CN104540847A - 钙调蛋白基因中的突变 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码至少一部分钙调蛋白的经分离的多核苷酸和包含至少一部分钙调蛋白的经分离的多肽，其中所述多核苷酸和多肽包含与心脏失调相关的至少一个突变。本发明还涉及用于确定个体是否具有增加的罹患心脏失调的风险的方法、用于诊断心脏失调的方法、用于治疗患有心脏失调的个体的方法、用于鉴定能够增强钙调蛋白与兰尼碱受体2的结合的化合物的方法和这样的化合物在治疗具有心脏失调的个体中的用途。本发明还提供了可以用于检测钙调蛋白编码基因中的具体突变的试剂盒。

Description

钙调蛋白基因中的突变
发明领域
本发明涉及编码至少一部分钙调蛋白的经分离的多核苷酸和包含至少一部分钙调蛋白的经分离的多肽，其中所述多核苷酸和多肽包含与心脏失调相关的至少一个突变。本发明还涉及用于确定个体是否具有增加的罹患心脏失调的风险的方法、用于诊断心脏失调的方法、用于治疗具有心脏失调的个体的方法、用于鉴定能够增强钙调蛋白与兰尼碱(ryanodine)受体2结合的化合物的方法和这样的化合物在治疗具有心脏失调的个体中的用途。本发明还提供了可以用于检测钙调蛋白编码基因中的具体突变的试剂盒。
发明背景
由于心肌壁中的电障碍(electrical malfunction)而引起毫无预兆的心脏骤停(cardiac arrest)是众所周知的和令人恐惧的心脏事件。其原因可能是心脏的一些潜在的功能性疾病。一个实例为导致这种致命发病的心脏中电脉冲传导中的先天性或获得性障碍，其是全世界每年超过700万死亡人数(在美国30万)的原因。然而，在没有先天性心脏病(CHD)或心肌病的情况下，这些病例中的5％至10％发生心脏性猝死(sudden cardiacdeath，SCD)。
在过去二十年间，已经鉴定了一组基因遗传的异常(“通道病”)(Campuzano,O.等人,Genet Med.2010May；12(5):260-7)，如长QT综合征(LQTS)、短QT综合征(SQTS)、Brugada综合征和儿茶酚胺能VT(CPVT)，其可以在心脏中没有明显结构性变化的情况下加速SCD。
原型心脏通道病(Prototype cardiac channelopathy)的特点在于延迟的心肌复极化、QT延长和晕厥、癫痫发作的临床风险的增加，心脏性猝死在文献中被频繁地描述并且现在被理解为众多的由基本的心脏离子通道中的突变引起的与基因相关的不同心律失常性心血管失调，所述基本的心脏离子通道统筹人心脏的动作电位(Vincent等人,N.Engl.J.Med.,327:846-852(1992)；Moss and Robinson,Ann.N.Y.Acad.Sci.,644:103-111(1992)；和Ackerman,Mayo Clin.Proc.,73:250-269(1998))。负责心肌收缩所需钙的释放的钾和钠通道、锚蛋白B以及肌质网的兰尼碱2受体(RyR2)中的异常可以扰乱心脏的正常电过程，造成威胁生命的室性心律失常。因此，遗传信息逐渐进入临床实践并被纳入受遗传的致心律失常性失调影响的患者的危险分层方案中。
如今，已经发现了几百个引起LQTS的突变并且75％的临床上稳健(clinically-robust)的LQTS可以用在三个编码关键离子通道亚单位的基因中可鉴别的致病突变从基因上阐明(Splawski等人,Circulation,102:1178-1185(2000)和Tester等人,Heart Rhythm,2:507-517(2005)):KCNQ1/KVLQT1(LQT1；Wang等人,Nat.Genet.,12:17-23(1996)),KCNH2/HERG(LQT2；Curran等人,Cell,80:795-803(1995))，SCN5A(LQT3；Wang等人,Cell,80:805-811(1995))。
特发性室性心动过速(VT)是在无结构性心脏病的患者中观察到的心律失常。根据ECG特征，其可以被分类为单形性VT和多形性VT，后者包括许多罕见的、通常恶性的家族性疾病，包括儿茶酚胺能多形性VT(CPVT)1。CPVT的特点为由运动或剧烈情绪诱发的短暂晕厥和/或突然心脏骤停。ECG在静息时一般在正常范围内，通常显示突出的U波，但在肾上腺素能活化时可以让位于室性心律失常。心律失常，通常是双向和/或多形性VT可以发展成心室纤维性颤动和猝死，使得该种失调具有高死亡率(到30岁时30-50％)。CPVT通常出现于童年，并且大约三分之一的病例中存在青少年猝死和应激诱导的晕厥的家族史。其可以表现为没有任何在先征兆或预兆的儿童猝死，并且在年轻人群中可以引起高达15％的原因不明的心脏性猝死(Cardiovasc.Dis,2008,51,23-30)。
与LQTS相比，儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)是最近加入心脏通道病目录的(Leenhardt等人,Circulation,91:1512-1519(1995)；Schimpf,R.等人,HerzErkrankungen,34卷,4期,第281-288页(2009年6月))。在遗传上，存在于编码RyR2的心脏兰尼碱受体/钙释放通道的关键区域中的CPVT1相关的突变占CPVT的约50％至65％，而一小部分患者具有继发于CASQ2编码的集钙蛋白中突变的2型CPVT(Mohamed,U.等人,Journal of Cardiovascular Electrophysiology,18(7):791-797(2007),Lahat等人,Circulation,103:2822-2827(2001)；Priori等人,Circulation,103:196-200(2001)；Priori等人,Circulation,106:69-74(2002)；Marks,Circulation,106(1):8-10(2002)；Lahat等人,Circulation,107(3):e29(2003)；以及Postma等人,Circulation Research,91:E21-E26(2002))。在表型上，CPVT的特点是心脏结构正常的情况下的劳累性晕厥或猝死。CPVT中的静息心电图是完全正常的。CPVT的心电图签名为运动诱导的或儿茶酚胺能诱导的心室心律失常。CPVT1与LQTS的表型，特别是隐蔽的LQT1的表型非常相似。
已知兰尼碱受体2基因(RYR2)中的突变引起显性遗传的CPVT(Circulation,2001,103,196-200)并且目前已知超过70种不同突变。失调的较不常见的常染色体隐性形式(CPVT2)是由集钙蛋白-2基因(CASQ2)中的突变引起的(Am.J.Hum.Genet,2001,69,1378-1384)。这些基因中的突变一起可以解释略多于一半的所有家族性CPVT病例。已经证实锚蛋白-2(ANK2)突变引起4型长QT综合征，然而，在患有类似于CPVT的多形性VT的单个个体中报道了ANK2的突变(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2004,101,9137-9142)。
严格控制的细胞内钙浓度循环是心肌收缩和确定心脏节律的基础。钙浓度的控制由离子通道、酶和钙结合蛋白的复杂网络支配。钙信号传导事件的关键细胞内钙传感蛋白和介质是钙调蛋白(CaM)，其是一种非常保守的蛋白质，其在所有脊椎动物物种中在氨基酸水平上100％相同。均编码广泛表达的相同CaM蛋白分子的三个独立基因，CALM1、CALM2和CALM3在人类基因组中的存在进一步强调了对抗该经典钙结合蛋白中的任何氨基酸变化的选择压力。
发明概述
本发明涉及对编码钙调蛋白的人类基因之一中的突变的出人意料的鉴定。三个哺乳动物基因CALM1、CALM2和CALM3均编码具有相同氨基酸序列的钙调蛋白。由于钙调蛋白基因的基本功能和极高的保守，预期不能容忍钙调蛋白中的氨基酸突变。因此，鉴定引起编码钙调蛋白的人类基因中的突变的氨基酸是出人意料的。如本文所述的，钙调蛋白基因中的突变引发失调，例如心脏失调或例如重度心律失常和心脏性猝死。
本发明的一方面涉及编码钙调蛋白(CaM)或至少一部分钙调蛋白(CaM)的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与失调相关的至少一个突变。在优选的实施方案中，本发明涉及编码钙调蛋白(CaM)或至少一部分钙调蛋白(CaM)的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与心脏失调相关的至少一个突变。
在优选的实施方案中，经分离的核苷酸序列与选自SEQ ID NO:1(CALM1)、SEQ ID NO:2(CALM2)和SEQ ID NO:3(CALM3)或其部分的多核苷酸具有至少90％的序列同一性。
优选地，多核苷酸序列中的至少一个突变导致编码的多肽序列中的至少一个突变，并且优选地产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的编码的突变的钙调蛋白。
优选地，一个或多个改变的功能特性为选自包含以下特性的列表的一个或多个特性：与RYR2受体的异常结合、与钙(Ca2+)的异常结合、异常的钙调蛋白-钙结合解离速率(如钙调蛋白-钙结合解离速率的增加)、异常的钙调蛋白/RYR2复合物钙结合亲和力、钙调蛋白折叠稳定性。
在一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合或由与RYR2受体的异常结合组成。优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，结合减少或消失。然而，在供选择的实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合亲和力相比，对RYR2的结合亲和力增加。
在另一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与钙(Ca2+)的异常结合或由与钙(Ca2+)的异常结合组成。优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，结合减少或消失。然而，在供选择的实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合亲和力相比，对钙(Ca2+)的结合亲和力增加。
在一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合(其可以是与野生型钙调蛋白显示的结合相比，减少或消失的结合，或者与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加的结合)和与钙的异常结合(并且其可以是与野生型钙调蛋白显示的结合相比，减少或消失的结合，或者与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加的结合)两者，或由与RYR2受体的异常结合(其可以是与野生型钙调蛋白显示的结合相比，减少或消失的结合，或者与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加的结合)和与钙的异常结合(并且其可以是与野生型钙调蛋白显示的结合相比，减少或消失的结合，或者与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加的结合)两者组成。
优选的是至少一个突变导致氨基酸替换。
在特定实施方案中，经分离的多核苷酸包含导致氨基酸替换Asn97Ser的突变。如在所附的实施例中所证实的，钙调蛋白中的氨基酸替换Asn97Ser导致其与RYR2受体的结合减少或消失，和/或其对RYR2受体的结合亲和力减小或消失。所附的实施例还证实了在钙调蛋白中的氨基酸替换Asn97Ser还导致其与钙的结合减少或消失和/或其对钙的结合亲和力减小或消失。
在另一个特定实施方案中，经分离的多核苷酸包含导致氨基酸替换Asn53Ile的突变。如在所附的实施例中所证实的，钙调蛋白中的氨基酸替换Asn53Ile导致其与钙的异常结合(如其与钙的结合增加或减少或消失，和/或其对钙的结合亲和力增大或减小或消失)。特别地，实施例显示了Asn53Ile变体的C-结构域(位于N结构域中)具有稍微增大的钙结合亲和力并且与野生型钙调蛋白相比以稍微更低的钙浓度结合至RYR2肽色氨酸(Trp)残基。
在一个实施方案中，经分离的多核苷酸包含导致氨基酸替换Asn97Ser和Asn53Ile的突变。
本发明的第二方面涉及包含钙调蛋白(CaM)或至少一部分钙调蛋白的经分离的多肽，其中所述多肽包含与心脏失调相关的至少一个突变。
在优选的实施方案中，经分离的多肽与SEQ ID NO:4或其部分具有至少90％的序列同一性。在特定实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:4的至少20个连续氨基酸具有至少90％同一性的序列。
优选地，多肽序列中的至少一个突变产生与野生型钙调蛋白相比具有一个或多个改变的功能特性的编码的突变的钙调蛋白。
在一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合或由与RYR2受体的异常结合组成。优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，结合减少或消失。然而，在供选择的实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合亲和力相比，对RYR2的结合亲和力增大。
在另一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与钙(Ca2+)的异常结合或由与钙(Ca2+)的异常结合组成。优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，结合减少或消失。然而，在供选择的实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合亲和力相比，对钙(Ca2+)的结合亲和力增大。
在一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合(其可以是与野生型钙调蛋白显示的结合相比，减少或消失的结合，或者与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加的结合)和与钙的异常结合(并且其可以是与野生型钙调蛋白显示的结合相比，减少或消失的结合，或者与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加的结合)两者，或由与RYR2受体的异常结合(其可以是与野生型钙调蛋白显示的结合相比，减少或消失的结合，或者与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加的结合)和与钙的异常结合(并且其可以是与野生型钙调蛋白显示的结合相比，减少或消失的结合，或者与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加的结合)两者组成。
优选的是至少一个突变导致氨基酸替换。
在特定实施方案中，经分离的多肽包含突变Asn97Ser。如在所附的实施例中所证实的，钙调蛋白中的氨基酸替换Asn97Ser导致其与RYR2受体的结合减少或消失和/或其对RYR2受体的结合亲和力减小或消失。所附的实施例还证实了钙调蛋白中的氨基酸替换Asn97Ser还导致其与钙的结合减少或消失和/或其对钙的结合亲和力减小或消失。
在另一个特定实施方案中，经分离的多肽包含导致氨基酸替换Asn53Ile的突变。如在所附的实施例中所证实的，钙调蛋白中的氨基酸替换Asn53Ile导致其与钙的异常结合(如其与钙的结合增加或减少或消失，和/或其对钙的结合亲和力增大或减小或消失)。特别地，实施例显示了Asn53Ile变体的C-结构域(位于N结构域中)具有稍微增大的钙结合亲和力并且与野生型钙调蛋白相比以稍微更低的钙浓度结合至RYR2肽色氨酸(Trp)残基。
在一个实施方案中，经分离的多肽包含导致氨基酸替换Asn97Ser和Asn53Ile的突变。
如本文所称的术语“心脏失调”包括与心脏相关的任何不良事件，包括但不限于，劳累诱导的或运动诱导的心脏事件、心脏性猝死、心脏骤停、心室纤维性颤动、室性心动过速、室性期外收缩、室性期前收缩和室性二联律。如本文所称的心脏失调可以例如为心律失常。在优选的实施方案中，心脏失调为室性心动过速，如多形性室性心动过速或特别是儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)。在进一步优选的实施方案中，心脏失调选自：婴儿猝死综合征(SIDS)、突发性猝死综合征(SUDS)、晕厥、癫痫发作、心脏事件。
钙调蛋白编码基因中的突变的鉴定可以用于确定个体是否具有增加的罹患心脏失调的风险的方法并用于诊断个体的失调如心脏失调的方法。因此，本发明的一方面涉及用于确定个体是否具有增加的罹患心脏失调或心脏性猝死的风险的方法，其中所述方法包括确定钙调蛋白编码基因中或一部分钙调蛋白编码基因中存在或缺失如本文所定义的至少一个突变，其中所述至少一个突变的存在指示罹患失调或心脏性猝死的风险增加。钙调蛋白编码基因可以例如选自：CALM1、CALM2和CALM3。优选的是所述失调为心脏失调。
在具体实施方案中，本发明涉及用于确定个体是否具有增加的罹患心脏失调或心脏性猝死的风险的方法，其中所述方法包括：
-确定来自所述个体的样品中的CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQ ID NO:3)中和/或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的多核苷酸中存在或缺失至少一个突变，和/或
-确定来自所述个体的样品中具有SEQ ID NO:4的多肽中或与SEQID NO:4或其部分具有至少90％的序列同一性的多肽中存在或缺失至少一个突变，
其中所述至少一个突变的存在指示罹患心脏失调的风险增加，并且优选地其中所述至少一个突变形成与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的突变的钙调蛋白。
如以上所讨论的，优选的是所述一个或多个改变的功能特性为选自包含以下特性的列表的一个或多个特性：与RYR2受体的异常结合、与钙(Ca2+)的异常结合、异常的钙调蛋白-钙结合解离速率(如钙调蛋白-钙结合解离速率的增高)、异常的钙调蛋白/RYR2复合物钙结合亲和力、钙调蛋白折叠稳定性。
优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)，或由与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)组成，和/或与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)，或由与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)组成。
在这些情况下，可能预防性地治疗具有增加的罹患心脏失调或心脏性猝死风险的个体，从而降低和/或消除心脏失调或心脏性猝死发作的风险。
因此，在一个实施方案中，用于确定个体是否具有增加的罹患心脏失调或心脏性猝死的风险的方法，所述方法包括在已鉴定具有增加的风险的个体之后进行的进一步的步骤，即预防性治疗所述个体以降低和/或消除心脏失调或心脏性猝死发作的风险。
用于预防性治疗个体以降低和/或消除心脏失调或心脏性猝死发作的风险的方法对于医学和药学领域中的技术人员而言是众所周知的。例如，可以使用“β阻断剂”疗法和/或钙通道阻断剂和/或通过植入除纤颤器来治疗这样的个体。
本发明的又一方面涉及用于诊断个体的心脏失调的方法，其中所述方法包括
-确定来自所述个体的样品中CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQID NO:2)和/或CALM3(SEQ ID NO:3)中和/或与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的多核苷酸中存在或缺失至少一个突变，和/或
-确定来自所述个体的样品中具有SEQ ID NO:4的多肽中或与SEQID NO:4或其部分具有至少90％的序列同一性的多肽中存在或缺失至少一个突变，
其中所述至少一个突变的存在指示心脏失调或罹患心脏失调的风险增加，并且优选地其中至少一个突变形成与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的突变的钙调蛋白。
如以上所讨论的，优选的是所述一个或多个改变的功能特性为选自包含以下特性的列表的一个或多个特性：与RYR2受体的异常结合、与钙(Ca2+)的异常结合、异常的钙调蛋白-钙结合解离速率(如钙调蛋白-钙结合解离速率的增加)、异常的钙调蛋白/RYR2复合物钙结合亲和力、钙调蛋白折叠稳定性。
优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)，或由与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)组成，和/或与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)或由与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)组成。
在一个实施方案中，用于诊断个体的心脏失调的方法包括在所述诊断之后进行的进一步的步骤，即治疗鉴定为具有心脏失调的个体。
用于治疗这样的心脏失调的方法对于医学和药学领域中的技术人员而言是众所周知的。例如，可以使用“β阻断剂”疗法和/或钙通道阻断剂和/或通过植入除纤颤器来治疗具有心脏失调的个体。例如，特别优选的是使用“β阻断剂”疗法治疗鉴定为仅具有LQTS的个体，而使用钙通道阻断剂和/或使用植入的除纤颤器治疗具有CPVT或极早发作型重度LQTS的个体。
在具体实施方案中，在
-CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQID NO:3)和/或
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的多核苷酸
中待确定的至少一个突变导致氨基酸替换Asn53Ile和/或氨基酸替换Asn97Ser。
在另一个具体实施方案中，在具有SEQ ID NO:4的多肽，或与SEQ IDNO:4或其部分具有至少90％的序列同一性的多肽中待确定的至少一个突变为Asn53Ile和/或Asn97Ser。
本发明的再一方面涉及用于治疗具有心脏失调的个体的方法，所述心脏失调与CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQ ID NO:3)中，和/或与CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ IDNO:2)和/或CALM3(SEQ ID NO:3)或其部分具有至少90％的序列同一性的多核苷酸中的至少一个突变相关，其中所述突变形成与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的突变的钙调蛋白，所述方法包括给予所述个体能够将改变的功能特性恢复和/或改进至野生型钙调蛋白中的水平的试剂。
如以上所讨论的，优选的是所述一个或多个改变的功能特性为选自包含以下特性的列表的一个或多个特性：与RYR2受体的异常结合、与钙(Ca2+)的异常结合、异常的钙调蛋白-钙结合解离速率(如钙调蛋白-钙结合解离速率的增加)、异常的钙调蛋白/RYR2复合物钙结合亲和力、钙调蛋白折叠稳定性。
在一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)或由与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)组成，在所述的实施方案中，所述方法包括以治疗有效的量，给予所述个体能够增加钙调蛋白和RYR2之间结合的试剂，从而治疗所述个体。
在另一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加)或由与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加)组成，在所述的实施方案中，所述方法包括以治疗有效的量，给予所述个体能够减少钙调蛋白和RYR2之间结合的试剂，从而治疗所述个体。
在又一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)或由与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)组成，在所述的实施方案中，所述方法包括以治疗有效的量，给予所述个体能够增加钙调蛋白和钙(Ca2+)之间结合的试剂，从而治疗所述个体。
在又一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加)或由与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加)组成，在所述的实施方案中，所述方法包括以治疗有效的量，给予所述个体能够减少钙调蛋白和钙(Ca2+)之间结合的试剂，从而治疗所述个体。
在特定实施方案中，所述至少一个突变导致氨基酸替换Asn97Ser和/或氨基酸替换Asn53Ile。
如本文所称的术语“心脏失调”包括与心脏相关的任何不良事件，包括但不限于，劳力诱导的或运动诱导的心脏事件、心脏性猝死、心脏骤停、心室纤维性颤动、室性心动过速、室性期外收缩、室性期前收缩和室性二联律。心脏失调可以例如为心律失常。在一个实施方案中，所述心脏失调为室性心动过速或多形性室性心动过速。在特定实施方案中，所述心脏疾病为儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)。在一个实施方案中，所述心脏失调可以为药物诱导的心律失常。在进一步优选的实施方案中，所述心脏失调选自：婴儿猝死综合征(SIDS)、突发性猝死综合征(SUDS)、晕厥、癫痫发作、心脏事件。
本发明的又一方面涉及用于鉴定化合物的方法，所述化合物能够增强钙调蛋白与兰尼碱受体2的结合，其中所述钙调蛋白包含降低与兰尼碱受体2的结合亲和力(并且优选地，其中与兰诺定受体2的结合减少或消失)的至少一个突变，所述方法包括
-提供第一样品，所述第一样品包含钙调蛋白或其片段，兰尼碱受体2或其片段和测试化合物，所述钙调蛋白或其片段具有降低与兰尼碱受体2的结合亲和力(并且优选地，其中与兰尼碱受体2的结合减少或消失)的突变
-测量所述第一样品中结合到兰尼碱受体2蛋白的钙调蛋白的量
-提供第二样品，所述第二样品包含钙调蛋白或其片段和兰尼碱受体2或其片段，所述钙调蛋白或其片段具有降低与兰尼碱受体2的结合亲和力(并且优选地，其中与兰尼碱受体2的结合减少或消失)的突变
-测量所述第二样品中结合到兰尼碱受体2蛋白的钙调蛋白的量
-比较第一和第二样品中结合到兰尼碱受体2蛋白的钙调蛋白的量，从而与第二样品相比，第一样品中结合到兰尼碱受体2蛋白的钙调蛋白的量更高指示测试化合物增强了钙调蛋白与兰尼碱受体2蛋白的结合。
优选地，降低与兰尼碱受体2的结合亲和力(并且优选地，其中与兰尼碱受体2的结合减少或消失)的突变包括氨基酸替换Asn97Ser，并且更优选地，包括氨基酸替换Asn97Ser和Asn53Ile。
优选的是钙调蛋白与SEQ ID NO:4或其部分具有至少90％的序列同一性。
在特定实施方案中，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ IDNO:4或其部分具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列中的至少一个突变是Asn97Ser。
本发明的又一方面涉及用于鉴定能够增强钙调蛋白与钙(Ca2+)之间结合的化合物的方法，其中所述钙调蛋白包含降低与钙(Ca2+)的结合亲和力(并且优选地，其中与钙(Ca2+)的结合减少或消失)的至少一个突变，所述方法包括
-提供第一样品，所述第一样品包含钙调蛋白或其片段和测试化合物，所述钙调蛋白或其片段具有降低与钙(Ca2+)的结合亲和力(并且优选地，其中与钙(Ca2+)的结合减少或消失)的突变
-测量所述第一样品中结合到钙(Ca2+)的钙调蛋白的量
-提供第二样品，所述第二样品包含钙调蛋白或其片段，所述钙调蛋白或其片段具有降低与钙(Ca2+)的结合亲和力(并且优选地，其中与钙(Ca2+)的结合减少或消失)的突变
-测量所述第二样品中结合到钙(Ca2+)的钙调蛋白的量
-比较第一和第二样品中结合到钙(Ca2+)的钙调蛋白的量，从而与第二样品相比，第一样品中结合到钙(Ca2+)的钙调蛋白的量更高指示测试化合物增强了钙调蛋白与钙(Ca2+)的结合。
优选地，降低与钙(Ca2+)的结合亲和力(并且优选地，其中与钙(Ca2+)的结合减少或消失)的突变包括氨基酸替换Asn53Ile，并且更优选地，包括氨基酸替换Asn53Ile和Asn97Ser。
优选的是钙调蛋白与SEQ ID NO:4或其部分具有至少90％的序列同一性。
在特定实施方案中，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ IDNO:4或其部分具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列中的至少一个突变是Asn53Ile。
本发明的又一方面涉及通过上述方法鉴定的化合物，所述化合物用于治疗具有心脏失调的个体，所述心脏失调与CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQ ID NO:3)中，和/或与SEQID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列中的至少一个突变相关，其中所述突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的突变的钙调蛋白。
如以上所讨论的，优选的是所述一个或多个改变的功能特性为选自包含以下特性的列表的一个或多个特性：与RYR2受体的异常结合、与钙(Ca2+)的异常结合、异常的钙调蛋白-钙结合解离速率(如钙调蛋白-钙结合解离速率的增加)、异常的钙调蛋白/RYR2复合物钙结合亲和力、钙调蛋白折叠稳定性。
在一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)或由与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)组成。在另一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)或由与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)组成。
在优选的实施方案中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3和/或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列包含导致氨基酸替换Asn97Ser和/或氨基酸替换Asn53Ile的突变。
本发明的再一方面涉及药物组合物，所述药物组合物用于治疗具有心脏失调的个体，所述心脏失调与CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQID NO:2)和/或CALM3(SEQ ID NO:3)中的至少一个突变相关，其中所述突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的突变的钙调蛋白，并且其中所述组合物包含能够将改变的功能特性恢复和/或改进至野生型钙调蛋白中的水平的试剂。
在一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)或由与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)组成，在所述实施方案中，所述组合物包含能够恢复和/或增加钙调蛋白与RYR2之间结合的试剂。
在另一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加)或由与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加)组成，在所述实施方案中，所述组合物包含能够恢复和/或减少钙调蛋白与RYR2之间结合的试剂。
在再一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)或由与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)组成，在所述实施方案中，所述组合物包含能够恢复和/或增加钙调蛋白与钙(Ca2+)之间结合的试剂。
在又一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加)或由与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加)组成，在所述实施方案中，所述组合物包含能够恢复和/或增加钙调蛋白与钙(Ca2+)之间结合的试剂。
如本文所称的术语“心脏失调”包括与心脏相关的任何不良事件，包括但不限于，劳累诱导的或运动诱导的心脏事件、心脏性猝死、心脏骤停、心室纤维性颤动、室性心动过速、室性期外收缩、室性期前收缩和室性二联律。心脏失调可以例如为心律失常。在一个实施方案中，所述心脏失调为室性心动过速或多形性室性心动过速。在特定实施方案中，所述心脏失调为儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)。在一个实施方案中，所述心脏失调可以为药物诱导的心律失常。在进一步优选的实施方案中，所述心脏失调选自：婴儿猝死综合征(SIDS)、突发性猝死综合征(SUDS)、晕厥、癫痫发作、心脏事件。
本发明的一方面涉及用于检测编码钙调蛋白(CaM)或钙调蛋白(CaM)的至少一部分的多核苷酸中的至少一个突变的试剂盒，其中所述试剂盒包含与所述钙调蛋白编码基因的序列互补的至少一种寡核苷酸，使得如果多核苷酸中存在突变，则由所述寡核苷酸的链延伸产生包含所述突变的延伸产物。
在优选的实施方案中，所述多核苷酸与选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3或其部分的多核苷酸具有至少90％的序列同一性。
优选地，在多核苷酸序列中的至少一个突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的编码的突变的钙调蛋白，如本文所述。
在一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合，优选地，其中结合增加或减少或消失，或由与RYR2受体的异常结合组成，优选地，其中结合增加或减少或消失。在另一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与钙(Ca2+)的异常结合，优选地，其中结合增加或减少或消失，或由与钙(Ca2+)的异常结合组成，优选地，其中结合增加或减少或消失。
在一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合(并且优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，其中结合增加或减少或消失)和与钙的异常结合(并且优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，其中结合增加或减少或消失)，或由与RYR2受体的异常结合(并且优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，其中结合增加或减少或消失)和与钙的异常结合(并且优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，其中结合增加或减少或消失)组成。
优选的是，至少一个突变导致氨基酸替换，优选地，所述至少一个突变包括氨基酸替换Asn97Ser和/或Asn53Ile。
附图说明
图1：谱系和心电图
(A)在第14号染色体上的最大连锁区域中显示单倍型的瑞典家族的谱系。用箭头指示索引患者。(B)在家族1的索引患者II:6的24小时ECG记录期间的静息和发生的心律失常事件(当踢足球时)期间的ECG。(C)来自第二个不相关的伊拉克裔的患者的静息和运动ECG。两种静息ECG证实了在前段中突出的U波，而在身体活动或运动期间观察到双向心室异位。
图2：全基因组连锁分析
携带大约100个基因的染色体14q32(lod分数3.9)上的新基因座。
图3：CALM1基因结构和突变
(A)在患有室性心动过速的两个不同患者中鉴定的Asn53Ile和Asn97Ser突变的位置，以及对比患者和对照受试者的外显子3和5的测序电泳图。(B)在瑞典家族中鉴定的突变的基因分型分析，以及携带杂合突变的所有受试者出现两个峰。
图4：序列比对
来自不同物种的钙调蛋白氨基酸序列的比对，指出了Asn53Ile和Asn97Ser突变(红色残基)。二级结构元件显示为绿色和橙色阴影(分别为α螺旋、β链(β-strand))并给Ca2+结合残基加外框。点表示保守的残基，显示钙调蛋白在所有脊椎动物中100％保守并且仅展示了蛔虫和植物的少数变化。
图5：钙调蛋白的三维结构
表明突变的残基Asn53和Asn97(以棒表示法显示)的位置的钙调蛋白的3D结构模型。(A)脱钙钙调蛋白，(B)Ca2+饱和的钙调蛋白和(C)结合Ca2+的钙调蛋白/RYR1肽复合物。钙离子显示为灰色球，RYR1显示为红色。RYR1中的两个芳香族疏水性结合锚以棒表示法显示。Asn53位于α螺旋C的溶剂暴露侧，不接触Ca2+、肽配基或其它钙调蛋白结构域。Asn97是Ca2+结合位点III的Ca2+配位残基之一。钙调蛋白的N-结构域位于顶部，C-结构域位于底部。钙调蛋白N结构域的方向为围绕脱钙(apo-)、Ca2+-和RYR1-复合的钙调蛋白结构之间的垂直轴逆时针旋转大约90度。
