CN116162650B - 一种带荧光标签RyR2突变质粒的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种带荧光标签RyR2突变质粒的构建方法及其应用。所述带荧光标签RyR2突变质粒是在RyR2突变蛋白表达质粒中的RyR2突变基因的第2801位核苷酸和第2802位核苷酸之间插入荧光标签序列后得到的质粒；所述RyR2突变蛋白表达质粒是将RyR2野生型蛋白表达质粒中的RyR2野生型基因进行突变后得到的质粒；所述RyR2突变蛋白为将鼠源的RyR2野生型蛋白氨基酸序列第1761位的精氨酸突变为色氨酸后得到的蛋白或人源的RyR2野生型蛋白氨基酸序列第1760位的精氨酸突变为色氨酸后得到的蛋白。本发明为RyR2研究提供了方法学保障，对研究心血管疾病中RyR2的病理生理机制具有重要意义。

Description

一种带荧光标签RyR2突变质粒的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种带荧光标签RyR2突变质粒的构建方法及其应用。
背景技术
Ryanodine Receptor 2(RyR2)是心肌细胞兴奋收缩耦联的重要离子通道蛋白，由四个足状结构的亚单位组成的同源四聚体，形成一个大的四叶草状结构，横跨心肌细胞肌浆网之间的间隙，是迄今为止发现的肌浆网膜上最大的离子通道。RyR2在介导心肌细胞Ca2+流中发挥非常关键的作用，其调控机制十分复杂，RyR2功能障碍造成的钙外流阈值改变导致钙异常释放是引起致死性心律失常和心力衰竭的病理基础。RyR2的基因突变、结构改变、功能障碍或与相关蛋白的相互作用异常均可造成RyR2受体的钙释放阈值降低，引起肌浆网钙异常释放，诱发或加重多种心脏疾病。
儿茶酚胺敏感性多形性室速(catecholaminergic polymorphic ventriculartachycardia，CPVT)是一种遗传离子通道疾病，是年轻人猝死的主要原因之一，约60％CPVT患者携带RyR2基因突变。心房颤动是临床上最常见的心律失常，其发病机制十分复杂，当心房颤动发生时，RyR2功能改变，其介导的自发性钙释放增加，并引起持续性心房颤动。心力衰竭是各种心脏疾病导致心功能不全的一种综合征，绝大多数情况下指心肌收缩力下降使心排血量不能满足机体静脉回流及身体组织代谢的需要，并由此产生一系列症状和体征。心力衰竭是一个慢性的高肾上腺素能状态，RyR2过磷酸化使通道开放性增强，肌浆网钙异常释放，导致后续的心脏收缩异常和心律失常发生。在心力衰竭患者的心脏中，RyR2过磷酸化导致通道功能丧失。
由于RyR2参与了多种心脏疾病的发生，包括心律失常、心肌肥厚和心力衰竭等，针对RyR2的分子学、细胞学、动物学研究一直是心脏疾病研究的热点，因此，在体外实验过程中构建表达RyR2突变的细胞是RyR2相关疾病基础研究的重要基础。然而鉴于RyR2蛋白分子量非常大，具有独特的表达特点，构建表达RyR2突变的质粒难度系数非常高。目前国内只有少数实验室具有构建RyR2质粒的能力，国内众多研究者只能通过国外团队馈赠的方式对RyR2进行研究，因此，探索出RyR2质粒的构建方法对国内RyR2相关疾病的研究发展至关重要。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的质粒。
本发明提供的表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的质粒是在RyR2突变蛋白表达质粒中的RyR2突变基因的第2801位核苷酸和第2802位核苷酸之间插入荧光标签序列后得到的质粒；
所述RyR2突变蛋白表达质粒是将RyR2野生型蛋白表达质粒中的RyR2野生型基因进行突变后得到的质粒；
所述RyR2突变蛋白为将鼠源的RyR2野生型蛋白(mRyR2野生型蛋白)氨基酸序列第1761位的精氨酸(R)突变为色氨酸(W)后得到的蛋白或将人源的RyR2野生型蛋白(hRyR2野生型蛋白)氨基酸序列第1760位的精氨酸(R)突变为色氨酸(W)后得到的蛋白。由于RyR2基因序列在不同种属中高度保守，hRyR2野生型蛋白第1760位氨基酸位点相当于mRyR2野生型蛋白第1761位氨基酸位点。
