去时，或在插入的碱基中含有相当于外显子的序列的结果、在剪接后的转录产物上插入新的外显子时，如上情况在转录产物上产生不连续接合点时，包含于本发明的插入。插入的碱基的数量没有特别的限定。例如，可以如上述插入一个碱基，也可如转座子插入数百个碱基以上。

“置换”是指野生型基因的碱基与其他碱基置换的突变。通常，在置换突变中，对比野生型基因和突变基因的情况下，在两者的基因以及其转录产物的碱基序列中不产生缺口。因此，通常除了破坏剪接位点的置换之外，在其基因的转录产物上不产生不连续接合点。另一方面，如果是破坏剪接位点的置换，在转录产物上，妨碍利用处于其剪接位点支配下的内含子的剪接的除去的结果，在转录产物上产生不连续接合点，即如后述，在野生型基因和突变基因的转录产物的碱基序列之间产生缺口。因此，本发明中的置换仅以破坏剪接位点的置换为对象。在此，剪接位点是指在基因序列中进行正常的剪接所必要的位点。例如，前mRNA剪接的情况，位于内含子的5’末端周围的5’剪接位点(供体位点)、位于内含子的3’末端周围的3’剪接位点(受体位点)，以及位于内含子内的分支点等的内含子内所定位置的一般位点符合。此外，也包含剪接所必要的内含子内的其他碱基或位于外显子内的碱基。另外，tRNA剪接或自剪接的情况下，对剪接需要的RNA序列内的高次结构的形成所必要的碱基符合。置换的碱基数量只要能够破坏剪接位点，就没有特别限定。例如，如剪接位点上的G(鸟嘌呤)，如果是前mRNA剪接所必要的碱基，也可以为一个碱基置换的点突变。

“重复”是指染色体中存在多个相同的基因的突变。通常，基因重复伴随含有其基因的染色体的一部分区域的重复发生。在本发明中，仅是基因的一部分重复，基于此，使在其转录产物上产生不连续接合点的基因产生的重复成为对象。

“易位”是指基因或染色体的一部分在相同或不同染色体上改变其位置的突变。在本发明中，利用易位基因一部分移动至不同位置的结果，在包含其易位基因一部分的转录产物上产生不连续接合点成为对象。例如，易位结果产生的嵌合基因，即为不同的两个以上的基因部分地融合的基因的情况下，其转录产物与成为其融合的基础的各基因的任意的转录产物对比具有不连续接合点的。

“倒位”是指染色体的一部分的方向形成逆向的突变。在本发明中，利用倒位基因的一部分的方向形成逆向的结果，在含有其形成逆向基因的一部分的转录产物上产生不连续接合点的成为对象。

“突变基因”是指含有与野生型基因的碱基序列不同的碱基的基因。在本发明中，突变基因除了包括在染色体上先天性存在的突变基因以外，也包括后天性获得的突变基因。突变基因不需要存在于构成个体的全部的细胞中，也可以仅存在于一部分细胞、组织或器官中。例如可以举出在一个体中，未存在于正常细胞中，仅存在于癌细胞中的突变基因。

在本说明书中，“显性突变基因”是指在个体中基于其突变的性状作为表型而显现的突变基因。如果为在其个体上作为结果以显性带来异常表型的突变基因，则不论该突变基因是否具有编码的蛋白质或功能性RNA的活性。例如，可以为功能获得型突变(gain of function mutation)或功能丧失型突变(loss of function mutation)中的任一种。功能获得型突变含有引起蛋白质表达量的上升(过表达：overexpression)或活性上升(组成型活化：constitutive active或功能亢进型：hyper active)的性状的超效等位基因突变(hypermorph mutation)、引起显示新型功能活性的性状的新效等位基因突变(neomorph mutation)及与源自野生型基因的蛋白质拮抗或对其抑制、抑制野生型突变基因的性状表达的反效等位基因突变(antimorph mutation：dominant negative)。另外，对功能丧失型突变而言，可以举出基因完全丧失了性状表达能力的无效等位基因突变(amorph mutation)及引起基因的性状表达能力的降低的亚效等位基因突变(hypomorph mutation)。在功能丧失型突变的情况，通常形成隐性的突变较多，但在本说明书中，仅限于其效果为显性的突变为对象。优选为功能获得型的显性突变。

在本说明书中，“不连续接合点”是指在将突变基因中的转录产物的碱基序列与野生型基因的转录产物的碱基序列对比时，通过至少一个碱基以上的缺口(该缺口可以位于转录产物的碱基序列端部)的存在，使突变基因的转录产物和野生型基因的转录产物之间对应的碱基的连续性中断的在突变基因的转录产物上的碱基的接合部。不连续接合点可以在一个突变基因的转录产物中有一个位置以上。

该不连续性为基于突变基因的突变的不连续性。例如，如图2所示，突变为一个外显子内的碱基缺失的情况，野生型基因A中用b表示的区域所缺失的突变基因B的转录产物B’中，与野生型基因的转录产物A’的碱基序列进行对比时，用a和c表示的区域的碱基序列对应，但在野生型基因的转录产物中a区域的3’末端的碱基与c区域的5’末端的碱基之间，其连续性中断。此时，突变基因的转录产物B’中a区域的3’末端的碱基与c区域的5’末端的碱基的接合部(J)成为不连续接合点。

另外，如图3所示，突变基因B中的缺失(参照用虚线表示缺失位点的C)为由第1外显子(0301)的3’末端的一部分碱基和第1内含子(0303)的5’末端的一部分碱基构成的区域(0306)的情况下，通过突变基因B的5’剪接位点(0305)的缺失，妨碍了由前mRNA剪接的第1内含子的除去，结果生成含有第1内含子(0303)的3’末端的一部分碱基的转录产物B’。在将该转录产物B’与野生型基因A的转录产物A’的碱基序列对比时，5’端的第1外显子(0301)的3’缺失末端的碱基，和3’端的第2外显子(0302)的5’末端的碱基，其连续性中断。因此，该情况下，第1外显子(0301)的3’缺失末端的碱基和5’末端的一部分截断的第1内含子(0304)的5’缺失末端的碱基的接合部(J1)，以及第1内含子(0304)的3’末端的碱基和第2外显子(0302)的5’末端的碱基的接合部(J2)的两个位置成为不连续接合点。

进而，如图4所示，突变基因B中的缺失(参照用虚线表示缺失位点的C)为由第1内含子(0404)的3’末端的一部分碱基和第2外显子(0402)的5’末端的一部分碱基构成的区域(0406)的缺失的情况下，通过突变基因B的第1内含子的3’剪接位点(0407)的缺失，第2外显子(0402)的3’末端的一部分区域(0408)由剪接除去，该转录产物B’可能为第1外显子(0401)和第3外显子(0403)成为连接状态的情况。在该转录产物B’和野生型基因A的转录产物A’的碱基序列进行对比时，第1外显子(0401)的3’末端的碱基和第3外显子(0403)的5’末端的碱基之间，其连续性中断。因此，该情况下，其第1外显子(0401)的3’末端的碱基和第3外显子(0403)的5’末端的碱基的接合部(J)成为不连续接合点。

另外，例如，如图5所示，突变基因B中的突变为向一个外显子内的碱基的插入的情况下，对比含有插入的c区域的突变基因B的转录产物B’和野生型基因A的转录产物A’的碱基序列，转录产物B’中的a区域的3’末端和c区域的5’末端，以及c区域的3’末端和b区域的5’末端，其连续性中断。该情况下，突变基因的转录产物B’中的a区域的3’末端的碱基和c区域的5’末端的碱基的接合部(J1)，以及c区域的3’末端的碱基和b区域的5’末端的碱基的接合部(J2)的两个位置成为不连续接合点。

在本实施方式中，靶基因的种类及该基因所源自的生物种没有特别限定。所有编码蛋白质或功能性核酸的基因可以成为本实施方式的抑制剂的靶。另外，生物种可以为动物、植物中的任一种，包括它们的所有种类。若是动物，则优选为脊椎动物，更优选为鱼类、鸟类或哺乳动物。在鱼类中，进一步优选为水产资源用鱼种(例如，鲑鱼科、鲈鱼科、鳕鱼科、鲱鱼科、比目鱼科、鲽鱼科、竹荚鱼科、玉筋鱼科、真鲷科及平鲉科(メバル科)的鱼种)。在鸟类中，进一步优选为食用种(例如，鸡、鹅、鸭、野鸭、杂种鸭、火鸡、鹌鹑、驼鸟等)。在哺乳动物中，进一步优选为家畜(猪、公牛、绵羊、山羊、马)、实验用动物(啮齿类、兔、狗、猴子)、比赛用的马、宠物(狗、猫、兔、猴子、啮齿类)或人。进一步优选的生物种为人。另一方面，若为植物，则优选为种子植物，更优选为被子植物，进一步优选为食用植物种(例如属于禾本科(例如，水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、高粱、小米)、豆科(例如，大豆、小豆、绿豆)、茄科(例如，番茄、茄子、马铃薯、辣椒、青椒)、旋花科(例如，红薯)、蔷薇科(例如，草莓、杏、桃、李子、梅、蔷薇、樱花)、十字花科(例如，萝卜、芜菁、油菜)、藜科(例如，菠菜、甜菜)、伞形科、蓼科、葫芦科、菊科、百合科、天南星科、葡萄科、芸香科、壳斗科、棕榈科等的食用的植物种)、纤维资源用植物种(例如，棉花、麻等)、木材资源用植物种(例如，杉、扁柏、冷杉、铁衫、松、紫杉树、樱花树、枫树、橡树、栎、山毛榉、榆树、榉、核桃树、ホウ、桂树、柚木树、柳安木、黑檀树、桃花心木、白杨、桉树等)。

上述突变所参与的性状也没有特别限定，优选为欲抑制其表达的性状。例如可以举出参与疾病的发病的突变、参与异常形态的突变等。在此所谓的疾病包含例如后天性地在特定的细胞内的基因组DNA中产生的突变引起的疾病或常染色体显性突变疾病。

对后天性地在特定的细胞内的基因组DNA中产生的突变引起的疾病而言，可以举出：新生物(肿瘤)、特别是恶性新生物(恶性肿瘤，所谓的癌，包含白血病)。作为对后天性地在特定的细胞内的基因组DNA中产生的碱基序列的插入或缺失引起的恶性新生物的具体实例，可以举出：以表皮生长因子受体(EGFR)基因的突变作为原因的非小细胞肺癌(NSCLC)，以CTNNB1基因的突变作为原因的大肠癌，以CDH1基因的突变作为原因的胃癌，以BRCA1基因或BRCA2基因的突变作为原因的乳腺癌，以AIRE基因的突变作为原因的自身免疫性多内分泌腺病综合征I型，以TNFRSF6/APT1/FAS基因的突变作为原因的自身免疫性淋巴细胞增生综合征。另外，作为对后天性地在特定的细胞内的基因组DNA中产生的伴有易位的基因的突变引起的产生恶性新生物的更具体的例子，可以举出：以BCR基因和ABL基因的嵌合基因作为原因的慢性骨髓性白血病(CML)或急性淋巴性白血病(ALL)，以c-myc基因和IgH基因的嵌合基因作为原因的伯基特淋巴瘤，以NPM基因和ALK基因的嵌合基因作为原因的间变性大细胞淋巴瘤，以EML4基因和ALK基因的嵌合基因作为原因的肺癌，以PDGFB基因和COL1A1基因的嵌合基因作为原因的隆突性皮肤纤维肉瘤，以ETV6基因和NTRK3基因的嵌合基因作为原因的先天性纤维肉瘤，以FUS基因和CREB3L2基因的嵌合基因作为原因的低度恶性纤维粘液性肉瘤，以EWS基因和CHN基因的嵌合基因作为原因的骨外黏液样软骨肉瘤，以将EWS1基因作为易位伙伴的嵌合基因作为原因的尤因肉瘤，以将SYT基因或SSX基因作为易位伙伴的嵌合基因作为原因的腺泡状横纹肌肉瘤，以将ALK基因作为易位伙伴的嵌合基因作为原因的炎性肌纤维母细胞肿瘤，以将CHOP基因作为易位伙伴的嵌合基因作为原因的脂肪肉瘤，以将ATF1基因作为易位伙伴的嵌合基因作为原因的透明细胞肉瘤或恶性纤维组织细胞瘤。

另外，伴随剪接异常的疾病，可以举出：以DMPK基因的突变作为原因的强直性肌营养不良，以SMN1基因的突变作为原因的脊髓性肌萎缩症，以CHRNE基因的突变作为原因的先天性肌无力综合征，以MAPT基因的突变作为原因的额颞痴呆症，以GH1基因的突变作为原因的单纯性生长激素缺乏症II型。