图6：钙结合
钙调蛋白的C结构域的Ca2+相对结合作为如酪氨酸荧光强度的变化所测定的总Ca2+浓度的函数。数据表示三个独立实验的平均值(+/-SD)，在大多数情况下，误差条小于符号。与天然钙调蛋白相比，a:p<0.05、b:p<0.01、c:p<0.001和d:p<0.0001。
图7：RYR2结合
结合到RYR2肽(R3581-L3611)的钙调蛋白。显示了在没有添加的钙调蛋白(RYR)和(A)低的细胞内(100nM游离Ca2+)浓度，(B)中等(1μM游离Ca2+)浓度，以及(C)饱和(200μM Ca2+)浓度下添加的饱和量的所示的钙调蛋白变体，归一化到单独肽的最大荧光强度的RYR2Trp3586荧光发射光谱。
图8：SNP全基因组连锁分析
图9：两点Adair模型(线)拟合的平衡滴定曲线(符号)。三个CaM变体的N-小叶(lobe)和C-小叶的小叶特异性Ca2+结合曲线分别绘制成作为[Ca2+]游离的函数的饱和分数。
图10：通过停流实验测量的CaM N-小叶和C-小叶Ca2+解离。左侧：通过Ca2+-探针Quin-2荧光的增加监测的在8℃下的CaM Ca2+解离。右侧：在不同温度下(10、15、20、25、30和37℃)，通过酪氨酸荧光的减少监测的C-小叶解离。
图11：作为温度函数的CaM C-小叶k解离值。条(bar)相当于90％的置信区间(符号大小覆盖该区间)。
图12：脱钙CaM变体和CaCaM变体各自的热变性和热化学变性。上：以在信号中的归一化的变化监测的脱钙CaM变体的解折叠分数。中：以酪氨酸荧光信号归一化的增加来监测的脱钙CaM C-小叶的解折叠分数。下：以在信号中的归一化的变化来监测的在存在5M尿素的情况下CaCaM的解折叠分数。
图13：CaM变体结构完整性。A)游离Ca2+和B)负载形式Ca2+中的CaM变体的远UV CD谱。C)在单个分析或在负载之前与WT CaM混合的CaM变体的非变性凝胶电泳。
图14：通过两点Adair模型(线)拟合的平衡Ca2+滴定曲线(符号)。绘制作为[Ca2+]游离的函数的色氨酸340/356nm发射率的饱和分数，其说明了与RYR2p的复合物中三个CaM变体的C小叶的Ca2+结合。
发明详述
定义
如本文中所使用的，术语“诊断(diagnose)”、“诊断的(diagnostic)”、“诊断(diagnosis)”或“诊断(diagnosing)”是指区分或鉴定疾病、症状或病症，或区分或鉴定具有特定疾病、症状或病症的人。通常，疾病或失调的诊断基于对指示疾病的一个或多个因素和/或症状的评价。在这方面，术语的意思是评估个体或受试者是否具有CALM1、CALM2和/或CALM3基因中的突变。
如本文中所使用的，术语“倾向于(predisposed)”或“倾向(predisposition)”是指增加的患者可能患有疾病的可能性。
如本文中所使用的，术语“杂合的”是指由基因座的两个不同等位基因或基因的两个不同等位基因组成的二倍体生物的基因型。杂合的还可以指来自其中可以检测到基因座的两个不同等位基因的生物体的样品。用于确定样品是否为杂合的方法，如核苷酸测序在本领域中是众所周知的。
如本文中所使用的，术语“纯合的”是指由基因座的两个相同基因或基因的两个相同等位基因组成的二倍体生物的基因型。“纯合的”还可以指来自其中可以检测到基因座的两个不同等位基因的生物体的样品。用于确定样品是否为纯合的方法，如核苷酸测序在本领域中是众所周知的。
如本文中所使用的，术语“样品”或“生物样品”是指获得自生物来源，如细胞或组织样品或体液的任何液体或固体材料。“体液”包括但不限于，血液、血清、血浆、唾液、脑脊液、胸膜液、眼泪、乳汁(lactal ductfluid)、淋巴、痰、尿液、唾液、羊水和精液。
术语“治疗有效量”是指足以引起希望的响应的量。
如本文中所使用的，术语“核苷酸”是指RNA或DNA的单体。核苷酸是连接到碱基和磷酸基两者的核糖或脱氧核糖。一磷酸核苷、二磷酸核苷和三磷酸核苷均称为核苷酸。
根据本发明的核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，所述核糖核苷酸含有选自腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的核碱基，而所述脱氧核糖核苷酸含有选自腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的核碱基。核碱基能够通过氢键特异性地与一个或多个其它核碱基结合。一个核碱基与另一个核碱基的特异性相互作用通常被称为“碱基配对”。碱基配对导致预定的和互补的核苷酸之间的特异性杂交。根据本发明的互补核苷酸是包含能够碱基配对的核碱基的核苷酸。在天然存在的核碱基中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)配对，而鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。因此，例如，含有A的核苷酸与含有T或U的核苷酸互补，而含有G的核苷酸与含有C的核苷酸互补。
如本文中所使用的，术语“多核苷酸”是指由链中共价键合的核苷酸单体组成的生物聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的实例。
如本文中所使用的，术语“寡核苷酸”是指由链中共价键合的核苷酸单体组成的生物聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是寡核苷酸的实例。如本文中所使用的寡核苷酸通常比多核苷酸短。寡核苷酸可以例如在PCR期间用于引发(prime)核苷酸链的合成。
如本文中所使用的，术语“基因”是指其通常的含义，具有转录能力的核酸序列，即其可以转录成RNA序列(表达的序列)以及调节表达的序列的表达或参与(engage)表达的序列的表达的调节序列，在大多数情况下，RNA序列被翻译成氨基酸序列。基因由基因的非编码部分的内含子和编码蛋白质的氨基酸序列的外显子组成。
如本文中使用的，术语“编码区”是指基因的编码区。编码区由外显子组成，其编码所产生的蛋白质的氨基酸序列。
当提及多核苷酸或多肽时，术语“经分离的”，是指天然存在的核酸或多肽(或其片段)，其基本上没有天然与其结合的天然存在的分子和细胞组分。例如，已经合成制备的任何核酸或多肽被认为是经分离的。通过引物延伸反应(如，PCR)重组表达、克隆、制备的，或以其它方式从基因组中切除的核酸也被认为是经分离的。类似地，重组制备的多肽也被认为是经分离的。然而，cDNA制备物等不认为是经分离的，因为它们不含天然存在的分子。
如本文中使用的，术语“碱基错配”是指核苷酸中的变化，使得当例如引物退火至多核苷酸时，形成核苷酸的异常碱基配对，如G-G、C-C、A-A、T-T、A-G、A-C、T-G或T-C之间的碱基配对。正常地，在形成双链核酸时，鸟嘌呤(G)结合胞嘧啶(C)而腺嘌呤(A)结合胸腺嘧啶(T)。标准的碱基配对是A-T或G-C。因此，在A-T或G-C之间的碱基配对不是碱基错配。
如本文中所使用的，术语“点突变”是指其中单个核苷酸被替换成另一个核苷酸的突变。点突变可以为A>G突变、A>C突变、A>T突变、T>G突变、T>C突变、T>A突变、G>T突变、G>C突变、G>A突变、C>G突变、C>T突变或C>A突变。A>G是指用G替换A。
如本文中所使用的，术语“错义突变”是其中改变单个核苷酸，产生编码不同氨基酸的密码子的点突变。
如本文中所使用的，术语“显性突变”是一个等位基因中尽管存在相应的野生型等位基因，但还是产生表型，如心脏疾病的突变。因此，显性突变仅需要存在于一个等位基因中从而产生表型或疾病。
如本文中所使用的，术语“结合亲和力”是指两个分子之间，例如两个蛋白质之间结合的强度。
如本文中所使用的，术语“退火”是指通过氢键使互补DNA或RNA序列配对以形成双链多核苷酸。该术语例如用于描述在聚合酶链式反应(PCR)过程中DNA探针、或引物与DNA链的结合。该术语还用于描述通过热分离的(热变性的)互补核苷酸链的重新形成(复性)。
如本文中所使用的，术语“扩增子”是指被扩增的多核苷酸。在本发明中，被扩增的多核苷酸是竞争引物(其可以例如为5’引物)和通用引物(其可以例如为3’引物)之间的序列。扩增子由通用引物和竞争引物的延伸产物的退火而产生。因此，扩增子是双链核苷酸并且包含引物的多核苷酸和5’引物与3’引物之间的多核苷酸。在优选的实施方案中，扩增子是双链DNA分子。
如本文中所使用的，术语“聚合酶”是指使用碱基配对相互作用，通过添加游离核苷酸至正在增长的多核苷酸以催化针对核苷酸模板链的多核苷酸，如RNA或DNA的合成的酶。因此，聚合酶使用完整的核苷酸作为模板，催化核苷酸聚合成多核苷酸。在优选的实施方案中，聚合酶是DNA聚合酶。DNA聚合酶是使用DNA链作为模板，催化脱氧核糖核苷酸的聚合的酶。在优选的实施方案中，DNA聚合酶是来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的Taq聚合酶，所述Taq聚合酶是具有约70至80℃的最佳活性温度的热稳定的DNA聚合酶。通常使用72℃的温度。
包含至少一个突变的钙调蛋白多核苷酸
钙调蛋白(CaM)是通过结合钙离子，然后修饰其与多种靶蛋白的相互作用来转导钙信号的一种钙结合信使蛋白。CaM介导许多关键的过程，如炎症、新陈代谢、细胞凋亡、平滑肌收缩、细胞内运动、短期和长期记忆以及免疫应答。CaM在许多细胞类型中表达并且在细胞器内可以具有不同的亚细胞位置，包括细胞质，或者与原生质或细胞器膜相连。结合CaM的许多蛋白自身不能结合钙，并且因此使用CaM作为钙传感蛋白和信号转导蛋白。CaM还可以利用内质网和肌质网中的钙库。
本发明涉及对编码钙调蛋白的人基因之一中的突变的出人意料的鉴定。三个哺乳动物基因，CALM1、CALM2和CALM3均编码具有相同氨基酸序列的钙调蛋白。钙调蛋白是在所有真核细胞中表达的普遍存在的蛋白，并且其非常保守。在脊椎动物中，其显示100％的氨基酸同一性(J.Biochem.,126(1999),572–577页)。由于钙调蛋白基因的基本功能和非常高的保守性，预期钙调蛋白不能容忍氨基酸突变。因此，鉴定在编码钙调蛋白的人类基因中引发突变的氨基酸是令人惊讶的。如本文中所述的，钙调蛋白基因中的突变引起心脏失调，如重度心律失常和心脏性猝死。
因此，本发明直接实现在患有重度心脏失调的家族中的症状发生前的基因诊断，能够启动对携带疾病突变的儿童和青少年个体的潜在地挽救生命的治疗。例如，三个钙调蛋白基因CALM1、CALM2和CALM3是用于患有CPVT样心律失常和原因不明的心脏性猝死的患者的基因筛查的候选物。
本发明的一方面涉及编码钙调蛋白(CaM)或至少一部分钙调蛋白(CaM)的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与失调相关的至少一个突变。在优选的实施方案中，本发明涉及编码至少一部分钙调蛋白(CaM)的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与心脏失调相关的至少一个突变。
优选地，在多核苷酸序列中的至少一个突变导致在编码的多肽序列中的至少一个突变，并且优选地产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的编码的突变的钙调蛋白。
如以上所讨论的，优选的是所述一个或多个改变的功能特性为选自包含以下特性的列表的一个或多个特性：与RYR2受体的异常结合、与钙(Ca2+)的异常结合、异常的钙调蛋白-钙结合解离速率(如钙调蛋白-钙结合解离速率的提高)、异常的钙调蛋白/RYR2复合物钙结合亲和力、钙调蛋白折叠稳定性。
在一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合或由与RYR2受体的异常结合组成。优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，结合减少或消失。然而，在供选择的实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合亲和力相比，对RYR2的结合亲和力增大。
在另一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与钙(Ca2+)的异常结合或由与钙(Ca2+)的异常结合组成。优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，结合减少或消失。然而，在供选择的实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合亲和力相比，对钙(Ca2+)的结合亲和力增大。
在一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合(其可以为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，减少或消失的结合，或者与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加的结合)和与钙的异常结合(并且其可以为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，减少或消失的结合，或者与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加的结合)两者，或由与RYR2受体的异常结合(其可以为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，减少或消失的结合，或者与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加的结合)和与钙的异常结合(并且其可以为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，减少或消失的结合，或者与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加的结合)两者组成。
在一个实施方案中，经分离的多核苷酸与选自SEQ ID NO:1(CALM1)、SEQ ID NO:2(CALM2)和SEQ ID NO:3(CALM3)或其部分的多核苷酸具有至少85％的序列同一性，如至少90％的序列同一性，至少95％的序列同一性，如至少97％的序列同一性，至少98％的序列同一性，如至少99％的序列同一性。
在特定实施方案中，经分离的多核苷酸与选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3的多核苷酸具有至少85％的序列同一性，如至少90％的序列同一性，至少95％的序列同一性，如至少97％的序列同一性，至少98％的序列同一性，如至少99％的序列同一性。
优选的是，经分离的核苷酸序列与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3或其部分的多核苷酸具有至少90％的序列同一性。
如本文和以上所述的经分离的多核苷酸可以例如包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中的至少10个核苷酸，例如至少15个核苷酸，如至少20个核苷酸，至少30个核苷酸，例如至少40个核苷酸，如至少50个核苷酸，至少60个核苷酸，例如至少80个核苷酸，如至少100个核苷酸，至少150个核苷酸，例如至少200个核苷酸，如至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，或如至少500个核苷酸。在一个实施方案中，经分离的多核苷酸包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的全部多核苷酸。
在一个实施方案中，经分离的多核苷酸包含这样的序列，所述序列与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的多核苷酸中的至少10个连续核苷酸，如至少15个连续核苷酸，例如至少30个连续核苷酸，至少40个连续核苷酸，如至少50个连续核苷酸，例如至少60个连续核苷酸，至少80个连续核苷酸，如至少100个连续核苷酸，例如至少150个连续核苷酸，至少200个连续核苷酸，如至少300个连续核苷酸或例如至少400个连续核苷酸，具有至少85％的同一性，如至少90％的同一性，至少95％的同一性，例如至少97％的同一性，至少98％的同一性，如至少99％的同一性。
在特定实施方案中，经分离的多核苷酸包含这样的序列，所述序列与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的多核苷酸的至少20个连续核苷酸具有至少90％的同一性。
在另一个特定实施方案中，经分离的多核苷酸与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和SEQ ID NO:3的全长具有至少90％的序列同一性。
优选的是，如本文所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的至少一部分编码区。
在一个实施方案中，如本文所述的经分离的多核苷酸编码钙调蛋白(SEQ ID NO:4)的至少10个氨基酸，如至少15个氨基酸，例如至少20个氨基酸，如至少30个氨基酸，例如至少40个氨基酸，如至少50个氨基酸，例如至少60个氨基酸，如至少80个氨基酸，例如至少100个氨基酸，如至少120个氨基酸，例如至少140个氨基酸。
在一个实施方案中，如本文所述的多核苷酸是编码至少一部分钙调蛋白(CaM)的cDNA序列或mRNA序列，其中所述多核苷酸包含与失调相关的至少一个突变。在优选的实施方案中，所述失调为心脏失调。
在一个实施方案中，经分离的多核苷酸与选自SEQ ID NO:5(CALM1mRNA)、SEQ ID NO:6(CALM2mRNA)和SEQ ID NO:7(CALM3mRNA)或其部分的多核苷酸具有至少85％的序列同一性，如至少90％的序列同一性，至少95％的序列同一性，如至少97％的序列同一性，至少98％的序列同一性，如至少99％的序列同一性。
在特定实施方案中，经分离的多核苷酸与选自SEQ ID NO:5(CALM1mRNA)、SEQ ID NO:6(CALM2mRNA)和SEQ ID NO:7(CALM3mRNA)或其部分的多核苷酸具有至少85％的序列同一性，如至少90％的序列同一性，至少95％的序列同一性，如至少97％的序列同一性，至少98％的序列同一性，如至少99％的序列同一性。
优选的是，经分离的多核苷酸与选自SEQ ID NO:5(CALM1mRNA)、SEQ ID NO:6(CALM2mRNA)和SEQ ID NO:7(CALM3mRNA)或其部分的多核苷酸具有至少90％的序列同一性。
如本文和以上所述的经分离的多核苷酸可以例如包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的至少10个核苷酸，例如至少15个核苷酸，如至少20个核苷酸，至少30个核苷酸，例如至少40个核苷酸，如至少50个核苷酸，至少60个核苷酸，例如至少80个核苷酸，如至少100个核苷酸，至少150个核苷酸，例如至少200个核苷酸，如至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，或例如至少500个核苷酸。在一个实施方案中，经分离的多核苷酸包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的全部多核苷酸。
在一个实施方案中，经分离的多核苷酸包含这样的序列，所述序列与选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的多核苷酸的至少10个连续核苷酸，如至少15个连续核苷酸，例如30个连续核苷酸，至少40个连续核苷酸，如至少50个连续核苷酸，例如60个连续核苷酸，至少80个连续核苷酸，如至少100个连续核苷酸，例如150个连续核苷酸，至少200个连续核苷酸，如至少300个连续核苷酸或例如至少400个连续核苷酸，具有至少85％的同一性，如至少90％的同一性，至少95％的同一性，例如至少97％的同一性，至少98％的同一性，如至少99％的同一性。
在特定实施方案中，经分离的多核苷酸包含这样的序列，所述序列与选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的多核苷酸的至少20个连续核苷酸具有至少90％的同一性。
在另一个特定实施方案中，经分离的多核苷酸与SEQ ID NO:5、SEQID NO:6或SEQ ID NO:7的全长具有至少90％的序列同一性。
优选的是，如本文所述的多核苷酸包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的至少一部分编码区。
如本文所述的多核苷酸可以为单链或双链的。因此，在以上陈述的实施方案中，核苷酸可以与碱基对互换。
在一个实施方案中，经分离的多核苷酸是纯化的核酸序列。所述多核苷酸可以根据技术人员已知的方法来纯化。
核酸(DNA或RNA)可以根据本领域技术人员已知的任何方法从样品分离。样品可以选自组织样品或体液样品，如选自血液、血浆、血清、精液和尿液的样品。样品可以通过标准程序获得并且可以立即使用，或在适于生物样品类型的条件下储存，用于随后使用。
例如，基因组DNA通常从生物样品，如外周血液样品中提取，但也可以从包括组织(例如，口腔内壁的粘膜刮屑)的其它生物样品提取。常规方法可用于从血液或组织样品中提取基因组DNA，所述常规方法包括例如酚提取。基因组DNA也可以使用市场上可获得的试剂盒来提取，所述试剂盒如Tissue Kit(Qiagen,Chatsworth,Calif.)、基因组DNA纯化试剂盒(Promega,Madison,Wis.)、Puregene DNA分离体系(Gentra Systems,Minneapolis,Minn.)和A.S.A.P.3基因组DNA分离试剂盒(Boehringer Mannheim,Indianapolis,Ind.)。
样品可以来自包括任何动物，优选为哺乳动物的受试者或个体。优选的是，所述个体为人。生物样品可以从处于生命的任何阶段的个体获得，如从胎儿、婴儿、儿童、青少年或成年人获得。特别优选的受试者为具有增加的罹患心脏失调，例如遗传性心脏失调的风险的人。
如以下所讨论的，分子生物学领域的技术人员知道可以用于确定钙调蛋白多核苷酸和/或多肽序列中存在一个或多个突变的许多方法。
在一个实施方案中，钙调蛋白多核苷酸序列可以直接测序。这种在个体内直接确定钙调蛋白序列可以使用聚合酶链式反应(PCR)和/或多重置换扩增(MDA)(Spits等人,2006)以扩增从待测试的个体中获得的核酸(例如，基因组DNA或cDNA)来进行。一旦扩增，核酸可以被测序并与野生型钙调蛋白序列进行比较，以确定核酸是否包含基因突变。序列可以使用例如但不限于Sanger测序、焦磷酸测序(Ronaghi等人,1999)和下一代测序(也称为“靶向再测序(targeted re-sequencing)”)(Su等人,2011；Metzker 2010)来确定。
组织或体液样品提取的核酸可以使用本领域中众所周知的核酸扩增技术来扩增。许多这些扩增方法还可以用于仅通过设计与特定核苷酸序列相互作用或与特定核苷酸序列杂交的寡核苷酸引物或探针检测突变的存在。这些技术可以例如包括聚合酶链式反应(PCR)、反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、巢式PCR、连接酶链式反应。
在一个实施方案中，PCR用于扩增感兴趣的靶序列或标记序列，例如测试突变的核苷酸序列。技术人员能够设计并制备适合于扩增靶序列或标记序列的引物。扩增引物的长度取决于包括核苷酸序列同一性和在体外核酸扩增过程中杂交或使用这些核酸的温度的几个因素。确定特定序列同一性的扩增引物的优选长度所必需的考虑因素对于普通技术人员而言是众所周知的。引物必须足够长以在聚合酶的存在下引发(prime)延伸产物的合成。引物的长度通常可以从约8个核苷酸至60个核苷酸变化。
在一类基于PCR的试验中，引物与靶核酸分子上与包含待鉴定的突变的基因或核酸序列的区域重叠的区域杂交，并且仅引发引物显示与其完美互补的等位基因形式的扩增(Gibbs,1989,Nucleic Acid Res.,17:2427-2448)。通常，引物的3'最末端核苷酸与包含待鉴定的突变的核酸序列的区域对齐并且与该区域互补。该引物与在远端位点杂交的第二引物结合使用。扩增从两个引物开始，产生指示测试样品存在哪一种等位基因形式的可检测产物。通常使用第二对引物进行对照，其中引物中的一个包含碱基错配，使得当引物退火至核苷酸链时，形成异常的核苷酸碱基配对，从而抑制扩增。当错配位于寡核苷酸的3'最末端位置时，所述方法一般最有效(即，寡核苷酸的3'最末端位置与包含待检测的突变的核苷酸序列的区域对齐)，因为该位置对于从引物开始的延伸是最能破坏稳定的(参见例如WO 93/22456)。
在一个实例中，引物包含与含有突变的靶核酸分子的片段基本上互补的序列，除了该引物在引物的3'最末端处的三个核苷酸位置之一中有错配的核苷酸，使得错配的核苷酸不与突变位点处的特定等位基因进行碱基配对。引物中的错配核苷酸可以为从引物的3'最末端位置的最后一个核苷酸开始的第一、第二或第三核苷酸。在一些实例中，引物和/或探针使用可检测标记进行标记。
本发明的核酸突变可以通过DNA测序来检测。测序可以通过由Zimmermann等人修改(Nucleic Acids Res.(1990),18:1067)的Sanger等人的双脱氧链终止法(Proceedings of the National Academy of Sciences USA(1977),74,5463-5467)进行。通过双脱氧链终止法进行的测序可以使用热测序酶(Amersham Pharmacia,Piscataway,NJ)，来自US Biochemicals的测序酶试剂或Sequatherm测序试剂盒(Epicenter Technologies,Madison,Wis.)进行。测序也可以通过来自PE Applied Biosystems的“RR dRhodamineTerminator Cycle Sequencing Kit”(产品编号403044,Weiterstadt,Germany)，Taq DyeDeoxy(TM)Terminator Cycle Sequencing kit和方法(Perkin-Elmer/Applied Biosystems)，使用Applied Biosystems Model 373A DNA或在染料终止子CEQ(TM)Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Beckman 608000)的存在下，在两个方向上进行。供选择地，测序可以通过被称为焦磷酸测序(Pyrosequencing,Westborough,Mass.)的方法进行。用于焦磷酸测序的详细方案可以见于：Alderborn等人的Genome Res.(2000),10:1249-1265。
核苷酸的测序可以通过也称为下一代测序的大规模并行测序技术(massively parallel sequencing technologies)进行。下一代测序平台的特点是平行处理数百万个序列读取(sequence reads)的能力，而不是例如，如通常基于毛细管的测序所见的每次96个。用于产生下一代序列阅读文库的工作流程是明确的，用于测序的DNA片段通过将特异性接头(adaptor)寡核苷酸连接到每个DNA片段的两个末端来制备。重要的是，产生文库需要相对少的输入DNA(至多几微克)。当前可用于下一代测序的平台形成较短的阅读长度(35–250bp，这取决于平台)，但更长的阅读也是可能的。(Mardis,E.R.The impact of next-generation sequencingtechnology on genetics,Trends Genet.2008Mar；24(3):133-41)。
在另一个实施方案中，钙调蛋白多核苷酸序列中的一个或多个突变可以通过如下鉴定：对个体的基因组测序，然后通过与一系列已知序列变化进行比较来鉴定在该个体内钙调蛋白基因的编码区域中的突变。
个体中钙调蛋白序列中的突变也可以由使用对完整基因组测序或外显子组测序/包括目标的初始富集的靶向再测序(Su等人,2011；Metzker2010)而鉴定的一系列变化来确定。而且，但并非绝对地，可以使用采用纳米孔分析单个的DNA/RNA和蛋白质分子的任何平台(Niedringhaus等人,2011)。
重要的是，计算机程序或软件可以用于鉴定并向科学和医疗人员报告钙调蛋白突变。报告来自完整基因组或外显子组序列数据的临床和诊断上的重要突变的任何软件可以用于鉴定钙调蛋白基因序列中的突变。
在另一个实施方案中，钙调蛋白多核苷酸序列中的突变可以通过以下方法来鉴定：筛选钙调蛋白序列的变化，然后测序以鉴定确切的突变。
用于筛选钙调蛋白序列变化的合适方法包括高分辨熔解(HighResolution Melting)(Erali和Wittwer.2010)、变性高效液相色谱(DenaturingHigh Performance Liquid Chromatography)(DHPLC；Liu等人,1998)和单链构象多态性检测(Single-Stranded Conformational Polymorphismdetection)(SSCP:Schafer等人,1998)。一旦发现个体的钙调蛋白序列中包含序列变化，可以随后使用标准多核苷酸测序方法确定特异性突变(如以上所描述的那些)。
在另一个实施方案中，钙调蛋白多核苷酸序列中的一个或多个突变可以通过针对单个突变或多核苷酸位置进行突变分析来鉴定，例如针对疑似存在于待测试的个体中的已知突变进行突变分析来鉴定。这样的方法可能适合测试与已经知道具有特定突变的个体有关的个体，例如属于其中一个或多个家族成员已经被鉴定为具有钙调蛋白突变的家族的个体。
用于确定个体的钙调蛋白序列中是否具有特异性突变的合适方法包括：PCR/连接酶检测反应(Yi等人,2011)、质谱应用(Mass-Spectrometryapplications)(Rodi等人,2002)、等位基因特异性杂交(Prince等人,2001)、等位基因特异性限制酶切(allele-specific restriction digests)以及突变特异性聚合酶链式反应。
在另一个实施方案中，钙调蛋白多核苷酸序列中的一个或多个突变可以通过分析来自个体的样品中(例如血液或心脏组织样品中)的钙调蛋白多肽或其片段来鉴定。任何合适的方法可以用于分析钙调蛋白多肽，包括免疫学方法、色谱法和光谱法。
例如，可以使用下述抗体检测来自哺乳动物的样品中导致突变的钙调蛋白多肽表达的钙调蛋白序列中的突变，所述抗体识别突变的钙调蛋白多肽，但不识别野生型钙调蛋白多肽。例如，这样的抗体可以识别与野生型钙调蛋白多肽有一个或多个氨基酸残基不同的突变的钙调蛋白多肽，而不识别野生型多肽。这样的抗体可以是天然存在的、重组的或合成的。
在优选的实施方案中，通过高分辨熔解(HRM)分析来检测突变(参见“试剂盒”部分)。
突变
如本文所述的，经分离的多核苷酸包含与心脏疾病相关的至少一个突变。即，包含该突变的个体可能易患心脏失调、具有增加的罹患心脏失调的风险，或个体可能已经罹患心脏失调。
优选地，多核苷酸序列中的至少一个突变导致编码的多肽序列中至少一个突变，并且优选地产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的编码的突变的钙调蛋白。
在一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合或由与RYR2受体的异常结合组成，优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，结合增加或减少或消失。
在另一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与钙(Ca2+)的异常结合或由与钙(Ca2+)的异常结合组成，优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，结合增加或减少或消失。
在一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合(并且，优选地其为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加或减少或消失的结合)和与钙的异常结合(并且，优选地其为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加或减少或消失的结合)两者，或由与RYR2受体的异常结合(并且，优选地其为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加或减少或消失的结合)和与钙的异常结合(并且，优选地其为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加或减少或消失的结合)两者组成。
突变可以，例如存在于钙调蛋白基因或突变的非编码区域中。在一个实施方案中，突变为不导致多肽或蛋白质的氨基酸序列改变的沉默突变。这样的突变可以例如改变基因的表达水平。
优选的是，突变存在于钙调蛋白编码基因的编码区中，例如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的编码区中。因此，在优选的实施方案中，突变位于钙调蛋白编码基因的外显子中，优选地位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的外显子中。在特定实施方案中，突变位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的外显子2中。在另一个优选的实施方案中，突变位于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的外显子4中。
在特定实施方案中，突变存在于SEQ ID NO:1的编码区中。
突变可以是任何类型的突变。在一个实施方案中，至少一个突变为一个或多个核苷酸的缺失，例如至少1个核苷酸，如至少2个核苷酸，至少3个核苷酸，例如至少4个核苷酸，如至少5个核苷酸，至少6个核苷酸，例如至少7个核苷酸，如至少8个核苷酸，至少9个核苷酸，例如至少10个核苷酸，如至少11个核苷酸，至少12个核苷酸，例如至少13个核苷酸，如至少14个核苷酸，至少15个核苷酸，或例如至少20个核苷酸的缺失。
在另一个实施方案中，至少一个突变为一个或多个核苷酸的插入，例如至少1个核苷酸，如至少2个核苷酸，至少3个核苷酸，例如至少4个核苷酸，如至少5个核苷酸，至少6个核苷酸，例如至少7个核苷酸，如至少8个核苷酸，至少9个核苷酸，例如至少10个核苷酸，如至少11个核苷酸，至少12个核苷酸，例如至少13个核苷酸，如至少14个核苷酸，至少15个核苷酸，或例如至少20个核苷酸的插入。
在优选的实施方案中，至少一个突变为点突变。在点突变中，单个核苷酸被替换成另一个核苷酸。点突变可以为A>G突变、A>C突变、A>T突变、T>G突变、T>C突变、T>A突变、G>T突变、G>C突变、G>A突变、C>G突变、C>T突变或C>A突变。在更优选的实施方案中，点突变为改变单个核苷酸的错义突变，产生编码不同氨基酸的密码子。
因此，在优选的实施方案中，根据本发明的经分离的多核苷酸包含导致氨基酸替换的至少一个突变。
在特定实施方案中，经分离的多核苷酸包含导致氨基酸替换Asn97Ser的突变。如在所附的实施例中所证实的，在钙调蛋白中的氨基酸替换Asn97Ser导致其与RYR2受体的结合减少或消失，和/或其对RYR2受体的结合亲和力减小或消失。所附的实施例还证实了在钙调蛋白中的氨基酸替换Asn97Ser还导致其与钙的结合减少或消失，和/或其对钙的结合亲和力减小或消失。
在另一个特定实施方案中，经分离的多核苷酸包含导致氨基酸替换Asn53Ile的突变。如在所附的实施例中所证实的，在钙调蛋白中的氨基酸替换Asn53Ile导致其与钙的异常结合(如其与钙的结合增加或减少或消失，和/或其对钙的结合亲和力增大或减小或消失)。
在一个实施方案中，所述经分离的多核苷酸包含导致氨基酸替换Asn97Ser和Asn53Ile的突变。
因此，在优选的实施方案中，经分离的多核苷酸包含导致氨基酸替换Asn53Ser的突变。具体实例为突变A4403G，其中位于SEQ ID NO:1的第4403位的腺嘌呤被鸟嘌呤替换。包含突变A4403G的序列为SEQ ID NO:8。包含Asn53Ser的钙调蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
在另一个优选的实施方案中，经分离的多核苷酸包含导致氨基酸替换Asn97Ile的突变。具体实例为突变A7404T，其中位于SEQ ID NO:1的第7404位的腺嘌呤被胸腺嘧啶替换。包含突变A7404T的序列为SEQ ID NO:11。包含Asn97Ser的钙调蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO:13。
Asn97Ser的意思是位于SEQ ID NO:4的第97位氨基酸天冬酰胺已经被丝氨酸替换(SEQ ID NO:13)。Asn53Ile的意思是位于SEQ ID NO:4的第53位氨基酸天冬酰胺已经被异亮氨酸替换(SEQ ID NO:10)。
如本文所述的突变可以例如为隐性突变。在优选的实施方案中，突变为显性突变，特别是常染色体显性突变。
在一个实施方案中，显性突变可以为改变基因产物使得其获得新功能的功能获得性突变。在另一个实施方案中，显性突变为具有改变的基因产物的显性负突变，所述改变的基因产物与野生型等位基因功能拮抗。