当所述RyR2野生型蛋白为hRyR2野生型蛋白时，所述RyR2突变蛋白为将hRyR2野生型蛋白氨基酸序列第1760位的精氨酸(R)突变为色氨酸(W)后得到的蛋白(human R1760W-RyR2，hR1760W-RyR2)。
当所述RyR2野生型蛋白为mRyR2野生型蛋白时，所述RyR2突变蛋白为将mRyR2野生型蛋白氨基酸序列第1761位的精氨酸(R)突变为色氨酸(W)后得到的蛋白(mouse R1761W-RyR2，mR1761W-RyR2)。
在本发明的具体实施例中，所述RyR2野生型蛋白为mRyR2野生型蛋白。所述mRyR2野生型蛋白氨基酸序列在NCBI中的GenBank号为AF295105。所述RyR2突变型蛋白为mR1761W-RyR2蛋白。
所述RyR2野生型基因为mRyR2野生型基因。所述mRyR2野生型基因的核苷酸序列在NCBI中的GenBank号为AF295105。所述RyR2突变基因为将mRyR2野生型基因第5281位的胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)后得到的基因。
上述质粒中，所述RyR2野生型蛋白表达质粒可为任一种含有RyR2野生型基因(如mRyR2野生型基因)的表达质粒，具体可为mRyR2-pcDNA5质粒。
上述质粒中，所述荧光标签序列可为各种常见的荧光标签序列(如mcherry序列)，具体可为序列表中序列5所示的包含gly-linker的mcherry序列。
本发明的另一个目的是提供上述质粒的构建方法。
本发明提供的上述质粒的构建方法包括如下步骤：
a1)以RyR2野生型蛋白表达质粒为模板，采用引物P1f和引物P1rm进行PCR扩增，得到PCR产物P1；以所述RyR2野生型蛋白表达质粒为模板，采用引物P2fm和引物P2r进行PCR扩增，得到PCR产物P2；
所述引物P1f为序列表中序列1所示的单链DNA分子；
所述引物P1rm为序列表中序列2所示的单链DNA分子；
所述引物P2fm为序列表中序列3所示的单链DNA分子；
所述引物P2r为序列表中序列4所示的单链DNA分子；
a2)以所述PCR产物P1和所述PCR产物P2为模板，采用所述引物P1f和所述P2r进行PCR扩增，得到PCR产物P3；
a3)用ClaI和BsiWI限制性内切酶对所述RyR2野生型蛋白表达质粒进行酶切反应，得到RyR2野生型蛋白表达质粒酶切物；用ClaI和BsiWI限制性内切酶对所述PCR产物P3进行酶切反应，得到P3酶切物；
a4)将所述RyR2野生型蛋白表达质粒酶切物和所述P3酶切物连接，得到RyR2突变蛋白表达质粒；
a5)以所述RyR2突变蛋白表达质粒为模板，采用引物F1和引物R1进行PCR扩增，得到RyR2分段扩增产物甲；以所述RyR2突变蛋白表达质粒为模板，采用引物F2和引物R2进行PCR扩增，得到RyR2分段扩增产物乙；
所述引物F1为序列表中序列6所示的单链DNA分子；
所述引物R1为序列表中序列7所示的单链DNA分子；
所述引物F2为序列表中序列8所示的单链DNA分子；
所述引物R2为序列表中序列9所示的单链DNA分子；
a6)将荧光标签序列、所述RyR2分段扩增产物甲和所述RyR2分段扩增产物乙进行无缝克隆连接，得到所述表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的质粒。
上述方法中，所述RyR2野生型蛋白表达质粒可为任一种含有RyR2野生型基因(如mRyR2野生型基因)的表达质粒，具体可为mRyR2-pcDNA5质粒。
上述方法中，所述荧光标签序列可为各种常见的荧光标签序列(如mcherry序列)，具体可为序列表中序列5所示的包含gly-linker的mcherry序列。
本发明又有一个目的是提供成套引物组或含有所述成套引物组的成套试剂。
所述成套引物组由序列表中序列1所示的单链DNA分子、序列表中序列2所示的单链DNA分子、序列表中序列3所示的单链DNA分子、序列表中序列4所示的单链DNA分子、序列表中序列6所示的单链DNA分子、序列表中序列7所示的单链DNA分子、序列表中序列8所示的单链DNA分子和序列表中序列9所示的单链DNA分子组成；