另外，人常染色体显性突变疾病，可以举出：以RHO基因作为原因的先天性夜盲症，以KCNQ4基因或GJB基因的突变作为原因的耳聋基因区域DFNA2，以MITF基因的突变作为原因的瓦登伯革氏综合征，以DIAPH1/DFNA1基因或POU4F3基因的突变作为原因的非综合征耳聋，以TNNT2基因的突变作为原因的肥厚型心肌病，以MYBPC3基因的突变作为原因的家族性肥厚型心肌病，以TNNI3基因的突变作为原因的心尖肥厚型心肌病，以MPZ基因的突变作为原因的腓骨肌萎缩症1B型，以PMP22基因的突变作为原因的腓骨肌萎缩症1A型，以KCNQ1基因或KCNH2基因或SCN5A基因或ANK2基因或KCNE1基因或KCNE2基因或KCNJ2或CAV3基因或SCN48或AKAP9基因或ANTA1基因的突变作为原因的长QT综合征，以KCNH2基因或KCNJ2基因的突变作为原因的短QT综合征，以SCN5A基因或GPD1L基因或CACNA1C基因或CACNB2B或SCN1B基因的突变作为原因的布鲁格达氏综合征，以RYR2基因的突变作为原因的儿荼酚胺敏感型多形性室速，以SCN5A基因或SCN1B基因的突变作为原因的心脏传导障碍，以TDP43基因的突变作为原因的肌萎缩侧索硬化症，以PTPN11基因的突变作为原因的奴南氏综合征，以CaR基因的突变作为原因的低钙血症。

1-3.RNAi分子的结构

本实施方式的抑制剂中所含的RNAi分子，包含在作为靶的显性突变基因的转录产物上产生至少一个不连续接合点的RNAi有义链区域，以及含有与所述RNAi有义链区域互补的碱基序列的RNAi反义链区域。

作为一个例子，本实施方式的抑制剂中所含的RNAi分子的结构中的概念图示于图6。如该图所示，RNAi分子包含双链分子(图6A)或单链分子(图6B)。此外，也可包含含有所述RNAi有义链区域以及含有与之互补的碱基序列的RNAi反义链区域的环状分子(例如，哑铃型核酸)。

(RNAi分子的共同构成要素)

在本实施方式的抑制剂中所含的RNAi分子为任一种的情况下，也含有RNAi有义链区域(0601)、RNAi反义链区域(0602)及不连续接合点(0603)作为必需的构成要素。以下，对RNAi分子的共同的构成要素进行说明。

“RNAi有义链区域”(0601)由与靶显性突变基因的转录产物的碱基序列一致的碱基序列构成，包含至少一个在其转录产物上产生的不连续接合点(0603)(在图6中，作为有义链区域(0061)中斜线区域和空白区域的接合部而表示)。另外，有义链区域(0601)的碱基长度为其转录产物的连续的16～30个碱基、18～25个碱基或19～23个碱基。进而，将与所述不连续接合点(0603)邻接的3’端的碱基(0604)作为基准(相当于后述的第2基准碱基)，从其基准碱基开始数朝向下游侧的第3～16位的碱基，优选第4～15位的碱基(0605)，更优选第4～13位的碱基构成该RNAi有义链区域的3’末端碱基。不连续接合点(0603)在一个转录产物中以多个存在的情况下，将与任一个不连续接合点邻接的3’端的碱基作为基准碱基即可。

“RNAi反义链区域”(0602)由与所述RNAi有义链区域(0601)完全互补的碱基序列构成。因此，在其碱基序列中，包含与所述基准碱基、即不连续接合点(0603)邻接的3’端的碱基互补的碱基(0607)。对RNAi反义链区域而言，在本实施方式的RNAi分子为双链分子(图6A)的情况下，含有在与含有RNAi有义链区域的多核苷酸链不同的其它多核苷酸链中，但在单链分子(图6B)的情况下，以反方向含有在与RNAi有义链区域相同的多核苷酸链中。

关于“不连续接合点”(0603)已详细说明，此处省略该说明。

本实施方式的RNAi分子的特征在于ASP得分值为0.4以上。“ASP得分”(Allele-SPecificity score)为在ASP-RNAi中将作为重要因素的等位基因识别能力进行数字化的值，进而，也可视为将RNAi分子针对正常型基因的非特异的表达抑制的影响，即，RNAi分子带给正常型基因的副作用进行数字化的值。ASP得分值由下式导出。

式中，对照RNAi分子为作为本实施方式的有效成分的siRNA分子的阴性对照的RNAi分子，为不影响所述正常型基因和突变基因的表达的RNAi分子，因此，上式中，将对照RNAi分子处理的标准化的基因表达量当作100％。例如，不存在成为靶的基因的含有任意的碱基序列的RNAi分子符合。在上式中，标准化后的表达量的相对比超过“1.0”时，视作其是无表达抑制效果的，将该相对比作为“1.0”计算。

根据ASP得分，可以反映对于突变基因的“特异性”和“抑制效果”这两方面。例如，某个RNAi分子的ASP得分值低时，该RNAi分子即使可较强地抑制突变基因的表达的情况下，但也意味着特异性低，所以也同时强烈抑制野生型基因的表达，即，这意味着对于野生型基因的副作用较强。ASP得分值为0.4以上时，该RNAi分子具有抑制突变基因的表达，

且具有针对野生型基因的没有副作用或较弱的副作用的效果，因此，可获得ASP-RNAi的功能。

关于用于ASP得分的计算的正常型基因和突变基因的表达量的测定，如果利用相同的方法测定各表达量，则可以使用在该领域公知的任意的方法，没有特别限定。另外，标准化可以基于未受到RNAi分子引起的表达抑制的内部或外来对照基因的表达量进行。优选使用通过Ohnishi Y.等(2006，Journal ofRNAi and Gene Silencing，Vol.2：154-160)所开发的报告基因表达质粒，在后述的实施例1所记载的条件下，基于萤火虫和海肾萤光素酶等报告基因的表达，以及作为对照的未受到RNAi引起的表达抑制的β-半乳糖苷酶基因的表达，测定野生型基因和突变基因的表达量。

(双链RNAi分子的构成要素)

在本实施方式的抑制剂中所含的RNAi分子为siRNA那样的双链分子的情况下，如上述图6A所示，除作为上述RNAi分子共同构成要素的RNAi有义链区域(0601)、RNAi反义链区域(0602)及不连续接合点(0603)之外，可以进一步在各自的多肽链的3’末端含有3’末端附加碱基(0606)。“3’末端附加碱基”(0606)由TT(胸腺嘧啶-胸腺嘧啶)或UU(尿嘧啶-尿嘧啶)的2个碱基构成。附加了该碱基的RNAi分子可以提高RNAi抑制效率(Tuschl T et al.，1999，Genes Dev，13(24)：3191-7)。

(单链RNAi分子的构成要素)

在本实施方式的抑制剂中所含的RNAi分子为shRNA那样的单链分子的情况下，如上述图6B所示，除作为上述RNAi分子共同构成要素的RNAi有义链区域(0601)、RNAi反义链区域(0602)及不连续接合点(0603)之外，进一步含有连接RNAi有义链区域(0601)和与此反方向的RNAi反义链区域(0602)的短的间隔序列(0608)。间隔序列可以设为由通常3～24个碱基、优选4～15个碱基构成的任意的碱基序列。因此，在RNAi分子为单链的情况下，作为分子整体，由35个碱基(16×2+3)～84个碱基(30×2+24)构成。在RNAi分子内，RNAi有义链区域和RNAi反义链区域互相进行碱基配对，位于其间的间隔序列形成环结构，由此，分子整体形成发夹型的茎环结构。具有上述结构的单链RNAi分子被导入于细胞内时，在细胞质内通过被称为Dicer的内切核酸酶的作用加工成双链siRNA，其中RNAi反义链区域被并入RISC(RNA-induced silencing complex，RNA诱导的沉默复合体)复合体之后，可以利用与上述的双链RNAi分子同样的RNAi机制抑制靶基因的转录后翻译前表达。单链分子中的RNAi有义链区域(0601)和RNAi反义链区域(0602)与所述双链RNAi分子相同，可以在各自区域的3’末端上包含3’末端附加碱基。在单链分子中的5’末端，和/或3’末端上，可以附加任意的序列。例如，在5’末端和/或3’末端上可以附加能形成茎环结构的碱基序列。

1-4.表达载体的构成

在本说明书中，“表达载体”是指本实施方式的抑制剂中所含的有效成分，即将编码上述RNAi分子的DNA以可以表达的方式插入表达用载体内的载体。

在RNAi分子为siRNA那样的双链分子的情况下，本实施方式的表达载体可以将编码各个RNAi有义链区域及RNAi反义链区域的DNA片段插入不同的两个表达用载体，另外，也可以独立地作为表达控制的DNA片段插入一个表达用载体内。另一方面，在RNAi分子为shRNA那样的单链分子的情况下，编码该单链RNA分子的DNA片段插入表达用载体内的规定的位置即可。

在本说明书中，“表达用载体”是指本实施方式的表达载体中的骨架部分，即在本实施方式的表达载体中实施方式1的编码RNAi分子的DNA片段以外的部分。表达用载体的种类没有特别限定，优选质粒或病毒。它们根据导入的宿主适宜选择即可。例如在导入的宿主为人的情况下，可以使用以腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、仙台病毒、腺伴随病毒等病毒或者非病毒载体为基础的载体那样的公知的表达载体。另外，在导入的宿主为植物的情况下，可以利用pBI系或者pRI系的双元载体等质粒或花椰菜花叶病毒(CaMV)、菜豆金色花叶病毒(BGMV)、烟草花叶病毒(TMV)等病毒。进而，在导入的宿主为大肠杆菌的情况下，例如可以利用pBI系、pPZP系、pSMA系、pUC系、pBR系、pBluescript系(stratagene公司)等的质粒。此外，也可以利用从各生命科学制造商市售的各种各样的各种宿主用表达载体。

上述表达用载体可以含有启动子、增强子或者终止子那样的调节区域、或选择标记基因那样的标记区域。各自的种类没有特别限定。根据导入表达载体的宿主适宜选择该领域中公知的载体即可。

作为在大肠杆菌中可操作的启动子，例如可以举出：lac、trp或者tac启动子或源自噬菌体的T7、T3、SP6、PR或者PL启动子等。作为在酵母中可操作的启动子，例如可以举出：源自酵母糖酵解基因的启动子、醇脱氢酶基因启动子、TPI1、ADH2-4c启动子等。作为在植物细胞中可操作的启动子，例如可以举出：花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子、胭脂碱合成酶基因的启动子(Pnos)、源自玉米的泛素蛋白启动子、源自水稻的肌动蛋白启动子、源自烟草的PR蛋白质启动子等。作为在昆虫细胞中可操作的启动子，例如可以举出：多角体蛋白启动子、P10启动子、苜蓿银纹夜蛾多角体碱性蛋白启动子、杆状病毒极早期基因1启动子、杆状病毒39K晚早期(遅延型初期)基因启动子等。而且，作为在以人为代表的动物细胞内可操作的启动子，可优选使用RNA聚合酶II(PolII)系的启动子或RNA聚合酶III(Pol III)系的启动子。优选为Pol III系的启动子，特别优选为U6及H1等启动子。另外，在任一宿主的情况下，也可以使用仅在生物体内的特定的位点上诱导表达的位点特异的启动子。予以说明，在不同的两个表达用载体中分别插入编码RNAi有义链区域及RNAi反义链区域的DNA片段的情况下，为了各RNA链以同程度的量表达，启动子优选使用相同的启动子或具有同程度的表达活性的不同的启动子。

1-5.RNAi分子的设计和制造

对本实施方式的抑制剂中所含的RNAi分子的设计方法进行说明。如图7所示，本设计方法含有基准碱基设定工序(0701)、3’末端碱基设定工序(0702)、RNAi有义链区域设定工序(0703)、及RNAi反义链区域设定工序(0704)。以下，对各个工序进行说明。

“基准碱基设定工序”(0701)为在作为靶的显性突变基因中，将与该转录产物上的不连续接合点邻接的5’端以及3’端的碱基分别作为第1和第2基准碱基进行设定的工序。在显性突变基因的转录产物中存在两处以上不连续接合点的情况下，选择任一个不连续接合点即可。此时，与选择的不连续接合点邻接的5’端以及3’端的碱基成为第1和第2基准碱基。