在一个实施方案中，突变可以为遗传性突变。因此，突变可以例如为显性遗传性突变或常染色体显性遗传性突变。在优选的实施方案中，遗传性突变为错义突变。
在另一个实施方案中，突变为新生突变(de novo mutation)，或特别是显性新生突变。在优选的实施方案中，新生突变为错义突变。
如本文所述的经分离的多核苷酸可以包含一个或多个如本文所述的突变，即，多核苷酸可以例如包含两个或多个如本文所述的突变的组合。
包含至少一个突变的钙调蛋白多肽
本发明的另一方面涉及包含钙调蛋白(CaM)或钙调蛋白的至少一部分的经分离的多肽，其中所述多肽包含与心脏失调相关的至少一个突变。
优选地，多肽序列中的至少一个突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的编码的突变的钙调蛋白，如本文所述。
在一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合或由与RYR2受体的异常结合组成，优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，其中结合增加或减少或消失。
在另一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与钙(Ca2+)的异常结合或由与钙(Ca2+)的异常结合组成，优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，其中结合增加或减少或消失。
在一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合(并且优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加或减少或消失的结合)和与钙的异常结合(并且优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加或减少或消失的结合)，或由与RYR2受体的异常结合(并且优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加或减少或消失的结合)和与钙的异常结合(并且优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加或减少或消失结合)组成。
在特定实施方案中，经分离的多核苷酸与SEQ ID NO:4或其部分具有至少85％的序列同一性，如至少90％的序列同一性，至少95％的序列同一性，如至少97％的序列同一性，至少98％的序列同一性，如至少99％的序列同一性。优选的是，经分离的多核苷酸与SEQ ID NO:4或其部分具有至少95％的序列同一性。
如本文所述的经分离的多肽可以例如包含SEQ ID NO:4的至少5个氨基酸，例如至少10个氨基酸，如至少15个氨基酸，至少20个氨基酸，例如至少25个氨基酸，如至少30个氨基酸，至少50个氨基酸，例如至少60个氨基酸，如至少70个氨基酸，至少80个氨基酸，例如至少90个氨基酸，如至少100个氨基酸，至少120个氨基酸，或例如至少140个氨基酸。在一个实施方案中，经分离的多肽包含SEQ ID NO:4的完整氨基酸序列。
在一个实施方案中，如本文所述的经分离的多肽与SEQ ID NO:4的至少10个连续氨基酸，如至少15个连续氨基酸，至少20个连续氨基酸，例如至少25个连续氨基酸，如至少30个连续氨基酸，至少50个连续氨基酸，例如至少60个连续氨基酸，如至少70个连续氨基酸，至少80个连续氨基酸，例如至少90个连续氨基酸，如至少100个连续氨基酸，至少120个连续氨基酸或例如至少140个连续氨基酸，具有至少85％的序列同一性，如至少90％的序列同一性，至少95％的序列同一性，如至少97％的序列同一性，至少98％的序列同一性，如至少99％的序列同一性。在优选的实施方案中，经分离的多肽与SEQ ID NO:4的至少20个连续氨基酸具有至少95％的序列同一性。
在一个实施方案中，经分离的多肽为纯化的氨基酸序列。氨基酸序列可以根据技术人员已知的方法进行纯化。
如本文所述的经分离的多肽包含与心脏失调相关的至少一个突变。即，包含该突变的个体可能易患心脏失调、具有增加的罹患心脏失调的风险，或个体可能已经罹患心脏失调。
突变可以为钙调蛋白或SEQ ID NO:4或其部分中的任何种类的氨基酸突变。例如，突变可以为氨基酸的缺失或插入。在优选的实施方案中，突变为氨基酸替换。
在特定实施方案中，经分离的多肽包含突变Asn97Ser。如在所附的实施例中所证实的，钙调蛋白中的氨基酸替换Asn97Ser导致其与RYR2受体的结合减少或消失，和/或其对RYR2受体的结合亲和力减小或消失。所附的实施例还证实了钙调蛋白中的氨基酸替换Asn97Ser还导致其与钙的结合减少或消失和/或其对钙的结合亲和力减小或消失。
在另一个特定实施方案中，经分离的多肽包含导致氨基酸替换Asn53Ile的突变。如在所附的实施例中所证实的，在钙调蛋白中的氨基酸替换Asn53Ile导致其与钙的异常结合(如其与钙的结合增加或减少或消失，和/或其对钙的结合亲和力增大或减小或消失)。
在一个实施方案中，所述经分离的多肽包含导致氨基酸替换Asn97Ser和Asn53Ile的突变。
因此，在优选的实施方案中，经分离的多肽包含突变Asn53Ile(SEQ IDNO:10)。在另一个优选的实施方案中，经分离的多肽包含突变Asn97Ser(SEQ ID NO:13)。
Asn97Ser的意思是位于SEQ ID NO:4的第97位氨基酸天冬酰胺已经被丝氨酸替换，而Asn53Ile的意思是位于SEQ ID NO:4的第53位氨基酸天冬酰胺已经被异亮氨酸替换。
如本文所述的经分离的多肽可以包含一个或多个如本文所述的突变，即经分离的多肽可以例如包含两个或多个如本文所述的突变的组合。
心脏失调
如本文所述，编码钙调蛋白(CaM)或钙调蛋白(CaM)的至少一部分的经分离的多核苷酸包含与心脏失调相关的至少一个突变，并且类似地，包含钙调蛋白(CaM)或钙调蛋白(CaM)的至少一部分的经分离的多肽包含与心脏失调相关的至少一个突变。
如本文所称的术语“心脏失调”包括与心脏相关的任何不良事件，包括但不限于，劳累诱导的或运动诱导的心脏事件、心脏性猝死、心脏骤停、心室纤维性颤动、室性心动过速、室性期外收缩、室性期前收缩和室性二联律。心脏失调可以例如为心律失常。在一个实施方案中，所述心脏失调为室性心动过速或多形性室性心动过速。在特定实施方案中，心脏失调为儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)。在一个实施方案中，所述心脏失调可以为药物诱导的心律失常。在进一步优选的实施方案中，所述心脏失调选自：婴儿猝死综合征(SIDS)、突发性猝死综合征(SUDS)、晕厥、癫痫发作、心脏事件。
在特定实施方案中，心脏失调可以与心脏性猝死相关或导致心脏性猝死。如果在来自婴儿的样品中发现突变，则该婴儿可能易患婴儿猝死综合征。
在优选的实施方案中，所述心脏失调为心律失常。心律失常是异常或不规则的心脏节律。心跳可能例如太慢(心动过缓)或太快(心动过速)，或太早。当一次心跳的发生比正常早时，其被称为期前收缩。在具体实施方案中，心律失常为药物诱导的心律失常。
在另一个优选的实施方案中，心脏失调为室性心动过速，例如多形性室性心动过速。在特别优选的实施方案中，心脏疾病为儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)。
儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)为引起结构正常的心脏心律失常和猝死的遗传性疾病。受影响的患者具有典型应激诱导的心房(室上性心动过速和房颤)和心室(双向性/多形性室性心动过速和心室纤维性颤动)心律失常模式。CPVT患者的静息心电图是正常的，而心律失常可以由突然的肾上腺素能兴奋(运动或剧烈情绪)可重复地触发。
如本文所述在CALM1基因中鉴定了突变Asn97Ser并且发现在患有重度显性遗传形式的CPVT的瑞典大家族中突变Asn97Ser与CPVT一起分离，而突变Asn53Ile被本发明人鉴定为CALM1基因中的新生突变(参见实施例部分)。
方法
钙调蛋白编码基因和/或钙调蛋白中的突变的鉴定可以用于确定个体是否具有增加的罹患心脏失调的风险的方法和用于诊断失调如个体的心脏失调的方法。
此外，与野生型钙调蛋白相比具有改变的功能特性的突变的钙调蛋白的鉴定可以用于确定个体是否具有增加的罹患心脏失调的风险的方法和用于诊断失调如个体的心脏失调的方法。
在一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合或由与RYR2受体的异常结合组成，优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，结合增加或减少或消失。在另一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与钙(Ca2+)的异常结合或由与钙(Ca2+)的异常结合组成，优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，结合增加或减少或消失。在进一步的实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合(并且优选为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加或减少或消失的结合)和与钙的异常结合(并且优选为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加或减少或消失的结合)两者，或由与RYR2受体的异常结合(并且优选为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加或减少或消失的结合)和与钙的异常结合(并且优选为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加或减少或消失的结合)两者组成。
适于确定钙调蛋白与RYR2受体的异常结合(例如增加或减少或消失的结合)和/或与钙(Ca2+)的异常结合(例如增加或下降或消失的结合)的方法对于本领域技术人员而言是众所周知的，并且包括例如在所附的实施例中所描述的方法。
因此，本发明的一方面涉及用于确定个体是否具有增加的罹患失调或心脏性猝死的风险的方法，其中所述方法包括确定钙调蛋白编码基因中或钙调蛋白编码基因的部分中是否存在至少一个突变，其中所述至少一个突变的存在指示罹患失调或心脏性猝死的风险增加。优选地，至少一个突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的编码的突变的钙调蛋白(如本文所述)。
本发明的另一方面涉及用于确定个体是否具有增加的罹患失调或心脏性猝死的风险的方法，其中所述方法包括确定是否存在与野生型钙调蛋白相比具有一个或多个改变的功能特性的钙调蛋白(如以上所讨论的)，其中一个或多个改变的特性的存在指示罹患失调或心脏性猝死的风险增加。
钙调蛋白编码基因可以例如选自CALM1、CALM2和CALM3。优选的是所述失调为心脏失调。
在具体实施方案中，本发明涉及用于确定个体是否具有增加的罹患心脏失调或心脏性猝死的风险的方法，其中所述方法包括
-确定来自所述个体的样品中CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQID NO:2)和/或CALM3(SEQ ID NO:3)中，和/或与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的多核苷酸中是否存在至少一个突变，和/或
-确定来自所述个体的样品中具有SEQ ID NO:4的多肽中，或与SEQID NO:4或其部分具有至少90％的序列同一性的多肽中是否存在至少一个突变，
其中所述至少一个突变的存在指示罹患失调或心脏性猝死的风险增加。
优选地，至少一个突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的编码的突变的钙调蛋白(如本文所述)。
如以上所讨论的，优选的是，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)，或由与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)组成，和/或与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)或由与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)组成。
在特定实施方案中，经分离的多肽包含突变Asn97Ser。如在所附的实施例中所证实的，在钙调蛋白中的氨基酸替换Asn97Ser导致其与RYR2受体的结合减少或消失和/或其对RYR2受体的结合亲和力减小或消失。所附的实施例还证实了在钙调蛋白中的氨基酸替换Asn97Ser还导致其与钙的结合减少或消失和/或其对钙的结合亲和力减小或消失。
在另一个特定实施方案中，经分离的多肽包含导致氨基酸替换Asn53Ile的突变。如在所附的实施例中所证实的，在钙调蛋白中的氨基酸替换Asn53Ile导致其与钙的异常结合(如其与钙的结合增加或减少或消失，和/或其对钙的结合亲和力增加或减小或消失)。
在一个实施方案中，所述经分离的多肽包含导致氨基酸替换Asn97Ser和Asn53Ile的突变。
在优选的实施方案中，所述个体为哺乳动物，而在最优选的实施方案中，所述个体为人。个体可以例如为婴儿、儿童、青少年或成年人。在一个实施方案中，所述个体为具有遗传形式的心脏失调，例如CPVT的家族史的人。因此，在一个实施例中，所述个体为疑似罹患心脏失调或具有CALM1、CALM2和/或CALM3中的突变的健康个体。
本发明的另一方面涉及用于诊断个体的失调的方法，其中所述方法包括确定钙调蛋白编码基因中或钙调蛋白编码基因的部分中是否存在至少一个突变，其中所述至少一个突变的存在指示失调或罹患失调的风险增加。优选地，至少一个突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的编码的突变的钙调蛋白(如本文所述)。
本发明的另一方面涉及用于诊断个体的失调的方法，其中所述方法包括确定是否存在与野生型钙调蛋白相比具有一个或多个改变的功能特性的钙调蛋白(如以上所讨论的)，其中一个或多个改变的特性的存在指示失调或罹患失调的风险增加。优选地，所述一个或多个改变的功能特性如本文所讨论的。
优选的是所述失调为心脏失调。钙调蛋白编码基因可以例如选自CALM1、CALM2和CALM3。
钙调蛋白序列中的一个或多个突变的存在还可以用于指示与钙调蛋白序列中不具有突变的相应个体相比，所述个体是否更易患淹溺或原因不明的猝死综合征。
在一些情况下，钙调蛋白序列中的一个或多个突变的存在与否可以与其它信息(例如，其它诊断测试的结果)组合用于确定个体是否易患淹溺或患晕厥、癫痫发作、心脏事件、婴儿猝死综合征(SIDS)和/或突发性猝死综合征(SUDS)。例如，钙调蛋白序列中的一个或多个突变的存在与否可以与心电图、超声心动图、运动测试(如，心电图踏车运动测试或心肺运动测试)或医学检查的结果组合使用。在一些情况下，关于钙调蛋白序列中突变的存在与否的信息可以与病史、家族史或来自已经记录心脏在一段时间内(例如，数天)的电活动的装置的信息一起使用。
钙调蛋白序列中的一个或多个突变的存在还可以用于区分一种病症(例如，CPVT或极早发作型重度LQTS，伴随可能的多形性室性心动过速)(Nyegaard等人2012,Crotti等人2013)与另一种病症(例如，单独LQTS)。例如，与钙结合亲和力的变化、钙调蛋白钙结合解离速率的增加、钙调蛋白/RYR2复合物钙结合亲和力或钙调蛋白折叠稳定性相关的钙调蛋白序列中的一个或多于一个的突变的存在，可以指示哺乳动物具有CPVT而不是LQTS，尤其是当哺乳动物为LQTS基因型阴性时。阴性LQTS基因型可以为KCNQ1/KVLQT1、KCNH2/HERG、SCN5A、KCNE1/MirK和KCNE2/MiRP1序列中的突变为阴性的基因型(Tester等人,Heart Rhythm,2(10):1099-105(2005))。
在具体实施方案中，本发明涉及用于诊断个体的心脏失调的方法，其中所述方法包括
-确定来自所述个体的样品中的CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQ ID NO:3)中，和/或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的多核苷酸中是否存在至少一个突变，和/或
-确定来自所述个体的样品中的具有SEQ ID NO:4的多肽中，或与SEQ ID NO:4其部分具有至少90％的序列同一性的多肽中是否存在至少一个突变，
其中所述至少一个突变的存在指示心脏失调或增加的罹患失调的风险，并且优选地其中所述至少一个突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的突变的钙调蛋白。
如以上所讨论的，优选的是，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)或由与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)组成，和/或与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)或由与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)组成。
在一个实施方案中，用于诊断个体的心脏失调的方法包括在所述诊断之后进行的进一步的步骤，即治疗鉴定为具有心脏失调的个体。
用于治疗这样的心脏失调的方法对于医学和药学领域中的技术人员而言是众所周知的。例如，可以使用“β阻断剂”疗法和/或钙通道阻断剂和/或通过植入除纤颤器来治疗具有心脏失调的个体。例如，特别优选的是使用“β阻断剂”疗法治疗鉴定为仅具有LQTS的个体，而使用钙通道阻断剂和/或使用植入的除纤颤器治疗具有CPVT或极早发作型重度LQTS的个体。
如本文所述的方法可以与其它信息(例如，其它诊断测试的结果)组合用于确定个体是否易患心脏失调。例如，所述方法可以与心电图、超声心动图、运动测试(如，心电图踏车运动测试或心肺运动测试)或医学检查的结果组合使用。所述方法还可以与病史或家族史和/或来自已经记录心脏在一段时间内(例如，数天)的电活动的装置的信息一起使用。
如本文在“包含至少一个突变的钙调蛋白多核苷酸”部分中所定义的多核苷酸如在“突变”部分中所定义的。
特别地，突变可以包括氨基酸替换Asn97Ser或由氨基酸替换Asn97Ser组成。如在所附的实施例中所证实的，在钙调蛋白中的氨基酸替换导致其与RYR2受体的结合减少或消失，和/或其对RYR2受体的结合亲和力减小或消失。所附的实施例还证实了在钙调蛋白中的氨基酸替换Asn97Ser还导致其与钙的结合减少或消失，和/或其对钙的结合亲和力减小或消失。
供选择地，突变可以包括氨基酸替换Asn53Ile或由氨基酸替换Asn53Ile组成。如在所附的实施例中所证实的，在钙调蛋白中的氨基酸替换Asn53Ile导致其与钙的异常结合(如其与钙的结合增加或减少或消失，和/或其对钙的结合亲和力增大或减小或消失)。
在一个实施方案中，所述突变包括Asn97Ser和Asn53Ile，或由Asn97Ser和Asn53Ile组成。
在具体实施方案中，在
-CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQID NO:3)和/或
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的多核苷酸
中待确定的至少一个突变导致氨基酸替换Asn53Ile和/或氨基酸替换Asn97Ser。
在另一个优选的实施方案中，在具有SEQ ID NO:4的多肽或与SEQ IDNO:4或其部分具有至少90％的序列同一性的多肽中待确定的至少一个突变为Asn53Ile和/或Asn97Ser。
用于确定个体是否具有增加的罹患心脏失调的风险的方法和用于诊断个体的心脏失调的方法可进一步包括确定个体就钙调蛋白编码基因中的突变而言是纯合的还是杂合的步骤。用于确定接合性状态的方法，例如核苷酸测序对于技术人员而言是已知的。
如以上所描述的，样品可以例如为组织样品。在一个实施方案中，样品为体液样品，例如血浆、血清、精液或尿液样品。在优选的实施方案中，样品为血液样品。样品可以通过标准程序获得并且可以立即使用，或在适于生物样品类型的条件下储存，用于随后使用。
样品可以来自受试者或包括任何动物，优选为哺乳动物的个体。优选的是所述个体为人。生物样品可以从处于生命的任何阶段的个体获得，如从胎儿、婴儿、儿童、青少年或成年人获得。特别优选的受试者为具有增加的罹患心脏失调，例如遗传性心脏失调的风险的人。
已知钙调蛋白直接结合兰尼碱受体2(RyR2)，从而调节RyR2的功能。RyR2为位于肌质网(SR)中的Ca2+释放通道，而对Ca2+从SR释放的生理控制对于在心动周期期间的及时收缩和松弛是必要的。RyR2和钙调蛋白之间的相互作用不稳定可以导致异常的RyR2-介导的Ca2+释放，所述异常的RyR2-介导的Ca2+释放与心律失常有关。
因此，在一个实施方案中，在钙调蛋白编码基因中发现的突变导致钙调蛋白和RyR2受体之间的异常结合。异常结合可以例如为钙调蛋白和RyR2之间下降的结合亲和力。钙调蛋白和RyR2之间的结合取决于Ca2+。因此，在一个实施方案中，钙调蛋白编码基因中的突变改变Ca2+与钙调蛋白的结合。钙调蛋白和Ca2+之间改变的结合可以导致钙调蛋白和RyR2之间的异常结合。在优选的实施方案中，异常结合为减少的结合。在优选的实施方案中，改变Ca2+与钙调蛋白的结合的突变位于钙调蛋白的C末端，例如SEQ ID NO:4的第75位氨基酸至第148位氨基酸。
在具体实施方案中，钙调蛋白基因中的突变改变Ca2+与钙调蛋白的结合，从而引起钙调蛋白和RyR2之间的异常结合，例如减小的结合亲和力。
在一个实施方案中，突变的钙调蛋白和RyR2之间的结合在低和/或高浓度的Ca2+下可以都是异常的。具体地，突变的钙调蛋白和RyR2之间的结合在低Ca2+浓度下为有缺陷的，而在高Ca2+浓度(例如，至少1μM Ca2+)下，突变的钙调蛋白和RyR2之间的结合恢复。在一个实施方案中，钙调蛋白基因中的突变导致在1μM以下的Ca2+浓度下钙调蛋白和RyR2之间结合亲和力下降。在一个实施方案中，在1μM以上的Ca2+浓度下，RyR2和钙调蛋白基因之间的结合亲和力可以恢复。
具有使RyR2和钙调蛋白之间的相互作用去稳定化的钙调蛋白编码基因中的突变的个体可以使用增大或增强钙调蛋白和RyR2之间的结合亲和力的试剂治疗。
本发明的再一方面涉及用于治疗具有下述失调的个体的方法，所述失调与钙调蛋白编码基因中或钙调蛋白编码基因的一部分中的至少一个突变相关，其中所述突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的突变的钙调蛋白，所述方法包括给予所述个体能够将改变的功能特性恢复和/或改进至野生型钙调蛋白中的水平的试剂。
如以上所讨论的，优选的是所述一个或多个改变的功能特性为选自包含以下特性的列表的一个或多个特性：与RYR2受体的异常结合、与钙(Ca2+)的异常结合、异常的钙调蛋白-钙结合解离速率(如钙调蛋白-钙结合解离速率的增加)、异常的钙调蛋白/RYR2复合物钙结合亲和力、钙调蛋白折叠稳定性。
在一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)或由与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)组成，在所述的实施方案中，所述方法包括以治疗有效的量，给予所述个体能够增加钙调蛋白和RYR2之间结合的试剂，从而治疗所述个体。
在另一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加)或由与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加)组成，在所述的实施方案中，所述方法包括以治疗有效的量，给予所述个体能够降低钙调蛋白和RYR2之间结合的试剂，从而治疗所述个体。
在又一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)，或由与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)组成，在所述的实施方案中，所述方法包括以治疗有效的量，给予所述个体能够增加钙调蛋白和钙(Ca2+)之间结合的试剂，从而治疗所述个体。
在再一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加)，或由与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加)组成，在所述的实施方案中，所述方法包括以治疗有效的量，给予所述个体能够降低钙调蛋白和钙(Ca2+)之间结合的试剂，从而治疗所述个体。
优选的是所述失调为心脏失调。钙调蛋白编码基因可以例如选自CALM1、CALM2和CALM3。
在具体实施方案中，本发明涉及用于治疗具有心脏失调的个体的方法，所述心脏失调与
-CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQID NO:3)中和/或
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的多核苷酸中
的至少一个突变相关，
其中所述突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的突变的钙调蛋白，所述方法包括给予所述个体能够将改变的功能特性恢复和/或改进至野生型钙调蛋白中的水平的试剂。
在一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)，或由与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)组成，在所述的实施方案中，所述方法包括以治疗有效的量，给予所述个体能够增加钙调蛋白和RYR2之间结合的试剂，从而治疗所述个体。这样的试剂可以例如为硝苯呋海因(Xu等人,Biochem BiophysResearch Comm,2010,394(3):660-666)。
在另一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加)，或由与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加)组成，在所述的实施方案中，所述方法包括以治疗有效的量，给予所述个体能够降低钙调蛋白和RYR2之间结合的试剂，从而治疗所述个体。这样的试剂可以例如为硝苯呋海因(Xu等人,Biochem Biophys Research Comm,2010,394(3):660-666)。
在另一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)，或由与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)组成，在所述的实施方案中，所述方法包括以治疗有效的量，给予所述个体能够增加钙调蛋白和钙(Ca2+)之间结合的试剂，从而治疗所述个体。
在另一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加)，或由与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加)组成，在所述的实施方案中，所述方法包括以治疗有效的量，给予所述个体能够降低钙调蛋白和钙(Ca2+)之间结合的试剂，从而治疗所述个体。
如本文在“包含至少一个突变的钙调蛋白多核苷酸”部分中所定义的多核苷酸如在“突变”部分中所定义的。
特别地，突变可以包括氨基酸替换Asn97Ser或由氨基酸替换Asn97Ser组成。如在所附的实施例中所证实的，在钙调蛋白中的氨基酸替换导致其与RYR2受体的结合减少或消失，和/或其对RYR2受体的结合亲和力减小或消失。所附的实施例还证实了在钙调蛋白中的氨基酸替换Asn97Ser还导致其与钙的结合减少或消失，和/或其对钙的结合亲和力减小或消失。
此外，突变可以包括氨基酸替换Asn53Ile或由氨基酸替换Asn53Ile组成。如在所附的实施例中所证实的，在钙调蛋白中的氨基酸替换Asn53Ile导致其与钙的异常结合(如其与钙的结合增加或减少或消失，和/或其对钙的结合亲和力增大或减小或消失)。
在一个实施方案中，所述突变可以包括Asn97Ser和Asn53Ile，或由Asn97Ser和Asn53Ile组成。
优选的是突变抑制钙调蛋白与RyR2的结合。
在优选的实施方案中，在
-CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQID NO:3)和/或
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的多核苷酸
中的至少一个突变导致氨基酸替换Asn97Ser。
在另一个优选的实施方案中，在具有SEQ ID NO:4的多肽或与SEQ IDNO:4或其部分具有至少90％的序列同一性的多肽中的至少一个突变为Asn97Ser。
如在本文的方法中所提及的心脏失调如在“心脏失调”部分中所定义的。因此，心脏失调可以例如为心律失常。在特定实施方案中，心脏失调为室性心动过速，例如儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)。
用于治疗心脏失调的化合物
如以上所描述的，与野生型钙调蛋白相比，钙调蛋白中的突变可以改变钙调蛋白功能特性中的一种或多种。
一方面，本发明提供了能够将突变的钙调蛋白的改变的功能特性恢复和/或改进至野生型钙调蛋白中的水平的试剂。如认识到的，这样的试剂提供了治疗具有心脏失调(如本文中所描述的那些失调)的个体的手段，所述心脏失调与由钙调蛋白中的突变引起的改变的钙调蛋白功能相关。
在一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)，或由与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)组成。
在所述的实施方案中，能够恢复突变的钙调蛋白和RYR2之间结合的试剂可以因此用于治疗具有由钙调蛋白中的一个或多个突变引起的失调如心脏失调的个体。例如，在突变的钙调蛋白与RYR2的结合减少或消失的情况下，能够建立和/或增强和/或增加突变的钙调蛋白和RYR2之间结合的试剂可以用于治疗个体。在突变的钙调蛋白与RYR2的结合增加的情况下，能够降低突变的钙调蛋白和RYR2之间结合(例如，降低至野生型水平)的试剂可以用于治疗个体。
在进一步的实施方案中，钙调蛋白中的一个或多个突变抑制钙调蛋白与RYR2的结合。优选地，当Ca2+浓度低于1μM时，钙调蛋白与RYR2的结合减少。
因此，能够增强钙调蛋白与兰尼碱受体2结合的试剂可以用于治疗具有由钙调蛋白中的一个或多个突变引起的失调如心脏失调的个体，所述钙调蛋白中的一个或多个突变抑制钙调蛋白与RYR2的结合。增强钙调蛋白与兰尼碱受体2的结合的意思是增大钙调蛋白与RyR2之间的结合亲和力。
在另一个实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)，或由与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合增加或减少或消失)组成。
在所述的实施方案中，能够恢复突变的钙调蛋白和钙(Ca2+)之间结合的试剂可以因此用于治疗具有由钙调蛋白中的一个或多个突变引起的失调如心脏失调的个体。例如，在突变的钙调蛋白与钙(Ca2+)的结合减少或消失的情况下，能够建立和/或增强和/或增加突变的钙调蛋白和钙(Ca2+)之间结合的试剂可以用于治疗个体。在突变的钙调蛋白与钙(Ca2+)的结合增加的情况下，能够降低突变的钙调蛋白和钙(Ca2+之间的结合(例如，降低至野生型水平)的试剂可以用于治疗个体。
因此，本发明的又一方面涉及用于鉴定下述化合物的方法，所述化合物能够增强钙调蛋白与兰尼碱受体2的结合，其中所述钙调蛋白包含降低与兰尼碱受体2的结合亲和力(并且优选地，其中与兰尼碱受体2的结合减少或消失)的至少一个突变，所述方法包括
-提供第一样品，所述第一样品包含钙调蛋白或其片段，兰尼碱受体2或其片段和测试化合物，所述钙调蛋白或其片段具有降低与兰尼碱受体2的结合亲和力(并且优选地，其使与兰尼碱受体2的结合减少或消失)的突变
-测量所述第一样品中结合到兰尼碱受体2的钙调蛋白的量
-提供第二样品，所述第二样品包含钙调蛋白或其片段和兰尼碱受体2或其片段，所述钙调蛋白或其片段具有降低与兰尼碱受体2的结合亲和力(并且优选地，其使与兰尼碱受体2的结合减少或消失)的突变
-测量所述第二样品中结合到兰尼碱受体2蛋白的钙调蛋白的量
-比较第一和第二样品中结合到兰尼碱受体2蛋白的钙调蛋白的量，从而与第二样品相比，第一样品中结合到兰尼碱受体2蛋白的钙调蛋白的更高指示测试化合物增强钙调蛋白与兰尼碱受体2蛋白的结合。
优选地，降低与兰尼碱受体2的结合亲和力(并且优选地，其中与兰尼碱受体2的结合减少或消失)的突变包括氨基酸替换Asn97Ser，并且更优选地，包括氨基酸替换Asn97Ser和Asn53Ile。
在优选的实施方案中，钙调蛋白与SEQ ID NO:4或其部分具有至少90％的序列同一性。在另一个优选的实施方案中，具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4或其部分具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列中的至少一个突变是Asn97Ser。
所述第一样品包含钙调蛋白和测试化合物，所述钙调蛋白具有降低与兰尼碱受体2的结合亲和力(并且优选地，其中与兰尼碱受体2的结合减少或消失)的突变。所述测试化合物为测试其改进突变的钙调蛋白与RyR2的结合的能力的化合物。钙调蛋白和RyR2蛋白可以例如存在于细胞提取物或纯化形式中。因此，样品可以包含含有RyR2蛋白和突变的钙调蛋白的细胞提取物。在一个实施方案中，样品包含纯化的钙调蛋白和RyR2蛋白。用于纯化蛋白的方法在本领域中是众所周知的。
可以通过使用不同浓度的钙调蛋白和RyR2，在存在不同浓度的测试化合物的情况下考察钙调蛋白与RyR2结合的亲和力。样品中蛋白质的浓度可以例如为10nM至10μM，例如100nM至10μM，如1μM至5μM。样品中测试化合物的浓度可以例如为1nM至1mM。
认识到第一和第二样品进一步包含Ca2+。样品可以包含各种浓度的Ca2+，例如10nM至200μM Ca2+。
在存在各种Ca2+浓度的情况下，对钙调蛋白与RyR2结合的亲和力的研究详细描述在实施例4中。
优选的是第一样品和第二样品包含相等浓度的钙调蛋白、RyR2蛋白和Ca2+，使得在存在或不存在测试化合物的情况下，分别从第一和第二样品中获得的关于结合亲和力的数据具有可比性。
测量在第一和第二样品中结合到兰尼碱受体2蛋白的钙调蛋白的量可以通过技术人员已知的常规方法进行。钙调蛋白与RyR2结合的亲和力可以例如通过测量特定氨基酸的固有荧光来评估(参见实施例部分)。供选择地，钙调蛋白与RyR2结合的亲和力可以通过以下方法来评估，即通过利用抗RyR2抗体的常规拉下试验(pull-down assay)，然后使用抗钙调蛋白抗体检测结合的钙调蛋白(Biochem Biophys Res Commun,2010,394(3):660-666)。
本发明的再一方面涉及用于鉴定能够增强钙调蛋白与钙(Ca2+)的结合的化合物，其中所述钙调蛋白包含降低与钙(Ca2+)的结合亲和力(并且优选地其使与钙(Ca2+)的结合减少或消失)的至少一个突变，所述方法包括
-提供第一样品，所述第一样品包含钙调蛋白或其片段和测试化合物，钙(Ca2+)和测试化合物，所述钙调蛋白或其片段具有降低与钙(Ca2+)的结合亲和力(并且优选地，其中与钙(Ca2+)的结合减少或消失)的突变
-测量所述第一样品中结合到钙(Ca2+)的钙调蛋白的量
-提供第二样品，所述第二样品包含钙调蛋白或其片段和钙(Ca2+)，所述钙调蛋白或其片段具有降低与钙(Ca2+)的结合亲和力(并且优选地，其中与钙(Ca2+)的结合减少或消失)的突变
-测量所述第二样品中结合到钙(Ca2+)的钙调蛋白的量
-比较第一和第二样品中结合到钙(Ca2+)的钙调蛋白的量，从而与第二样品相比，第一样品中结合到钙(Ca2+)的钙调蛋白的量更高指示测试化合物增强了钙调蛋白与钙(Ca2+)的结合。
优选地，降低与钙(Ca2+)的结合亲和力(并且优选地，其中与钙(Ca2+)的结合减少或消失)的突变包括氨基酸替换Asn53Ile，并且更优选地，包括氨基酸替换Asn53Ile和Asn97Ser。
本发明进一步涉及通过上述方法鉴定的化合物，所述化合物用于治疗具有心脏失调的个体，所述心脏疾病与CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQ ID NO:3)中和/或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列中的至少一个突变相关，其中所述突变降低钙调蛋白和兰尼碱受体2之间的结合亲和力。
在优选的实施方案中，
-CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQID NO:3)和/或
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的多核苷酸
中的至少一个突变导致氨基酸替换Asn97Ser。
在另一个优选的实施方案中，具有SEQ ID NO:4的多肽或与SEQ IDNO:4或其部分具有至少90％的序列同一性的多肽中的至少一个突变为Asn97Ser。
药物组合物