所述成套试剂由上述成套引物组、上述RyR2野生型蛋白表达质粒、ClaI限制性内切酶、BsiWI限制性内切酶和上述荧光标签序列组成。
上述成套试剂中，所述RyR2野生型蛋白表达质粒可为任一种含有RyR2野生型基因(如mRyR2野生型基因)的表达质粒，具体可为mRyR2-pcDNA5质粒。
上述成套试剂中，所述荧光标签序列可为各种常见的荧光标签序列(如mcherry序列)，具体可为序列表中序列5所示的包含gly-linker的mcherry序列。
本发明还有一个目的是提供上述质粒或按照上述方法制备得到的质粒或上述成套引物组或上述成套试剂的新用途。
本发明提供了上述质粒或按照上述方法制备得到的质粒或上述成套引物组或上述成套试剂在如下A1)-A6)任一种中的应用：
A1)构建表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的细胞；
A2)研究RyR2相关疾病；
A3)筛选预防和/或治疗RyR2相关疾病的药物；
A4)制备构建表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的细胞的产品；
A5)制备研究RyR2相关疾病的产品；
A6)制备筛选预防和/或治疗RyR2相关疾病的药物的产品。
本发明最后一个目的是提供一种表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的细胞。
本发明提供的表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的细胞是将上述质粒或按照上述方法制备得到的质粒导入生物细胞后得到的。
上述生物细胞具体可为HEK293细胞。
上述表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的细胞在如下C1)-C4)任一种中的应用也属于本发明的保护范围：
C1)研究RyR2相关疾病；
C2)筛选预防和/或治疗RyR2相关疾病的药物；
C3)制备研究RyR2相关疾病的产品；
C4)制备筛选预防和/或治疗RyR2相关疾病的药物的产品。
上述任一所述应用中，所述RyR2相关疾病为与RyR2突变相关或由RyR2突变导致的疾病，包括但不限于儿茶酚胺敏感性室性心动过速、致心律失常右室心肌病、心房颤动、心力衰竭等。所述RyR2相关疾病具体可为由RyR2蛋白(hRyR2野生型蛋白)第1760位的精氨酸突变为色氨酸导致的儿茶酚胺敏感性多形性室速(CPVT)。
本发明首次构建获得表达RyR2突变蛋白R1760W-RyR2的RyR2突变质粒，进一步的，为了便于在细胞表达过程中对RyR2突变蛋白表达水平进行评估和筛选，采用无缝连接技术使其具有表达红色荧光的功能，构建获得带荧光标签RyR2突变质粒。本发明中的带荧光标签RyR2突变质粒及其构建方法不仅为RyR2研究提供了方法学保障，也为RyR2相关疾病的诊疗提供新的思路，对研究心血管疾病中RyR2的病理生理机制具有重要意义。
附图说明
图1为Sanger测序验证hR1760W突变。
图2为倒置荧光显微镜下观察HEK293细胞成功表达红色荧光的mR1761W-RyR2蛋白。
图3为RyR2在HEK293细胞中的蛋白表达。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的mRyR2-pcDNA5质粒即为文献“Gong D,Chi X,Wei J,etal.Modulation of cardiac ryanodine receptor 2by calmodulin.Nature 2019；572:347-351.DOI:10.1038/s41586-019-1377-y.”中的RyR2-pcDNA5质粒。
本发明中的RyR2突变型蛋白hR1760W-RyR2是北京清华长庚医院在疾病管理过程中发现的一例具有猝死临床表型的CPVT患者携带的一个在非RyR2突变热点区域发生的结构变异较大的RyR2突变型蛋白，其为将RyR2野生型蛋白(人源的RyR2野生型蛋白，hRyR2野生型蛋白)氨基酸序列第1760位的精氨酸(R)突变为色氨酸(W)后得到的蛋白。