“3’末端碱基设定工序”(0702)将对应于所述第2基准碱基的碱基为起点朝向下游侧第4～15位，优选第4～14位或第4～13位的碱基设定为与RNAi有义链区域的3’末端碱基对应的工序。

“RNAi有义链区域设定工序”(0703)，是在显性突变基因的转录产物的碱基序列中，将含有第1和第2基准碱基的连续的16～30个碱基作为RNAi有义链区域进行设定的工序。通过所述3’末端碱基设定工序决定3’末端碱基，因此，在转录产物的碱基序列上，从其3’末端碱基对应的碱基开始数，朝向上游包含第1和第2基准碱基，将16～30个碱基作为RNAi有义链区域进行设定即可。通过本工序决定针对RNAi分子的显性突变基因的靶区域。

“RNAi反义链区域设定工序”(0704)为将含有与经设定的RNAi有义链区域的碱基序列互补的碱基序列的碱基序列作为RNAi反义链区域进行设定的工序。

不论本实施方式的抑制剂中含有的RNAi分子的形态(例如，单链RNAi分子、双链RNAi分子或环状RNAi分子等)，以上的工序也为共同的工序。接着，对3’末端附加工序及间隔连接工序、ASP得分筛选工序进行说明。“3’末端附加工序”的特征在于，在上述设计的RNAi有义链区域及RNAi反义链区域的各个3’末端上附加TT(胸腺嘧啶-胸腺嘧啶)或UU(尿嘧啶-尿嘧啶)。本工序为任选工序，因此根据需要进行添加即可。

“间隔连接工序”为对于单链RNAi分子或环状RNAi分子特有的且必需的工序。本工序为将上述中设计的RNAi有义链区域的3’末端(在本工序前，如RNAi有义链区域经过3’末端附加工序时，在RNAi有义链区域的3’末端附加的TT或UU的3’末端)和RNAi反义链区域的5’末端(即，与RNAi有义链区域相反方向)分别与间隔序列的3’末端和5’末端连接而制成单链分子或环状RNAi分子的工序。间隔序列可以为由3～24个碱基、优选4～15个碱基构成的任意的碱基序列。优选为在间隔序列内不会形成碱基配对的碱基序列。

“ASP得分筛选工序”为由上述工序制备的RNAi分子中，仅对ASP得分值为0.4以上的RNAi分子进行筛选的工序。

ASP得分值由上述式计算即可。

本实施方式的RNAi分子可以基于通过上述的方法设计的碱基序列通过化学的合成法来合成。对RNAi分子的化学合成而言，各生命科学制造商(例如，西格玛奥德里奇公司、BEX公司、宝生物公司、英杰公司等)进行有受托制造服务，也可以利用这些服务。另外，对本实施方式的RNAi分子而言，将通过上述的方法设计的碱基序列暂时转换为DNA序列，基于该序列将化学合成DNA而成的物质进行克隆后，利用该领域中公知的体外RNA转录法对RNA进行制备。体外RNA转录法例如参照SambrooK，J.et.al.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual Second Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York即可。另外，可以以Ui-Tei等的方法(Nucleic Acids Res.，32：936-948，2004)、Reynolds等的方法(Nat.Biotechnol.，22：326-330，2004)、Amarzguioui等的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.，316：1050-1058，2004)作为参考。

1-6.表达载体的制备

本实施方式的抑制剂中所含的表达载体的制备方法基本上可以依据该领域中公知的方法，例如Sambrook，J.et.al.，(1989)Molecular Cloning：aLaboratory Manual Second Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York中记载的方法进行制备。

若举出具体的例子，则首先，依据上述的“1-5.RNAi分子的设计和制造”的项目中说明的方法，确定RNAi分子的碱基序列。接下来，基于与其对应的DNA序列，通过化学合成法等分别合成有义链DNA及反义链DNA。此时，优选在各链的两末端附加适当的限制位点或在各链退火后形成适当的粘性末端。对DNA合成而言，生命科学相关制造商各公司进行有受托合成服务，也可以利用该服务。将合成后的两链进行混合并退火，制备双链DNA片段后，在末端附加限制位点的情况下，根据需要用限制酶切断。进而，根据需要用T4多核苷酸激酶等将各链的5’末端进行磷酸化。接下来，将上述制备的双链DNA片段与表达用载体的启动子下游的对应的限制位点连接。对DNA片段而言，暂时与适当的克隆载体连接而进行克隆化后，可以将从其中切出的DNA片段与表达用载体连接。

另外，为了使具有3’末端附加碱基的RNAi分子表达，注意预先将TT插入到RNAi有义链区域以及RNAi反义链区域中各自的3’末端。本工序为任选工序，因此根据需要进行添加即可。

1-7.突变型EGFR基因表达抑制剂

作为本实施方式的显性突变基因表达抑制剂的一个例子，可以举出：将特异性地抑制突变型EGFR(表皮生长因子受体)基因的表达的RNAi分子(EGFR-RNAi分子)作为有效成分的突变型EGFR基因表达抑制剂。此处的突变型EGFR基因为后天性产生的显性突变基因，是成为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer；NSCLC)的原因的基因。表皮生长因子等的配体一旦在EGFR的细胞外结构域上结合，则通常被细胞内结构域的酪氨酸激酶活化，自体磷酸化作用运转。认为在突变型EGFR基因中，EGFR基因的特定的碱基上产生置换、缺失、插入，下游的细胞内信号传导通路通过成为处于组成型活化状态的功能获得型而产生(Paez G..J.etal.，Science，2004，304；1497-1500)。

本实施方式的突变型EGFR基因表达抑制剂，在这样的突变型EGFR基因中，可以特异性地抑制基于除置换以外的缺失和插入等的突变的基因的表达。

作为本实施方式的突变型EGFR基因表达抑制剂的具体实例，如图8-1、9-1、10-1和11-1的各A所示，可以例举为：将分别针对人EGFR基因的部分碱基缺失的del(E746-A750)突变以及del(L747-T751)-L747S突变、以及部分碱基的缺失和插入产生的del(L747-E749)-A750P突变的EGFR-RNAi分子作为有效成分的突变型EGFR基因表达抑制剂。予以说明，关于del(L747-E749)-A750P突变，如后述，即使编码的氨基酸序列相同，通过碱基序列的缺失和插入的差异，存在具有G和A的一个碱基的不同的两种突变。在本说明书中，del(L747-E749)-A750P突变中，在有必要区别这些突变的不同时，以后适当地将具有G的突变作为del(L747-E749)-A750P(G)突变(图10-1A)，而将具有A的突变作为del(L747-E749)-A750P(A)突变(图11-1A)。作为更具体的突变型EGFR基因表达抑制剂，例如，作为del(E746-A750)的表达抑制剂，可以举出：有义链区域由序列号3、5、7、9、11、13、15、17、19或21所示的单链或双链RNAi分子、或将编码RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体。另外，作为del(L747-T751)-L747S的表达抑制剂，可以举出：例如，有义链区域由序列号29、31、33、35、37、39、41、43、45、47或49所示的单链或双链RNAi分子、或将编码RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体。进而，作为del(L747-E749)-A750P(G)的表达抑制剂，可以举出：例如，有义链区域由序列号53、55、59、61、63、65或67所示的单链或双链RNAi分子、或将编码RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体。或者，作为del(L747-E749)-A750P(A)的表达抑制剂，可以举出：例如，有义链区域由序列号129、131、133、135、137、139、141、143或145所示的单链或双链RNAi分子、或将编码RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体。

1-8.BCR-ABL嵌合基因表达抑制剂

作为本实施方式的显性突变基因表达抑制剂的一个例子，可以举出：将特异性地抑制通过费城染色体中的易位突变产生的BCR-ABL嵌合基因的表达的RNAi分子(BCR-ABL-RNAi分子)作为有效成分的BCR-ABL嵌合基因表达抑制剂。此处的BCR-ABL嵌合基因为后天性产生的显性突变基因，是成为慢性骨髓性白血病(CML)或急性淋巴性白血病(ALL)的原因基因。

费城染色体(Ph染色体)以慢性骨髓性白血病(CML)的90％以上，以及急性淋巴性白血病(ALL)的约20％的病例被发现，是具有9号染色体的一部分易位到22号染色的结构的肿瘤特异的染色体。根据该易位，产生了位于9号染色体长臂(9q34)上的ABL基因与位于22号染色体长臂(22q11)上的BCR基因互相易位形成BCR-ABL嵌合基因的结果，产生有酪氨酸激酶活性促进的p210或p190蛋白质。本实施方式的BCR-ABL嵌合基因表达抑制剂可以特异性地抑制这样的BCR-ABL嵌合基因的表达。

作为本实施方式的BCR-ABL嵌合基因表达抑制剂的具体实例，可以举出：如图12-1以及13-1的A所示，将针对BCR-ABL嵌合基因的BCR-ABL-RNAi分子作为有效成分的BCR-ABL嵌合基因表达抑制剂。更具体地，例如，有义链区域由序列号97、99、101、103、105、107、109、111或113所示的单链或双链RNAi分子、或将编码RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体。

1-9.效果

根据本实施方式的基因表达抑制剂，有效成分的RNAi分子几乎或不太会对非靶基因的表达造成影响，可以选择性且有效地抑制靶基因的表达。

根据本实施方式的抑制剂，在导入于细胞内时，在以RNAi分子作为有效成分的情况下，该RNAi分子可以直接与靶显性突变基因作用并利用RNAi沉默机制抑制其表达，另外，在以表达载体为有效成分的情况下，在该表达载体中所含的DNA中所编码的RNAi分子进行表达后，可以与靶显性突变基因作用并利用RNAi沉默机制抑制其表达。因此，在抑制剂含有RNAi分子的情况下，可以在较短时间内对给药后的细胞等赋予该RNAi产生的抑制效果。另一方面，在抑制剂含有表达载体的情况下，只要在给药后的细胞内维持表达载体，则可以继续赋予所述效果。因此，通过将这些组合使用，可以有效地抑制显性突变基因的表达。

若使用本实施方式的抑制剂，则通过加入于后述的药物组合物，可以治疗或减轻各种疾病。

2.药物组合物

本发明的第2实施方式为药物组合物。

2-1.构成

本发明的药物组合物含有作为有效成分的所述实施方式1的显性突变基因表达抑制剂。显性突变基因表达抑制剂可单独含有针对作为靶的显性突变基因的RNAi分子或将编码该RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体，也可含有将相同基因作为靶的一个以上不同的RNAi分子和/或将编码一个以上不同的RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体。

例如，本实施方式的药物组合物的有效成分为突变型EGFR基因表达抑制剂，在该抑制剂含有两个以上不同的EGFR-RNAi分子的情况下，可以含有选自由以所述del(E746-A750)突变基因作为靶的EGFR-RNAi分子(例如，有义链区域含有由序列号3、5、7、9、11、13、15、17、19或21所示的碱基序列)、以del(L747-T751)-L747S突变基因作为靶的EGFR-RNAi分子(例如，有义链区域含有由序列号29、31、33、35、37、39、41、43、45、47或49所示的碱基序列)、以del(L747-E749)-A750P(G)突变基因作为靶的EGFR-RNAi分子(例如，有义链区域含有由序列号53、55、59、61、63、65或67所示的碱基序列)以及以del(L747-E749)-A750P(A)突变基因作为靶的EGFR-RNAi分子(例如，有义链区域含有由序列号129、131、133、135、137、139、141、143或145所示的碱基序列)构成的组中的两个以上RNAi分子。

另外，突变型EGFR基因表达抑制剂也可含有EGFR-RNAi分子和EGFR-RNAi分子表达载体(例如，将编码该EGFR-RNAi分子和/或不同EGFR-RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体)。

进而，实施方式的医药组合物可以在制药上可容许的范围内，且在不使实施方式1的显性突变基因表达抑制剂中的RNAi分子及/或表达载体失活的范围内含有其它有效成分，可以为所谓的复合制剂。