本发明的一方面涉及用于治疗具有心脏失调的个体的药物组合物，所述心脏失调与钙调蛋白(CaM)或其至少一部分中的至少一个突变相关，其中所述突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的突变的钙调蛋白，并且其中所述组合物包含能够将改变的功能特性恢复和/或改进至野生型钙调蛋白中的水平的试剂。
如以上所讨论的，优选的是所述一个或多个改变的功能特性为选自包含以下特性的列表的一个或多个特性：与RYR2受体的异常结合、与钙(Ca2+)的异常结合、异常的钙调蛋白-钙结合解离速率(如钙调蛋白-钙结合解离速率的增加)、异常的钙调蛋白/RYR2复合物钙结合亲和力、钙调蛋白折叠稳定性。
在一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合或由与RYR2受体的异常结合组成。优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，结合减少或消失。然而，在供选择的实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合亲和力相比，对RYR2的结合亲和力增大。
在另一个实施方案中，突变的钙调蛋白显示的改变的功能特性可以包括与钙(Ca2+)的异常结合或由与钙(Ca2+)的异常结合组成。优选地，与野生型钙调蛋白显示的结合相比，结合减少或消失。然而，在供选择的实施方案中，与野生型钙调蛋白显示的结合亲和力相比，对钙(Ca2+)的结合亲和力增大。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗具有心脏失调的个体的药物组合物，所述心脏失调与CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQ ID NO:3)中的至少一个突变相关，其中所述组合物包含能够增大钙调蛋白和兰尼碱受体2之间的结合亲和力的试剂。
药物组合物为包含具有药物特性的一种或多种物质以及药学上可接受的载体的组合物。
如以上所述的化合物可以配制为药物组合物并以适合于所选择的给药途径的多种形式给予哺乳动物宿主，如人类患者。给药途径包括，例如静脉内、动脉内、皮下、肌内、腹腔内和由本领域技术人员选择的其它途径。
化合物的溶液可以例如用水或盐水制备，并且任选地与无毒表面活性剂混合。静脉内或动脉内给药的制剂可以包括也可以包含缓冲液、脂质体、稀释剂和其它适合的添加剂的无菌水溶液。药物组合物还可以包含或包括血清。
适合于注射或输注的药物剂型可以包括含有活性成分的无菌水溶液或分散剂，所述无菌水溶液或分散剂适合于通过封装在脂质体中给药。在所有情况下，最终的剂型必须是无菌的流体并且在生产和储存的条件下稳定。
如本文所述的药物组合物包含能够增大钙调蛋白和兰尼碱受体2之间的结合亲和力的试剂。在优选的实施方案中，所述试剂通过如上所述的用于鉴定化合物的方法进行鉴定。
所述药物组合物用于治疗具有心脏疾病的个体。心脏疾病在“心脏疾病”部分中描述。因此，心脏失调可以例如为心律失常或例如药物诱导的心律失常。在特定实施方案中，心脏失调为室性心动过速，例如儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)。
试剂盒
本发明还提供了可以用于检测钙调蛋白中的突变的试剂盒。
在一个实施方案中，本发明提供了可以用于检测钙调蛋白编码基因，如CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQID NO:3)中的突变的试剂盒。
因此，一方面，本发明提供了用于检测在编码钙调蛋白(CaM)或钙调蛋白(CaM)的至少一部分的多核苷酸中的至少一个突变，其中所述试剂盒包括与所述钙调蛋白编码基因的序列互补的至少一个寡核苷酸，使得如果在多核苷酸中存在突变，则由所述寡核苷酸的链延伸产生包含所述突变的延伸产物。
多核苷酸在“包含至少一个突变的钙调蛋白多核苷酸”部分中定义。在优选的实施方案中，多核苷酸为钙调蛋白编码基因。
寡核苷酸包含与多核苷酸的序列互补或基本上互补的序列，使得寡核苷酸结合到多核苷酸，从而使链能够延伸。寡核苷酸被设计成结合到多核苷酸的区域或在多核苷酸的区域的存在下退火，测试所述多核苷酸的区域中至少一个突变的存在，使得所生成的延伸产物包含测试其中至少一个突变的存在的序列。如果在样品中存在突变，则这将会产生包含突变的延伸产物。因此，寡核苷酸可以用于引发包含待检测的突变的多核苷酸区域的延伸。
在一个实施方案中，寡核苷酸包含待检测的突变。因此，寡核苷酸更加特异性地结合到具有突变的基因。优选的是突变位于寡核苷酸的3’端。
在具体实施方案中，寡核苷酸特异性地结合到包含Asn97Ser的钙调蛋白编码基因的区域。因此，在一个实施方案中，寡核苷酸包含与多核苷酸的核苷酸序列互补的序列，其中所述核苷酸序列包含导致氨基酸替换Asn97Ser的突变。
在另一个具体实施方案中，寡核苷酸特异性地结合到包含Asn53Ile的钙调蛋白编码基因的区域。因此，在一个实施方案中，寡核苷酸包含与多核苷酸的核苷酸序列互补的序列，其中所述核苷酸序列包含导致氨基酸替换Asn53Ile的突变。
在特别优选的实施方案中，所述试剂盒包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸特异性地结合到包含Asn97Ser的钙调蛋白编码基因的区域(例如，具有与导致氨基酸替换Asn97Ser的多核苷酸的核苷酸序列互补的序列的寡核苷酸)，而所述第二寡核苷酸特异性地结合到包含Asn53Ile的钙调蛋白编码基因的区域(例如，具有与导致氨基酸替换Asn53Ile的多核苷酸的核苷酸序列互补的序列的寡核苷酸)。
在特别优选的实施方案中，多核苷酸选自CALM1(SEQ ID NO:1),CALM2(SEQ ID NO:2)和CALM3(SEQ ID NO:3)。在特定实施方案中，多核苷酸为CALM1(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含一个或多个多核苷酸模板，所述一个或多个多核苷酸模板包含突变的钙调蛋白多核苷酸序列的部分或全部，其可以用作用来鉴定样品中突变的钙调蛋白多核苷酸的阳性对照。例如，所述一个或多个多核苷酸模板可以包含钙调蛋白多核苷酸序列(例如，通过SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3所定义的)，所述钙调蛋白多核苷酸序列具有编码Asn97Ser和/或Asn53Ile的突变。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含引物，所述引物结合到与含有突变的寡核苷酸结合的核苷酸链互补的核苷酸链，使得引物的延伸产物包含与含有突变的寡核苷酸的延伸产物互补的区域。
所述试剂盒还包含耐热性DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶、核苷酸和辅助因子以启动DNA序列的扩增。因此，所述试剂盒可以包含对于在野生型基因组DNA的背景下，快速和灵敏检测低百分比的突变DNA所必需的所有试剂。突变可以例如通过DNA测序分析进行检测。
在一个实施方案中，所述试剂盒用于通过实时PCR或qPCR检测突变。
在这方面，所述试剂盒可以包含含有待检测的突变的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够选择性地扩增包含突变的序列。含有待检测的突变的寡核苷酸可以例如共价连接到包含荧光团和猝灭剂的探针。在PCR过程中，当寡核苷酸结合到多核苷酸链上时，荧光团和猝灭剂分开。这导致来自反应管的荧光增加。
所述试剂盒还可以用于通过解链分析来检测突变。因此所述试剂盒还可以包含用于解链分析，例如高分辨率解链(HRM)分析的组分。
高分辨率解链(HRM)分析是用于鉴定核酸序列中变异的PCR后分析(post-PCR analysis)方法。该方法是基于检测在PCR产生的扩增子的解链温度中的微小差异。该过程仅仅是使样品或反应混合物从约50℃精确加温至高达约95℃。在该过程中的一些点，达到扩增子的解链温度，并且双链DNA分离，即扩增子变性为单链DNA。
在HRM分析中，使用能够实时检测过程的荧光染料。可以用于HRM的染料被称为特异性地结合到双链DNA的嵌入染料(intercalating dyes)并且当它们结合时，它们发出明亮的荧光。当双链DNA变性为单链DNA时，嵌入染料从DNA中解离。当嵌入染料未结合到DNA时，它们仅发出低水平的荧光。在HRM分析开始时，由于双链扩增子，样品中有高水平的荧光。但随着温度升高，扩增子的双链解链分开，双链DNA的浓度降低并且因此荧光减少。HRM机器具有测量荧光的照相机，并且之后机器将数据绘制为称为解链曲线的图，所述图显示不同温度下的荧光水平。例如，当样品中存在具有不同解链温度的两个扩增子时，这将产生两种不同的解链曲线。
在一个实施方案中，所述试剂盒用于通过低变性温度共扩增PCR(co-amplification of lower denaturation temperature PCR，COLD-PCR)检测突变。因此，所述试剂盒还可以包含用于解链分析，例如COLD-PCR的组分。
在完整COLD-PCR中，实施五步PCR方案，其包括标准的变性步骤、杂交步骤、在限定的临界温度(Tc)下的临界变性步骤、引物退火步骤和延伸步骤。在PCR循环期间使用杂交步骤(通常在70℃下进行)以使得突变体和野生型等位基因杂交。所产生的异源双链在比同源双链低的温度下解链，该异源双链可以使用扩增子特异性Tc选择性地变性并且在整个PCR过程中优先扩增；相反，对于同源双链分子，变性效率降低，结果，在整个热循环过程中大部分分子将保留在双链的同源双链状态。因此，主要等位基因(通常是野生型)的扩增效率明显降低。然而，通过将变性温度降低至Tc，在沿着序列的任何位置的突变在COLD-PCR扩增期间都优先富集。
在快速COLD-PCR中，含有突变的扩增子选择性地变性。COLD-PCR的根本原则在于，如果突变意味着扩增子中氢键的数量减少，则单个核苷酸突变可以稍微改变双链DNA的解链温度，如G>A突变、C>T突变、G>T突变或C>A突变(突变的解链温度)。沿着双链DNA序列的任何地方的突变的单个核苷酸解链温度，使所述序列的解链温度中产生小的变化，并且突变的序列在低于野生型序列的温度下解链。在PCR程序中COLD-PCR使用临界温度以富集扩增的序列的突变。在PCR反应中的变性步骤过程中，温度设定为导致仅包含突变的扩增子变性的这样的临界温度。从而，包含突变的序列在退火步骤和随后的扩增期间优先变性并且可用于引物结合。
在进一步的实施方案中，本发明提供了可以用于检测钙调蛋白多肽中的突变的试剂盒，例如SEQ ID NO:4的多肽中的突变的试剂盒。
在所述实施方案中，优选地，试剂盒包含能够特异性结合包含突变(并且，优选地Asn97Ser和/或Asn53Ile突变)的钙调蛋白多肽序列(如SEQID NO:4)的可检测试剂。优选的是，可检测试剂不结合野生型钙调蛋白多肽序列和/或比野生型钙调蛋白多肽序列更强烈地结合到突变的钙调蛋白多肽序列(例如，强5倍，或强10倍，或强100倍)，从而能够选择性检测突变的钙调蛋白序列。
优选地，所述可检测试剂为抗体。在优选的实施方案中，抗体为单克隆抗体，如单克隆IgG抗体。
在进一步优选的实施方案中，抗体(如单克隆抗体，或单克隆IgG抗体)能够特异性结合包含Asn97Ser和/或Asn53Ile突变的钙调蛋白多肽序列(如SEQ ID NO:4)。
在本发明的所述实施方案中，优选地，所述试剂盒还包含一个或多个多肽分子，所述一个或多个多肽分子包含突变的钙调蛋白多肽序列的部分或全部，其可以用作用来鉴定样品中突变的钙调蛋白多肽序列的阳性对照。例如，所述一个或多个多肽分子可以包含钙调蛋白多肽序列(例如，通过SEQ ID NO:4所定义的)，所述钙调蛋白多肽序列具有Asn97Ser和/或Asn53Ile突变。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可以用于检测与野生型钙调蛋白相比，在突变的钙调蛋白多肽中的一个或多个改变的功能特性。
优选地，所述一个或多个特性选自包含以下特性的列表：在钙调蛋白多肽，例如SEQ ID NO:4的多肽中，与RYR2受体的异常结合、与钙(Ca2+)的异常结合、异常的钙调蛋白-钙结合解离速率(如钙调蛋白-钙结合解离速率的增加)、异常的钙调蛋白/RYR2复合物钙结合亲和力、钙调蛋白折叠稳定性突变。
在优选的实施方案中，本发明提供了用于检测野生型钙调蛋白相比，钙调蛋白与RYR2受体的结合下降的试剂盒。在所述实施方案中，所述试剂盒包含RYR2受体(或其部分)、野生型钙调蛋白多肽(如SEQ ID NO:4的多肽)以及一个或多个多肽分子，所述一个或多个多肽分子包含显示与RYR2受体(其可以用作对照)的结合降低的、突变的钙调蛋白多肽序列的部分或全部。优选地，所述一个或多个多肽分子包含具有Asn97Ser和/或Asn53Ile突变的钙调蛋白多肽序列(例如，通过SEQ ID NO:4所定义的)。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了用于检测，与野生型钙调蛋白相比，钙调蛋白与钙(Ca2+)的结合下降的试剂盒。在所述实施方案中，所述试剂盒包含野生型钙调蛋白多肽(如SEQ ID NO:4的多肽)以及一个或多个多肽分子，所述一个或多个多肽分子包含显示与钙(Ca2+)(其可以用作对照)的结合减少的、突变的钙调蛋白多肽序列的部分或全部。优选地，所述一个或多个多肽分子包含具有Asn97Ser和/或Asn53Ile突变的钙调蛋白多肽序列(例如，通过SEQ ID NO:4所定义的)。任选地，所述试剂盒还包含RYR2受体(或其部分)。
实施例
A-实验数据
方法
CALM1测序
扩增CALM1基因的编码区、邻近的剪切位点及5’-和3’-非翻译区的引物使用Primer315(补充表1)设计。在使用标准条件和60℃的退火温度进行PCR之后，纯化扩增的产物并在MWG下对两条链测序(EurofinsMWG Operon,Ebersberg,Germany)。使用Mutation Surveyor(Softgenetics,State College,PA,USA)进行序列分析。对来自家族1的一个受影响的(索引患者)和一个未受影响的家族成员进行了测序。在发现突变之后，使用由TIB MOLBIOL(Berlin,Germany)(补充表1)开发的基因型分型试验来确认与疾病的共分离，所述基因分型试验使用LightCycler 480仪器和Roche(Roche,Hvidovre,Denmark)，HPLC纯化的引物(MWG)和LightCycler 480Genotyping Master(Roche)根据生产说明进行。
突变筛选
为了筛选CALM1的所有编码外显子中的新突变，基于扩增的PCR产物(补充表1)的高分辨率熔解(HRM)开发了五种筛选分析。使用Primer315设计引物。在Lightcycler 480仪器(Roche)上，使用HPLC纯化的引物(MWG)和LightCycler 480High Resolution Melting Master(Roche)，根据生产说明进行筛选。所有的样品一式两份进行分析，并且对具有异常熔解曲线的样品以及用于对照的具有正常熔解曲线的10个样品进行测序。所有分析条件可根据需要获得。
基于Ensembl版本63和Interim 20101123的1期变体识别，在http://browser.1000genomes.org下通过项目浏览器#ICHG2011查询2011年10月发布的1000基因组，其代表整套变体识别，和源自低覆盖范围和涉及1092个个体的外显子测序数据的INDELS。
混杂的
以Pymol(LLC)，使用分别为脱钙钙调蛋白、Ca2+-饱和钙调蛋白和结合Ca2+的钙调蛋白/RYR1复合物的PDB ID 1DMO、1CLL和2BCX来制备钙调蛋白的结构模型16,17,18。使用的钙调蛋白编号为没有起始蛋氨酸残基的成熟加工的钙调蛋白的编号。
质粒构建体
通过使用巢式引发方法(在补充表1中列出的引物)、KOD高保真聚合酶(EMD Chemicals,Gibbstown,USA)和来自肝脏的内部(in house)cDNA制备物19，通过PCR扩增来获得CALM1cDNA。使用内克隆引物的PCR产物连接到含有另外的接头序列的经修饰的pMAL_c2x载体(NewEngland Biolabs,Ipswich,USA)，所述另外的接头序列编码烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus，TEV)蛋白酶切割位点(ENLYFQG)，紧随其后的是XhoI限制性位点。所产生的载体pMal_CaM编码N末端麦芽糖结合蛋白，随后是TEV蛋白酶识别位点和没有起始Met残基的全长天然CaM。融合蛋白的TEV切割留下位于钙调蛋白的N末端Ala残基之前的N末端GLE三肽序列。使用在补充表1中列出的突变寡核苷酸和Lightning Site-Directed Mutagenesis kit(QIAGEN Nordic,Copenhagen,Denmark)根据生产商的说明引入错义突变，产生pMal_CaM-N53I和pMal_CaM-N97S表达构建体。所有构建体通过钙调蛋白编码部分的Sanger测序来确认。
蛋白表达和纯化
通过用1mM IPTG在约0.3-0.4的OD600下诱导，钙调蛋白变体在Rosetta B(DE3)细胞(EMD Chemicals)中表达，所述Rosetta B(DE3)细胞在带挡板的摇瓶(baffled shaker flasks)的1L LB培养物中37℃下生长，并持续生长3小时。使用溶菌酶和在含有广谱蛋白酶抑制剂(LifeTechnology)Benzonase核酸酶(EMD Chemicals)的裂解缓冲液(20mMTris、50mM NaCl，pH 7.5)中的三个冻结/解冻循环来裂解细胞。所有缓冲液和试剂使用纯化的和去离子(>18.2Ω电阻)的MilliQ水(Millipore,Billerica,USA)，并使用塑料容器来配制，以Ca2+使污染最小化。所有实验设备用1M HCl和MilliQ水清洗。使用的缓冲液的总Ca2+浓度确定为1至3μM，使用Quin-2荧光钙指示剂和钙校正标准溶液，根据生产商的说明(Calcium Calibration Buffer Kit#1,Invitrogen)来定量。蛋白质通过直链淀粉树脂(New England Biolabs)亲和色谱，根据生产商的说明来纯化，然后利用TEV切割缓冲液(50mM Tris、2mM EDTA、2mMβ-巯基乙醇、1％(V/V)甘油，pH 8.0)进行透析，接着，在4℃下用TEV切割处理过夜。在通过SDS-PAGE分析确认完成切割之后，使用配备有用溶剂A(20mM Tris,50mM NaCl,pH 7.5)平衡的Source 15Q 10/10柱(GE health care)的purifier快速纯化液相色谱(FPLC)对切割混合物进行离子交换层析。线性梯度从20至100％(V/V)的溶剂B(20mM Tris，1M NaCl，pH 7.5)进行。通过使用用20mM Hepes、100mM KCl、6.9mM NaCl，在pH 7.2下平衡的Superdex 75(16/60)柱(GE health care,USA)的尺寸排阻层析实现钙调蛋白纯度的最终提高(polishing)。通过在280nm下的吸收来确定蛋白质的浓度。通过完整质量和采用Bruker Reflex III质谱仪(Bruker-Daltronics)的胰蛋白酶肽指纹MALDI-TOF质谱来确认每种蛋白制备物的特性和完整性。
实施例1：鉴定Asn53Ile突变
瑞典多发家族
瑞典多发家族(multiplex family)呈现主要与身体运动或应激相关的室性心律失常、晕厥和猝死的病史。索引病例(II:6)为一名现年42岁的瑞典种族来源的男性，其在12岁踢足球时出现晕厥(图1)。入院时的ECG(图1)显示窦性心动过缓(HR＝45/min)以及V2和V3中的显著的U波，但没有QT延长的迹象(QTc＝0.42秒)。该病例具有至少四次在身体活动期间意识丧失，和一次与火警有关的意识丧失的病史。24h记录显示在足球训练期间的室性期外收缩(VES)、二联律和成对的VES(图1)，但没有症状报告。该患者开始以β1肾上腺素能受体阻断剂治疗。随访时，24h ECG和运动测试仍旧显示伴随增加的负载和心率的一些VES和二联律。随后，筛查索引患者并发现其对于包括CPVT基因RYR2和CASQ2的一组心律失常基因中的突变为阴性。其23岁的哥哥(II:4)具有在运动期间反复晕厥的病史。在运动期间测试，其显示多形性VT(当时的ECG未获得)。在β1肾上腺素能受体阻断剂治疗之后，随访的运动测试显示在高负载下的VES。家族史还包括一名兄弟(II:3)，其具有先前的晕厥发作，其在15岁时的游泳比赛期间溺死，和一名患有痉挛或晕厥的姐姐(II:2)。在随后的心室纤维性颤动(VF)发作之后，使用β1肾上腺素能受体阻断剂治疗，使姐姐(II:2)稳定并且症状消失。妹妹(II:8)在7岁时呈现出在剧烈的身体活动期间反复晕厥的病史。
据报告一名年轻的家族成员(III:5)从2.5岁开始晕厥，在13岁时突然死亡，其已经接受β1肾上腺素能受体阻断剂治疗数年。另一名家族成员(III:4)在4岁时患有晕厥，在进行β1肾上腺素能受体阻断剂治疗后症状消失并在16岁时患心脏骤停。在快速除颤和复苏之后，其恢复并被植入ICD。年轻些的姐姐(III:2)从6-7岁出现晕厥，并在β1肾上腺素能受体阻断剂(Pindolol)治疗后症状消失。年长的姐姐(III:6)在3-4岁时出现晕厥。家族成员III:9、III:12和IV:1在患上晕厥和头晕发作之后服用β1肾上腺素能受体阻断剂。基于来自家族的信息，受试者I:1在其青少年期具有多发性晕厥并进行药物治疗。其在60岁死亡。因此，该家族的表型图像表征为具有包括频繁晕厥的症状的CPVT样特征和三例猝死/心脏骤停。受影响的家族成员没有显示其它明显的临床表现。
连锁分析
在瑞典家族中，使用Affymetrix GeneChip Human Mapping 50K SNPArray Xba240芯片进行全基因组连锁分析。包括瑞典家族的十二名成员，九名受影响的(II:2、II:4、II:6、II:8、III:2、III:4、III:6、III:9和III:12)，三名未受影响的(III:3、III:7和III:8)(图1)。未受影响的受试者在入选时，均大于16岁。通过Affymetrix Genotyping Console识别基因型，并上传至BCSNP数据管理平台(BC Platforms,Espoo,Finland)(58.958个标记)，用于质量控制过滤。首先，使用MERLIN12检测具有孟德尔错误的标记并从数据集中去除。这导致去除113个标记。接下来，使用PLINK13去除所有单态性标记，并使用50个SNP的滑动窗口和0.5的r^2阈值进行LD修剪(pruning)。这导致产生彼此大约连锁平衡的7199个SNP数据集。最后，使用MERLIN鉴定不同的基因型，导致从数据集中去除292个基因型。在常染色体显性遗传、完全外显率和疾病基因频率为0.0001的假设下，以MERLIN使用1cM网格进行多参数连锁分析。使用来自Affymetrix100K频率(白种人)的SNP频率和来自Affymetrix 100K Marshfield cM映射文件的遗传距离。用MERLIN重建单倍型并用HaploPainter14进行图表显示。通过从家族中入选另外的六名受试者(一名受影响的，IV:1；两名未受影响的，III:10、III:11；和三名健康的已婚个体，II:1、II:5、II:7)进行采用微卫星的跟踪分析。在总共18名个体中用D14S1037、D14S68、D14S81、D14S65、D6S305、D6S386和D6S1590进行基因分型并在ABI310遗传分析仪(Applied Biosystem,Foster City,US)上进行分析。引物序列从NCBI UniSTS数据库检索得到。
疾病基因座的绘图和CALM1突变的鉴定
对来自瑞典大家族(图1)的12名成员进行基于全基因组SNP的连锁分析，并且鉴定了染色体14q31-32和6q27-qter上的两个可能连锁的基因座，每个基因座的最大lod分数为3.01(附图1)。在这两个区域中，使用包括一名另外新诊断的受影响儿童(IV:1)和三名未受影响儿童(II:1,II:5,II:7)的微卫星标记的广泛跟踪分析排除了在第6号染色体上的基因座，并将疾病基因座绘制在第14号染色体上(lod分数3.9)(图2)。家族中的单倍型分析证实了所有受影响的个体的第14号染色体疾病单倍型的分离，并且未受感染的个体的第14号染色体疾病单倍型都不分离(图1)，提示该家族中的突变为100％的外显率。横跨21cM的第14号染色体上的疾病基因座的范围从rs323782(86.6Mb)至rs721403(95.7Mb)(hg19)。在第14号染色体上的连锁区域中的大约100个基因中，选择CALM1基因用于测序，这是因为钙调蛋白在钙信号传导和心脏收缩中的关键作用。所有五个编码外显子的系统测序揭示在外显子3(相当于编码外显子2)中的杂合错义突变，导致在索引患者中天冬酰胺(Asn)到异亮氨酸(Ile)的改变(Asn53Ile)(图3)。对于突变的基因分型分析(图3)证实了Asn53Ile突变与疾病共分离，并且在未受影响的家族成员中或在500名丹麦对照个体中没有发现。1200名对照个体(500名来自奥尔胡斯大学的丹麦医学学生志愿者，和700名匿名丹麦血液捐助者)的基因分型显示，在这些2400个对照染色体中不存在突变。该样本量提供了80％的把握以检测次要等位基因频率为0.001的变体，证实了突变极不可能为正常的罕见序列变异。
实施例2：伊拉克新生病例
索引病例为一名23岁的伊拉克种族来源的女性，其在4岁时呈现由于在跑步期间的VF而引起的院外心脏骤停，又成功恢复知觉。她在神经学上完全恢复并在进行β1肾上腺素能受体阻断剂治疗后稳定。初始ECG和超声波心动图在正常范围内，没有QT延长的迹象(未显示)。她的直系亲属的评价不显著。基于完全β受体阻断进行的运动ECG和电生理研究以及右心室和冠状动脉造影术在正常范围内。当时作出了特发性VF的初始诊断。随访ECG显示前段中明显的U波，但没有延长的QT或Brugada综合征迹象(图1)。在12岁时进行的包括信号平均ECG、超声波心动描记术、心脏MRI及冷升压和普鲁卡因胺测试的进一步研究不显著。β1肾上腺素能受体阻断剂的运动ECG显示具有各种形状的二连搏和三连搏的心室异位恢复(图1)。这些有时看起来是双向的。基于此，进行CPVT诊断，但对于RYR2、CASQ2和KCNJ2中的突变的遗传测试证明为阴性。其它心律失常基因KCNQ1、KCNH2、KCNE1、KCNE2、SCN5A的跟踪遗传测试也证明为阴性。在她十几岁时，她又晕厥两次并在15岁时进一步患上心脏骤停。恢复之后，植入ICD，该患者保持良好，但被诊断为系统性红斑狼疮(SLE)。索引患者的母亲62岁，直到发展为继发于源自乳腺癌治疗的阿霉素诱导的心肌病的心力衰竭时才出现症状。她没有患晕厥或心律失常。ECG显示左束支传导阻滞，伴随轴左偏。她的父亲66岁，患有与血管迷走神经晕厥一致的、在应激情况下的非劳累性晕厥发作。他的静息ECG是正常的，对于非典型胸部疼痛的运动测试诱导了没有心律失常的缺血性改变。血管造影片报告显示通畅的冠状动脉和血管痉挛。
第二新生突变的发现。
为了系统性地筛查新的CALM1突变，对全部五个编码外显子开发了HRM突变检测试验。试验用于筛查在Statens Serum Institute,Denmark中的RYR2突变分析所涉及的63例患者，其中61例发现为RYR2突变为阴性。我们在表现为非典型室性心动过速和诊断具有CPVT的伊拉克裔的患者中鉴定了第二杂合CALM1错义突变。该突变位于外显子5中并导致天冬酰胺(Asn)到丝氨酸(Ser)的改变(Asn97Ser)(图3)。家族的DNA测序揭示该突变在母亲和父亲中均不存在，其母亲和父亲都没有显示心律失常征兆，证明了在患者中存在新生突变。微卫星标记分析证实了亲子关系。
为了评估CALM1错义突变是否存在于一般群体中，在500名丹麦对照个体中进行了所有五个CALM1编码外显子的系统性HRM筛查。在这1000个对照染色体中没有鉴定出错义突变。相反，鉴定了三个罕见的沉默多态性(存在于总共五个对照个体中)(补充表2)，强调了针对该基因中的错义突变的选择压力。我们没有考察作为伊拉克突变的对照的特定伊拉克群体，因为该突变为新生突变，并且突变速率可能在所有群体中相同。为了追踪在其它群体中错义突变的存在，我们查询了来自1000基因组计划的测序数据(基于测序的1092个个体，2011年10月发布)并没有发现在CALM1中的错义突变的报道。文献检索也没有提供关于任何先前鉴定的钙调蛋白突变的证据。这与钙调蛋白在整个进化中是最保守的分子之一，在所有脊椎动物物种中十分保守并且仅因为植物的趋异有轻微的进化相一致(图4)。
钙调蛋白是α-螺旋蛋白，其包含四个典型的Ca2+结合EF手，每个结合一个钙离子。两个鉴定的错义突变位于哑铃型钙调蛋白分子的分开结构域中，Asn53残基位于N-结构域中Ca2+结合位点II的第一a-螺旋的溶剂暴露表面上，而Asn97残基是位于钙调蛋白C-结构域中结合位点III的Ca2+结合残基之一(图5)。钙调蛋白与大量的细胞内蛋白结合并调节其活性，但在可获得的已发表的高分辨率钙调蛋白结构中都不是两个突变的残基与任何结合的蛋白或肽直接接触(例如，图5中RYR1肽/钙调蛋白结构)。
实施例3：钙与钙调蛋白的结合
钙调蛋白结合试验
对于钙结合实验，用CaCl2滴定凝胶过滤缓冲液中的15μM钙调蛋白变体，同时在配备peltier温度控制器的FluoroMax 4分光荧光计(HORIBAJobin Yvon)上记录固有酪氨酸荧光。从290至400nm，以1nm的增量测量277nm激发的发射扫描，用277nm激发、5nm的带宽度和0.1ms积分时间。使温度保持在37℃。在每个滴定系列之前，比色皿用1％(V/V)Hellmanex II(HelmaAnalytics)清洗两次，用Milli-Q水清洗两次，用1MHCl浸没并最终用Milli-Q水清洗三次，然后用氮干燥。对于每个滴定点在320nm下的荧光强度信号(FI320)根据
&theta; i = F i * - F max F min - F max
归一化，其中θi为第i个滴定点的归一化值，而Fi *是在滴定期间针对钙调蛋白稀释校正的第i个滴定点的FI320。Fmax和Fmin分别为每个滴定数据集内测量的最高和最低FI320。在三次测量值中对θi值取平均，并且绘制为总Ca2+浓度的函数。误差条表示标准差。用双因素重复测量ANOVA分析钙结合数据，Bonferroni多重比较事后检验使用Graphpad Prism。
用于钙调蛋白突变的改变的钙结合。
为了在功能上表征突变，我们首先考察了天然的和突变的钙调蛋白的Ca2+结合特性。通过检测由于钙调蛋白在结合Ca2+时的构象变化而发生的固有酪氨酸(Tyr)荧光的变化，可以跟踪C-结构域的部分Ca2+饱和22。我们测量了作为总Ca2+浓度的函数的C-结构域Ca2+结合，并证实了由于Asn97Ser突变对Ca2+亲和力的显著减小(图6)，与天然钙调蛋白的～25μM总Ca2+相比，其明显为～40μM的半饱和浓度。另一方面，Asn53Ile突变证实了轻微但显著增加的C-结构域Ca2+饱和，较早的半饱和为～21μM。由于Asn53Ile突变位于钙调蛋白的N-结构域，我们提示该“较早的”C-结构域Ca2+饱和反映了减小的N-结构域Ca2+亲和力，导致C-结构域可用的游离Ca2+增加，所述C-结构域以较低的总Ca2+浓度结合，或者不太可能的是在N-结构域和C-结构域之间主动的结构域间协调性增加。因此，我们表明两个突变导致改变的钙调蛋白结合特性以及表明突变对突变的钙调蛋白的N-结构域和C-结构域之间结合的Ca2+的分布施加不同的作用。
实施例4：钙调蛋白与RyR2的结合
RYR2结合试验
对应于RYR2(R3581-SKKAVWHKLLSKQRKRAVVACFRMAPLYN-L3611)片段的钙调蛋白结合肽获自Genscript(Piscataway,New Jersey,USA)并且使用MALDI-TOF MS验证完整性。钙调蛋白-RYR2肽的结合在添加和不添加饱和量的钙调蛋白变体的情况下，通过监测RYR2Trp3586的固有荧光发射来评估。使用280nm激发，5nm的带通和37℃的温度，在以下四个不同游离Ca2+浓度([Ca2+]游离)下收集来自以1nm增量从290至450nm的荧光发射扫描：无游离Ca2+([Ca2+]游离＝0mM,5mM EGTA)、静息心肌细胞条件([Ca2+]游离～100nM)、兴奋条件([Ca2+]游离～1μM)，20和饱和Ca2+条件(200μM总Ca2+)，均在20mM HEPES；100mM KCl，pH 7.2中。在每个数据获得之前，平衡时间设定为10min。使用如之前所述的EGTA-Ca2+缓冲体系控制兴奋和静息条件的游离Ca2+浓度21。对于所有条件，使用0.5μM浓度的RYR2肽，不添加钙调蛋白变体(单独RYR2)、添加1μM的钙调蛋白变体(1μM[Ca2+]游离和200μM总Ca2+)或添加3μM钙调蛋白变体(零和100nM[Ca2+]游离)。使用相同浓度的、没有添加RYR2肽的钙调蛋白进行背景发射扫描。数据表示为平均的(N＝3)减去背景并且归一化至在没有添加钙调蛋白情况下的RYR2荧光的最大荧光强度。
在低钙浓度下的异常RYR2结合
我们接下来考察了钙调蛋白变体和来自包含钙调蛋白结合结构域的RYR2的肽(RYR2残基R3581-L3611)之间的相互作用。在结合到来自RYR1的等价肽的钙调蛋白的高分辨率3D结构中，钙调蛋白的结合Ca2+的C-结构域完全包围RYR肽的单个色氨酸(Trp)残基(RYR1Trp3620，对应于RYR2的Trp3586，图5)。由于钙调蛋白自身不包含任何Trp残基，钙调蛋白与RYR2肽的结合可以通过RYR2Trp3586残基的荧光强度的大量增加来监测。当在低钙浓度(100nM游离Ca2+)下添加饱和量的钙调蛋白时，证实了Asn97Ser与Asn53Ile和天然钙调蛋白相比，RYR2结合的显著差异。Asn97Ser仅诱导轻微的蓝移并且荧光强度没有增加(图7)，与当在缺乏Ca2+的情况下，钙调蛋白结合到骨骼肌细胞兰尼碱受体(RYR1)23时观察到的作用类似。明显不同的是，在中等(1μM游离)钙浓度或饱和(总共200μM)钙浓度下观察到在Asn97Ser钙调蛋白、Asn53Ile钙调蛋白和天然钙调蛋白之间的RYR2结合差异很小或没有差异(图7)。因此，我们的数据证实，对于Asn97Ser突变而言，钙调蛋白-RYR2相互作用在低的细胞内Ca2+浓度下是有缺陷的，而在中等至高Ca2+浓度下恢复。
通过RYR2的肌质网(SR)钙的释放是心肌收缩过程中最关键的分子事件之一。RYR2是SR Ca2+-通道，其在局部细胞内Ca2+浓度少量增加(从大约100纳摩尔到几微摩尔)时从关闭的构象转换为打开的构象，导致来自SR储库Ca2+的大量涌入，最终引起肌肉收缩。目前与VT相关的RYR2的分子学解释为RYR2突变使得四聚物RYR2复合物“渗漏(leaky)”，从而导致局部Ca2+浓度增加(Ca2+启动(sparks))，附近的RYR2簇通过钙诱导的钙释放(CICR)过早地兴奋并最终心律失常27,28。由于钙调蛋白直接结合RYR2，并且已被证实在所有Ca2+浓度下降低RYR2打开的概率29，因此，在此证实的由于Ans97Ser受损的钙调蛋白RYR2相互作用，可能主要引起在低舒张期Ca2+浓度下RYR2打开的概率增加。因此，我们提示，与RYR2突变类似，钙调蛋白Asn97Ser突变导致功能获得性突变，其将解释在六个编码相同蛋白中一个突变的钙调蛋白等位基因如何足以引起具有显著遗传特征的表型。
B-进一步的实验数据
引言
在真核细胞中，游离钙离子([Ca2+]游离)浓度的变化是通用的细胞内信号并且是可兴奋细胞如心肌细胞的功能基础。心跳受Ca2+信号传导控制，肌纤维膜动作电位转化成最终将电信号与用于肌丝收缩的化学信号偶联的心肌细胞[Ca2+]游离瞬变波。这种[Ca2+]游离的精确放大、时空分布瞬变调节心脏节律和收缩性。在该信号传导中心的是Ca2+-传感蛋白钙调蛋白(CaM)，其通过与数百个Ca2+信号通路中的蛋白靶点相互作用而传输空间和时间上复杂信号。
CaM由两个Ca2+结合小叶组成，每个Ca2+结合小叶具有以哑铃状构象的接头分开的两个EF-手。因此，CaM共结合四个Ca2+并且可以以结合Ca2+的(CaCaM)形式和游离(脱钙CaM)形式两者与蛋白靶点相互作用。CaM Ca2+结合和动力学对与蛋白靶点的相互作用敏感并且可以在单个小叶下调节。此外，小叶的结合状态也彼此互相影响{Peersen:1997hx}。结合具有显著不同Ca2+结合特性的CaM N-小叶和C-小叶，CaM可以非常复杂的方式破译Ca2+信号。两个小叶的结构使得CaM在以其他物质为代价的情况下将Ca2+波动的频率解码为一些酶的差别活化。
CaM在将通用[Ca2+]游离信号传送到许多靶点上的关键作用反映在其显著的进化保守程度中。三个人类CaM基因(CALM1-3)全部编码完全相同的蛋白并且自从出现脊椎动物，148个残基蛋白中还没有引入氨基酸变化。例如，在1500人的CALM1-3外显子，即在9000个CaM编码等位基因的筛查中没有发现错义突变，进一步说明了CaM中的突变一般是不能容忍的(Nyegaard,M,等人,2012)。
然而，在最近的研究中，我们将CaM中的两个新的突变与儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)和心脏性猝死联系起来(Nyegaard,M,等人,2012)。CPVT是遗传性心脏失调，其中运动或剧烈情绪可以导致晕厥或心脏性猝死而没有在先症状。尽管诊断的个体很少见，但推测CPVT为年轻人中不明原因的心脏死亡的重要原因，并且具有非常高的死亡率。有趣地并且有点令人费解地，尽管CaM的普遍存在，但是CaM突变的携带者没有显示除CPVT之外的病理症状。CaM调节的心脏肌质网Ca2+通道、兰尼碱受体2(RYR2)，和一些其辅助蛋白，肌集钙蛋白和三合蛋白中的突变先前已经与CPVT联系起来，使得Ca2+-CaM-RYR2相互作用成为与CaM联系的CPVT分子机制的可能候选解释。两个CaM突变，N53I和N97S位于相对的Ca2+结合小叶中，并且我们之前发现Ca2+亲和力在性质上与野生型蛋白(WT)的那些不同并且发现N97S变体与RYR2的相互作用已经消失(Nyegaard,M,等人,2012)。