由于hRyR2野生型蛋白氨基酸序列第1760位氨基酸位点相当于来源于小鼠的RyR2野生型蛋白(mRyR2野生型蛋白)氨基酸序列第1761位氨基酸位点，将mRyR2野生型蛋白氨基酸序列第1761位的精氨酸(R)突变为色氨酸(W)后得到的蛋白记作RyR2突变型蛋白mR1761W-RyR2。
mRyR2野生型蛋白的氨基酸序列(大小为4967aa)在NCBI中的GenBank号为AF295105。mRyR2突变基因为将mRyR2野生型基因第5281位的胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)后得到的基因。mRyR2野生型基因的核苷酸序列(大小为14904bp)在NCBI中的GenBank号为AF295105。
实施例1、RyR2带荧光标签突变质粒的构建方法
本发明首先通过重叠延伸PCR法构建表达RyR2突变型蛋白mR1761W-RyR2的突变质粒mR1761W-RyR2，并进一步在mR1761W-RyR2突变质粒基础上进行技术创新通过无缝克隆法构建具有荧光表达功能的荧光质粒mR1761W-RyR2-2801mcherry，以便在细胞表达过程中进行表达水平的评估和筛选。具体实验方法如下：
一、重叠延伸PCR法构建mR1761W-RyR2突变质粒
本发明通过重叠延伸PCR法将野生型mRyR2-pcDNA5质粒中的mRyR2野生型基因进行突变，得到表达RyR2突变型蛋白mR1761W-RyR2的mR1761W-RyR2突变质粒。
1、根据mRyR2突变位点和mRyR2突变位点附近的限制性内切酶位点，设计用于重叠延伸PCR法构建mR1761W-RyR2突变质粒的引物。最终选择在距离mRyR2突变位点最近的限制性内切酶ClaI(上游)和BsiWI(下游)并设计了如下4条引物：
P1f：5’-CAATATCGATGGCCTGTTCTTTCCAGTTG-3’(序列1)；
P1rm：5’-CGCATCCAAGGCCGGAGGGAGGTGCTAAGGCCTATG-3’(序列2)；
P2fm：5’-CACCTCCCTCCGGCCTTGGATGCGCTTTTCCTCCCCGAG-3’(序列3)；
P2r：5’-TGCTCGTACGGGAAGTGTTCTCCTTTG-3’(序列4)。
2、根据重叠延伸PCR的原则进行第一步反应，第一步反应包括PCR反应1和PCR反应2。
PCR反应1：以野生型mRyR2-pcDNA5质粒为模板，采用引物P1f和P1rm进行PCR扩增，得到PCR产物P1。
PCR反应2：以野生型mRyR2-pcDNA5质粒为模板，采用引物P2fm和P2r进行PCR扩增，得到PCR产物P2。
PCR反应体系见表1，反应条件见表2。
表1、重叠延伸PCR反应第一步反应体系
表2、重叠延伸PCR反应第一步反应条件
3、分别将第一步反应的PCR产物P1和PCR产物P2进行琼脂糖凝胶(1％)电泳，切下目标条带P1和P2。
4、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收提纯PCR产物P1和PCR产物P2。具体步骤如下：称取切下凝胶块的重量并转移到1.5mL EP管中。按100mg凝胶块相当100μL体积计算，加入3倍体积Buffer GDP。将凝胶块在55℃水浴10分钟，颠倒混匀数次加速溶胶，至凝胶块完全溶解。将HiPure DNAMini Column套在1.5mLEP管上，将溶胶液转移至柱子中，12000g离心60秒，倒弃滤液，把柱子套回1.5mL EP管中。向柱子中加入Buffer GDP 300μL，室温静置1分钟，12000g离心60秒，倒弃滤液，把柱子套回1.5mL EP管中。向柱子中加入已用无水乙醇稀释的Buffer DW2 600μL，12000g离心60秒，倒弃滤液，把柱子套回1.5mL EP管中。再次进行12000g离心2分钟，打开盖子，空气干燥5分钟以彻底去除乙醇。把柱子套在1.5mL EP管中，加入15-30μL Elution Buffer至柱子膜中央，室温放置2分钟，12000g离心1分钟，DNA保存于-20℃。
5、根据重叠延伸PCR原则进行第二步反应，得到第二步反应的产物(PCR产物P3)。PCR反应体系见表3，PCR反应条件见表4。