此处所谓的其他有效成分，将与所述实施方式1的显性突变基因表达抑制剂的相同基因作为靶，但可含有具有和所述实施方式1的有效成分不同的结构的RNAi分子和/或将编码该RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体作为表达抑制剂。作为一个例子，将突变型EGFR基因作为靶基因的情况下，除了含有具有所述实施方式1所记载的结构的EGFR-RNAi分子和/或将编码该RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体的显性突变基因表达抑制剂以外，可以举出：含有有义链区域含有由序列号83或85所示的RNAi分子，以及/或将编码该RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体的显性等位基因表达抑制剂。此外，也可含有与所述的显性等位基因表达抑制剂不同的显性突变基因表达抑制剂，含有以后述的实施例4说明的有义链区域由序列号89所示的RNAi分子，及/或将编码该RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体作为有效成分的抑制剂。如此，以相同基因的不同突变位点作为靶，将抑制基于每个突变的基因表达的抑制剂作为有效成分的复合制剂在靶基因的突变位点不清楚的时候是有用的。作为所述抑制剂的有效成分的RNAi分子对于靶突变基因的特异性高，因此具有下面的优点，即使混合也几乎没有抑制其他基因表达的副作用，或使RNAi分子及/或表达载体失活的可能性。

另外，其他有效成分，也可为具有与所述实施方式1的显性突变基因表达抑制剂不同药理作用的药剂。例如，可以例举为抗生素。

本发明的药物组合物含有作为有效成分的RNAi分子及/或表达载体的介质。对介质而言，例如可以举出：水、乙醇、丙二醇、乙氧基化异硬脂醇、聚氧化异硬脂醇及聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯类那样的溶剂。这样的介质优选进行杀菌，优选根据需要与血液等张地调整。

在本发明的药物组合物中，作为药物组合物中的有效成分的RNAi分子及/或表达载体的含量根据作为治疗对象的疾病的原因基因的种类、其基因的发病作用机制、RNAi分子的作用效果及稳定性、表达载体的表达量、药物组合物的剂型、使用的载体的种类及给药方法、给药的受治疗者的状态等各种条件而不同。这些基于该领域的公知技术适宜选择即可。对本发明的RNAi分子或表达载体的含量的具体实例而言，在利用注射液对不需要其它的医药的并用的人成人男子(体重60kg)给药的情况下，每给药单位的注射液含有约0.01％(w/v)～约20％(w/v)、优选约0.1％(w/v)～约10％(w/v)即可。具体而言，例如在1次1ml的注射剂中通常含有siRNA1μg～200μg即可。另外，在得到本发明的药物组合物的药理效果的基础上，在需要本发明的核酸的大量给药的情况下，为了减轻对于受治疗者的负担，也可以分成数次进行给药。

本发明的药物组合物可以根据需要进一步含有制药上可容许的载体。“制药上可容许的载体”是指在制剂技术领域中通常使用的添加剂。例如可以举出：赋形剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、乳化剂、流动添加调节剂、润滑剂等。

作为赋形剂，作为例子可以举出：如单糖、二糖类、环糊精及多糖类之类的糖(更具体而言，没有限定，含有葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、糊精、麦芽糊精、淀粉及纤维素)、金属盐(例如，氯化钠、磷酸钠或者磷酸钙、硫酸钙、硫酸镁、碳酸钙)、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、低、中、高分子量的聚乙二醇(PEG)、普朗尼克、高岭土、硅酸或它们的组合。

作为粘合剂，作为例子可以举出：使用了玉米、小麦、稻米或者马铃薯的淀粉的淀粉糊、单糖浆、葡萄糖液、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、虫胶及/或聚乙烯基吡咯烷酮等。

作为崩解剂，作为例子可以举出：上述淀粉及乳糖、羧甲基淀粉、交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、昆布糖粉末、碳酸氢钠、碳酸钙、海藻酸或者海藻酸钠、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯或它们的盐。

作为填充剂，作为例子可以举出：上述糖及/或磷酸钙(例如，磷酸三钙或者磷酸氢钙)。

作为乳化剂，作为例子可以举出：山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯。

作为流动添加调节剂及润滑剂，作为例子可以举出：硅酸盐、滑石、硬脂酸盐或聚乙二醇。

这样的载体是主要容易形成上述剂型，另外，用于维持剂型及药剂效果之外，还用于使得作为显性突变基因表达抑制剂的有效成分的RNAi分子难以被体内的核酸酶分解，根据需要适宜使用即可。除上述添加剂以外，也可以根据需要含有矫味矫臭剂、助溶剂、悬浮剂、稀释剂、表面活性剂、稳定剂、吸收促进剂、增量剂、加湿剂、保湿剂、吸附剂、崩解抑制剂、包衣剂、着色剂、防腐剂、抗氧化剂、香料、风味剂、甜味剂、缓冲剂等。

本发明的药物组合物也可以在不丧失上述RNAi分子所具有的药理效果的范围内含有其它的药剂。例如若在注射剂的情况下，则可以含有规定量的抗生素。

本实施方式的药物组合物的剂型只要为不使作为抑制剂中的有效成分的RNAi分子或表达载体以及其它的附加的有效成分失活的形态就没有特别限定。RNA一般不稳定，因此在给药RNAi分子情况下，优选在体内难以分解的剂型。例如可以为液体、固体或半固体中的任一种。作为具体的剂型，例如可以举出：注射剂、悬浮剂、乳剂、洗眼剂、滴鼻剂、乳膏剂、软膏剂、硬膏剂、贴敷剂及栓剂等非口服剂型或液剂、散剂、颗粒剂、药片、胶囊剂、舌下剂、片剂等经口剂型。在含有以RNAi分子或表达载体作为有效成分的抑制剂的本实施方式的药物组合物的情况下，优选剂型为注射剂。

另外，可以将本实施方式的药物组合物或所述实施方式1的显性突变基因表达抑制剂制备为纳米颗粒(例如，包含Davis ME，et al.，Nature，2010，464：1067-1070中所记载的靶纳米颗粒递送系统)、脂质体(例如，包含膜渗透肽结合脂质体、SNALP)、胆固醇结合体的形态。也可以利用Castanotto D.&Rossi JJ，Nature，2009，457，426-433中所记载的RNAi递送系统。

2-2.给药方法

本实施方式的药物组合物为了治疗目标疾病，可以对生物体给药制药上有效的量。作为给药的对象的生物体为脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为人。

在本说明书中，“制药上有效的量”是指作为本发明的药物组合物中所含的抑制剂的有效成分的RNAi分子及/或表达载体在治疗作为对象的疾病或减轻症状方面需要的用量(具体而言，可以抑制作为疾病原因的显性突变基因的性状表达的用量)，且对于给药的生物体几乎或完全没有有害的副作用(例如，野生型基因等的表达抑制等)的用量。其具体的量根据靶基因的种类、显性突变基因的性状表达效果、使用的剂型、受治疗者(在人的情况下为受试者)的信息及给药路径而不同。在对人进行给药的情况下，制药上有效的量的范围及优选的给药路径一般基于由细胞培养分析及动物实验得到的数据而策划制定。最终的给药量根据各个受试者通过医师的判断来确定并进行调整。此时，在所考虑的受试者的信息中含有疾病的进行度或重症度、全身的健康状态、年龄、体重、性别、饮食生活、对药物敏感性及治疗的耐性等。

本发明的RNAi分子可以为全身给药或局部给药中的任一种。可以根据疾病的种类、发病场所或进行度等而适宜选择。若发病场所为局部的疾病，则优选利用注射等在发病场所及其周边直接给药的局部给药。这是因为，可以对应治疗的场所(组织或器官)给药充分量的本发明的RNAi分子，另外，对其它的组织不易产生影响。另一方面，如在转移性癌那样无法确定治疗场所的情况或发病为全身性的疾病的情况下，没有限定，优选利用静脉注射等的全身给药。这是因为通过经由血流使本发明的RNAi分子遍布于全身，对在诊断中无法发现的病变部也可以给药。

本发明的RNAi分子可以用所含有的有效成分不会失活的所有的适当的方法进行给药。例如可以为非口服(例如，注射、气雾剂、涂布、洗眼、滴鼻)或口服中的任一种。优选为注射。

在利用注射给药的情况下，注入部位没有特别限定。只要由本发明的RNAi分子或表达载体生产的RNAi分子对于靶分子发挥其功能且可以实现药物组合物的目的，就可以为任一部位。例如可以举出：静脉内、动脉内、肝脏内、肌肉内、关节内、骨髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、肠内或舌下等。优选静脉内注射或动脉内注射等向血管内的注射。这是因为可如上述那样经由血流使本发明的药物组合物遍布于全身，另外，侵袭性也较低。例如，可以使用上述Davis等的靶纳米粒子递送系统等，利用血管内注射向全身给药RNAi分子。

2-3.用法

本发明的药物组合物可用于治疗疾病。例如，通过在以常染色体显性遗传疾病那样的显性突变基因的表达作为原因的疾病中进行应用，可以选择性地抑制突变基因的表达，同时可以实现编码具有正常功能的基因蛋白质的野生型基因的性状，因此，除目前其治疗困难的遗传病或癌等的治疗以外，可以用于动植物的品种改良等。因此，作为本实施方式的药物组合物的对象的疾病为抑制剂中所含的RNAi分子或表达载体表达的RNAi分子所基于的目标的显性突变基因的显性性状的疾病。作为这样的疾病的具体实例包含例如后天性地在特定的细胞内的基因组DNA中产生的突变引起的疾病或常染色体显性突变疾病。关于这些疾病的具体实例如上所述。因此，本实施方式的药物组合物根据作为治疗对象的疾病，通过将针对作为其原因基因的显性突变基因的RNAi分子或含有编码其的DNA的表达载体用作有效成分，可以对各种各样的疾病进行应用。

实施例

<实施例1：siRNA针对EGFR基因的ASP-RNAi效果的研究>

对特异性地抑制突变型EGFR(表皮生长因子受体)基因的表达的siRNA(EGFR-siRNA)进行设计，对针对突变基因(致癌基因)的表达抑制效果，即ASP-RNAi(等位基因特异的基因沉默)效果进行验证。

功能获得型的突变型EGFR基因为非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer；NSCLC)的原因基因。因此，本发明的EGFR-siRNA只要具有仅特异性地抑制功能获得型的突变型EGFR基因的表达的ASP-RNAi效果，则可成为对非小细胞肺癌的有效的治疗剂。

(1)突变型EGFR基因的种类

在非小细胞肺癌患者中，在EGFR基因(登记号NM_005228)内发现了与疾病相关的各种突变(功能获得型突变)。例如，具有如下：如图8-1A所示从第2235位到第2249位(将起始密码子的A作为第1位，以下相同)的碱基序列缺失的“del(E746-A750)突变”(伴随所述基因的缺失突变，将起始甲硫氨酸作为第1位时，产生从第746位的谷氨酸到第750位的丙氨酸缺失的突变蛋白质)，如图9-1A所示从第2240位到第2251位的碱基序列缺失的“del(L747-T751)-L747S突变”(伴随所述基因的缺失突变，产生从第747位的亮氨酸到第751位的苏氨酸缺失以及将第747位的亮氨酸置换为丝氨酸的突变蛋白质)，如图10-1A所示从第2238位到第2248位的碱基序列缺失，向其缺失位点插入新的两个碱基的“del(L747-E749)-A750P(G)突变”(伴随所述基因的缺失/插入突变，产生从第747位的亮氨酸到第749位的谷氨酸缺失并将第750位的丙氨酸置换为脯氨酸的突变蛋白质)，进而如图11-1A所示从起始密码子的A开始相当于第2238位的碱基，即编码E746的密码子(GAG)的第三位的碱基不是“G”(Pao et al.，2005，Plos Medicine，vol.2，Issue3：e73)而是“A”(Paezet al.，2004，Science，vol，304，1497-1500)的“del(L747-E749)-A750P(A)突变”等。另外，其它也可以举出：点突变。

于是，对于基于实施方式1所记载的RNAi分子的设计方法进行设计、制备的EGFR-siRNA是否可特异性地抑制这些突变基因的表达进行验证。

(2)EGFR-siRNA的设计和制备

关于上述del(E746-A750)突变、del(L747-T751)-L747S突变以及del(L747-E749)-A750P突变，在其突变基因产物(突变mRNA)上，分别对应在图8-1A、9-1A、10-1A以及11-1A中用箭头所示的位置之处相当于本说明书所记载的不连续接合点。即，del(E746-A750)突变基因以及del(L747-T751)-L747S突变基因的转录产物上分别有一处不连续接合点，另外在del(L747-E749)-A750P突变基因的转录产物上存在两处。于是，分别将与该不连续接合点邻接的5’端以及3’端的碱基作为第1和第2基准碱基(基准碱基设定工序)。del(L747-E749)-A750P突变基因的转录产物具有两个不连续接合点，且仅相隔1个碱基((L747-E749)-A750P(A)的情况下)或2个碱基((L747-E749)-A750P(G)的情况下)而彼此接近。因此，在此，将在形式上位于3’端的与不连续接合点邻接的5’端以及3’端的碱基分别作为第1和第2基准碱基。接着，逐一移动从第2基准碱基对应的碱基到3’末端的碱基数，设定RNAi有义链区域的3’末端碱基(3’末端碱基设定工序)。接着，在各突变基因中，将包含含有其转录产物的第1和第2基准碱基的连续的19个碱基的碱基序列作为RNAi有义链区域进行设定(RNAi有义链区域设定工序)。另外，将含有与设定的RNAi有义链区域的碱基序列互补的碱基序列作为RNAi反义链区域(RNAi反义链区域设定工序)。