在该实施例中，我们进一步表征突变的CaM蛋白的改变的特性，作为进一步理解与CaM相关的CPVT的分子机制的步骤。
实验程序
材料
质粒构建体-使用两种类型的构建体。
1)通过使用Lightning Site-Directed Mutagenesis试剂盒(QIAGEN Nordic,Copenhagen,Denmark)，去除CaM N-末端GLE增加物来修饰来自先前研究的表达载体构建体(Nyegaard,M,等人,2012)。所产生的载体(pMal_CaMn、pMal_CaMn-N53I和pMal_CaMn-N97S)编码由以下组成的融合蛋白：麦芽糖结合蛋白变体，接着是烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶截短的切割位点(ENLYFQ)和全长CaM变体，而没有初始Met残基。TEV蛋白酶识别位点没有向CaM添加额外的残基。所有构建体通过CaM编码部分的Sanger测序来确认。
2)突变的CaM基因(无标签)也使用用于人CaM的合成基因作为模板，通过PCR来制备，所述人CaM的合成基因具有用于在大肠杆菌中表达而优化的密码子。突变体在PetSac载体(Pet3的衍生物)的NdeI和SacI之间克隆，并且通过DNA测序确认来自单个菌落的质粒制备物。
蛋白表达和纯化–质粒构建体用于两个分离的蛋白和纯化程序。在Rosetta B细胞中从pMAL_CaMn构建体表达的CaM变体如先前所述进行纯化(Nyegaard,M,等人,2012)。通过EDTA的添加去除结合CaM的Ca2+，然后是最终的尺寸排阻色谱，并且如使用Quin-2荧光Ca2+指示剂和钙校准缓冲液试剂盒#1(Invitrogen)所确定的，最终缓冲液(20mM HEPES，100mM KCl，pH 7.2(25℃))包含～1uM Ca2+。通过在280nm下的吸收值确定蛋白浓度。通过MALDI-TOF质谱(Bruker Reflex III,Bruker-Daltronics)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析确认每种蛋白制备物的特性和完整性。该批次的蛋白用于Ca2+-缓冲的平衡滴定、停流、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、圆二色谱法(CD)、荧光发射扫描和变性实验–见下文。
每种无标签突变体使用PetSac表达构建体在大肠杆菌ER2566中表达，并且使用以下方法分离：在20mM咪唑、20mM NaCl、1mM EDTA、pH 7.0(缓冲液A)中的探针超声波处理，在27000×g下离心10min，将上清液倒入沸腾缓冲液中，加热至90℃，接着在冰上快速冷却并通过如上所述的离心去除大肠杆菌蛋白。然后，通过将上清液加载在用缓冲液A平衡的3.4x 20cm DEAE纤维素离子交换层析柱上纯化CaM突变体。通过缓冲液A中20至500mM NaCl的线性NaCl梯度洗脱蛋白，达1.4L。汇集蛋白组分，补充5mM CaCl2，pH上调至7.5并泵送至用10mM Tris/HCl，1mM CaCl2，pH 7.5(缓冲液B)平衡的0.4L苯基琼脂糖柱上。用0.5L缓冲液B清洗柱子，并用10mM Tris/HCl，1mM EDTA，pH 7.5洗脱CaM。再次汇集CaM组分，补充5mM CaCl2并加载在缓冲液B中的2.2x 20cmDEAE Sephacel柱上，并使用1L溶液B中的0至400mM NaCl的线性NaCl梯度洗脱。汇集CaM组分，冻干，溶解于3mL 0.1M EDTA pH 8.0中，并在H2O中的3.4x 20cm Sephadex G25超细柱上脱盐。在15mL饱和的NaCl之后，加载制备物(通过chelex-100树脂脱钙)。蛋白在凝胶过滤过程中通过NaCl带并且洗脱而不含EDTA和Ca2+两者，如通过NMR光谱所确认的。该批次的蛋白用于在存在5,5-Br2BAPTA[Ca2+]游离探针的情况下的平衡滴定–见下文。
Ca2+平衡滴定–为了确定小叶特异性Ca2+亲和力，使用Ca2+滴定具有在pH-和Ca2+-缓冲溶液(50mM HEPES、100mM KCl、0.5mM EGTA和2mM NTA，pH 7.2(25℃))中的0.75□M fura-2或fura-6F Ca2+-探针(Invitrogen)的15□M CaM，通过经初始溶液与具有相同组成的外加7mM CaCl2的溶液的体积替换改变[Ca2+]游离。使用pCa-计算器计算24个滴定点所需要的总Ca2+浓度范围在1nM-2mM(Dweck,D等人,2005)。使用具有用于温度控制的Peltier元件的分光荧光计(HORIBA Jobin Yvon,-4)跟踪荧光强度。使1mL搅拌比色皿中的0.8mL蛋白溶液保持在25℃并且测量CaM固有蛋白荧光，分别为部分苯丙氨酸和酪氨酸发射光谱(VanScyoc,WS,等人.,2002)。苯丙氨酸光谱：250nm激发和265-275nm发射，带宽7nm。以1nm的增量收集数据点，并且取3个光谱的平均值。酪氨酸光谱：277nm激发和314-326发射，带宽分别为5和7nm。以2nm的增量收集数据点，并取2个光谱的平均值。使用两个探针测量[Ca2+]游离。探针激发光谱：510nm发射和330-390nm激发，带宽3nm。以2nm的增量收集数据点，并取2个光谱的平均值。对于所有记录，积分时间为0.2s。测量一式四份进行。苯丙氨酸和酪氨酸光谱显示了随着[Ca2+]游离增加，分别降低和增加的荧光强度(FI)，如之前所述(Vanscyoc,WS,等人.,2002)。CaM N-小叶的饱和分数(θN)通过根据以下公式将苯丙氨酸270nm发射信号归一化为用于每次重复的[Ca2+]游离的函数(FIN)来计算，
&theta; N = FI N - max - FI N FI N - max - FI N - min
FIN-max和FIN-min分别测量为初始和最后六个滴定点的平均值。CaM C-小叶的饱和分数(θC)通过根据以下公式将Tyr 320nm发射信号归一化为来自每次重复的[Ca2+]游离的函数(FIC)来计算，
&theta; C = FI C - FI C - min FI C - max - FI C - min
FIC-max和FIC-min分别测量为初始和最后四个滴定点的平均值。Fura-2和Fura-6F能够测量63.1nM–63.1uM范围内的[Ca2+]游离，并且这些表明与使用pCa-计算器，在探针范围内在15个滴定点确定的值具有>97％的一致性。由于对滴定[Ca2+]游离精确度的非常保守的估计，探针测量值的相对标准偏差用于计算用于绘图和拟合所使用的pCa-计算器值的最小标准偏差。将平均相对标准偏差(5.0％)应用于探针范围之外的滴定点。为了评价单个CaM小叶的Ca2+结合的热力学参数，将每个CaM变体的θN和θC的四个重复设定拟合到结合的Adair模型。对于异种两位点结合，如在以下方案中所显示的，Adair模型采取以下形式
Y = ( k 1 + k 2 ) &CenterDot; [ X ] + 2 &CenterDot; ( k 1 &CenterDot; k 2 &CenterDot; k 12 ) &CenterDot; [ X ] 2 2 &CenterDot; ( 1 + ( k 1 + k 2 ) &CenterDot; [ X ] + ( k 1 &CenterDot; k 2 &CenterDot; k 12 ) &CenterDot; [ X ] 2 ) = K 1 &CenterDot; [ X ] + 2 &CenterDot; K 2 &CenterDot; [ X ] 2 2 &CenterDot; ( 1 + K 1 &CenterDot; [ X ] + K 2 &CenterDot; [ X ] 2 )
其中Y表示大分子的平均饱和分数，配体X和平衡常数k如在k12表示协同效应的结合方案中所显示。K2可以看作是配体与两个位点结合的平衡常数；因此与两个位点结合的Ca2+的自由能(ΔG2)可以计算为
ΔG2＝-R·T·ln(K2)
通过在Prism 5(Graphpad,Version 5.0d)中的非线性回归进行拟合。使用如上的方法和相同的缓冲液，进行了1uM RYR2钙调蛋白结合结构域肽(RYR2p,3580-RSKKAVWHKLLSKQRKRAVVACFRMAPLYNL-3612)与10uM的CaM变体的Ca2+滴定。对于每个滴定点，记录色氨酸发射光谱：295nm下激发和320-370nm发射，二者均具有5nm带宽并且取3个光谱的平均值。积分时间设定为0.2s，并且以2nm增量收集数据点。在340nm(CaCaM结合的FI最大值)下的荧光强度(FI)与在356nm(游离RYR2p FI最大值)下的荧光强度之比用于跟踪Ca2+与结合RYR2p的CaM C-小叶的结合。CaM C-小叶Ca2+结合诱导复合物的构象转变，导致RYR2p色氨酸荧光的增加。使比率信号归一化并拟合到上述Adair方程。
CaM Ca2+解离动力学为了确定CaM Ca2+解离速率(k解离)，使用配备20uL光学池的停流仪器(SX20,Applied Photophysics)并使用了SQ.1连续混合器样品处理单元进行固有和非固有荧光停流研究。仪器空载时间为～1.6ms。温度由循环的水浴和内部温度探针控制。R6095光电倍增管安装在10mm视口上，用于酪氨酸(WG320,Schott)或Quin-2(CG495,Schott)荧光的两个滤波器之一在适当的位置。驱动注射器为1.5mL玻璃Hamilton注射器，并且对于所有实验，注射设定为来自每个注射器50μL。使用固有蛋白酪氨酸荧光并混合80μM CaM的缓冲液(20mM HEPES、100mMKCl和640μMCaCl2)的溶液与等体积的EDTA缓冲液(20mM HEPES、100mM KCl和4mM EDTA)来测量CaM C-小叶k解离。测量在10、15、20、25、30和37℃下进行，每个温度测量4-5次。在277nm下，使用4.6nm狭缝宽度和12.5□s平均时间激发。CaM使用Quin-2Ca2+探针(Invitrogen)外在地测量N-小叶k解离。将16μM CaM的缓冲溶液(20mMHEPES、100mKCl和130μM CaCl2)与Quin-2溶液(20mM HEPES、100mKCl和250μM Quin-2)混合。测量在8℃下进行，并在50ms内使用对数取样方法取20个测量值的平均值。在330nm下，使用7nm狭缝宽度和12.5us平均时间激发。所有缓冲液在25℃下，pH为7.2。使用过量的Ca2+螯合剂EDTA和Quin-2使得CaM Ca2+解离动力学的分析作为假一级反应，即
其中速率常数(k)变成观察到的作为近似恒定螯合剂浓度([螯合剂])和k乘积的速率常数(kobs)。假定与螯合剂的Ca2+解离可以忽略并且CaM解离作为速率限定步骤，kobs等于k解离。
用于酪氨酸荧光监测的CaM C-小叶的k解离通过将作为时间函数(FI(t))的荧光强度信号拟合到一阶衰变
FI ( t ) = FI ( 0 ) + FI ss - FI ss &CenterDot; e - k off &CenterDot; t
获得，并且用于quin-2荧光监测的CaM N-小叶和C-小叶的k解离通过将FI(t)拟合到一阶两相增加函数
获得，其中Fss为在稳态下的FI信号{Vogel:2002wl}。在N-小叶拟合例行过程中，慢得多的C-小叶k解离值作为常数输入，使得N-小叶k解离值适当拟合。C-小叶k解离绘制为T的函数，并且ln(k解离)也绘制为1/T的函数。后者用于拟合到线性Arrhenius方程
k = A &CenterDot; e - E a R &CenterDot; T &DoubleLeftRightArrow; ln k = ln A + - E a R &CenterDot; 1 T
其中，A为频率因子，R为理想气体常数，而Ea为活化能。Ea和lnA通过
与过渡态焓和熵相关，
其中，κ为传输因数，kB和h分别为玻尔兹曼和普朗克常数{Winzor:2006hq}。假定和是不依赖温度的。由于0<k<1并且通常在0.8-1的范围，当ln(A)～25和时，假定ln(κ)项在的计算中是可忽略的。标准过渡态吉布斯自由能由以下计算
T＝298.15。
蛋白稳定性apoCaM变体的热变性曲线通过监测在加热蛋白溶液期间，CD信号的变化来获得。将缓冲液(10mM HEPES、100mM KCl和2mM EDTA，pH 7.2)中的25μM CaM置于分光偏振计中(Chirascan Plus CD,Applied Photophysics)，并将金属丝温度计插入比色皿中(Spectrosil21/Q/0.5/CD 0.5mm,Starna)。在1-90℃，以1℃/min加热速率的热扫描期间，记录222nm下的CD信号(□-螺旋信号)。带宽为1nm，并且平均化时间为15s，每60s测量。一式三份并且连续进行测量，以避免分批效应。用0.5℃/min加热速率和12.5μM蛋白进行另外的实验以排除加热速率和蛋白浓度效应。222nm CD信号，减去缓冲液扫描并转化成平均残基重量椭圆率(□)。三态模型用于分析CaM的解折叠。模型假定两个CaM结构域的解折叠具有中间态，一个折叠的结构域和一个解折叠的结构域。天然(n)、中间(i)或解折叠(u)态的CaM的部分(Fn,Fi,Fu)分别通过两个过渡的平衡常数(Ki和Ku)来描述
F n = 1 1 + K i + K i &CenterDot; K u ^ F i = K i &CenterDot; F n ^ F u = K i &CenterDot; K u &CenterDot; F n
给定的三态模型，信号作为温度的函数为
&theta; MAW 222 nm = F n ( a n + b n &CenterDot; T ) + F i ( a i + b i &CenterDot; T ) + F u ( a u + b u &CenterDot; T )
其中，常数a和b为来自三个不同态的信号贡献的线性温度依赖性。使用分别用于CaM变体的的y-截距(an、ai、au)和斜率bn、bi、bu)确定依赖性。通过分别为1-15℃和78-88℃范围内的线性回归确定an、bn和au、bu。ai和bi计算为天然和解折叠态的值的平均值(Masino,L,等人,2000；Sorensen,BR,等人,1998)。将修改的吉布斯-赫尔姆霍茨方程与表达为平衡常数的函数的吉布斯活化能组合产生
K = e &Delta;H m &CenterDot; ( 1 T m - 1 T ) + &Delta; C p &CenterDot; ( T m - T + T &CenterDot; ln ( T T m ) ) - RT
其中，ΔHm为在Tm下变性的焓，ΔCp为热容变化，R为理想气体常数，Tm为特定过渡的熔解温度，且方程应用于三态模型的两个过渡态，即Ki和Ku。使用Prism 5(Graphpad,5.0d版本)中的非线性回归将数据拟合到模型并且对于第一和第二过渡态ΔCp分别固定在3.363kJ/mol和3.041kJ/mol，ΔHm也被认为不依赖T{Masino:2000dm,Sorensen:1998fr}。使单个CaM结构域变性的标准焓(ΔHo)、熵(ΔSo)和吉布斯自由能(ΔGo)根据以下公式计算
&Delta;H T = &Delta;H T m + ( T - T m ) &CenterDot; &Delta;C P
&Delta;S T = &Delta;H T m T m + ln ( T T m ) &CenterDot; &Delta;C P
ΔGT＝ΔHT+T·ΔST
且T＝298.15K。为了绘图目的，信号和模型拟合归一化为总信号变化的程度的分数。为了考察CaCaM变体的蛋白稳定性，使用与如上所述相同的CD方法在存在5M尿素的情况下进行热变性。数据归一化也以相同的方式进行，然而，没有模型可以拟合，因为尿素的存在不能使用常规解折叠模型。也通过监测作为CaM C-小叶变性的信号的固有酪氨酸荧光信号来进行apoCaM变体的热变性(Chirascan Plus CD,AppliedPhotophysics)。10-90℃的热扫描以1℃/min的加热速率进行。在277nm和320nm下的激发和发射分别使用5和9nm狭缝宽度进行。积分时间为20s，而测量在Hellma 115-QS 10mm比色皿中进行。320nm荧光信号减去缓冲液扫描并在归一化到10℃下最大绝对值的分数。由于仅监测一个CaM小叶的解折叠，以上模型的简化的二态版本用于分析CaM C-小叶的解折叠。平衡常数和热动力学参数的计算与三态模型一样进行。
蛋白结构分析CaM变体经过非变性PAGE。上样缓冲液(0.75M Tris,15％(V/V)甘油和18mg.L-1溴酚蓝，pH 8.8)中20uL的13-18uM CaM样品以及2mM EDTA或0.5mM CaCl2被加载至定制浇注的20％(W/V)丙烯酰胺(37.5:1)凝胶，并且在非变性电泳缓冲液(0.19M甘氨酸和0.025M Tris，pH 8.8)中，100V恒定电压下进行凝胶电泳5小时。凝胶用考马斯亮蓝G-250染色并进行数字化扫描。PAGE在环境温度和在5℃下等温地进行，具有相同的结果。制备缓冲液和凝胶以使Ca2+污染最小化(～1uM)。与预测算法结合，CD也用于探测蛋白质二级结构分布。将比色皿(Suprasil 106-QS-0.1mm,Hellma)中的缓冲液(2mM HEPES，50mM KCl，pH 7.2(25℃))中的25μM CaM变体，以及0.5mM或2mM EDTA置于旋光分光计中。在190-250nm下，使用1nm带宽，3s平均化时间记录CD光谱，并取3个光谱的平均值。在25℃下一式三份制备样品并测量。CD光谱减去缓冲液空白并将信号转换为平均残基重量椭圆率(θMRW)。使用CDpro(http://lamar.colostate.edu/～sreeram/CDPro/main.html)运行CDSSTR程序，利用蛋白的SP43参考设置计算CaM变体中的二级结构元件的分布(Sreerama,N,等人,2000)。二级结构元件分为规则的α-螺旋、扭曲的α-螺旋、规则的β-链、扭曲的β-链、转角和无规则卷曲(unordered)(Sreerama,N,等人.,2000)。
结果
CaM变体在Ca2+亲和力方面显示不同的变化使用[Ca2+]游离缓冲的固有蛋白荧光来考察CaM变体的Ca2+亲和力(Vanscoyc,WS,等人,2002；Dweck,D,等人,2005)。随着[Ca2+]游离增加，分别在CaM N-小叶和C-小叶的饱和态下报告小叶特异性荧光信号。归一化的饱和曲线显示WT、N53I和N97S之间的显著差异；N53I滴定曲线显示减小的N-小叶Ca2+亲和力和稍微增加的C-小叶亲和力，而N97S C-小叶曲线显示显著减小的亲和力。这些差异通过拟合到两位点Adair模型来定量。(图9A和表1)。ΔG2值，对应于结合的吉布斯自由能(由复合的平衡常数K2计算的)，确认了定性观察。ΔG2值证实N53I具有显著降低的N-小叶亲和力和增加的C-小叶亲和力，尽管后者的程度相对小。N97S变体的ΔG2值证实了N-小叶亲和力没有变化，但在其C-小叶亲和力显著变化，其改变至接近N-小叶亲和力。K1值报告了结合单个小叶中的任一个EF-手位点的平衡常数的总和，而K2报告了相同的两个平衡常数的乘积和来自任何协同效应的贡献(参见方法)。与N53I N-小叶K2值相反，与WT值相比，K1值没有显著改变。这表明降低的N53I N-小叶亲和力是由于两个N-小叶EF-手型之间的协同性减少。对N53I C-小叶进行了相同的观察。在N97S C-小叶情况下，K1和K2值两者均改变，表明C-结构域EF-手的单个位点亲和力的改变和也可能它们的协同性的改变。
对于WT CaM，结合四个Ca2+离子的CaM和结合两个Ca2+离子的任一个小叶计算的吉布斯自由能(分别为ΔG2和ΔGtot)与等价研究中确定的值非常一致(表1){Linse:1991wo,VanScyoc:2002jm}。N97S变体明显改变了其C-小叶的ΔG2和ΔGtot值，其在两种情况下均转化成完整N97S CaM分子Ca2+饱和的改变的吉布斯自由能。另一方面，个体N53I小叶的Ca2+亲和力经历相反的变化，因此总分子的N53IΔG2和ΔGtot值与WT蛋白的没有显著不同。
CaM变体具有改变的Ca2+解离速率我们通过在不同温度下的停流实验确定了CaM变体的CaM Ca2+解离速率(k解离)。采用在Ca2+释放时固有蛋白酪氨酸荧光中的变化确定C-小叶k解离，并且通过使用快速荧光Ca2+探针，quin-2来确定N-小叶(和C-小叶)k解离。使用quin-2的N-小叶k解离的测量还能够同时测量C-小叶k解离。CaM N-小叶k解离甚至在15℃下处于仪器空载时间范围内，这是为什么这些在8℃的可获得的最低温度下评价(图10和表2)。N53I N-小叶相对于WT N-小叶，k解离显示两倍的增加，即在仪器的测量上限(circa 2000s-1)。相反，N97S N-小叶具有显著降低的k解离。有趣的是，使用Ca2+-缓冲体系，和对应于用于停流分析的实验条件的平衡滴定，没有显示N97S N-小叶Ca2+亲和力的显著变化(表1，上部)。
在10、15、20、25、30和37℃下分析C-小叶k解离值并且均显示典型的Arrhenius方程行为(图10和11)。N53I C-小叶仅在37℃显示下显著下降的k解离，其与k解离的改变的温度依赖性，即改变的Ea一致。过渡态理论分析进一步表明N53I C-小叶和显著改变(表2)。无论怎样，因为和的变化在热力学上是相反的，所以对的净效应不显著。如由平衡滴定所预期的，对于N97S C-小叶，观察到对k解离的最剧烈效应证实为～10倍增加。N97S C-小叶过渡态参数显示的显著降低，并且这主要是因为不太有利的熵贡献。没有分析CaM Ca2+结合速率，因为这些对于当前方法而言太快速。
CaM突变影响蛋白稳定性通过CD和酪氨酸荧光监测脱去(apo-)和结合Ca2+的CaM变体的热变性。apoCaM N53I和N97S变体相对于WT蛋白分别是不稳定和稳定的(图12A)。通过三态模型进行的拟合解折叠过程表明apoN53I N-小叶不稳定，主要是因为解折叠的焓(ΔHo)降低，虽然具有来自稍微不利的折叠熵(ΔSo)的贡献(表3)。此外，apoN53I C-小叶具有降低的解链温度(Tm)，不稳定，最可能是因为ΔSo的改变。apoN97S热变性曲线与WT的总体上非常类似，但其第一部分转向更高的Tm。与定性观察一致，apoN97S的拟合证实了C-小叶的Tm显著增加，可归因于增加的ΔHo。对于apoN97S N-小叶，没有观察到显著变化。通过酪氨酸荧光监测的apoCaM的热变性和随后的曲线拟合将WT、N53I和N97S C-小叶的Tm分别确定为43.0、42.4和45.3℃(图11B)。这些Tm值与通过拟合到CD监测的变性，针对C-小叶解折叠所确定的那些非常一致，并且也与apoN53I和apoN97S C-小叶的不稳定和稳定分别一致。
应用在存在5M尿素的情况下的热变性，以使高度稳定的CaCaM变性(图11C)。尿素变性使CaM小叶解折叠的顺序颠倒，即N-小叶在比C-小叶更低的温度下解折叠(Masino,L,等人,2000)。因此，相对于WT，在CaN53I变性曲线的初始部分的左侧位移表明CaN53I N-小叶不稳定。类似地，CaN97S变性的后面部分的左侧位移与不稳定的CaN97S C-小叶一致。尿素和加热对CaCaM的双重效应通过模型拟合免去了热动力学评价。然而，单个apoCaM小叶的折叠吉布斯自由能和相应的结合两个Ca2+的自由能的加和给出了两个CaCaM变体的折叠的吉布斯自由能的评估(表4)。有趣的是，这些值与CaCaM变性曲线一致并且与也影响负载Ca2+的形式的折叠稳定性的CaM突变一致。
N53I和N97S突变影响CaM结构使用非变性凝胶电泳，我们考察了CaM突变对蛋白流体动力学半径的影响。相对于WT CaCaM，CaN53I和CaN97S的绝对迁移率没有明显变化。然而，apoN97S显示，增加的绝对迁移率既不能归因于凝胶中残留Ca2+的结合，也不能归因于热效应(图13A)。因此，apoN97S CaM好像比WT更加紧密。对于apoN53I，没有观察到电泳迁移率的差异。
通过CD考察CaM变体中二级结构分布的差异(图13B)。在apo和负载Ca2+的两种形式中，N53I与CaWT高度类似，不同之处是在194nm最大值处的信号增加。apo-和CaN97S均显示改变的CD光谱，以及在208和222nm最小值下增加的信号强度。此外，apoN97S显示194nm最大值下增加的信号强度。与在208和222nm最小值下，N97S和WT CD光谱之间的差异一致，使用CDSSTR程序预测的二级结构表明apo-和CaN97S的α-螺旋含量稍微降低。对N53I变体进行的等价分析表明在apo和负载Ca2+的形式中，分别降低的α-螺旋和无规则卷曲含量。各个CaM变体的CD信号强度在245-250nm范围内相同。
CPVT-CaM/RYR2_CaMBD复合物的Ca2+亲和力的差异使用对应于RYR2CaM结合结构域的31个残基肽(RYR2_CaMBD)考察了CaM突变对CaM介导的RYR2的Ca2+传感的效应。ApoCaM结合RYR2_CaMBD并且在Ca2+结合C-小叶时，复合物(CaM/RYR2_CaMBD)经历结构转型，其中结合Ca2+的C-小叶几乎完全包围RYR2_CaMBD单个Trp残基，显著影响荧光(Maximciuc,AA,等人,2006；Nyegaard,M,等人,2012)。apoCaM/RYR2_CaMBD复合物使用Ca2+滴定并监测色氨酸荧光信号的变化，并且看成是对复合物中CaM C-小叶的Ca2+结合的测量(图14)。与游离CaM相比，在CaM/RYR2_CaMBD复合物中，所有CaM变体的C-小叶的Ca2+亲和力明显增加(～100倍)。结合RYR2_CaMBD的N53I和N97SC-小叶证实了反映游离变体的那些的Ca2+亲和力差异。拟合到两点Adair模型证实了N53I/RYR2_CaMBD C-小叶的K2值稍微但显著的增加，即增加的Ca2+亲和力(表5)。有趣的是该K2增加的程度大于对游离蛋白所观察的(在表1和5中比较)。N97S/RYR2_CaMBD C-小叶显示Ca2+亲和力的显著降低，因为K1和K2值显著降低(表5)。就N53I/RYR2_CaMBD C-小叶而言，与游离蛋白相比，N97S/RYR2_CaMBD C-小叶的Ca2+亲和力变化的程度减弱。
表
表1：根据两个平衡滴定方法计算的CaM Ca2+结合的热动力学参数。来自[Ca2+]游离-缓冲的滴定的结果。针对结合两个Ca2+离子的任一个CaM小叶和总CaM的计算的平衡常数K1-2和ΔG2值。括号中的误差表明95％的置信区间(+/-)。提供先前公开的WT变体的值。对于WT CaM的统计学上显著变化的程度计算为解离常数的比率(ΔK1,ΔK2[-])。
表2：CaM N-和C-小叶k解离值，并且N-小叶和C-小叶速率分别在8℃和25℃下测量。由将k解离(T)拟合到Arrhenius方程计算的CaM C-小叶Ca2+解离的过渡态理论热力学参数。在没有另外规定的情况下，值以kJ/mol计。
表3：从图9中所提供的数据计算的apoCaM变体的热变性的热力学参数。变性温度(Tm)和焓(ΔH(Tm))用于计算单个CaM小叶变性的标准焓(ΔHo)、熵(ΔSo)和吉布斯自由能(ΔGo)。括号中的误差(+/-)对应于95％的置信区间。
表4.基于对apoCaM变体所确定的值和它们结合两个Ca2+离子的自由能，对CaCaM变体的折叠的吉布斯自由能(ΔG折叠)的估计。括号中的误差(+/-)表明95％的置信区间。
表5.来自CaM:RYR2Ca2+滴定的CaM C-小叶Adair值。括号中的误差(+/-)表明95％的置信区间。对于WT CaM的统计学上显著变化的程度计算为解离常数的比率(ΔK1，ΔK2[-])。
参考文献
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序列
SEQ ID NO：1
钙调蛋白1(CALM1)基因序列(来自UCSC基因组浏览器)。外显子序列用大写。
＞hg19_knownGene_uc001xy1.2范围＝chr14：90863327-908746195′pad＝0 3′pad＝0链＝+重复掩蔽＝无
GATACGGCGCACCATATATATATCGCGGGGCGCAGACTCGCGCTCCGGCAGTGGTGCTGGGAGTGTCGTGGACGCCGTGCCGTTACTCGTAGTCAGGCGGCGGCGCAGGCGGCGGCGGCGGCATAGCGCACAGCGCGCCTTAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCGGCATCGGAGGTACCCCCGCCGTCGCAGCCCCCGCGCTGGTGCAGCCACCCTCGCTCCCTCTGCTCTTCCTCCCTTCGCTCGCACCATGgtaggtcgggagtggcaaatgccggcgtagcagctgcccgagatttcttcccagatttctagttgttttgtttgttttttgtttgtttttggttcttggaggtttttcttttctgagtgttacgcagcagctgcgcttaaaggaggttgcattttggatttgcatctcggcgacctctgccagggagcttcatttattggttccccttggagctggacttggtcgtaggccgtccacgggcaggggctccggccgcaactgcagcgggggtttctgcatccaatccccctgccccccgcccagccccgcacccactgcatccactagcgccgcacccgggctgcctgcagcgcagcgtttcggcctgggagccgggcggggccgggcactagacccccccccccggcccgcccctccccaccccgcttctccgccggcgcgaaggtggcaggtcgggcgggcagtggagaatgaatgggctggagctggccggtggcgcacattgttccggccgggtgttgaggggcgcagtcagcgcccgccacctccccactttggccggccctgctgggcgccctccctcggtcgctctcccctccttcttcccggggggcgcggcgcgggcgtgggctgggaaggaaggagccggggaagggtggggttgggggcaggaaggcgaggggttgggggcggagagggcggaagcggcggccgggccgccctgcgcccgggcggggccctgcggtgtggccgtggcttgttcctgccgctttcgcaccctgcggccccccacccagtgcagcagtgcgggcgggcgtgagcctcggtgcaccaggaggcacttcccgcgggaggcgctgggctcgcgctaattggggcggggggggggggcggcgggggaggagggaactggcgcgcggcttggtttccattagagacgcaaagtttctgctccgggaggaggcggcggcgccgcgggctcgtcgcctgggggagcagaagcgggtgggaggtgcgggtggccttggcctcagccctggtgcgcgggggccgggggtggtgaccctcctggccgaggaggggcggcgtccagacgcccgctcgggggccgccttcccccccacgcctgcccccgggcacgcgccctgcccggtccctcgccccgcgccacttccagtccgcagagagatgccctccacgtttctgctttctctgcagcctctagattgccagatgcgactgtgcgcctcgctgggtgtgttttccacagccccttcctcctcggcgtgcagggctgacatcaccgactgcgtttctggtttggcgggtggggagatggttccccgcagggttctggtacacctttgcccccagggctagcgccatttgggggaggaggttttcgttgtcgagaaagttggatgctcctggtaacccctctaacaagagagttctgtagcgaggtgggactgttctccccataaggtgacagtttctcttgcgaggtgtggcagcgcttcctgttgtacaagacagatgttgccttggcgttacgtaaatcatcgtgtctccgtcatttaaagaaagccaatttttagtgattgaggtagaaagaaagatccgtttataatttgtaaaaacaaattttcacccagaatcaatatattggaacaccattcctactgttaaagttttcacttaagagtataaacttcatcagctttctattaggacttattttgtaattggcttcttaggcatccttctttaaaagagaaatccacgttagctctccttgaggtctcgagttccctcggctggaggcacaggttcagtggagaccaaataatgcaggtgaattaccttcgtggccattactgcctccaacgaagtgtgtttattaagaacagttcttatgtcattcttaaggtaggtagggttaatactctccagcaaatttagtagatactctttgccagaaaagagaggagtatatatagtttgataattattgtgtagttttctgtgtacttaatttttgcagttttgtaacacttcatttgtaagatggtaccattttttcctggcttctgaatcataggatagtttgacccagggcattagccattgtaatggtaggcttttaacaaataactgcctaatttaaaggattggaaagcatttgttacatggaaatgaagttggtggcgtacccagttgctgtatctttattttttctacttaattatttctcataaaatggatataaaagcctgttaatccaacccaatgccattatgtaacgccagtttggagatttcgagggcctggagcagtgcgcaaggtgcgctgaaagcctgcccctggatgagatccttatcctggctgtgatggcagtggcagtgggctgggtcccttgttgagtggaaagggggactgcggtgtccatggtgcagtaggtggcgctcttctgtcttagagcctgccgccactgcagctggtgccaaggggccttctgccactagaggtgccatttttcacatgatgaacttagcctagttagatcgcagagcaagctgtaagccatgggcccagaaaagaaaacttgaagtgagcagatgttgtcacttccttgtaatcctttgttaaaatagcataaggagttttctttattctatttactttcattaaatgaccgtgctacaggtttcaaaggattttaagattgatttttgaaagatcacaatattaaaagtataactggaaaacctatgttgaaatcaaccaaacatgtcgtggactgaatgataaccttttctttcttcatatagGCTGATCAGCTGACCGAAGAACAGATTGCTGgtaagttgacaactccaaggagtccccagaaggccagaactaggcactgactcagttttggtgactcctctgttcctccccgctacagtctgggcagttttctaagaatttatttaaataagaacagtaagcagaaacactgaggtcagatgttattcttgccagtactttatagatgaggtgaaaggaagtaaaactaaggatgcccacatgttaaactctggagaatttgaccatgtttcacaatgtgcaaagtttgcgtatgattaattgtactgagcctgctactcagcggtttagtttacaattcttatgccatgggtctttcagtaatctgccacgaaagcttgtgctcgctatcctaaaataaatggaaatgggtgaatatgagtgttaggaccactgtagtaattgggaagaaagttacattagttaaactctgttgcccaggctggtctctaactcctgggctcaagcaatcctcctgcctcagcctcctgagtagctgggactacaggcatgtgccaccacgtctggcagattttagctttttaatattcctggaggacttgttttgagactgtttctcgttaggaaaccaggaatgcttctgaaatattctaaaagtcatgtggagagagtttacctgggaatgtacatttctagtaaccattttatttgttatgaaacaagggattcttatggctttagaaatgtaacaggaagggatttgaagggggcacatggaccaatcttgtcagattggatttagtcccttgaacctgggaggcaggggttgtagtgagctgagattgcaccactgcactccaatctcggtgacagagcgagactccattgtttaaaaaaaaaaaaaaagattggatttaggactaatttaagcatgttccagcttagccgccttgaaacctttgggaatattgtggtgtgtggcactgtttattgggagcagtgtttgctttatgggctgctgtatgaaggccagtccaacaggactattgtggtcattatttcagtagataaagaccagacttctgatacgttgcacaacttgaatggctggctttggcaagcccccggcaagtgtgtattgtgactgggttggataaagacattgattctaacgggtcaacttttgttttcagAATTCAAGGAAGCCTTCTCCCTATTTGATAAAGATGGCGATGGCACCATCACAACAAAGGAACTTGGAACTGTCATGAGGTCACTGGGTCAGAACCCAACAGAAGCTGAATTGCAGGATATGATCAATGAAGTGGATGCTGATGgtaagagctttaaaaccatgaatgagggccattgttgtgtaattcaagttcagacatgttacaggattgtctttcaggtccccagagcaaagcaaatgtgcaaagatcctttctgtggttgccccagggccattgacaattaaaatagaagatgatgggccttgcgtccatcctgcttagtgtctagaatgttttctgcatgggatcactattgttttcttcctgcttggtgcgacctagagctcaaatctatttttttttttttttttggagacggagtctcgccctgtcgcccaggctggagtggcactggcgcgatctcggctcactgcaacctctgcctcttgggttccagcgattctcctgcgtcagccttctgagtagctggaattacaggcgtgtgtcgccacgcccagttagtgttttgtatctttagtagagatggggtttcaccatgttggccaggctggtctcaaactcctgacctcgtgatccgccctccccggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgaaccactgctcctggccgagctcaaagcttttatcaactggccca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SEQ ID NO：2