表3、重叠延伸PCR反应第二步反应体系
表4、重叠延伸PCR反应第二步反应条件
6、将第二步反应的PCR产物P3进行琼脂糖凝胶(1％)电泳，切下目标条带P3。
7、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(美基生物)回收提纯PCR产物P3。
8、用ClaI(NEB，#R0197S)和BsiWI(NEB，#R3553L)限制性内切酶对野生型mRyR2-pcDNA5质粒进行酶切反应，得到野生型mRyR2-pcDNA5质粒酶切物，用ClaI和BsiWI限制性内切酶对PCR产物P3进行酶切反应，得到P3酶切物。
酶切反应体系及条件见表5。
表5、ClaI和BsiWI酶切反应体系及条件
ClaI酶(10000units/mL) 1μL
BsiWI酶(10000units/mL) 1μL
DNA 1μg
10X NEB buffer(NEB) 5μL
灭菌水 补足50μL
反应温度 37℃
反应时间 15min
9、将酶切反应的产物进行琼脂糖凝胶(1％)电泳，切下目标条带并通过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收提纯。
10、T4连接酶(NEB，#M0202V)将野生型mRyR2-pcDNA5质粒酶切物(大小为13263bp)和P3酶切物(大小为6742bp)连接，得到mR1761W-RyR2突变质粒。
连接反应体系见表6，连接反应条件见表7。
表6、T4连接酶反应体系
反应体系 反应条件
载体 野生型mRyR2-pcDNA5质粒酶切物(50ng)
目的基因 P3酶切物(160.2ng)
无核酶水 补足50μL
T4连接酶 1μL
表7、T4连接酶反应条件
反应温度 26℃
反应时间 10min
终止条件 65℃10min
二、mR1761W-RyR2-C-mcherry荧光质粒和mR1761W-RyR2-2801mcherry荧光质粒的构建
(一)mR1761W-RyR2-C-mcherry荧光质粒的构建
在mR1761W-RyR2突变质粒中的RyR2突变基因的C端插入mcherry序列，得到mR1761W-RyR2-C-mcherry荧光质粒。具体步骤如下：
1、以pLV-mcherry(addgene，Plasmid#36084)为模版，采用引物F’和引物R’进行PCR扩增，得到PCR产物，即为NotI-mcherry序列(序列10)，NotI-mcherry序列为在mcherry序列两端加入NotI酶切引物序列后得到的序列。引物序列如下：
F’：5’-ATATAGCGGCCGCATGGTGAGCAAGGG-3’；
R’：5’-TCGCGGCCGCTTTCTTGTACAGCTCGTC-3’。
PCR反应体系见表8，反应条件见表9。
表8、PCR反应体系
表9、PCR反应条件
温度 时间 循环次数
98℃ 10sec 30
60℃ 15sec 30
68℃ 60sec 30
2、将PCR产物进行琼脂糖凝胶(1％)电泳确认条带分子量，并通过DNA回收试剂盒回收提纯。
3、将NotI(NEB，#R0189S)限制性内切酶对步骤1中的PCR产物(NotI-mcherry序列)进行酶切，得到NotI-mcherry酶切产物；将NotI(NEB，#R0189S)限制性内切酶对mR1761W-RyR2突变质粒进行酶切，得到mR1761W-RyR2酶切产物，并通过DNA回收试剂盒回收提纯。
NotI酶切反应体系及条件见表10。
表10、NotI酶切反应体系及条件
4、用T4连接酶将步骤3中回收的NotI-mechrry酶切产物和mR1761W-RyR2酶切产物进行连接反应，得到mR1761W-RyR2-C-mcherry。
连接反应体系和条件见表11。
表11、T4连接反应体系及条件
(二)mR1761W-RyR2-2801mcherry荧光质粒的构建
在mR1761W-RyR2突变质粒中的RyR2Y2801位点插入包含gly-linker的mcherry序列，得到具有荧光表达功能的mR1761W-RyR2-2801mcherry荧光质粒。具体步骤如下：