利用本实施例进行设计，在表1～4中表示使用的EGFR-siRNA的具体碱基序列。

[表1]

[表2]

[表3]

[表4]

表1对应于del(E746-A750)突变基因、表2对应于del(L747-T751)-L747S突变基因、表3对应于del(L747-E749)-A750P(G)突变基因、且表4对应于del(L747-E749)-A750P(A)突变基因，分别表示设计的siRNA的有义链区域(ss)以及反义链区域(as)的碱基序列。各表所示的碱基序列，为了便于记载，删除了由有义链区域以及反义链区域的3’末端中UU构成的3’末端附加碱基。另外，表中的序列号与序列表的编号对应。

关于各表中的EGFR-siRNA名称，例如，表1中的“si746/50-3D19”将del(E746-A750)突变的第2基准碱基作为起点至3’末端的碱基数量为3个，表示RNAi有义链区域由19个碱基构成的siRNA。即，在“si746/50-3D19”的“si746/50”中，分别“si”表示siRNA，“746/50”表示del(E746-A750)突变的746～750，以及在“3D19”中，分别“D”表示缺失突变，“3”表示将第2基准碱基作为起点至3’末端的碱基数量为3个，且“19”表示RNAi有义链区域由19个碱基构成。但是，关于对表4所示的del(L747-E749)-A750P(A)突变基因的siRNA名称，为了与对表3所示的del(L747-E749)-A750P(G)突变基因的siRNA区别，在上述基准中，对于“si747/49-3D19”如“si747/49(A)-3D19”那样添加“(A)”，这样与对于del(L747-E749)-A750P(G)突变基因的siRNA进行了区别。另外，各表的有义链区域(ss)中的“^”表示不连续接合点，反义链区域(as)中的“^”表示对应于反义链区域内的不连续接合点的位置。在各表的有义链区域(ss)中，有下划线的碱基表示第2基准碱基。另外，黑体字表示del(L747-E749)-A750P(G)突变中的插入碱基(2个碱基)。

各siRNA的合成委托给西格玛奥德里奇公司。对合成的siRNA而言，将有义链区域及反义链区域进行退火处理，将其直接用于实验。

(3)报告基因表达质粒的构建

为了进行上述(1)制备的EGFR-siRNA中的RNAi效果的评价的选定，使用表达萤火虫萤光素酶(Photinus luciferase)基因的pGL3-TK(Ohnishi Y.，et al.，2006，Journal of RNAi and Gene Silencing，Vol.2：154-160)和及表达海肾萤光素酶(Renilla luciferase)基因的phRL-TK质粒(普洛麦格公司)，进行作为siRNA的靶的显性突变基因和非靶的野生型基因的报告基因表达质粒的构建。

关于含有突变位点的合成DNA寡核苷酸的设计、对报告基因表达质粒的插入、选定方法，依据Ohnishi Y,，et al.，2008，PloS One，Vol.3，Issue5：e2248。具体而言，分别合成分别含有作为非小细胞肺癌的病因的EGFR基因的del(E746-A750)、del(L747-T751)-L747S、或del(L747-E749)-A750P的各基因的缺失或缺失插入突变位点的DNA寡核苷酸的有义链区域及反义链区域(委托给西格玛奥德里奇公司)。予以说明，DNA合成时，将表1～4中各有义链区域及反义链区域的U(尿嘧啶)变换为T(胸腺嘧啶)。关于不具有突变的野生型基因，也同样地进行DNA寡核苷酸合成。将各个具体的碱基序列示于表5或表6。这些有义链区域及反义链区域含有在EGFR基因片段的有义链区域及反义链区域的两端构成限制酶切断位点的连接序列。表中，使用下划线表示连接序列，将EGFR基因中的不连续接合点用“^”表示，将各表的有义链区域(ss)中的第2基准碱基以黑白倒转字符表示，且表5中del(L747-E749)-A750P(G)突变基因中的插入碱基(2个碱基)、和表6中del(L747-E749)-A750P(A)突变基因中的插入碱基(1个碱基)以粗体表示。予以说明，EGFR(T790T)和EGFR(T790M)为用于EGFR的点突变的合成DNA寡核苷酸，小写字符标记的碱基表示点突变位点。

[表5]

[表6]

接着，进行合成的各链DNA寡核苷酸的退火处理。具体而言，以最终体积为10μL的方式将有义链及反义链的单链DNA寡核苷酸(最终浓度：分别为1μM)、10×退火缓冲液(英杰公司，最终浓度：1×)及灭菌水进行混合，在80℃下进行5分钟热处理后，在室温下放置30分钟，形成双链。

接下来，将双链DNA寡核苷酸插入经限制酶处理的上述2种质粒。具体而言，将pGL3-TK质粒和phRL-TK质粒用限制酶XbaI及NotI进行处理后，正常型等位基因插入pGL3-TK质粒中的各报告基因的3’非翻译区域(3’UTR)内，另外，显性突变基因插入phRL-TK质粒中的各报告基因的3’非翻译区域(3’UTR)内，构建野生型EGFR报告基因表达质粒及显性突变型EGFR报告基因表达质粒。另外，也对于正常型及显性突变基因同样地构建了替换了报告基因的报告基因表达质粒。

(4)细胞培养

将作为源自人的细胞系的HeLa细胞使用10％胎牛血清(FBS；英杰公司)及含有抗生素(100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素；和光公司)的DMEM培养液(和光公司)，在5％C0₂下、在37℃下进行培养。

(5)转染及报告分析

通过使用所述报告基因表达质粒的报告分析，对各种EGFR-siRNA的RNAi效果以及适于RNAi诱导的RNAi分子结构的一般法则进行研究。

在基因导入的前一天，通过胰蛋白酶消化使HeLa细胞分散后，以细胞密度为1×10⁵细胞/cm²的方式进行调整并接种在96孔培养板上，用不含抗生素的DMEM培养液对所述HeLa细胞进行培养。24小时后，将3种质粒，即(a)作为野生型EGFR报告基因表达质粒的pGL3-TK骨架质粒(60ng/孔)、(b)作为突变型EGFR基因的各报告基因表达质粒的phRL-TK骨架质粒(20ng/孔)及(c)作为外来对照的未受到RNAi引起的表达抑制的β-半乳糖苷酶基因表达质粒即pSV-β-半乳糖苷酶对照用质粒(普洛麦格公司)(10ng/孔)与以EGFR显性突变基因作为靶进行设计的表1～4所示的各种各样的EGFR-siRNA(终浓度20nM)同时导入。作为阴性对照，使用终浓度20nM的不诱导RNAi的siRNA(siControl；凯杰公司)。这些核酸的导入使用脂质体2000(英杰公司)。转染法依据所附的方案。导入核酸24小时后，使用在双萤光素酶报告基因检测系统(Dual-Luciferase reporter assay system，普洛麦格公司)的试剂盒(双萤光素酶报告基因检测系统)中所附的细胞裂解缓冲液(Passive lysis buffer)制备细胞提取液，将表达的各个报告突变基因(及2种萤光素酶)和对照的β-半乳糖苷酶的活性使用双萤光素酶报告基因检测系统(普洛麦格公司)及Beta-Glo检测系统(普洛麦格公司)分别进行测定。测定使用融合通用酶标分析仪“Fusion Universal MicroplateAnalyzer”(珀金埃尔默公司)。进而，关于报告，为了排除使用的2种萤光素酶活性的不同引起的测定差异的可能性，对各突变基因del(E746-A750)、del(L747-T751)-L747S、del(L747-E749)-A750P基因也进行了替换了报告基因的实验。

(6)结果

针对del(E746-A750)突变基因的各EGFR-siRNA的结果表示于图8-1B，针对del(L747-T751)-L747S突变基因的各EGFR-siRNA的结果表示于图9-1B，且针对del(L747-E749)-A750P(G)、以及del(L747-E749)-A750P(A)突变基因的各EGFR-siRNA的结果分别表示于图10-1B和图11-1B。在各图中，将非靶的野生型EGFR基因和靶的突变型EGFR基因的萤光素酶活性作为在各自的siControl的萤光素酶为1.0时的相对值算出。各样品的萤光素酶活性通过未受到RNAi引起的表达抑制的作为外来对照的β-半乳糖苷酶的表达量进行校正。

以第2基准碱基为起点朝向下游逐一移动RNAi有义链区域的3’末端碱基，同时进行导入，在将整个RNAi有义链区域的碱基长度保持为19个碱基的情况下，如图8-1B和图9-1B所示，表明将第4～15位的碱基设定在RNAi有义链区域的3’末端碱基上时(用-4D19～-15D19表示)，与对照(siControl)的表达相比，强烈地抑制了突变型EGFR基因的表达，但不抑制野生型EGFR基因的表达，或者几乎与对照相同。即，意味着这是ASP-RNAi效果高的有用的siRNA。

另一方面，在图10-1B中，表明将第2～9位的碱基设定在RNAi有义链区域的3’末端碱基上时，与对照(siControl)的表达比较，较强地抑制了突变型EGFR基因的表达，但不抑制野生型EGFR基因的表达，或者几乎与对照相同。该结果含有上述del(E746-A750)突变和del(L747-T751)-L747S突变的结果和一些偏差。然而，如图10-1A、图11-1A所示，在del(L747-E749)-A750P(G)、(A)中存在两处不连续接合点，分别相隔2个碱基和1个碱基且彼此接近。因此，在上述的实施例中，形式上分别将与3’端的不连续接合点邻接的5’端和3’端的碱基作为第1和第2基准碱基制备si747/49-2D19～-9D19和si747/49(A)-3D19∽-11D19，但这可能分别使得与5’端的不连续接合点邻接的5’端和3’端的碱基成为第1和第2基准碱基，此时，成为si747/49-4D19～-11D19和si747/49(A)-4D19～-12D19，与del(E746-A750)突变和del(L747-T751)-L747S突变的结果一致。

因此，明确在设计ASP-RNAi效果高的有用的EGFR-siRNA方面优选以第2基准碱基作为起点并将其下游的第4～15位的碱基设定在RNAi有义链区域的3’末端碱基上。

由上表明，将含有不连续接合点的转录产物作为靶的RNAi分子，也不是只要含有夹有不连续接合点的2个碱基(第1和第2基准碱基)，就可任意地设定其序列，如果第1和第2基准碱基不在RNAi有义链区域规定的位置，则得不到期望的ASP-RNAi效果。虽然看来稍有偏差，但如后述的实施例5和图12和图13所示，表明这种倾向为与相同基因内的靶区域的碱基序列的差异或靶基因的差异都无关的现象。

<实施例2：EGFR-siRNA针对源自人非小细胞肺癌的细胞系的缺失(或缺失/插入)突变基因特异的RNAi效果>

在上述实施例1中，关于突变型EGFR，即针对del(E746-A750)、del(L747-T751)-L747S、del(L747-E749)-A750P显示有效的表达抑制效果的EGFR-siRNA，验证它们是否对于内源的突变型EGFR也显示特异的表达抑制效果(ASP-RNAi效果)。在本实验中，将具有EGFRdel(L747-E749)-A750P的源自人肺癌的PC3细胞作为例子而使用。对于EGFR-siRNA而言，针对实施例1中的del(L747-E749)-A750P突变，特别使用具有表达抑制效果的si747/49-3D19、及si747/49(A)-8D19进行内源的突变型EGFR的RNAi击倒(RNAiノツクダウン)。

[方法]

(1)细胞培养

将作为源自人非小细胞肺癌的细胞系的PC3细胞使用含10％胎牛血清(FBS；英杰公司)的EMEM培养液(和光公司)在5％CO₂、37℃下进行培养。

(2)利用电穿孔法的EGFR-siRNA的导入

将上述(1)培养的细胞在通过胰蛋白酶消化分散后，通过离心(120G、5分钟)进行回收，将约1×10⁶个细胞用含有EGFR-siRNA(终浓度5μM)的100μL的电穿孔缓冲液(Amaxa Cell Line Nucleofector Solution V，Amaxa公司)进行悬浮。制备3个上述电穿孔用样品，依据所附的方案并利用电穿孔(程序：U-005，基因导入系统Nucleofector，Amaxa公司)进行核酸(1个为不加入核酸的对照实验组)的导入。导入的核酸为si747/49-3D19、si747/49(A)-8D19和不诱导RNAi的对照siRNA(凯杰公司)。