钙调蛋白2(CALM2)基因序列(来自UCSC基因组浏览器)。外显子序列用大写。
＞hg19_knownGene_uc002rvt.2范围＝chr2：47387221-47403740 5′pad＝03′pad＝0链＝-重复掩蔽＝无
CTCGTTTGCGATGTTCCGTTATCTGGATGCGGCGGAGGGATCTGGCGGAGGGAGGTGTTTATGAGGCGCTGGGGGCGGAGGAGGCGAATTAGTCCGAGTGGAGAGAGCGAGCTGAGTGGTTGTGTGGTCGCGTCTCGGAAACCGGTAGCGCTTGCAGCATGgtgagtgcatcgctgagctgccggcgctgggcctgtggggggaagagactggagcgaactgactaaacaaaggaaactcgcctcccttacaccttcaaggagtggtttctgccagagggatggcgcgaaagaggccagggatgccggcgacggttgtgtcgcaggtgctcccccacccccattctcttcaggggggcttcctctagtgagttgagggccggacgcacagttcccgaggtggtgaagctcctcgggggcttggctggaggaggatgggtccgggatgagggacagcccagtgcacgggaaggagagaaagtgaaggaagggagagagggagcgtagagagccttctgtcgggcgtctggaaaggtcaagcagggggcgaattcaatccacccgaccgacggttagtgcgggcgccaggaagcgcctttgtccgcttgcggccgccatgcgcccagggggcgggaggagcgcgcggggccctggggcgagcgtcggcgtcgcagttagcccgcgtcctccgcgtgccgggatccagggggcgcgcgggcgggcgggcggcgcgctgtgtgggccgagcccgcgcggcgcagggagcggccggtgggggcggggcgggcgagcgcctcgcgggacccggagccgccgccccgctcggccccgctcgagctccagctgctctgctggcacctgcaggactgcggagatctccttggcgctgcggggccattggcggggatgggcgggggaggggggcctcgacggtttcccatccccctctggcaaccctaatcttccttctccatctgggccctggggcgtcttccaccacccaggccggatgctttaaaaaaaattgctttttaaagtgtctgtcgttgaaagaaattagtcttacccttgaagtcaggggcgcgtcctcgcaatacacatcttgttagggaaagtgttcggctccagctagggttctacaaggcgtttcttgttcaccgccggagggaagcaggctccggagtgactgccttctgaaagtcggtcttgtaacaattggatggatgcctttgaagagcccctgtccctattctatgcttgaaaacagcgtgcagtcctaatgttcaagaaccacgaccacataaaaacattgctccccttctgctgctttgaaaacgacccctaaattccgtgtagaagttgccaggtcgtcttgacgtacacttcgtttgtatgatgtttgtctgtcaaatactgtgatggaagagtgtatgcgggggaggagcagggaatttttaaaagcattttccggtcacctcagactgggagatcatgttctttcctgaaaaaaaaaaaaaaaaacacctaatgagggcggtgatctgtgatacttactttgtggttcctcctgccaagtggttacagcgatgggtgtgtccaggaggcaaggtgacatcttaaacaggagttagggatccttgccaactgaaacctccagcctgtatgggtgtggggagacgatttcaccttaaataaaactagcgttcattgacgtttgatggatttgcttcatcttgatgcttcaaatgttattctgaatttgaatgtgctggttacatttgctttcttaaagatgtagttacaggcatatgtaataaacattacaagttgtggagtaagcttttttttttaaataaacgaagggtaaagttttctttaatcagttttgataattgaatcagtaattcgaatagattttttcttggtagagttggtatctacgcatttgtggtcccttgcccagtgttaagcttttgtagttactgtttgcatcactggtgctttgggggttttctgttaaattgacagctcttactataagagacaaagtcgaaaaaaaaaatcttaataaaaattgacagatatcattatttgtgacagatacagtaaatttgaaaattgccttcacataactttataattagaggactgagattttacattaggaatccaattaaaaaaaattagccggacataatggcctgtgcgtgtagtcctggctagtcaatgggctgaggcaggaggatcatcttgggcccgggagttggagactgtagtgagctatgatcacaccactgcactccctgggcaacagagtgagaccctgtctctcaaaaaataaaaaaaattaggaccccaagttaaagtataaaaaattttatacggaagtaaagtaagattgctcatgtaactcttgagtttacatgtaatcaacatatgctcattgaaaacgggattgcttcaagaggactttgagtgcagggtgattaggtaagtaaaagatgtaaaaaggtagaaaatttttgtcacttgagtctaaataattgttcttataagtgccaacgcctgtttctgttaggctcagaagatcaaaggatttggctcttttaaaatatagaaagctctagcttcagctagaatttaggcctttagtaatagccctaatttttatgaagccattttgttccagtgatcttttggtgagagatgctatgtaagtactattcttcagaattaggtgtctttttaccctaatgaaataatttagattgcttttgatacaggtaaaacaaatatcctggcttccataattgtagaaaaaacttcatataggaatccttgttgtatcaaagtagcacctgatgggaatgaacagacaggaatggatgaaggatagcagtttgcgttccatttcaagcctatgggctcacacatttattcagataagaacaccacctttcactagataaactccaacagtattcatgcatacttttgaatggcatgtaggaaatgtttgataggtacataatgtattcacttcaggtcactaatgtaatacggggtcgtgctccttagtgttgacagatcacctatggttctccaaaatgaacattctagtacaggaggtctagggaggaacctgagagtatactaatgcctaggaactttctctggagtggcaagagcagtgggaagaattatgtcaatagctacagaaataagggagtaagaacaagtcatctctctagtgaattcttcttcactttactgagataaacatacatgttaatgagcttgagttttcccaaaagtataattcttctggttcttctaagaaaatggcactccctggaaacaaggaagaaccaaatttattcgcctttgtagcagttgggaaagttagtgctaggaagtcttcttgatttatagtaggctttaatctggatattgctggtaaaagtttattctaaaacctgaactctggataagtaatacaaaaagcttctcaaccttccaagcaaaattgagagctttcaggttatgtgagtaatttggtctcttgggtgcttaattcattccttgaagctcatttttgtgatctcttccaagattgcatttgcttggaggtagggagttagacaagatggtatgaggtccctaaattttgactttccaagcaaaattggacagtggttcctaaattgctaacatcctcgtttcttcctaaggcttctcatgtttcatatatagtagccttcccaaagtcccatttcccaccccccccccccccccaacccatgtagagagaacgaacctgtctcccttcctgtacagagtacgggatccttcaactttcacacaggctgcagtgtctgccacacatttagctcaacttttttttagccttaaagtgatgtccgctgcatctgtcgctgggttgcaccttgtggatttagtttgcataaattttctcagcttaaacaaagttaacattgaatagagtaagcttaccataaagggcttaataaatgccatgcatgtctacattcggtgtggaaattgagctagtcaggttgatatttaacattgtaggttctttgttaatttatatgaaataatggttatcatttaactctttaggttagctttgtacatagcatctcactttgcacaacaaccctgcaaggtaagtattgttattcttgtgctacaaatgaagttgactgagaggaggagtaccacgtccaaggtcacacagctattaaatggcagggctgggatactggcctgtgactcagaacttgatgctttccccccacgccacgcatgccaggttgcccttcctttcagaaatggtggaagtcctgcaaaatgcaataaactgaagtaatgtagcttctattaatacaaagtaaataactcagatttactggattttaaaccttattccttgggtaaacaatctgtgactgacttcacaccaaatatttgttggcggaggatttggactttagggataaaagtggatacattttttattttacaaactctgtatttgaacttaattattggctcttcaattttacgttaccagcttttttttttttttttttttttaatgaatttgatttacatcatggtcaaacaaaaattgttgagcagggaaaataaactgctttctggattccttcttgaattttctcatgtgccctagagaaaatgtgttccacattaaggtgttactttttccaggggtgtgttcatttaaaaagaatgaagccaggcaatgtttatttttcttttacctataaataaatgaatggattaatcattgtatacttgactcccatgttggtagggattttagataggaggctatttcttgtctgtgcttctcaataccccataagcagttgcttcatggatgtatatactaataagcagtgaaagaaagtgcatgttcaaagaatacaacaaggagtctggatattttgcaat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SEQ ID NO：3
钙调蛋白3(CALM3)基因序列(来自UCSC基因组浏览器)。外显子序列用大写。
＞hg19_knownGene_uc002pew.3范围＝chr19：47104512-471140395′pad＝0 3′pad＝0链＝+重复掩蔽＝无
GGCGGGGCGCGCGCGGCGGCCGTTGAGGGACCGTTGGGGCGGGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCGCGCGCTGCGGGCAGTGAGTGTGGAGGCGCGGACGCGCGGCGGAGCTGGAACTGCTGCAGCTGCTGCCGCCGCCGGAGGAACCTTGATCCCCGTGCTCCGGACACCCCGGGCCTCGCCATGgtgagtgaggctggggggtcgccgaggctgcgggctctgaggcgggcttaacggggcaggacccctgagggggcgacagagcccagagtggggggcgtccgggcccggcgagagcctcgggacccttttctacccgcgttgtcgggggctgttgaacccagagcgggacgtctggatcaccagaggtttccagaagcgactttagcaccaaatgggatgtttaagtccacaaatgggtatctgagcccctaaaggggacatttgaaccccggatggaggatcgggaccctcagtgggacccctcaaaaggattttggacccaggatggggcgttgggtttcaggatggaggtgtttggaccccaggggacgaaataagaaagatgggctggggaggggagctattcgggccctgatgaaggcgtttggtcctgagaggatgcggggaacgggggacgaagggaggctgggctgctcctggatggggtggtggagggtagctgggcccgggcggggaggggcgacccctgggctcctgtggagcagaggagagggtcaaggatgggcggtcacttctacagatgagactcccgagggtgggggagggtgggggagggtggtctccagagcccagcactgcagaggaggaggagggtgaggtgcaagcttatgggaggaagagcctggggtgggtggcagcggagattagaagatactcttgaaggcttccgggacggagaaggatcagggtcgtggaggtggtgaaaagggatggtgagagtggggctcgccagtagtcgggggacagggacccttggggttaatttggaagtagctagaaaaggttccgaggttactagtgggttaagactgttgctctagaaagacagaatttttttaacggggtgggagtgttgtgtttgggtccaagagaagatggatttccaaggtgaggggtgggggaggacttgggcttgggtggttgggaggtgaggtggaaggagaaaatgaatggcagtcaggggggcctaggtttgggggtggatgtgggtagcaccctgccagtctccagggacaggccaggacaaagacggctcagtgtggatggggagtgggctgcagggcccggaggaagcttttctaccgtcctccttcctcaggaagaacgcggctgggtggaagacaccggggcagtgggagcaggtgggcggagctgttcgggcccctattgcgcactgaagcctcatgaaatggggatgggagatcaaagtttggggtgcctcgaatgagccagctttttcaagcctagaagcctcactctgtcgctgcccttttcaggccaagagcactgccttttcccagcaggagcgccggttttctcatgatccccagccccacgcaccatgctgcacctcgtcacttgtgccaaatgacagtgcagtacagtgtggcgtcagtgacaatcagatgcctattcccgtgccctcggggtgggggctgcagagcttgatcagagagtgcctctggggagaccccttgatcggcctgagggccacttgttccattcagggccctcgctgagcgtgtctgttaattcacagggctttgagagaaaaccagcagactagttctttcctactccctgccacccacaacacccacagccccaccaggctgagcctgggaaccgtgtgcagccatcctccctggcaaggctggggagaacaggcagccgctgctgtgtatcagatctcatacttgctgacacagacctgatggctcctcttgccgctaccccattttcccccagcagaacctggctaaaaggggccctgaagcactagcaggccccctacctccagaataggacccaagctttggccacaactagtttctctttctgtttgtaatcagcaaggtagaggtgggacaagtcactggtaactggccttggactttggcctgagctctgtggctcctccttggcccgggtgaggggccctggccttggtttctgatctcatctaacactgctctctggcattggctgggggctggggcaaggcagagaaatcacaccctcttccctcccccacctcatggttttttttcttgtccagccccttgctggagcctaagatgagggataaggaagcaggagaccagctgagttattttggaaacagtttttgttgaaagtttagtcttcaggtctagaaagggaagaaaccttgagcaaggatcaatgatatcttcttaggcggtcggttttctgggcggcaaccttgcttgagatctgtacctttccttgaccaagcagggaagtgggtctccaacatgggagggagagcatctgacaggccctccatgcagagccacgcctatttgcagcaaccctgtgacagaactgaacatggcagtgcctcatctgcatcttccagtcttttggtggagactggcaaacggtggccttcagagccgctcggggcagtctgcagcctgtcacagcctcctcgcccccacccccagccccttacagtgctgcccaaaggtccggggagctggacttcttgcagggcggaacagtgggctgggaaggccctgacctggctcgctttttccattctaggccaggggaaagaatgaaaagcagatgggatggcagccacctccccacactgctgccctcctctctgttctttccctgaccctccctgggcattgcctggtctcggtaaccagaagcccatcctcccttctcactttccctaagcctcttcctcaggtgtcaggacctaagggatggctccaggcttttttgtccatggtgggaggtggggggcaggtggatcaagaggctcatgggcctggggctaccaggttggcatttagaagcccaaccaccctgtcttttttgaaggcaatgcagaagaatcttcatttggcctccccacctcccctttacactttggacttttccagaatgtgcatgtgtgccgttttctcccttcctctttccccctccctaagccctctcccctctgtgatcatcattttgattacccctcccattctgcctatttggggcttgcaagttcttcttccgttaggttttttttttttttttctaacttttttagatcagtgattgttaatatttgggacggggatgggggtaggggaggcaggcagtggtttgttcctagcttctggaacctctccgtagaatactgcaaattcacataatagtctgcttctatttctgaggctctcagactcgagactagaacatgctatagacttggagcccctttccctgattgtgaaaggaaggggaacagacccaccatggtcccgggatggtggtgccttcttcacagcatcaacaaaaaccagggaaaatgtgtcttttggctgctaaagctaaatgttgggattcagcctccccaaccccccagccccgctcctgccccataggatcactatgcctggctgatgcccagcacaccagtgcaggagaagccagtccccgcatctcctccccacccccaaaccccgcatgcagcaagggctgcctgccacccactggccagtccccagagtgcccaagctggaaagggttaaaaactgcagtgcaagccagcttcagtcctctgctgctgcccgctgcagccctctccctgacgtttgtcccttctgcccaaaagaaacaaaacagaatggccctgtgccctcactgtgcgcagggggtggagcgcctgcctccagcctgaccagagttctttaggtgcttgagcaactcgggccgccggttaggagaatttttgccacttgggtggactctgcctgagccaaccgcctccaaataggtgacacagaaactagcagagatagccccagacatcgtccctctgccctacccaaggactggcctgcttcagtttggagccttctagagcttcttgatgaggcctccagggcaatcgttcccttcactcggcctctggggctctcactgatgagatgcaaacctgtgccaggcctcaccagcgctgctggtttggggctggggcaggcttttctcccgcccctgtggctcccacatgctgagttgagattggaagcccgtgggtctgggcagcttcatcgggccgtgcgtccagcaggcctgagtgtccagcccaccctggtacccagctttctgaatcaccagactttatcatcaggcgctggctctgcctcagaccctgactctggcatgctcctccctggcccggcgggaatggcacgtggagctggcctcactggggccgagggtctgggctgagtgaggaagatgcgtccgtgctgtccggcctggtgactgactttccccttcatgcttttacagGCTGACCAGCTGACTGAGGAGCAGATTGCAGgtgagtctgctatccccctcatcttagctcaggaaagcctccacatccccagccaaatcttagccactgaggagtgacatctgatgggtgaacctgtgtatcccttgtgtcacctaacactatgccttgtgcctagaatgctgataaatgtgtgtaagagcacaccagtgccccaatgacacgaagccccatggccctgagacaggcctttaccagacaccaaaggctgtgttcctctcctgggcctgggtcatctaggggcttgatatcagtggctgcaggacgagcccaactctctctcccagcttcagccaggttggcttagaaggtgagctccctgcctccctgtggggcctgcagagctcctgtcccactttaggagccgcccaggagctggctcgtcactcccacctctgcgcttgcctgcgctttgcacttcctttcgcatgtgcctgcgcctgcctgttctgctggcggaagtgcctccccagtgctttgcatgggcagctccttcccgtcccttagctcagatgtcccctcggggaggccttccctgacccccatctcaagtacacagccttcctttactctccttcacatcactttattttcttcataacctttctcgctgtctgaaattattttcttatgtcttcacctgttgtatctcctgttactagatgtgagttccattgagtttgggacttggttttgttggtccctgctatagccttaatgcctgcctagaacgtagtaggtcctccgcaaacttttgctggctaaacaaacatctctctctcagcaagctagaagaaatccctggatcccatctaattcatttttctaacccctccaaaaccccagaagggtcagctacaggaactattgtgtaattacagatccgtgcctgcctacccgcccatactgagctgcccgaggacagagagcaactcttggtttatctccatagccaggggccagcacacagtagaccagagtagcgatccagagaatgggcctctgctccccaccagctacccagcccccagctctgctgtcaggttcaaccggctgtgtaacaagtactaaaggcccagcttctgcggtgggaggcaggaacggacttgccttctctcctttctcccctcaacccgcatcacagagtcacctttgcagcttcaaaattttggccctgggtggctatggagacccctgaggaaagccagaagatggcctggtttagtgatcatgagctcggggtgccccatgacccactcactacctgccctccccaagaacaacaaggcctcagcacagggaggtgccagcctccccaaagagactcttgccatgtccccagggcccagaggctcagggccacagcttcccagctgtgcatgtccctcccaatgcacctgccacccatctcccaactctggccttgtgcaacataaacggtctgcttttcaccctgtccccattagcaaactgtccaccgcctcaccccagcccacaccctctgggaataggctgccggacatctgtttttggagggcttgggggtagaggagcaccaggtgccaaaatgggcccagtgggagggcaagagccatgtgcttttctccctgcccctgatgcggccccagctgtggccttcccactcagcactgctagctcctcatcctcctggcttggcagccgtcccctcgctttccatccccccatcaaccccacgcactgtccgtcagccatgttctgctgccgaccacccccacgctcaccacacgcagtggctcagctcctttggaagctggtagcacccacggcaaggaacagggctgccagtcagaagggagtggatgcctgcatttcctcttcaggccggccagaggcattctgcagcctcccctcctcgtcccagccagccaaccctggctaacacactcagacaaagaatcctttcggctctcattcactccatgactttggttcatttcatcatttcaagggagaagtcaaagccagggaccaaacagaaatgtagaatcatctaaggacagctgtcagaccattttccccactgtcttcactggctggccagaaaaatagcttcacctagcacagtgttgatgttcaataactgttgaatgaaggttggaagggctttgccctgagcactgaggagagagagctggttgcgtgggacttgaagtctgtctcagtttctttaggtgggactgatgcccttggccttcctccagggaaggcatccagcatccagaggtaaggattctcctgtggaccttgtgacctctgactcctcccccttcttcccccagAGTTCAAGGAGGCCTTCTCCCTCTTTGACAAGGATGGAGATGGCACTATCACCACCAAGGAGTTGGGGACAGTGATGAGATCCCTGGGACAGAACCCCACTGAAGCAGAGCTGCAGGATATGATCAATGAGGTGGATGCAGATGgtgagccccacagagcgcgtgggcagccctgctcctggtcaccccgagtgactgcagggagcctctctcagggtgatggatgagcccgtgtctctcagggcccaggccaagagcattctccatcctttccccaccttccagGGAACGGGACCATTGACTTCCCGGAGTTCCTGACCATGATGGCCAGAAAGATGAAGGACACAGACAGTGAGGAGGAGATCCGAGAGGCGTTCCGTGTCTTTGACAAGgtaagcagccctctccaggggcggctctgagactgacgccagccttcaggcagacaggcggaactggagccacggagctaccacttccaggaggtccgggtcccggtgccagcctcattgccaacctgctctgccacctcaggcagcctccctcactgtgctcactgctgagggatggtgatgacagccacccctctcactgcctctctccccaccgggagaagtgcccagtgaaaggctttatccccaacccccagGATGGGAATGGCTACATCAGCGCCGCAGAGCTGCGTCACGTAATGACGAACCTGGGGGAGAAGCTGACCGATGAGGAGGTGGATGAGATGATCAGGGAGGCTGACATCGATGGAGATGGCCAGGTCAATTATGAAGgtgagtcaaggccaggcttgatctctggaacaagaagagaatcgcagcttcaggaacaagcccccagatccctcttgttggggagggccgctcgccacttagcctgcccgcctgacctcctctctctctgcttcactccacagAGTTTGTACAGATGATGACTGCAAAGTGAAGGCCCCCCGGGCAGCTGGCGATGCCCGTTCTCTTGATCTCTCTCTTCTCGCGCGCGCACTCTCTCTTCAACACTCCCCTGCGTACCCCGGTTCTAGCAAACACCAATTGATTGACTGAGAATCTGATAAAGCAACAAAAGATTTGTCCCAAGCTGCATGATTGCTCTTTCTCCTTCTTCCCTGAGTCTCTCTCCATGCCCCTCATCTCTTCCTTTTGCCCTCGCCTCTTCCATCCATGTCTTCCAAGGCCTGATGCATTCATAAGTTGAAGCCCTCCCCAGATCCCCTTGGGGAGCCTCTGCCCTCCTCCAGCCCGGATGGCTCTCCTCCATTTTGGTTTGTTTCCTCTTGTTTGTCATCTTATTTTGGGTGCTGGGGTGGCTGCCAGCCCTGTCCCGGGACCTGCTGGGAGGGACAAGAGGCCCTCCCCCAGGCAGAAGAGCATGCCCTTTGCCGTTGCATGCAACCAGCCCTGTGATTCCACGTGCAGATCCCAGCAGCCTGTTGGGGCAGGGGTGCCAAGAGAGGCATTCCAGAAGGACTGAGGGGGCGTTGAGGAATTGTGGCGTTGACTGGATGTGGCCCAGGAGGGGGTCGAGGGGGCCAACTCACAGAAGGGGACTGACAGTGGGCAACACTCACATCCCACTGGCTGCTGTTCTGAAACCATCTGATTGGCTTTCTGAGGTTTGGCTGGGTGGGGACTGCTCATTTGGCCACTCTGCAAATTGGACTTGCCCGCGTTCCTGAAGCGCTCTCGAGCTGTTCTGTAAATACCTGGTGCTAACATCCCATGCCGCTCCCTCCTCACGATGCACCCACCGCCCTGAGGGCCCGTCCTAGGAATGGATGTGGGGATGGTCGCTTTGTAATGTGCTGGTTCTCTTTTTTTTTCTTTCCCCTCTATGGCCCTTAAGACTTTCATTTTGTTCAGAACCATGCTGGGCTAGCTAAAGGGTGGGGAGAGGGAAGATGGGCCCCACCACGCTCTCAAGAGAACGCACCTGCAATAAAACAGTCTTGTCGGCCAGCTGCCCAGGGGACGGCAGCTACAGCAGCCTCTGCGTCCTGGTCCGCCAGCACCTCCCGCTTCTCCGTGGTGACTTGGCGCCGCTTCCTCACATCTGTGCTCCGTGCCCTCTTCCCTGCCTCTTCCCTCGCCCACCTGCCTGCCCCCATACTCCCCCAGCGGAGAGCATGATCCGTGCCCTTGCTTCTGACTTTCGCCTCTGGGACAAGTAAGTCAATGTGGGCAGTTCAGTCGTCTGGGTTTTTTCCCCTTTTCTGTTCATTTCATCTGGCTCCCCCCACCACCTCCCCACCCCACCCCCCACCCCCTGCTTCCCCTCACTGCCCAGGTCGATCAAGTGGCTTTTCCTGGGACCTGCCCAGCTTTGAGAATCTCTTCTCATCCACCCTCTGGCACCCAGCCTCTGAGGGAAGGAGGGATGGGGCATAGTGGGAGACCCAGCCAAGAGCTGAGGGTAAGGGCAGGTAGGCGTGAGGCTGTGGACATTTTCGGAATGTTTTGGTTTTGTTTTTTTTAAACCGGGCAATATTGTGTTCAGTTCAAGCTGTGAAGAAAAATATATATCAATGTTTTCCAATAAAATACAGTGACTACCTGA
SEQ ID NO：4
钙调蛋白氨基酸序列。
ADQLTEEQIAEFKEAFSLFDKDGDGTITTKELGTVMRSLGQNPTEAELQDMINEVDADGNGTIDFPEFLTMMARKMKDTDSEEEIREAFRVFDKDGNGYISAAELRHVMTNLGEKLTDEEVDEMIREADIDGDGQVNYEEFVQMMTAK
SEQ ID NO：5
成熟的mRNA序列(CALM1)
＞uc001xy1.2(CALM1)长度＝4268