1、以pLV-mcherry(addgene，Plasmid#36084)为模版采用引物F和R进行PCR扩增，得到PCR产物，即为包含gly-linker的mcherry序列(序列5)。引物序列如下：
F：5’-GGGACAGCATGGCCCTTTATGGTGGAGGTGGAAGTGGAGGTGGAGGTACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3’；
R：5’-GAAATTCGTCGAGTCCGGTTACCACCTCCTCCAGATCCTCCACCACCCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’。
PCR反应体系见表12，反应条件见表13。
表12、PCR反应体系
表13、PCR反应条件
温度 时间 循环次数
98℃ 10sec 30
60℃ 15sec 30
68℃ 60sec 30
2、将PCR产物进行琼脂糖凝胶(1％)电泳确认条带分子量，并通过DNA回收试剂盒回收提纯(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，美基生物)。
3、以野生型mRyR2-pcDNA5质粒为模板，采用引物F1和R1进行PCR扩增，得到RyR2分段扩增产物1；以mR1761W-RyR2突变质粒为模板，采用引物F1和R1进行PCR扩增，得到RyR2分段扩增产物1’。PCR反应体系见表14，PCR反应条件见表16。
以野生型mRyR2-pcDNA5质粒为模板，采用引物F2和R2进行PCR扩增，得到RyR2分段扩增产物2；以mR1761W-RyR2突变质粒为模板，采用引物F2和R2进行PCR扩增，得到RyR2分段扩增产物2’。PCR反应体系见表15，PCR反应条件见表16。
引物序列如下：
F1：5’-AACCGGACTCGACGAATTTC-3’(序列6)；
R1：5’-ATCATGTAACTCGCCTTGAT-3’(序列7)；
F2：5’-ATCAAGGCGAGTTACATGAT-3’(序列8)；
R2：5’-ATAAAGGGCCATGCTGTCCC-3’(序列9)。
表14、PCR反应体系
表15、PCR反应体系
表16、PCR反应条件
将PCR产物进行琼脂糖凝胶(1％)电泳确认条带分子量，并通过DNA回收试剂盒回收提纯(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，美基生物)。
4、将步骤1中的PCR产物(包含gly-linker的mcherry序列)、RyR2分段扩增产物1、RyR2分段扩增产物2进行无缝克隆连接，得到荧光质粒WT-RyR2-2801mcherry。
将步骤1中的PCR产物(包含gly-linker的mcherry序列)、RyR2分段扩增产物1’、RyR2分段扩增产物2’进行无缝克隆连接，得到荧光质粒mR1761W-RyR2-2801mcherry。
连接反应体系见表17，连接条件见表18。
表17、连接反应体系
表18、连接反应条件
反应温度 50℃
反应时间 60min
5、将荧光质粒WT-RyR2-2801mcherry和mR1761W-RyR2-2801mcherry在大肠杆菌中进行热激法转化，将菌液涂布于氨苄青霉素抗性的circlegrow固体培养基中生长，待长出菌斑后进行单克隆挑菌并在氨苄青霉素抗性的circlegrow液体培养基中过夜培养至呈现浑浊状态。浑浊菌液通过无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒并进行浓度测定，将高纯度质粒进行sanger测序验证。测序结果如图1所示。
测序结果表明：荧光质粒WT-RyR2-2801mcherry为在野生型mRyR2-pcDNA5质粒中的RyR2Y2801位点(即mRyR2突变基因第2801位核苷酸和第2802位核苷酸之间)插入包含gly-linker的mcherry序列后得到具有荧光表达功能且表达mRyR2野生型蛋白的质粒。