将上述3组细胞使用上述(1)的培养液用6孔培养板进行培养，24小时后进行回收。

(3)cDNA合成

将在上述(2)中回收的细胞使用TRIzol试剂(英杰公司)，依据所附的方案回收总RNA。之后，使用SuperScript III Reverse Transcriptase(英杰公司)以及Oligo(dT)₁₅(普洛麦格公司)通过逆转录酶反应合成cDNA，之后进行RNA酶H(英杰公司)处理。上述操作全部依据所附的方案进行。

(4)PCR分析

将在上述(3)中得到的cDNA使用AmpliTaq Gold DNA Polymerase(应用生物系统公司)和特异性地扩增EGFR突变位点周围序列的引物进行PCR分析。PCR的温度、时间条件为在初期变性(95℃、10分钟)后，并将变性(94℃、30秒)、退火(55℃、30秒、延伸反应(72℃、30秒)3个阶段重复26次。之后，将PCR扩增产物用电泳法(7％聚丙烯酰胺凝胶、100mA、1小时)进行分析。使用的引物序列表示于表7。

[表7]

[结果]

分别将si747/49-3D19的结果表示于图14，将si747/49(A)-8D19的结果表示于图15。证实了不论哪种EGFR-siRNA都不抑制野生型EGFR基因的表达，但特异性地且强烈地抑制内源突变型EGFR基因的表达。

<实施例3：EGFR-siRNA针对源自人非小细胞肺癌的细胞系的细胞死亡以及对细胞增殖能力的影响评价>

如实施例2所示的使用EGFR-siRNA(si747/49-3D19以及si747/49(A)-8D19)对内源突变型EGFR(del(L747-E749)-A750P)的特异性且有效的表达抑制是否对细胞增殖或细胞死亡产生影响，分别研究了相关的细胞总数、细胞毒性、细胞增殖、生存活性、细胞死亡(细胞凋亡)。

(1)细胞培养

与上述“实施例2(1)”相同地进行PC3细胞的培养。

(2)利用电穿孔法的HTT-siRNA的导入

与上述“实施例2(2)”相同地进行电穿孔。

使用上述(1)的培养液用96孔培养板进行细胞培养(细胞密度：约3×10⁴个/孔)，提供1天、4天后的各评价实验。关于si747/49-3D19，与对照一同，也在2天后以及6天后提供相同的评价实验。

1.细胞增殖能力(细胞总数)的测定

[方法]

为了调查si747/49-3D19导入后的PC3细胞中实时细胞数的变化(细胞增殖能力)，使用CytoTox96(R)Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(普洛麦格公司)测定细胞内LDH(Lactate Dehydrogena；乳酸脱氢酶)含量。实验是依据所附的方案进行的。简单而言，将附加在所述检测试剂盒中的细胞裂解缓冲液(Lysis Solution(10×))添加到所有样品组的培养液中，通过45分钟37℃的培养，全部细胞中含有的全部LDH释放。以测定该LDH含量间接地算出细胞总数。吸光度的测定使用BenchMark Plus(伯乐公司)。对阴性对照而言，使用不添加siRNA的样品(无siRNA)和添加不诱导RNAi的siRNA(siControl；凯杰公司)的样品。

[结果]

结果表示于图16。在该图中，用当作细胞总数的第1天的“无siRNA”LDH含量作为100％时的LDH含量的相对值(％)表示。EGFR-siRNA(si747/49-3D19)无论相对于“无siRNA”还是“siControl”都显著地使PC3细胞的细胞总数减少。即，该结果意味si747/49-3D19抑制了PC3细胞的细胞增殖。另外，同时显示si747/49-3D19针对通过组成型活化促进细胞增殖活性的PC3内源显性突变型EGFR(del(L747-E749)-A750P)基因，特异性且有效地抑制了其表达。

2.细胞毒性评价

[方法]

为了评价si747/49-3D19导入后的对于PC3细胞的细胞毒性，使用CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(普洛麦格公司)测定通过细胞毒性释放到细胞外的存在于培养液中的LDH含量。实验操作是依据所附的方案进行的，吸光度的测定使用BenchMark Plus(伯乐公司)。另外，使用的阴性对照与在上述细胞增殖能力的测定时相同，使用两个对照(无siRNA以及siControl)。

[结果]

结果表示于图17。在该图中，使用第1天的“无siRNA”的全部细胞含有的LDH含量(与所述细胞增殖能力评价实验相同添加细胞裂解缓冲液后的样品)作为100％时的LDH含量的相对值(％)表示。表明si747/49-3D19不诱导与“无siRNA”和“siControl”相同或更大的细胞毒性，或内源突变型EGFR的表达抑制引起的细胞死亡。

3.细胞增殖以及生存活性评价(1)

[方法]

为了评价si747/49-3D19导入后的PC3细胞的细胞增殖以及生存活性，使用CellTiter96AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay(普洛麦格公司)测定活细胞中含有的NADH(nicotinamide adenine dinucleotide；烟碱腺嘌呤二核苷酸)引起的MTS还原作用。实验操作依据所附的方案进行，吸光度的测定使用BenchMark Plus(伯乐公司)。另外，使用的阴性对照与在上述细胞增殖能力的测定时相同，使用两个对照(无siRNA和siControl)。

[结果]

分别将si747/49-3D19的结果表示于图18、将si747/49(A)-8D19的结果表示于图19。在该图中，细胞增殖以及生存活性(细胞生存率)作为“无siRNA”的第1天的NADH活性为100％时的相对值表示。表明si747/49-3D19和si747/49(A)-8D19无论相对于“无siRNA”还是“siControl”都显著地抑制了其增殖率，或降低了生存率。

4.细胞增殖以及生存活性评价(2)

[方法]

为了评价si747/49-3D19导入后的PC3细胞中的细胞增殖以及生存活性，使用CellTiter-Glo Assay(普洛麦格公司)测定细胞的相对ATP含量。实验操作依据所附的方案进行，发光量的测定使用Fusion UniversalMicroplate Analyzer(珀金埃尔默公司)。另外，使用的阴性对照与在上述细胞增殖能力的测定时相同，使用两个对照(无siRNA和siControl)。

[结果]

结果表示于图20。细胞增殖以及生存活性(细胞生存率)表示为在“无siRNA”的培养第1天的相对ATP含量作为100％时的第1天和第4天的相对值。如该图所示，si747/49-3D19在培养第4天时无论相对于“无siRNA”还是“siControl”都显著地抑制了其增殖率，或降低了生存率。

5.细胞死亡评价

[方法]

为了评价si747/49-3D19导入后的PC3细胞中的细胞死亡(细胞凋亡)，使用Caspase-Glo3/7Assay(普洛麦格公司)测定胱天蛋白酶3/7的活性。实验操作是依据所附的方案进行的，发光量的测定使用Fusion UniversalMicroplate Analyzer(珀金埃尔默公司)。另外，使用的阴性对照与在上述细胞增殖能力的测定时相同，使用两个对照(无siRNA和siControl)。

[结果]

结果表示于图21。胱天蛋白酶3/7表示为在“无siRNA”的培养第1天的活性作为100％时的第1天和第4天的相对值。如该图所示，si747/49-3D19与在培养第4天时与“无siRNA”和“siControl”的任一种比较，胱天蛋白酶3/7活性都没有显示显著的变化。这表示si747/49-3D19引起的突变型EGFR特异的表达抑制不诱导细胞凋亡。

<实施例4：EGFR-siRNA针对源自人非小细胞肺癌的细胞系的点突变基因特异的RNAi效果>

(1)EGFR-siRNA针对EGFR基因的ASP-RNAi效果的研究

[方法]

如实施例1所记载，在非小细胞肺癌患者中，在EGFR基因内作为与疾病关联的功能获得型突变，也已知有点突变(Paez G.J.et al.，Science，2004，304；1497-1500)。例如，可以举出：如图22A所示的第2369位的碱基C置换为T(T790M突变)(伴随所述基因的点突变)，第790位的色氨酸向甲硫氨酸的氨基酸变化(T790M)的点突变。具有这样的点突变引起的置换突变的突变基因由于其转录产物不具有不连续接合点，因此不能成为本申请实施例1的显性突变基因表达抑制剂的对象。

然而，如果是可以不影响野生型的EGFR基因表达，而特异性地抑制具有这样的点突变引起的置换突变的突变型EGFR基因的表达，且具有与实施方式1的显性突变基因表达抑制剂不同的结构的其它siRNA和/或将编码该siRNA的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体，则可通过将其与实施例1所记载的EGFR-siRNA并用，期待更高的抑制效果。

于是，对特异性地抑制点突变型EGFR(表皮生长因子受体)基因的表达的siRNA(EGFR-siRNA)进行设计，并对针对突变基因(致癌基因)的表达抑制效果进行验证。表8表示针对T790M突变而设计的siRNA的有义链区域(ss)以及反义链区域(as)的碱基序列。在碱基序列中，用黑体字表示的碱基相当于点突变位点。予以说明，各表所示的碱基序列，为了便于记载，删除了由有义链和反义链的3’末端中UU构成的3’末端附加碱基。另外，表中的序列号与序列表的编号对应。关于各表的EGFR-siRNA名，例如，表8的“si790-9C/U18”表示如下内容：以T790突变的点突变位点为起点至有义链区域的5’末端碱基的碱基数为9个碱基，通过点突变野生型EGFR基因上的碱基C被U(T)置换，且有义链区域以及反义链区域的碱基数为共计18个碱基。

[表8]

(2)报告基因表达质粒的构建和报告分析

为了选定由所述1制备的EGFR-siRNA的RNAi效果的评价，进行了siRNA的靶显性突变基因和非靶野生型基因的报告基因表达质粒的构建、细胞培养、转染以及报告分析。基本的操作顺序基于实施例1所记载的方法。

[结果]

结果表示于图22B。如图所示，表明如下内容：si790-9C/U18与siControl相比对野生型EGFR基因的表达有较强的抑制效果，因此为较不优选的siRNA，但si790-10C/U18和si790-11C/U18对于野生型EGFR基因几乎没有表达抑制效果，另一方面，针对突变型EGFR基因具有有效的抑制作用。

因此，表示si790-10C/U18和si790-11C/U18为优选的EGFR-siRNA。

<实施例5：BCR-ABL-siRNA针对BCR-ABL嵌合基因的易位突变基因特异的RNAi效果>

对将通过费城染色体中的易位突变产生的BCR-ABL嵌合基因为靶的具有本实施方式1的结构的siRNA(BCR-ABL-siRNA)进行设计，对针对作为白血病原因基因的BCR-ABL嵌合基因的表达抑制效果进行验证。

[方法]

如上述，BCR-ABL嵌合基因被看作在具有费城染色体的患者中发现的CML或ALL的原因基因，如果本发明的BCR-ABL-siRNA可仅特异性地抑制功能亢进型的BCR-ABL基因的表达，则可成为针对在具有费城染色体的患者中的CML或ALL的有效的预防剂或治疗剂。

(1)BCR-ABL嵌合基因的种类

Ph易位中的BCR基因的切断点，已知集中在Major-BCR(下游：M-BCR)和minor-BCR(上游：m-BCR)的两处，在慢性中性粒细胞白血病/特发性血小板增多症中，进一步报告了下游的μ-BCR(p230)的参与。分别产生p210BCR/ABL(M-BCR切断点)、p190BCR/ABL(m-BCR切断点)、p230BCR/ABL(μ-BCR切断点)的蛋白，其中，p210BCR/ABL在几乎所有CML以及Ph阳性ALL中被发现，而p190BCR/ABL则在Ph阳性ALL其余一半的患者中被发现。

于是，针对在该疾病中视作最高频率的将M-BCR作为切断点的BCR-ABL嵌合基因，基于实施方式1所记载的RNAi分子的设计方法设计和制备BCR-ABL-siRNA，对于是否可特异性地抑制这些易位突变基因的表达进行验证。

(2)BCR-ABL-siRNA的设计和制备

关于将上述M-BCR作为切断点的BCR-ABL嵌合基因，在其突变基因产物(突变mRNA)上，分别针对野生型ABL基因和野生型BCL基因，在图12-1A以及13-1A中用箭头所示的位置之处相当于本说明书所记载的不连续接合点。将与该不连续接合点邻接的5’端和3’端的碱基分别作为第1和第2标准碱基，通过与实施例1相同的方法设计、制备BCR-ABL-siRNA。