gatacggcgcaccatatatatatcgcggggcgcagactcgcgctccggcagtggtgctgggagtgtcgtggacgccgtgccgttactcgtagtcaggcggcggcgcaggcggcggcggcggcatagcgcacagcgcgccttagcagcagcagcagcagcagcggcatcggaggtacccccgccgtcgcagcccccgcgctggtgcagccaccctcgctccctctgctcttcctcccttcgctcgcaccatggctgatcagctgaccgaagaacagattgctgaattcaaggaagccttctccctatttgataaagatggcgatggcaccatcacaacaaaggaacttggaactgtcatgaggtcactgggtcagaacccaacagaagctgaattgcaggatatgatcaatgaagtggatgctgatggtaatggcaccattgacttccccgaatttttgactatgatggctagaaaaatgaaagatacagatagtgaagaagaaatccgtgaggcattccgagtctttgacaaggatggcaatggttatatcagtgcagcagaactacgtcacgtcatgacaaacttaggagaaaaactaacagatgaagaagtagatgaaatgatcagagaagcagatattgatggagacggacaagtcaactatgaagaattcgtacagatgatgactgcaaaatgaagacctactttcaactcctttttcccccctctagaagaatcaaattgaatcttttacttacctcttgcaaaaaaaagaaaaaagaaaaaagttcatttattcattctgtttctatatagcaaaactgaatgtcaaaagtaccttctgtccacacacacaaaatctgcatgtattggttggtggtcctgtcccctaaagatcaagctacacatcagttttacaatataaatacttgtactaccttaatgataaggactccttaaagttccatttgctaatgattaatacactgtttgggctggccagtttttcatgcatgcagcttgacgattgagcacagtcaggcctttgtattaaaaatgaaaaatgaaaaaacaaattcaaaacctattcaaatgggttctagttcaatttgtttagtataaattgtcatagctggtttactgaaaacaaacacatttaaaattggtttacctcaggatgacgtgcagaaaaatgggtgaaggataaaccgttgagacgtggccccactggtaggatggtcctcttgtacttcgtgtgctccgacccatggtgacgatgacacaccctggtggcatgcccgtgtatgttggtttagcgttgtctgcattgttctagagtgaaacaggtgtcaggctgtcactgttcacacaaatttttaataagaaacatttaccaagggagcatctttggactctctgtttttaaaaccttctgaaccatgacttggagccggcagagtaggctgtggctgtggacttcagcacaaccatcaacattgctgttcaaagaaattacagtttacgtccattccaagttgtaaatgctagtctttttttttttttttccaataaaaagaccattaacttaaagtggtgttaaatgctttgtaaagctgagatctaaatggggacaaggcaggtggaggggaggccagtgtacatgtaaatgcccacagcccagcattgggtttccctcccaaggccccagcaccaacctctgagcccaagaccttgcctgaaaacaagcagataccgattgcttcatcctatttatggacatgtaggtctagttgcattttcactggggggaggggggaaggtgaattatggtaacttttaatgatctattcaggcagtagagctcttaaggaaaaaaaaaaacccactttctctcaagcatgtatttaggggttgttctcaattgtgctgctgattacctgtcttatgtaactacttgagaccatctgcaagagacatgatttagtgtgtctgtaattcaatcttcgctgtgtgtggtagaagcagtagtcacttttgtaagccagtctcttcatgcctaaaagacactaccagtcacctttgattcgcgacttttaatttatgattatacttagcctcctcctcctttttttttttttcccaagttgacttgactttgcttttttccccccaagtagaactaatgctagcttccagcttgaaagtaaaactccagtgtggagtgaattttgtgtctaattataaacctgtaaccaaaactcagacatctggtactggtctttgcattgagattggtccctgtaaaaccccctttaaaagcatattgcatttagtacagagctcttttttgaaatgaaggctggagatgtgcatttttcacggtgttaactggttgtatcttattagcaaggagattggggttttgagtgtttgcgtgggtggtttcaatttgccagggaacagtggcaggctgctagcaaggcagtgagaagctcttggcagccaaatgggtgcattcagggctgatttatagagacccttggcttctccttctcctactccctgtctttctggcattttgtagcttgttagattttctgccagaggggtgggtcagagcagtggaggggagacatcgcccatgtgcttctgctactggtccttgggctgggtggttggtagaggagatgttgacactatgagctaagggttggcttttgtaattacctgaatctgaaaggaatgcctaaggttaccttggggtttctcttctggtgagatagggttcctggtttgagtaagttaatgtcctggatatttcttgtggcagggggtggtcaaagagcctgattgctgacccagtctcaggcctgtggtcgatgacctctcggtagtttcaaagggggctggagggggatatttgacttgttttttcgaaatgtagccttctaaccctcaagtctttagaagctgggtggactcttagtggtcctgcagcgtatcctaaaagactacctttgaaacaggattcttgtatggccaggatcctgtctgggaaccagaaaccctacaccctccccctccagggaatgctgagttccagttttgagcagaggtgaggcagaatccactgtagccttccgccctggtatttggggggatgaccagcccaggcgttgggtgttagtctgcatgagtttgtgagaggaaatagctgggtgtcctggcagtgcccttgaagttggttaggaccttcctgtaaactcttgcccctacttctaactactctataaatatatacatatatttatatataaagtgattagttgaactggcatcctgctttagcctgagacttgccataagaaactgctgagtacttggcaaaccctttcatagttttgttctccatctgtttggggtaggtgttgagcgaggcaaatggatctcgatatttcagatgggcttttgatgcactgttgccaaggaaggctttttctgattttttgacaaatgaatttttgcacactttcattggtgtctttcggcaacttacacacattgaaaatgagctattgtacatatttttatattctctttataaatgcatgtctgattgtacttgtaacaatattgtaatgaacggctgtgcagtaggcccagcgctgctgtgtctcgtcagaggaatagcttaccacgaacccctcagcatactgggaatctcttcctgaacaacgaatgtaaatttggtcaagtctactcttccgttcattcaattattttaagcatttgaattatttattgtatatcctaaatatatttctcctttggcagtgactagatttccactaatgtgtcttaatctatccctccagctggcagttactgtttttttaatcccctgaagttgtcctgtaggagacagaaattctttgctgtctgtatcccttggagtaagaaggtagtggcatgggtggagtgtgtgttctttctccaaatctattatgatgtttattaaacacttctgtagcaaagatggtggtagttcttttgttactgaagttgcccttcaccatggctatttgaaaaggagatgtacttggacgtttctgtaaatcttgagataaactgtttggagatttaaccacctctctgatgggggaccaactctatggaaattgtaaatacgttttatttataaacctggcactgtattcaataaacatttctgcagcctttcatctctaactgcgaaaaaaaaaaaaaa
SEQ ID NO：6
成熟的mRNA序列(CALM2)
＞uc002rvt.2(CALM2)长度＝1309
ctcgtttgcgatgttccgttatctggatgcggcggagggatctggcggagggaggtgtttatgaggcgctgggggcggaggaggcgaattagtccgagtggagagagcgagctgagtggttgtgtggtcgcgtctcggaaaccggtagcgcttgcagcatggctgaccaactgactgaagagcagattgcagaattcaaagaagctttttcactatttgacaaagatggtgatggaactataacaacaaaggaattgggaactgtaatgagatctcttgggcagaatcccacagaagcagagttacaggacatgattaatgaagtagatgctgatggtaatggcacaattgacttccctgaatttctgacaatgatggcaagaaaaatgaaagacacagacagtgaagaagaaattagagaagcattccgtgtgtttgataaggatggcaatggctatattagtgctgcagaacttcgccatgtgatgacaaaccttggagagaagttaacagatgaagaagttgatgaaatgatcagggaagcagatattgatggtgatggtcaagtaaactatgaagagtttgtacaaatgatgacagcaaagtgaagaccttgtacagaatgtgttaaatttcttgtacaaaattgtttatttgccttttctttgtttgtaacttatctgtaaaaggtttctccctactgtcaaaaaaatatgcatgtatagtaattaggacttcattcctccatgttttcttcccttatcttactgtcattgtcctaaaaccttattttagaaaattgatcaagtaacatgttgcatgtggcttactctggatatatctaagcccttctgcacatctaaacttagatggagttggtcaaatgagggaacatctgggttatgccttttttaaagtagttttctttaggaactgtcagcatgttgttgttgaagtgtggagttgtaactctgcgtggactatggacagtcaacaatatgtacttaaaagttgcactattgcaaaacgggtgtattatccaggtactcgtacactatttttttgtactgctggtcctgtaccagaaacattttcttttattgttacttgctttttaaactttgtttagccacttaaaatctgcttatggcacaatttgcctcaaaatccattccaagttgtatatttgttttccaataaaaaaattacaatttacccaatggttgctctgcatctgagtcatttaactgttgaagtctaataattttgaaaataaaatatggcattggtttctgcttggtaaaaaaaa
SEQ ID NO：7
成熟的mRNA序列(CALM3)
＞uc002pew.3(CALM3)长度＝2277
ggcggggcgcgcgcggcggccgttgagggaccgttggggcgggaggcggcggcggcggcggcgcgcgctgcgggcagtgagtgtggaggcgcggacgcgcggcggagctggaactgctgcagctgctgccgccgccggaggaaccttgatccccgtgctccggacaccccgggcctcgccatggctgaccagctgactgaggagcagattgcagagttcaaggaggccttctccctctttgacaaggatggagatggcactatcaccaccaaggagttggggacagtgatgagatccctgggacagaaccccactgaagcagagctgcaggatatgatcaatgaggtggatgcagatgggaacgggaccattgacttcccggagttcctgaccatgatggccagaaagatgaaggacacagacagtgaggaggagatccgagaggcgttccgtgtctttgacaaggatgggaatggctacatcagcgccgcagagctgcgtcacgtaatgacgaacctgggggagaagctgaccgatgaggaggtggatgagatgatcagggaggctgacatcgatggagatggccaggtcaattatgaagagtttgtacagatgatgactgcaaagtgaaggccccccgggcagctggcgatgcccgttctcttgatctctctcttctcgcgcgcgcactctctcttcaacactcccctgcgtaccccggttctagcaaacaccaattgattgactgagaatctgataaagcaacaaaagatttgtcccaagctgcatgattgctctttctccttcttccctgagtctctctccatgcccctcatctcttccttttgccctcgcctcttccatccatgtcttccaaggcctgatgcattcataagttgaagccctccccagatccccttggggagcctctgccctcctccagcccggatggctctcctccattttggtttgtttcctcttgtttgtcatcttattttgggtgctggggtggctgccagccctgtcccgggacctgctgggagggacaagaggccctcccccaggcagaagagcatgccctttgccgttgcatgcaaccagccctgtgattccacgtgcagatcccagcagcctgttggggcaggggtgccaagagaggcattccagaaggactgagggggcgttgaggaattgtggcgttgactggatgtggcccaggagggggtcgagggggccaactcacagaaggggactgacagtgggcaacactcacatcccactggctgctgttctgaaaccatctgattggctttctgaggtttggctgggtggggactgctcatttggccactctgcaaattggacttgcccgcgttcctgaagcgctctcgagctgttctgtaaatacctggtgctaacatcccatgccgctccctcctcacgatgcacccaccgccctgagggcccgtcctaggaatggatgtggggatggtcgctttgtaatgtgctggttctctttttttttctttcccctctatggcccttaagactttcattttgttcagaaccatgctgggctagctaaagggtggggagagggaagatgggccccaccacgctctcaagagaacgcacctgcaataaaacagtcttgtcggccagctgcccaggggacggcagctacagcagcctctgcgtcctggtccgccagcacctcccgcttctccgtggtgacttggcgccgcttcctcacatctgtgctccgtgccctcttccctgcctcttccctcgcccacctgcctgcccccatactcccccagcggagagcatgatccgtgcccttgcttctgactttcgcctctgggacaagtaagtcaatgtgggcagttcagtcgtctgggttttttccccttttctgttcatttcatctggctccccccaccacctccccaccccaccccccaccccctgcttcccctcactgcccaggtcgatcaagtggcttttcctgggacctgcccagctttgagaatctcttctcatccaccctctggcacccagcctctgagggaaggagggatggggcatagtgggagacccagccaagagctgagggtaagggcaggtaggcgtgaggctgtggacattttcggaatgttttggttttgttttttttaaaccgggcaatattgtgttcagttcaagctgtgaagaaaaatatatatcaatgttttccaataaaatacagtgactacctgaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
SEQ ID NO：8
包含突变A4403T的钙调蛋白1(CALM1)基因序列。外显子序列用大写。
＞hg19_knownGene_uc001xy1.2范围＝chr14：90863327-908746195′pad＝0 3′pad＝0链＝+重复掩蔽＝无
GATACGGCGCACCATATATATATCGCGGGGCGCAGACTCGCGCTCCGGCAGTGGTGCTGGGAGTGTCGTGGACGCCGTGCCGTTACTCGTAGTCAGGCGGCGGCGCAGGCGGCGGCGGCGGCATAGCGCACAGCGCGCCTTAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCGGCATCGGAGGTACCCCCGCCGTCGCAGCCCCCGCGCTGGTGCAGCCACCCTCGCTCCCTCTGCTCTTCCTCCCTTCGCTCGCACCATGgtaggtcgggagtggcaaatgccggcgtagcagctgcccgagatttcttcccagatttctagttgttttgtttgttttttgtttgtttttggttcttggaggtttttcttttctgagtgttacgcagcagctgcgcttaaaggaggttgcattttggatttgcatctcggcgacctctgccagggagcttcatttattggttccccttggagctggacttggtcgtaggccgtccacgggcaggggctccggccgcaactgcagcgggggtttctgcatccaatccccctgccccccgcccagccccgcacccactgcatccactagcgccgcacccgggctgcctgcagcgcagcgtttcggcctgggagccgggcggggccgggcactagacccccccccccggcccgcccctccccaccccgcttctccgccggcgcgaaggtggcaggtcgggcgggcagtggagaatgaatgggctggagctggccggtggcgcacattgttccggccgggtgttgaggggcgcagtcagcgcccgccacctccccactttggccggccctgctgggcgccctccctcggtcgctctcccctccttcttcccggggggcgcggcgcgggcgtgggctgggaaggaaggagccggggaagggtggggttgggggcaggaaggcgaggggttgggggcggagagggcggaagcggcggccgggccgccctgcgcccgggcggggccctgcggtgtggccgtggcttgttcctgccgctttcgcaccctgcggccccccacccagtgcagcagtgcgggcgggcgtgagcctcggtgcaccaggaggcacttcccgcgggaggcgctgggctcgcgctaattggggcggggggggggggcggcgggggaggagggaactggcgcgcggcttggtttccattagagacgcaaagtttctgctccgggaggaggcggcggcgccgcgggctcgtcgcctgggggagcagaagcgggtgggaggtgcgggtggccttggcctcagccctggtgcgcgggggccgggggtggtgaccctcctggccgaggaggggcggcgtccagacgcccgctcgggggccgccttcccccccacgcctgcccccgggcacgcgccctgcccggtccctcgccccgcgccacttccagtccgcagagagatgccctccacgtttctgctttctctgcagcctctagattgccagatgcgactgtgcgcctcgctgggtgtgttttccacagccccttcctcctcggcgtgcagggctgacatcaccgactgcgtttctggtttggcgggtggggagatggttccccgcagggttctggtacacctttgcccccagggctagcgccatttgggggaggaggttttcgttgtcgagaaagttggatgctcctggtaacccctctaacaagagagttctgtagcgaggtgggactgttctccccataaggtgacagtttctcttgcgaggtgtggcagcgcttcctgttgtacaagacagatgttgccttggcgttacgtaaatcatcgtgtctccgtcatttaaagaaagccaatttttagtgattgaggtagaaagaaagatccgtttataatttgtaaaaacaaattttcacccagaatcaatatattggaacaccattcctactgttaaagttttcacttaagagtataaacttcatcagctttctattaggacttattttgtaattggcttcttaggcatccttctttaaaagagaaatccacgttagctctccttgaggtctcgagttccctcggctggaggcacaggttcagtggagaccaaataatgcaggtgaattaccttcgtggccattactgcctccaacgaagtgtgtttattaagaacagttcttatgtcattcttaaggtaggtagggttaatactctccagcaaatttagtagatactctttgccagaaaagagaggagtatatatagtttgataattattgtgtagttttctgtgtacttaatttttgcagttttgtaacacttcatttgtaagatggtaccattttttcctggcttctgaatcataggatagtttgacccagggcattagccattgtaatggtaggcttttaacaaataactgcctaatttaaaggattggaaagcatttgttacatggaaatgaagttggtggcgtacccagttgctgtatctttattttttctacttaattatttctcataaaatggatataaaagcctgttaatccaacccaatgccattatgtaacgccagtttggagatttcgagggcctggagcagtgcgcaaggtgcgctgaaagcctgcccctggatgagatccttatcctggctgtgatggcagtggcagtgggctgggtcccttgttgagtggaaagggggactgcggtgtccatggtgcagtaggtggcgctcttctgtcttagagcctgccgccactgcagctggtgccaaggggccttctgccactagaggtgccatttttcacatgatgaacttagcctagttagatcgcagagcaagctgtaagccatgggcccagaaaagaaaacttgaagtgagcagatgttgtcacttccttgtaatcctttgttaaaatagcataaggagttttctttattctatttactttcattaaatgaccgtgctacaggtttcaaaggattttaagattgatttttgaaagatcacaatattaaaagtataactggaaaacctatgttgaaatcaaccaaacatgtcgtggactgaatgataaccttttctttcttcatatagGCTGATCAGCTGACCGAAGAACAGATTGCTGgtaagttgacaactccaaggagtccccagaaggccagaactaggcactgactcagttttggtgactcctctgttcctccccgctacagtctgggcagttttctaagaatttatttaaataagaacagtaagcagaaacactgaggtcagatgttattcttgccagtactttatagatgaggtgaaaggaagtaaaactaaggatgcccacatgttaaactctggagaatttgaccatgtttcacaatgtgcaaagtttgcgtatgattaattgtactgagcctgctactcagcggtttagtttacaattcttatgccatgggtctttcagtaatctgccacgaaagcttgtgctcgctatcctaaaataaatggaaatgggtgaatatgagtgttaggaccactgtagtaattgggaagaaagttacattagttaaactctgttgcccaggctggtctctaactcctgggctcaagcaatcctcctgcctcagcctcctgagtagctgggactacaggcatgtgccaccacgtctggcagattttagctttttaatattcctggaggacttgttttgagactgtttctcgttaggaaaccaggaatgcttctgaaatattctaaaagtcatgtggagagagtttacctgggaatgtacatttctagtaaccattttatttgttatgaaacaagggattcttatggctttagaaatgtaacaggaagggatttgaagggggcacatggaccaatcttgtcagattggatttagtcccttgaacctgggaggcaggggttgtagtgagctgagattgcaccactgcactccaatctcggtgacagagcgagactccattgtttaaaaaaaaaaaaaaagattggatttaggactaatttaagcatgttccagcttagccgccttgaaacctttgggaatattgtggtgtgtggcactgtttattgggagcagtgtttgctttatgggctgctgtatgaaggccagtccaacaggactattgtggtcattatttcagtagataaagaccagacttctgatacgttgcacaacttgaatggctggctttggcaagcccccggcaagtgtgtattgtgactgggttggataaagacattgattctaacgggtcaacttttgttttcagAATTCAAGGAAGCCTTCTCCCTATTTGATAAAGATGGCGATGGCACCATCACAACAAAGGAACTTGGAACTGTCATGAGGTCACTGGGTCAGAACCCAACAGAAGCTGAATTGCAGGATATGATCATGAAGTGGATGCTGATGgtaagagctttaaaaccatgaatgagggccattgttgtgtaattcaagttcagacatgttacaggattgtctttcaggtccccagagcaaagcaaatgtgcaaagatcctttctgtggttgccccagggccattgacaattaaaatagaagatgatgggccttgcgtccatcctgcttagtgtctagaatgttttctgcatgggatcactattgttttcttcctgcttggtgcgacctagagctcaaatctatttttttttttttttttggagacggagtctcgccctgtcgcccaggctggagtggcactggcgcgatctcggctcactgcaacctctgcctcttgggttccagcgattctcctgcgtcagccttctgagtagctggaattacaggcgtgtgtcgccacgcccagttagtgttttgtatctttagtagagatggggtttcaccatgttggccaggctggtctcaaactcctgacctcgtgatccgccctccccggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgaaccactgctcctggccgagctcaaagcttttatcaactggcccat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SEQ ID NO：9
包含突变A409T的成熟的mRNA序列(CALM1)
＞uc001xy1.2(CALM1)长度＝4268
gatacggcgcaccatatatatatcgcggggcgcagactcgcgctccggcagtggtgctgggagtgtcgtggacgccgtgccgttactcgtagtcaggcggcggcgcaggcggcggcggcggcatagcgcacagcgcgccttagcagcagcagcagcagcagcggcatcggaggtacccccgccgtcgcagcccccgcgctggtgcagccaccctcgctccctctgctcttcctcccttcgctcgcaccatggctgatcagctgaccgaagaacagattgctgaattcaaggaagccttctccctatttgataaagatggcgatggcaccatcacaacaaaggaacttggaactgtcatgaggtcactgggtcagaacccaacagaagctgaattgcaggatatgatcatgaagtggatgctgatggtaatggcaccattgacttccccgaatttttgactatgatggctagaaaaatgaaagatacagatagtgaagaagaaatccgtgaggcattccgagtctttgacaaggatggcaatggttatatcagtgcagcagaactacgtcacgtcatgacaaacttaggagaaaaactaacagatgaagaagtagatgaaatgatcagagaagcagatattgatggagacggacaagtcaactatgaagaattcgtacagatgatgactgcaaaatgaagacctactttcaactcctttttcccccctctagaagaatcaaattgaatcttttacttacctcttgcaaaaaaaagaaaaaagaaaaaagttcatttattcattctgtttctatatagcaaaactgaatgtcaaaagtaccttctgtccacacacacaaaatctgcatgtattggttggtggtcctgtcccctaaagatcaagctacacatcagttttacaatataaatacttgtactaccttaatgataaggactccttaaagttccatttgctaatgattaatacactgtttgggctggccagtttttcatgcatgcagcttgacgattgagcacagtcaggcctttgtattaaaaatgaaaaatgaaaaaacaaattcaaaacctattcaaatgggttctagttcaatttgtttagtataaattgtcatagctggtttactgaaaacaaacacatttaaaattggtttacctcaggatgacgtgcagaaaaatgggtgaaggataaaccgttgagacgtggccccactggtaggatggtcctcttgtacttcgtgtgctccgacccatggtgacgatgacacaccctggtggcatgcccgtgtatgttggtttagcgttgtctgcattgttctagagtgaaacaggtgtcaggctgtcactgttcacacaaatttttaataagaaacatttaccaagggagcatctttggactctctgtttttaaaaccttctgaaccatgacttggagccggcagagtaggctgtggctgtggacttcagcacaaccatcaacattgctgttcaaagaaattacagtttacgtccattccaagttgtaaatgctagtctttttttttttttttccaataaaaagaccattaacttaaagtggtgttaaatgctttgtaaagctgagatctaaatggggacaaggcaggtggaggggaggccagtgtacatgtaaatgcccacagcccagcattgggtttccctcccaaggccccagcaccaacctctgagcccaagaccttgcctgaaaacaagcagataccgattgcttcatcctatttatggacatgtaggtctagttgcattttcactggggggaggggggaaggtgaattatggtaacttttaatgatctattcaggcagtagagctcttaaggaaaaaaaaaaacccactttctctcaagcatgtatttaggggttgttctcaattgtgctgctgattacctgtcttatgtaactacttgagaccatctgcaagagacatgatttagtgtgtctgtaattcaatcttcgctgtgtgtggtagaagcagtagtcacttttgtaagccagtctcttcatgcctaaaagacactaccagtcacctttgattcgcgacttttaatttatgattatacttagcctcctcctcctttttttttttttcccaagttgacttgactttgcttttttccccccaagtagaactaatgctagcttccagcttgaaagtaaaactccagtgtggagtgaattttgtgtctaattataaacctgtaaccaaaactcagacatctggtactggtctttgcattgagattggtccctgtaaaaccccctttaaaagcatattgcatttagtacagagctcttttttgaaatgaaggctggagatgtgcatttttcacggtgttaactggttgtatcttattagcaaggagattggggttttgagtgtttgcgtgggtggtttcaatttgccagggaacagtggcaggctgctagcaaggcagtgagaagctcttggcagccaaatgggtgcattcagggctgatttatagagacccttggcttctccttctcctactccctgtctttctggcattttgtagcttgttagattttctgccagaggggtgggtcagagcagtggaggggagacatcgcccatgtgcttctgctactggtccttgggctgggtggttggtagaggagatgttgacactatgagctaagggttggcttttgtaattacctgaatctgaaaggaatgcctaaggttaccttggggtttctcttctggtgagatagggttcctggtttgagtaagttaatgtcctggatatttcttgtggcagggggtggtcaaagagcctgattgctgacccagtctcaggcctgtggtcgatgacctctcggtagtttcaaagggggctggagggggatatttgacttgttttttcgaaatgtagccttctaaccctcaagtctttagaagctgggtggactcttagtggtcctgcagcgtatcctaaaagactacctttgaaacaggattcttgtatggccaggatcctgtctgggaaccagaaaccctacaccctccccctccagggaatgctgagttccagttttgagcagaggtgaggcagaatccactgtagccttccgccctggtatttggggggatgaccagcccaggcgttgggtgttagtctgcatgagtttgtgagaggaaatagctgggtgtcctggcagtgcccttgaagttggttaggaccttcctgtaaactcttgcccctacttctaactactctataaatatatacatatatttatatataaagtgattagttgaactggcatcctgctttagcctgagacttgccataagaaactgctgagtacttggcaaaccctttcatagttttgttctccatctgtttggggtaggtgttgagcgaggcaaatggatctcgatatttcagatgggcttttgatgcactgttgccaaggaaggctttttctgattttttgacaaatgaatttttgcacactttcattggtgtctttcggcaacttacacacattgaaaatgagctattgtacatatttttatattctctttataaatgcatgtctgattgtacttgtaacaatattgtaatgaacggctgtgcagtaggcccagcgctgctgtgtctcgtcagaggaatagcttaccacgaacccctcagcatactgggaatctcttcctgaacaacgaatgtaaatttggtcaagtctactcttccgttcattcaattattttaagcatttgaattatttattgtatatcctaaatatatttctcctttggcagtgactagatttccactaatgtgtcttaatctatccctccagctggcagttactgtttttttaatcccctgaagttgtcctgtaggagacagaaattctttgctgtctgtatcccttggagtaagaaggtagtggcatgggtggagtgtgtgttctttctccaaatctattatgatgtttattaaacacttctgtagcaaagatggtggtagttcttttgttactgaagttgcccttcaccatggctatttgaaaaggagatgtacttggacgtttctgtaaatcttgagataaactgtttggagatttaaccacctctctgatgggggaccaactctatggaaattgtaaatacgttttatttataaacctggcactgtattcaataaacatttctgcagcctttcatctctaactgcgaaaaaaaaaaaaaa