荧光质粒mR1761W-RyR2-2801mcherry为在mR1761W-RyR2突变质粒中的mRyR2Y2801位点(即mRyR2突变基因第2801位核苷酸和第2802位核苷酸之间)插入包含gly-linker的mcherry序列，得到具有荧光表达功能且表达RyR2突变型蛋白mR1761W-RyR2的质粒。
实施例2、RyR2突变型蛋白mR1761W-RyR2的瞬时表达
分别将实施例1中的mR1761W-RyR2-C-mcherry荧光质粒、WT-RyR2-2801mcherry荧光质粒和mR1761W-RyR2-2801mcherry荧光质粒在HEK293细胞中进行瞬时转染。具体步骤如下：
1、将HEK293细胞培养于3.5cm培养皿或6孔培养板内，在铺板后1-2天内生长到60-70％融合度为宜。
2、在转染前30-60分钟，吸去细胞培养液，加入新鲜的不含抗生素的完全培养液(DMEM，Hyclone)2mL。
3、取2-6μg荧光质粒加入到100μL CaCl2溶液(碧云天磷酸钙法细胞转染试剂盒)中，混匀，得到DNA-CaCl2溶液。
4、将DNA-CaCl2溶液加入到100μL BBS溶液(碧云天磷酸钙法细胞转染试剂盒)中，混匀，室温孵育10-20分钟，得到DNA-CaCl2-BBS混合物。
5、将DNA-CaCl2-BBS混合物均匀滴加到3.5cm培养皿或6孔培养板内。在含5％二氧化碳的37℃细胞培养箱内培养。
6、在4-10小时后轻轻晃动培养板数次以充分悬浮一些磷酸钙沉淀，吸去含磷酸钙沉淀的培养液，加入2mL新鲜的完全培养液，继续培养。
7、通过荧光显微镜观察，并计算转染效率。转染效率＝(荧光细胞/全部细胞)×100％。
结果表明：结果表明：mR1761W-RyR2-C-mcherry荧光质粒瞬时转染HEK293细胞后无红色荧光表达，说明mR1761W-RyR2-C-mcherry质粒无法在HEK293细胞中同时表达mRyR2突变型蛋白和mcherry荧光蛋白。而WT-RyR2-2801mcherry和mR1761W-RyR2-2801mcherry质粒通过瞬时转染HEK293细胞后显示红色荧光(图2)，转染效率约为60％；且通过Western blot方法检测表明WT-RyR2-2801mcherry和mR1761W-RyR2-2801mcherry成功表达于HEK293细胞(图3)。以上结果说明只有在特定的RyR2基因位点插入荧光序列，才能在不影响RyR2蛋白功能的前提下使其携带荧光表达功能。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (13)

1.一种表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的质粒，所述质粒是在RyR2突变蛋白表达质粒中的RyR2突变基因的第2801位核苷酸和第2802位核苷酸之间插入荧光标签序列后得到的质粒；
所述RyR2突变蛋白表达质粒是将RyR2野生型蛋白表达质粒中的RyR2野生型基因进行突变后得到的质粒；
所述RyR2突变蛋白为将鼠源的RyR2野生型蛋白氨基酸序列第1761位的精氨酸突变为色氨酸后得到的蛋白；
所述RyR2野生型基因的核苷酸序列在NCBI中的GenBank号为AF295105。
2.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于：所述RyR2突变基因为将RyR2野生型基因第5281位的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶后得到的基因。
3.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于：所述荧光标签序列为序列表中序列5所示的DNA分子。
4.根据权利要求1所述的质粒，其特征在于：所述RyR2野生型蛋白表达质粒为mRyR2-pcDNA5质粒。
5.权利要求1-4任一所述质粒的构建方法，包括如下步骤：
a1）以RyR2野生型蛋白表达质粒为模板，采用引物P1f和引物P1rm进行PCR扩增，得到PCR产物P1；以所述RyR2野生型蛋白表达质粒为模板，采用引物P2fm和引物P2r进行PCR扩增，得到PCR产物P2；
所述引物P1f为序列表中序列1所示的单链DNA分子；