本实施例中设计、使用的BCR-ABL-siRNA的具体碱基序列表示于表9。表9表示针对将M-BCR作为切断点的BCR-ABL嵌合基因设计的siRNA的有义链区域(ss)以及反义链区域(as)的碱基序列。但是，对于各表所示的碱基序列，为了便于记载，删除了由有义链区域以及反义链区域的3’末端中UU构成的3’末端附加碱基。另外，表中的序列号与序列表的编号对应。

[表9]

各siRNA的合成委托给西格玛奥德里奇公司。对合成的siRNA而言，将有义链区域及反义链区域实施退火处理，将其直接用于实验。

(3)报告基因表达质粒的构建

关于报告基因表达质粒的构建、含有突变位点的合成DNA寡核苷酸的设计、向报告基因表达质粒的插入、选定方法，基于实施例1的“(3)报告基因表达质粒的构建”所记载的方法。使用的合成DNA寡核苷酸的碱基序列示于表10。

[表10]

(4)细胞培养

基于实施例1的“(4)细胞培养”所记载的方法。

(5)转染及报告分析

基于实施例1的“(5)转染及报告分析”所记载的方法。

[结果]

将各BCR-ABL-siRNA的针对BCR-ABL嵌合基因的结果表示于图12-1B以及图13-1B。为了评价各BCR-ABL-siRNA的针对该基因的特异的表达抑制效果，必须针对BCR-ABL嵌合基因与两个野生型基因(ABL基因和BCR基因)进行评价。因此，将各BCR-ABL-siRNA的靶基因特异的表达抑制效果利用BCR-ABL嵌合基因和野生型ABL基因(图12-1B)、BCR-ABL嵌合基因和野生型BCR基因(图13-1B)的组合进行评价。与上述相同，在各图中，将非靶的野生型ABL或BCR基因和靶的BCR-ABL嵌合基因的萤光素酶活性作为在各自的siControl的萤光素酶活性为1.0时的相对值算出。各样品的萤光素酶活性通过未受到RNAi引起的表达抑制的作为外来对照的β-半乳糖苷酶的表达量进行校正。

以第2基准碱基为起点朝向下游逐一移动siRNA有义链区域的3’末端碱基，同时进行导入，在将整个RNAi有义链区域的碱基长度保持为19个碱基的情况下，如图12-1B和图13-1B所示，表明将第4～13位的碱基设定在RNAi有义链区域的3’末端碱基上时(用-4D19～-13D19表示)，与对照(siControl)的表达相比，强烈地抑制了BCR-ABL嵌合基因的表达，但不抑制野生型ABL或BCR基因的表达，或者几乎与对照相同。即，意味着这是ASP-RNAi效果高的有用的siRNA。

因此，与上述“实施例1”相同，显示在设计ASP-RNAi效果高的有用的BCR-ABL-siRNA方面优选以第2基准碱基为起点并将其下游的第4～15位范围的碱基设定在RNAi有义链区域的3’末端碱基上。

<实施例6：EGFR-siRNA以及抗癌剂吉非替尼对源自人非小细胞肺癌的细胞系的细胞生存活性的影响>

使用在上述实施例1中的针对EGFR的del(L747-E749)-A750P突变或del(E746-A750)突变分别显示特异的表达抑制的EGFR-siRNA、以及针对表达突变型EGFR的非小细胞肺癌的有效抗癌剂吉非替尼，对针对各自的细胞增殖以及细胞生存活性的影响进行验证。

[方法]

(1)细胞培养

在分析中，使用具有EGFR的del(L747-E749)-A750P突变和del(E746-A750)突变的源自人非小细胞肺癌的细胞系的PC3细胞和PC9细胞、以及具有对照用的野生型EGFR的人HeLa细胞。PC3细胞的培养同上述“实施例2：(1)”相同的进行，而HeLa细胞的培养同上述“实施例1：(4)”相同的进行。PC9细胞使用含有10％胎牛血清(FBS；英杰公司)的RPMI-1640培养液(和光公司)，在5％CO₂下、在37℃下进行培养。

(2)吉非替尼处理

将培养的PC3细胞、PC9以及HeLa细胞通过胰蛋白酶消化分散后，通过离心(120G、5分钟)进行回收，并在96孔培养板上进行细胞培养(细胞密度：约1×10⁵个/em²)。24小时后，暴露在终浓度0、10^-3、10^-2、10^-1、10⁰和10¹μM的吉非替尼(易瑞沙；阿斯利康公司)，第3天后测定细胞生存活性。

(3)利用电穿孔法的向PC3细胞的EGFR-siRNA的导入

以与上述“实施例2：(2)”相同的方法，进行EGFR-siRNA的细胞导入。具体而言，将用上述(1)的培养液培养的PC3细胞通过胰蛋白酶消化分散后，通过离心(120G、5分钟)进行回收，并将约1×10⁶个细胞用含有终浓度100、50、25、10、5、1和0nM的EGFR-siRNA(si747/49-3D19)或不诱导RNAi的siRNA(siControl；凯杰公司)的100μl的电穿孔缓冲液(AmaxaCell Line Nucleofector Solution V，Amaxa公司)进行悬浮。依据所附的方案进行电穿孔(程序：U-005，基因导入系统Nucleofector，Amaxa公司)，将所述siRNA导入细胞。利用“实施例2：(1)”所记载的培养基进行培养，在第3天后测定细胞生存活性。

(4)利用脂质体转染法的向PC9细胞的EGFR-siRNA的导入

在上述(1)96孔培养板上进行细胞培养(细胞密度：约1×10⁵个/em²)。将终浓度100、50、25、10、5、1和0nM的EGFR-siRNA(si746/50-4D19)或不诱导RNAi的siRNA(siControl；凯杰公司)使用脂质体2000(英杰公司)导入到PC9细胞。转染方法依据所附的方案。在培养第3天后测定细胞生存活性。

(5)细胞增殖以及生存活性的评价

以与上述“实施例3；3.细胞增殖以及生存活性评价(1)”相同的方法进行评价。

[结果]

(1)吉非替尼对细胞增殖和生存活性的影响

将吉非替尼引起的各细胞的细胞增殖以及生存活性的结果表示于图23A～C。图23A为具有del(L747-E749)-A750P突变的PC3细胞的结果，图23B为具有del(E746-A750)突变的PC9细胞的结果，图23C为HeLa细胞的结果。各图分别表示在未经处理的细胞中细胞生存活性作为100％时的相对值。

相对于PC9细胞在10^-2μM以上的吉非替尼浓度下显示显著的细胞增殖抑制以及生存活性降低，PC3细胞和HeLa细胞均在1μM以上显示浓度依存的细胞增殖抑制和生存活性降低。由该结果表明，相对于PC9作为即使给药少量的吉非替尼即可抑制其增殖的吉非替尼感受性的细胞，PC3细胞为如果不给药连HeLa细胞也受影响、即连具有野生型EGFR的细胞也被抑制的高浓度的吉非替尼，则不能发现其细胞增殖和生存活性的抑制效果的吉非替尼耐受性细胞。

由上，显示吉非替尼对于具有del(E746-A750)突变的吉非替尼感受性的EGFR突变的非小细胞肺癌能成为有效的抗癌剂，但对于具有del(L747-E749)-A750P突变且获得吉非替尼耐受性的非小细胞肺癌，如果不给药对给药个体产生有害副作用的高浓度的吉非替尼则得不到效果。

实际上，报告有在吉非替尼的有效性和EGFR基因突变中存在密切的关系(Paez G.J.et al.Science，2004，304；1497-1500，Lynch T.J.et al.N EnglJ Med，2004，350；2129-2139)，已知具有吉非替尼感受性EGFR突变的患者，通过吉非替尼的给药得到显著的治疗效果，但对于具有吉非替尼耐受性EGFR突变的患者，吉非替尼的给药则会引起间质性肺炎或急性肺损伤等副作用，本实施例的结果，也与上述结果相符。

(2)EGFR-siRNA针对细胞增殖和生存活性的影响

将EGFR-siRNA引起的各细胞的细胞增殖和生存活性的结果表示于图24A～C。

图24A为EGFR-siRNA(si747/49-3D19)针对具有del(L747-E749)-A750P突变的PC3细胞的结果，图24B为EGFR-siRNA(si746/50-4D19)针对具有del(E746-A750)突变的PC9细胞的结果，图24C为EGFR-siRNA(si747/49-3D19)针对HeLa细胞的结果。各图分别表示在未经处理的细胞中细胞生存活性作为100％时的相对值。

如该图所示，观察到了EGFR-siRNA(si746/50-4D19和si747/49-3D19)针对具有EGFR上的突变的PC3细胞以及PC9细胞两者的显著的细胞增殖抑制以及生存活性的降低。另一方面，所有的EGFR-siRNA针对具有野生型EGFR的HeLa细胞未显示细胞增殖以及生存活性的抑制效果。

以上结果证明本发明的EGFR-siRNA针对野生型的EGFR的表达几乎没有影响(即，无副作用的影响或极小)，且即使为吉非替尼耐受性、感受性的任一种的EGFR突变，与吉非替尼相比能够以低浓度诱导特异性极高的细胞增殖抑制以及生存活性降低。

<实施例7：通过源自人非小细胞肺癌的细胞系的异种异位移植的模型小鼠的制作和EGFR-siRNA针对其的效果>

将使用个体水平验证以细胞水平验证的EGFR-siRNA效果。

[方法]

在裸鼠的皮下移植PC3细胞，制作小鼠皮下肿瘤模型，使用该模型小鼠对EGFR-siRNA给药引起的肿瘤生长抑制效果进行验证。

(1)通过源自人非小细胞肺癌的PC3细胞的异种异位移植的模型小鼠的制作

(i)细胞培养

使用与上述“实施例2：(1)”同样的方法，培养PC3细胞。

(ii)PC3细胞的移植

在培养的PC3细胞通过胰蛋白酶消化分散后，通过离心(120G、5分钟)进行回收，并使用不含血清和抗生素的培养液(RPMI-1640，和光公司)进行再悬浮，并制备细胞数1×10⁷个细胞/ml。将该细胞悬浮液和BDMatrigel基底膜基质(Beckton Dickinson公司)等量混合制备细胞数5×10⁶个细胞/ml。将此在免疫缺陷模型的裸鼠(5周龄，BALB/cAJcl-nu/nu，日本CLEA有限公司)的右侧腹部以100μl(0.5×10⁶个细胞)进行皮下给药。

(2)向小鼠的皮下肿瘤的EGFR-siRNA的给药

(i)EGFR-siRNA的制备和给药

将去端肽胶原作为主要成分的核酸递送介质的AteloGene(注册商标)Local Use(高研有限公司)，和在实施例1～3中针对PC3细胞显示有效的细胞增殖抑制效果的si747/49-3D19、或si747/49(A)-8D19的复合体进行制备。制备方法依据所附的方案，将EGFR-siRNA(si747/49-3D19或si747/49(A)-8D19)的终浓度作为0.1mg/ml。作为对照试验也同样制备不诱导RNAi的siRNA(siControl；凯杰公司)，并也制备不含siRNA的去端肽胶原液。

(ii)针对皮下肿瘤的siRNA的给药

在移植PC3细胞1周后(6周龄)通过肿瘤直径算出肿瘤体积，针对达到约50mm³的肿瘤，将上述制备的3个样品，即不含siRNA的去端肽胶原液、siControl以及EGFR-siRNA的20μg/200μl的溶液分别以1.0mg/kg体重直接向肿瘤单次给药。肿瘤体积使用以下的公式进行计算。

体积＝(短径)²×(长径)×0.5

(iii)siRNA给药后的观察

在siRNA等的给药3周后(9周龄)(图25A为si747/49-3D19，图28A为si747/49(A)-8D19)，通过上述计算公式测定肿瘤体积，进而取出肿瘤(图25B为si747/49-3D19，图28B为si747/49(A)-8D19)，测量湿重。

[结果]

将通过EGFR-siRNA的给药的肿瘤体积的时间变化分别表示于图26(si747/49-3D19给药)、图29(si747/49(A)-8D19给药)，将摘出的肿瘤的湿重分别表示于图27(si747/49-3D19给药)、图30(si747/49(A)-8D19给药)。给药EGFR-siRNA(si747/49-3D19或si747/49(A)-8D19)的个体组与仅给药去端肽胶原溶液和siControl的个体组相比，显示了皮下肿瘤的肥大显著的被抑制。进而，肿瘤的湿重也与其相比显著的降低。