所述引物P1rm为序列表中序列2所示的单链DNA分子；
所述引物P2fm为序列表中序列3所示的单链DNA分子；
所述引物P2r为序列表中序列4所示的单链DNA分子；
a2）以所述PCR产物P1和所述PCR产物P2为模板，采用所述引物P1f和所述P2r进行PCR扩增，得到PCR产物P3；
a3）用ClaI和BsiWI限制性内切酶对所述RyR2野生型蛋白表达质粒进行酶切反应，得到RyR2野生型蛋白表达质粒酶切物；用ClaI和BsiWI限制性内切酶对所述PCR产物P3进行酶切反应，得到P3酶切物；
a4）将所述RyR2野生型蛋白表达质粒酶切物和所述P3酶切物连接，得到RyR2突变蛋白表达质粒；
a5）以所述RyR2突变蛋白表达质粒为模板，采用引物F1和引物R1进行PCR扩增，得到RyR2分段扩增产物甲；以所述RyR2突变蛋白表达质粒为模板，采用引物F2和引物R2进行PCR扩增，得到RyR2分段扩增产物乙；
所述引物F1为序列表中序列6所示的单链DNA分子；
所述引物R1为序列表中序列7所示的单链DNA分子；
所述引物F2为序列表中序列8所示的单链DNA分子；
所述引物R2为序列表中序列9所示的单链DNA分子；
a6）将荧光标签序列、所述RyR2分段扩增产物甲和所述RyR2分段扩增产物乙进行无缝克隆连接，得到所述表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的质粒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述荧光标签序列为序列表中序列5所示的DNA分子。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述RyR2野生型蛋白表达质粒为mRyR2-pcDNA5质粒。
8.成套引物组或成套试剂，所述成套引物组由序列表中序列1所示的单链DNA分子、序列表中序列2所示的单链DNA分子、序列表中序列3所示的单链DNA分子、序列表中序列4所示的单链DNA分子、序列表中序列6所示的单链DNA分子、序列表中序列7所示的单链DNA分子、序列表中序列8所示的单链DNA分子和序列表中序列9所示的单链DNA分子组成；
所述成套试剂由所述成套引物组、RyR2野生型蛋白表达质粒、ClaI限制性内切酶、BsiWI限制性内切酶和荧光标签序列组成。
9.根据权利要求8所述的成套引物组或成套试剂，其特征在于：所述荧光标签序列为序列表中序列5所示的DNA分子。
10.根据权利要求8所述的成套引物组或成套试剂，其特征在于：所述RyR2野生型蛋白表达质粒为mRyR2-pcDNA5质粒。
11.权利要求1-4任一所述的质粒或按照权利要求5-7任一所述方法制备得到的质粒或权利要求8-10任一所述的成套引物组或成套试剂在如下A1）-A6）任一种中的应用：
A1）构建表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的细胞；
A2）研究RyR2相关疾病；
A3）筛选预防和/或治疗RyR2相关疾病的药物；
A4）制备构建表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的细胞的产品；
A5）制备研究RyR2相关疾病的产品；
A6）制备筛选预防和/或治疗RyR2相关疾病的药物的产品；
所述RyR2相关疾病包括由RyR2突变导致的儿茶酚胺敏感性室性心动过速、致心律失常右室心肌病、心房颤动、心力衰竭。
12.一种表达带荧光标签的RyR2突变蛋白的细胞，是将权利要求1-4任一所述的质粒或按照权利要求5-7任一所述方法制备得到的质粒导入生物细胞后得到的。
13.权利要求12所述的细胞在如下C1）-C4）任一种中的应用：
C1）研究RyR2相关疾病；
C2）筛选预防和/或治疗RyR2相关疾病的药物；
C3）制备研究RyR2相关疾病的产品；
C4）制备筛选预防和/或治疗RyR2相关疾病的药物的产品；
所述RyR2相关疾病包括由RyR2突变导致的儿茶酚胺敏感性室性心动过速、致心律失常右室心肌病、心房颤动、心力衰竭。
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