以上结果确认了本发明的EGFR-siRNA不仅在细胞水平上，而且在个体水平上对癌细胞增殖的抑制也是有效的。证明本发明的EGFR-siRNA针对在吉非替尼的给药中副作用较大而至今不能使用的吉非替尼耐受性的EGFR突变可以极有效地且安全地抑制癌细胞的增殖以及生存活性。

非小细胞肺癌患者的癌细胞是否具有突变EGFR基因可以通过LNA-PNA-PCR clamp方法(专利第4216266号)等高感度检测方法进行检测。在患者的EGFR基因具有del(E746-A750)突变那样的吉非替尼感受性突变的情况下，吉非替尼可成为极有效的治疗剂。然而，在具有del(L747-E750)-A750P突变那样的突变而且获得吉非替尼耐受性的癌细胞的情况下，有效且无副作用的药剂至今未知。显示本发明的EGFR-siRNA针对具有没有确定那样的有效治疗方法的吉非替尼耐受性的EGFR基因突变的非小细胞肺癌患者，能够成为非常有效的抗癌剂。

<实施例8：内源野生型EGFR基因表达抑制引起的副作用的验证>

如上述实施例证明，与本发明的EGFR-siRNA仅特异性地抑制突变型的EGFR基因的表达相比，现有的siRNA不区分野生型和突变型的EGFR基因且强烈地抑制两者的表达。在此，对本发明的EGFR-siRNA和现有的siRNA对小鼠个体给药时的副作用的有无进行验证。

[方法]

在ICR小鼠(雄，10周龄)的腹腔内给药各种siRNA。实验组为分别进行如下给药的共计4组的实验组：不给药siRNA而仅给药去端肽胶原溶液的组(无siRNA)、给药不诱导RNAi的siRNA(siControl；凯杰公司)的组、给药特异性地抑制突变型EGFR基因的表达的si747/49-3D19的组、以及给药在小鼠活体内发现抑制内源野生型EGFR基因的表达的siEgfr的组。这些以与上述实施例7相同的方法进行制备，并在小鼠腹腔内给药。予以说明，将本实施例中设计并使用的siEgfr的具体的碱基序列表示于表11。

[表11]

给药3日后，对各小鼠进行采血，将采集的全血进行离心分离(1200×g，10分钟)并得到血浆。接着，将血浆中的总胆红素、间接胆红素、直接胆红素的含量使用QuantiChrom^TM Bilirubin Assay Kit(BioAssaySystems公司)进行测定，另外将碱性磷酸酶的含量使用LabAssay^TM ALP(和光公司)进行测定。实验操作依据各试剂盒所附的方案。

[结果]

结果表示于图31。关于血浆中的总胆红素(A)、直接胆红素(B)、间接胆红素(C)、和碱性磷酸酶(D)的含量，与无siRNA组和siControl给药组相比，在抑制内源野生型EGFR基因的表达的siEgfr给药组中，观察到了显著的上升。另一方面，在本发明的EGFR-siRNA(si747/49-3D19)给药组中，未观察到显著的变化。该血中参数的显著的上升是以siEgfr的给药引起的内源野生型EGFR的表达被抑制为起因，而且变化的血中参数的数据暗示了肝胆管系统的障碍的引起。另外，内源野生型EGFR基因为肝细胞再生所必需的(Natarajan et al.，2007，ProcNatl Acad Sci USA.，Vol.104：17081-17086)，因此，综上所述暗示内源野生型EGFR基因的表达抑制具有引起严重的副作用的危险性。相对于此，本发明的EGFR-siRNA给药证明了完全不影响血中参数、对内源野生型EGFR基因的表达几乎不产生影响。该结果暗示，本发明的EGFR-siRNA与现有的EGFR-siRNA不同，没有产生上述的肝胆管系统的障碍等的副作用的危险性，或者危险性极低。由此，证明了本发明的显性突变基因的表达抑制剂的RNA干扰技术是有用的。

将本说明书中引用的全部的出版物、专利及专利申请直接作为参考引入本说明书中。

Claims

1.一种显性突变基因的表达抑制剂，含有将ASP得分值为0.4以上的RNAi分子作为有效成分，其中，

所述ASP得分由以下公式算出，

2.一种显性突变基因的表达抑制剂，含有将编码ASP得分值为0.4以上的RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体作为有效成分，其中，

所述ASP得分由以下公式算出，

3.如权利要求1或2所述的抑制剂，其中，在RNAi有义链区域和RNAi反义链区域上进一步附加TT或UU。

4.如权利要求1～3中任一项所述的抑制剂，其中，RNAi分子为siRNA。

5.如权利要求1～4中任一项所述的抑制剂，其中，RNAi分子为shRNA。

6.如权利要求1～5中任一项所述的抑制剂，其中，显性突变基因中的突变从由碱基缺失、碱基插入、破坏剪接位点得到的碱基置换、基因重复、基因易位、以及染色体倒位构成的组中选出。

7.如权利要求1～6中任一项所述的抑制剂，其中，显性突变基因为功能获得型。

8.如权利要求1～7中任一项所述的抑制剂，其中，显性突变基因参与疾病的发病。

9.如权利要求8所述的抑制剂，其中，疾病为恶性新生物。

10.如权利要求9所述的抑制剂，其中，恶性新生物为非小细胞肺癌，且成为其靶的所述显性突变基因为突变型EGFR基因；恶性新生物为大肠癌，且成为其靶的所述显性突变基因为突变型CTNNB1基因；恶性新生物为胃癌，且成为其靶的所述显性突变基因为突变型CDH1基因；恶性新生物为乳腺癌，且成为其靶的所述显性突变基因为突变型BRCA1基因或突变型BRCA2基因；恶性新生物为自身免疫性多内分泌腺病综合征I型，且成为其靶的所述显性突变基因为突变型AIRE基因；恶性新生物为自身免疫性淋巴细胞增生综合征，且成为其靶的所述显性突变基因为突变型TNFRSF6/APT1/FAS基因；恶性新生物为慢性骨髓性白血病或急性淋巴性白血病，且成为其靶的所述显性突变基因为BCR-ABL嵌合基因；恶性新生物为伯基特淋巴瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为c-myc-IgH-嵌合基因；恶性新生物为间变性大细胞淋巴瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为NPM-ALK-嵌合基因；恶性新生物为肺癌，且成为其靶的所述显性突变基因为EML4-ALK-嵌合基因；恶性新生物为隆突性皮肤纤维肉瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为PDGFB-COL1A1嵌合基因；恶性新生物为先天性纤维肉瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为ETV6-NTRK3嵌合基因；恶性新生物为低度恶性纤维粘液性肉瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为FUS-CREB3L2嵌合基因；恶性新生物为骨外黏液样软骨肉瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为EWS-CHN嵌合基因；恶性新生物为尤因肉瘤或促纤维增生性小细胞肿瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为将EWSR1基因作为易位伙伴的嵌合基因；恶性新生物为腺泡状横纹肌肉瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为将SYT基因或SSX基因作为易位伙伴的嵌合基因；恶性新生物为炎性肌纤维母细胞肿瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为将ALK基因作为易位伙伴的嵌合基因；恶性新生物为脂肪肉瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为将CHOP基因作为易位伙伴的嵌合基因；或者恶性新生物为透明细胞肉瘤或恶性纤维组织细胞瘤，且成为其靶的所述显性突变基因为将ATF1基因作为易位伙伴的嵌合基因。

11.如权利要求10所述的抑制剂，其中，恶性新生物为非小细胞肺癌，且成为其靶的所述显性突变基因为突变型EGFR基因。

12.如权利要求11所述的抑制剂，其中，RNAi分子的有义链区域由序列号3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、53、55、59、61、63、65、67、129、131、133、135、137、139、141、143或145所示的核苷酸构成。

13.如权利要求10所述的抑制剂，其中，恶性新生物为慢性骨髓性白血病或急性淋巴性白血病，且成为其靶的所述显性突变基因为BCR-ABL嵌合基因。

14.如权利要求13所述的抑制剂，其中，RNAi分子的有义链区域由序列号97、99、101、103、105、107、109、111或113所示的核苷酸构成。

15.如权利要求8所述的抑制剂，其中，疾病为人常染色体显性突变疾病。

16.如权利要求15所述的抑制剂，其中，人常染色体显性突变疾病为先天性夜盲症，且成为其靶的所述显性突变基因为RHO基因；人常染色体显性突变疾病为耳聋基因区域DFNA2，且成为其靶的所述显性突变基因为KCNQ4基因或GJB基因；人常染色体显性突变疾病为瓦登伯革氏综合征，且成为其靶的所述显性突变基因为MITF基因；人常染色体显性突变疾病为非综合征耳聋，且成为其靶的所述显性突变基因为DIAPH1/DFNA1基因或POU4F3基因；人常染色体显性突变疾病为肥厚型心肌病，且成为其靶的所述显性突变基因为TNNT2基因；人常染色体显性突变疾病为家族性肥厚型心肌病，且成为其靶的所述显性突变基因为MYBPC3基因；人常染色体显性突变疾病为心尖肥厚型心肌病，且成为其靶的所述显性突变基因为TNNI3基因；人常染色体显性突变疾病为腓骨肌萎缩症1A型，且成为其靶的所述显性突变基因为PMP22基因；人常染色体显性突变疾病为腓骨肌萎缩症1B型，且成为其靶的所述显性突变基因为MPZ基因；人常染色体显性突变疾病为长QT综合征，且成为其靶的所述显性突变基因为KCNQ1基因或KCNH2基因或SCN5A基因或ANK2基因或KCNE1基因或KCNE2基因或KCNJ2或CAV3基因或SCN48或AKAP9基因或ANTA1基因；人常染色体显性突变疾病为短QT综合征，且成为其靶的所述显性突变基因为KCNH2基因或KCNJ2基因；人常染色体显性突变疾病为布鲁格达氏综合征，且成为其靶的所述显性突变基因为SCN5A基因或GPD1L基因或CACNA1C基因或CACNB2B或SCN1B基因；人常染色体显性突变疾病为儿荼酚胺敏感型多形性室速，且成为其靶的所述显性突变基因为RYR2基因；人常染色体显性突变疾病为心脏传导障碍，且成为其靶的所述显性突变基因为SCN5A基因或SCN1B基因；人常染色体显性突变疾病为肌萎缩侧索硬化症，且成为其靶的所述显性突变基因为TDP43基因；人常染色体显性突变疾病为奴南氏综合征，且成为其靶的所述显性突变基因为PTPN11基因；或者人常染色体显性突变疾病为低钙血症，且成为其靶的所述显性突变基因为CaR基因。

17.如权利要求8所述的抑制剂，其中，疾病为强直性肌营养不良，且成为其靶的所述显性突变基因为DMPK基因；疾病为脊髓性肌萎缩症，且成为其靶的所述显性突变基因为SMN1基因；疾病为先天性肌无力综合征，且成为其靶的所述显性突变基因为CHRNE基因；疾病为额颞痴呆症，且成为其靶的所述显性突变基因为MAPT基因；或者疾病为单纯性生长激素缺乏症II型，且成为其靶的所述显性突变基因为GH1基因。

18.一种药物组合物，至少含有一种权利要求1～17中任一项所述的抑制剂作为有效成分。

19.如从属于权利要求11或12的权利要求18所述的药物组合物，进一步含有有义链区域由序列号83或85所示的核苷酸构成的RNAi分子、和/或将编码其核苷酸的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体，以及/或者有义链区域由序列号89所示的核苷酸构成的RNAi分子、和/或将编码该RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体作为有效成分。

20.一种点突变型EGFR基因表达抑制剂，含有有义链区域由序列号89所示的核苷酸构成的RNAi分子、和/或将编码该RNAi分子的DNA以可工作的方式连接而成的表达载体。

21.一种选择性地抑制在转录产物上具有不连续接合点的显性突变基因的表达的RNAi分子的设计方法，其中，包括：

(c)在所述显性突变基因中，将含有包括其转录产物的第1和第2基准碱基的连续的16～30个碱基的碱基序列作为RNAi有义链区域进行设定的工序；

22.一种如权利要求21所述的设计方法，其中，进一步含有(e)将ASP得分值为0.4以上的RNAi分子进行筛选的工序，

所述ASP得分由以下公式算出，

23.如权利要求21或22所述的抑制剂，其中，在RNAi有义链区域和RNAi反义链区域上进一步附加TT或UU。