SEQ ID NO：10
包含突变Asn53Ile的钙调蛋白氨基酸序列。
ADQLTEEQIAEFKEAFSLFDKDGDGTITTKELGTVMRSLGQNPTEAELQDMIEVDADGNGTIDFPEFLTMMARKMKDTDSEEEIREAFRVFDKDGNGYISAAELRHVMTNLGEKLTDEEVDEMIREADIDGDGQVNYEEFVQMMTAK
SEQ ID NO：11
包含突变A7404G的钙调蛋白1(CALM1)基因序列。外显子序列用大写。
＞hg19_knownGene_uc001xy1.2范围＝chr14：90863327-908746195′pad＝0 3′pad＝0链＝+重复掩蔽＝无
GATACGGCGCACCATATATATATCGCGGGGCGCAGACTCGCGCTCCGGCAGTGGTGCTGGGAGTGTCGTGGACGCCGTGCCGTTACTCGTAGTCAGGCGGCGGCGCAGGCGGCGGCGGCGGCATAGCGCACAGCGCGCCTTAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCGGCATCGGAGGTACCCCCGCCGTCGCAGCCCCCGCGCTGGTGCAGCCACCCTCGCTCCCTCTGCTCTTCCTCCCTTCGCTCGCACCATGgtaggtcgggagtggcaaatgccggcgtagcagctgcccgagatttcttcccagatttctagttgttttgtttgttttttgtttgtttttggttcttggaggtttttcttttctgagtgttacgcagcagctgcgcttaaaggaggttgcattttggatttgcatctcggcgacctctgccagggagcttcatttattggttccccttggagctggacttggtcgtaggccgtccacgggcaggggctccggccgcaactgcagcgggggtttctgcatccaatccccctgccccccgcccagccccgcacccactgcatccactagcgccgcacccgggctgcctgcagcgcagcgtttcggcctgggagccgggcggggccgggcactagacccccccccccggcccgcccctccccaccccgcttctccgccggcgcgaaggtggcaggtcgggcgggcagtggagaatgaatgggctggagctggccggtggcgcacattgttccggccgggtgttgaggggcgcagtcagcgcccgccacctccccactttggccggccctgctgggcgccctccctcggtcgctctcccctccttcttcccggggggcgcggcgcgggcgtgggctgggaaggaaggagccggggaagggtggggttgggggcaggaaggcgaggggttgggggcggagagggcggaagcggcggccgggccgccctgcgcccgggcggggccctgcggtgtggccgtggcttgttcctgccgctttcgcaccctgcggccccccacccagtgcagcagtgcgggcgggcgtgagcctcggtgcaccaggaggcacttcccgcgggaggcgctgggctcgcgctaattggggcggggggggggggcggcgggggaggagggaactggcgcgcggcttggtttccattagagacgcaaagtttctgctccgggaggaggcggcggcgccgcgggctcgtcgcctgggggagcagaagcgggtgggaggtgcgggtggccttggcctcagccctggtgcgcgggggccgggggtggtgaccctcctggccgaggaggggcggcgtccagacgcccgctcgggggccgccttcccccccacgcctgcccccgggcacgcgccctgcccggtccctcgccccgcgccacttccagtccgcagagagatgccctccacgtttctgctttctctgcagcctctagattgccagatgcgactgtgcgcctcgctgggtgtgttttccacagccccttcctcctcggcgtgcagggctgacatcaccgactgcgtttctggtttggcgggtggggagatggttccccgcagggttctggtacacctttgcccccagggctagcgccatttgggggaggaggttttcgttgtcgagaaagttggatgctcctggtaacccctctaacaagagagttctgtagcgaggtgggactgttctccccataaggtgacagtttctcttgcgaggtgtggcagcgcttcctgttgtacaagacagatgttgccttggcgttacgtaaatcatcgtgtctccgtcatttaaagaaagccaatttttagtgattgaggtagaaagaaagatccgtttataatttgtaaaaacaaattttcacccagaatcaatatattggaacaccattcctactgttaaagttttcacttaagagtataaacttcatcagctttctattaggacttattttgtaattggcttcttaggcatccttctttaaaagagaaatccacgttagctctccttgaggtctcgagttccctcggctggaggcacaggttcagtggagaccaaataatgcaggtgaattaccttcgtggccattactgcctccaacgaagtgtgtttattaagaacagttcttatgtcattcttaaggtaggtagggttaatactctccagcaaatttagtagatactctttgccagaaaagagaggagtatatatagtttgataattattgtgtagttttctgtgtacttaatttttgcagttttgtaacacttcatttgtaagatggtaccattttttcctggcttctgaatcataggatagtttgacccagggcattagccattgtaatggtaggcttttaacaaataactgcctaatttaaaggattggaaagcatttgttacatggaaatgaagttggtggcgtacccagttgctgtatctttattttttctacttaattatttctcataaaatggatataaaagcctgttaatccaacccaatgccattatgtaacgccagtttggagatttcgagggcctggagcagtgcgcaaggtgcgctgaaagcctgcccctggatgagatccttatcctggctgtgatggcagtggcagtgggctgggtcccttgttgagtggaaagggggactgcggtgtccatggtgcagtaggtggcgctcttctgtcttagagcctgccgccactgcagctggtgccaaggggccttctgccactagaggtgccatttttcacatgatgaacttagcctagttagatcgcagagcaagctgtaagccatgggcccagaaaagaaaacttgaagtgagcagatgttgtcacttccttgtaatcctttgttaaaatagcataaggagttttctttattctatttactttcattaaatgaccgtgctacaggtttcaaaggattttaagattgatttttgaaagatcacaatattaaaagtataactggaaaacctatgttgaaatcaaccaaacatgtcgtggactgaatgataaccttttctttcttcatatagGCTGATCAGCTGACCGAAGAACAGATTGCTGgtaagttgacaactccaaggagtccccagaaggccagaactaggcactgactcagttttggtgactcctctgttcctccccgctacagtctgggcagttttctaagaatttatttaaataagaacagtaagcagaaacactgaggtcagatgttattcttgccagtactttatagatgaggtgaaaggaagtaaaactaaggatgcccacatgttaaactctggagaatttgaccatgtttcacaatgtgcaaagtttgcgtatgattaattgtactgagcctgctactcagcggtttagtttacaattcttatgccatgggtctttcagtaatctgccacgaaagcttgtgctcgctatcctaaaataaatggaaatgggtgaatatgagtgttaggaccactgtagtaattgggaagaaagttacattagttaaactctgttgcccaggctggtctctaactcctgggctcaagcaatcctcctgcctcagcctcctgagtagctgggactacaggcatgtgccaccacgtctggcagattttagctttttaatattcctggaggacttgttttgagactgtttctcgttaggaaaccaggaatgcttctgaaatattctaaaagtcatgtggagagagtttacctgggaatgtacatttctagtaaccattttatttgttatgaaacaagggattcttatggctttagaaatgtaacaggaagggatttgaagggggcacatggaccaatcttgtcagattggatttagtcccttgaacctgggaggcaggggttgtagtgagctgagattgcaccactgcactccaatctcggtgacagagcgagactccattgtttaaaaaaaaaaaaaaagattggatttaggactaatttaagcatgttccagcttagccgccttgaaacctttgggaatattgtggtgtgtggcactgtttattgggagcagtgtttgctttatgggctgctgtatgaaggccagtccaacaggactattgtggtcattatttcagtagataaagaccagacttctgatacgttgcacaacttgaatggctggctttggcaagcccccggcaagtgtgtattgtgactgggttggataaagacattgattctaacgggtcaacttttgttttcagAATTCAAGGAAGCCTTCTCCCTATTTGATAAAGATGGCGATGGCACCATCACAACAAAGGAACTTGGAACTGTCATGAGGTCACTGGGTCAGAACCCAACAGAAGCTGAATTGCAGGATATGATCAATGAAGTGGATGCTGATGgtaagagctttaaaaccatgaatgagggccattgttgtgtaattcaagttcagacatgttacaggattgtctttcaggtccccagagcaaagcaaatgtgcaaagatcctttctgtggttgccccagggccattgacaattaaaatagaagatgatgggccttgcgtccatcctgcttagtgtctagaatgttttctgcatgggatcactattgttttcttcctgcttggtgcgacctagagctcaaatctatttttttttttttttttggagacggagtctcgccctgtcgcccaggctggagtggcactggcgcgatctcggctcactgcaacctctgcctcttgggttccagcgattctcctgcgtcagccttctgagtagctggaattacaggcgtgtgtcgccacgcccagttagtgttttgtatctttagtagagatggggtttcaccatgttggccaggctggtctcaaactcctgacctcgtgatccgccctccccggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgaaccactgctcctggccgagctcaaagcttttatcaactggccca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SEQ ID NO：12
包含突变A541G的成熟mRNA序列(CALM2)。
＞uc001xy1.2(CALM1)长度＝4268
gatacggcgcaccatatatatatcgcggggcgcagactcgcgctccggcagtggtgctgggagtgtcgtggacgccgtgccgttactcgtagtcaggcggcggcgcaggcggcggcggcggcatagcgcacagcgcgccttagcagcagcagcagcagcagcggcatcggaggtacccccgccgtcgcagcccccgcgctggtgcagccaccctcgctccctctgctcttcctcccttcgctcgcaccatggctgatcagctgaccgaagaacagattgctgaattcaaggaagccttctccctatttgataaagatggcgatggcaccatcacaacaaaggaacttggaactgtcatgaggtcactgggtcagaacccaacagaagctgaattgcaggatatgatcaatgaagtggatgctgatggtaatggcaccattgacttccccgaatttttgactatgatggctagaaaaatgaaagatacagatagtgaagaagaaatccgtgaggcattccgagtctttgacaaggatggcatggttatatcagtgcagcagaactacgtcacgtcatgacaaacttaggagaaaaactaacagatgaagaagtagatgaaatgatcagagaagcagatattgatggagacggacaagtcaactatgaagaattcgtacagatgatgactgcaaaatgaagacctactttcaactcctttttcccccctctagaagaatcaaattgaatcttttacttacctcttgcaaaaaaaagaaaaaagaaaaaagttcatttattcattctgtttctatatagcaaaactgaatgtcaaaagtaccttctgtccacacacacaaaatctgcatgtattggttggtggtcctgtcccctaaagatcaagctacacatcagttttacaatataaatacttgtactaccttaatgataaggactccttaaagttccatttgctaatgattaatacactgtttgggctggccagtttttcatgcatgcagcttgacgattgagcacagtcaggcctttgtattaaaaatgaaaaatgaaaaaacaaattcaaaacctattcaaatgggttctagttcaatttgtttagtataaattgtcatagctggtttactgaaaacaaacacatttaaaattggtttacctcaggatgacgtgcagaaaaatgggtgaaggataaaccgttgagacgtggccccactggtaggatggtcctcttgtacttcgtgtgctccgacccatggtgacgatgacacaccctggtggcatgcccgtgtatgttggtttagcgttgtctgcattgttctagagtgaaacaggtgtcaggctgtcactgttcacacaaatttttaataagaaacatttaccaagggagcatctttggactctctgtttttaaaaccttctgaaccatgacttggagccggcagagtaggctgtggctgtggacttcagcacaaccatcaacattgctgttcaaagaaattacagtttacgtccattccaagttgtaaatgctagtctttttttttttttttccaataaaaagaccattaacttaaagtggtgttaaatgctttgtaaagctgagatctaaatggggacaaggcaggtggaggggaggccagtgtacatgtaaatgcccacagcccagcattgggtttccctcccaaggccccagcaccaacctctgagcccaagaccttgcctgaaaacaagcagataccgattgcttcatcctatttatggacatgtaggtctagttgcattttcactggggggaggggggaaggtgaattatggtaacttttaatgatctattcaggcagtagagctcttaaggaaaaaaaaaaacccactttctctcaagcatgtatttaggggttgttctcaattgtgctgctgattacctgtcttatgtaactacttgagaccatctgcaagagacatgatttagtgtgtctgtaattcaatcttcgctgtgtgtggtagaagcagtagtcacttttgtaagccagtctcttcatgcctaaaagacactaccagtcacctttgattcgcgacttttaatttatgattatacttagcctcctcctcctttttttttttttcccaagttgacttgactttgcttttttccccccaagtagaactaatgctagcttccagcttgaaagtaaaactccagtgtggagtgaattttgtgtctaattataaacctgtaaccaaaactcagacatctggtactggtctttgcattgagattggtccctgtaaaaccccctttaaaagcatattgcatttagtacagagctcttttttgaaatgaaggctggagatgtgcatttttcacggtgttaactggttgtatcttattagcaaggagattggggttttgagtgtttgcgtgggtggtttcaatttgccagggaacagtggcaggctgctagcaaggcagtgagaagctcttggcagccaaatgggtgcattcagggctgatttatagagacccttggcttctccttctcctactccctgtctttctggcattttgtagcttgttagattttctgccagaggggtgggtcagagcagtggaggggagacatcgcccatgtgcttctgctactggtccttgggctgggtggttggtagaggagatgttgacactatgagctaagggttggcttttgtaattacctgaatctgaaaggaatgcctaaggttaccttggggtttctcttctggtgagatagggttcctggtttgagtaagttaatgtcctggatatttcttgtggcagggggtggtcaaagagcctgattgctgacccagtctcaggcctgtggtcgatgacctctcggtagtttcaaagggggctggagggggatatttgacttgttttttcgaaatgtagccttctaaccctcaagtctttagaagctgggtggactcttagtggtcctgcagcgtatcctaaaagactacctttgaaacaggattcttgtatggccaggatcctgtctgggaaccagaaaccctacaccctccccctccagggaatgctgagttccagttttgagcagaggtgaggcagaatccactgtagccttccgccctggtatttggggggatgaccagcccaggcgttgggtgttagtctgcatgagtttgtgagaggaaatagctgggtgtcctggcagtgcccttgaagttggttaggaccttcctgtaaactcttgcccctacttctaactactctataaatatatacatatatttatatataaagtgattagttgaactggcatcctgctttagcctgagacttgccataagaaactgctgagtacttggcaaaccctttcatagttttgttctccatctgtttggggtaggtgttgagcgaggcaaatggatctcgatatttcagatgggcttttgatgcactgttgccaaggaaggctttttctgattttttgacaaatgaatttttgcacactttcattggtgtctttcggcaacttacacacattgaaaatgagctattgtacatatttttatattctctttataaatgcatgtctgattgtacttgtaacaatattgtaatgaacggctgtgcagtaggcccagcgctgctgtgtctcgtcagaggaatagcttaccacgaacccctcagcatactgggaatctcttcctgaacaacgaatgtaaatttggtcaagtctactcttccgttcattcaattattttaagcatttgaattatttattgtatatcctaaatatatttctcctttggcagtgactagatttccactaatgtgtcttaatctatccctccagctggcagttactgtttttttaatcccctgaagttgtcctgtaggagacagaaattctttgctgtctgtatcccttggagtaagaaggtagtggcatgggtggagtgtgtgttctttctccaaatctattatgatgtttattaaaggtcactgggtcagaacccaacagaagctgaattgcaggatatgatcaatgaagtggatgctgatggtaatggcaccattgacttccccgaatttttgactatgatggctagaaaaatgaaagatacagatagtgaagaagaaatccgtgaggcattccgagtctttgacaaggatggcatggttatatcagtgcagcagaactacgtcacgtcatgacaaacttaggagaaaaactaacagatgaagaagtagatgaaatgatcagagaagcagatattgatggagacggacaagtca
SEQ ID NO：13
包含突变Asn97Ser的钙调蛋白氨基酸序列
ADQLTEEQIAEFKEAFSLFDKDGDGTITTKELGTVMRSLGQNPTEAELQDMIIEVDADGNGTIDFPEFLTMMARKMKDTDSEEEIREAFRVFDKDGGYISAAELRHVMTNLGEKLTDEEVDEMIREADIDGDGQVNYEEFVQMMTAK

Claims (96)

1.一种经分离的多核苷酸，其编码钙调蛋白(CaM)或钙调蛋白(CaM)的至少一部分，其中所述多核苷酸包含与心脏失调相关的至少一个突变。
2.根据权利要求1所述的经分离的多核苷酸，其中所述经分离的多核苷酸与选自SEQ ID NO:1(CALM1)、SEQ ID NO:2(CALM2)和SEQ IDNO:3(CALM3)或其部分的多核苷酸具有至少90％的序列同一性。
3.根据权利要求1和2任一项所述的经分离的多核苷酸，其中所述至少一个突变导致氨基酸替换。
4.根据前述权利要求任一项所述的经分离的多核苷酸，其中所述至少一个突变为显性突变。
5.根据权利要求4所述的经分离的多核苷酸，其中所述显性突变为功能获得性突变。
6.根据权利要求4所述的经分离的多核苷酸，其中所述显性突变为显性负突变。
7.根据前述权利要求任一项所述的经分离的多核苷酸，其中所述至少一个突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的编码的突变的钙调蛋白。
8.根据权利要求7所述的经分离的多核苷酸，其中所述一个或多个改变的功能特性为选自包含以下特性的列表的一个或多个特性：与RYR2受体的异常结合、与钙(Ca2+)的异常结合、异常的钙调蛋白-钙结合解离速率(如钙调蛋白-钙结合解离速率的增加)、异常的钙调蛋白/RYR2复合物钙结合亲和力、钙调蛋白折叠稳定性。
9.根据权利要求8所述的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含导致钙调蛋白和RyR2受体之间异常结合的突变。
10.根据权利要求9所述的经分离的多核苷酸，其中与野生型钙调蛋白显示的结合相比，所述异常结合为增加的结合或下降的结合或减少的结合或消失的结合。
11.根据权利要求8所述的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含导致钙调蛋白和钙(Ca2+)之间异常结合的突变。
12.根据权利要求11所述的经分离的多核苷酸，其中与野生型钙调蛋白显示的结合相比，所述异常结合为增加的结合或下降的结合或减少的结合或消失的结合。
13.根据权利要求11或12任一项所述的经分离的多核苷酸，其中所述至少一个突变导致钙调蛋白和RyR2之间的结合亲和力降低。
14.根据权利要求1至13任一项所述的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含导致氨基酸替换Asn97Ser的突变。
15.根据权利要求1至13任一项所述的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含导致氨基酸替换Asn53Ile的突变。
16.一种经分离的多肽，其包含钙调蛋白(CaM)或钙调蛋白(CaM)的至少一部分，其中所述多肽包含与心脏失调相关的至少一个突变。
17.根据权利要求16所述的经分离的多肽，其中所述多肽与SEQ IDNO:4或其部分具有至少90％的序列同一性。
18.根据权利要求16或17任一项所述的经分离的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:4的至少20个连续氨基酸具有至少90％同一性的序列。
19.根据权利要求16至18任一项所述的经分离的多肽，其中所述至少一个突变为显性突变。
20.根据权利要求16至19任一项所述的经分离的多肽，其中所述显性突变为功能获得性突变。
21.根据权利要求16至20任一项所述的经分离的多肽，其中所述显性突变为显性负突变。
22.根据权利要求16至21任一项所述的经分离的多肽，其中所述至少一个突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的突变的钙调蛋白。
23.根据权利要求22所述的经分离的多肽，其中所述一个或多个改变的功能特性为选自包含以下特性的列表的一个或多个特性：与RYR2受体的异常结合、与钙(Ca2+)的异常结合、异常的钙调蛋白-钙结合解离速率(如钙调蛋白-钙结合解离速率的增加)、异常的钙调蛋白/RYR2复合物钙结合亲和力、钙调蛋白折叠稳定性。
24.根据权利要求23所述的经分离的多肽，其中所述多肽包含导致钙调蛋白和RyR2受体之间异常结合的突变。
25.根据权利要求24所述的经分离的多肽，其中与野生型钙调蛋白显示的结合相比，所述异常结合为增加的结合或下降的结合或减少的结合或消失的结合。
26.根据权利要求23所述的经分离的多肽，其中所述多肽包含导致钙调蛋白和钙(Ca2+)之间异常结合的突变。
27.根据权利要求26所述的经分离的多肽，其中与野生型钙调蛋白显示的结合相比，所述异常结合为下降的结合或为增加的结合或减少的结合或消失的结合。
28.根据权利要求26或27任一项所述的经分离的多肽，其中所述至少一个突变导致钙调蛋白和RyR2之间的结合亲和力降低。
29.根据权利要求16至28任一项所述的经分离的多肽，其中所述多肽包含氨基酸替换Asn97Ser。
30.根据权利要求16至29任一项所述的经分离的多肽，其中所述多肽包含氨基酸替换Asn53Ile。
31.根据权利要求1至15任一项所述的经分离的多核苷酸，或根据权利要求16至30任一项所述的经分离的多肽，其中所述心脏失调选自：劳累诱导的或运动诱导的心脏事件、心脏性猝死、心脏骤停、心室纤维性颤动、室性心动过速、室性期外收缩、室性期前收缩、室性二联律、心律失常、室性心动过速，如多形性室性心动过速或儿茶酚胺能多形性室性心动过速、婴儿猝死综合征(SIDS)、突发性猝死综合征(SUDS)、晕厥、癫痫发作、心脏事件。
32.根据权利要求31所述的经分离的多核苷酸或所述的经分离的多肽，其中所述心脏失调为心律失常。
33.根据权利要求31所述的经分离的多核苷酸或所述的经分离的多肽，其中所述心脏失调为室性心动过速。
34.根据权利要求31所述的经分离的多核苷酸或所述的经分离的多肽，其中所述心脏失调为多形性室性心动过速。
35.根据权利要求31所述的经分离的多核苷酸或所述的经分离的多肽，其中所述心脏失调为儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)。
36.一种用于确定个体是否具有增加的罹患心脏失调或心脏性猝死的风险的方法，其中所述方法包括
-确定来自所述个体的样品中CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQID NO:2)和/或CALM3(SEQ ID NO:3)中，和/或与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的多核苷酸中是否存在至少一个突变，和/或
-确定来自所述个体的样品中具有SEQ ID NO:4的多肽中，或与SEQID NO:4或其部分具有至少90％的序列同一性的多肽中是否存在至少一个突变，
其中所述至少一个突变的存在指示增加的罹患心脏失调的风险。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述至少一个突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的突变的钙调蛋白。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中与野生型钙调蛋白相比一个或多个改变的功能特性为如在权利要求7至13任一项所定义的。
39.一种用于诊断个体的心脏失调的方法，其中所述方法包括
-确定来自所述个体的样品中CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQID NO:2)和/或CALM3(SEQ ID NO:3)中，和/或与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的多核苷酸中是否存在至少一个突变，和/或
-确定来自所述个体的样品中具有SEQ ID NO:4的多肽中，或与SEQID NO:4或其部分具有至少90％的序列同一性的多肽中是否存在至少一个突变，
其中所述至少一个突变的存在指示心脏失调或增加的罹患心脏失调的风险。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述至少一个突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的突变的钙调蛋白。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中与野生型钙调蛋白相比，所述的一个或多个改变的功能特性为如在权利要求7至13任一项所定义的。
42.根据权利要求36至41任一项所述的方法，其中在
-CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQID NO:3)和/或
-与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的多核苷酸
中待确定的至少一个突变导致氨基酸替换Asn53Ile和/或氨基酸替换Asn97Ser。
43.根据权利要求36至41任一项所述的方法，其中在具有SEQ IDNO:4的多肽，或与SEQ ID NO:4或其部分具有至少90％的序列同一性的多肽中待确定的至少一个突变为Asn53Ile和/或Asn97Ser。
44.一种用于治疗患有心脏失调的个体的方法，所述心脏失调与CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQ IDNO:3)中，和/或与CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQ ID NO:3)或其部分具有至少90％的序列同一性的多核苷酸中的至少一个突变相关，其中所述突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的突变的钙调蛋白，所述方法包括给予所述个体能够将改变的功能特性恢复和/或改进至野生型钙调蛋白中的水平的试剂。
45.根据权利要求44所述的方法，其中与野生型钙调蛋白相比，所述的一个或多个改变的功能特性为如在权利要求7至13任一项所定义的。
46.根据权利要求44或45所述的方法，其中与野生型钙调蛋白显示的结合相比，所述的一个或多个改变的功能特性包括与RYR2受体的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)。
47.根据权利要求46所述的方法，其中给予试剂的步骤包括以治疗有效的量给予所述个体能够增加钙调蛋白和RYR2之间的结合的试剂，从而治疗所述个体。
48.根据权利要求44或45所述的方法，其中与野生型钙调蛋白显示的结合相比，所述的一个或多个改变的功能特性包括与钙(Ca2+)的异常结合(优选地，其中结合减少或消失)。
49.根据权利要求46所述的方法，其中给予试剂的步骤包括以治疗有效的量给予所述个体能够增加钙调蛋白和钙(Ca2+)之间的结合的试剂，从而治疗所述个体。
50.根据权利要求44至49任一项所述的方法，其中所述的至少一个突变导致氨基酸替换Asn97Ser。
51.根据权利要求44至49任一项所述的方法，其中所述的至少一个突变导致氨基酸替换Asn53Ile。
52.根据权利要求44至51任一项所述的方法，其中所述心脏失调选自：劳累诱导的或运动诱导的心脏事件、心脏性猝死、心脏骤停、心室纤维性颤动、室性心动过速、室性期外收缩、室性期前收缩、室性二联律、心律失常、室性心动过速，如多形性室性心动过速或儿茶酚胺能多形性室性心动过速、婴儿猝死综合征(SIDS)、突发性猝死综合征(SUDS)、晕厥、癫痫发作、心脏事件。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述心脏失调为心律失常。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述心脏失调为室性心动过速。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述心脏失调为多形性室性心动过速。
56.根据权利要求52所述的方法，其中所述心脏失调为儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)。
57.根据权利要求52所述的方法，其中所述心脏失调为药物诱导的心律失常。
58.一种用于鉴定化合物的方法，所述化合物能够增强钙调蛋白与兰尼碱受体2的结合，其中所述钙调蛋白包含降低与兰尼碱受体2的结合亲和力的至少一个突变，所述方法包括
-提供第一样品，所述第一样品包含钙调蛋白或其片段、兰尼碱受体2或其片段和测试化合物，所述钙调蛋白或其片段具有降低与兰尼碱受体2的结合亲和力的突变
-测量所述第一样品中结合到兰尼碱受体2蛋白的钙调蛋白的量
-提供第二样品，所述第二样品包含钙调蛋白或其片段和兰尼碱受体2或其片段，所述钙调蛋白或其片段具有降低与兰尼碱受体2的结合亲和力的突变
-测量所述第二样品中结合到兰尼碱受体2蛋白的钙调蛋白的量
-比较第一和第二样品中结合到兰尼碱受体2蛋白的钙调蛋白的量，从而与所述第二样品相比，所述第一样品中结合到兰尼碱受体2蛋白的钙调蛋白的量更高指示所述测试化合物增强钙调蛋白与兰尼碱受体2蛋白的结合。
59.根据权利要求58所述的方法，其中与野生型钙调蛋白显示的结合相比，降低与兰尼碱受体2的结合的突变优选地使结合减少或消失。
60.一种用于鉴定化合物的方法，所述化合物能够增强钙调蛋白与钙(Ca2+)的结合，其中所述钙调蛋白包含降低与钙(Ca2+)的结合亲和力(并且优选地其使与钙(Ca2+)的结合减少或消失)的至少一个突变，所述方法包括
-提供第一样品，所述第一样品包含钙调蛋白或其片段和测试化合物，所述钙调蛋白或其片段具有降低与钙(Ca2+)的结合亲和力(并且优选地其使与钙(Ca2+)的结合减少或消失)的突变
-测量所述第一样品中结合到钙(Ca2+)的钙调蛋白的量
-提供第二样品，所述第二样品包含钙调蛋白或其片段和钙(Ca2+)，所述钙调蛋白或其片段具有降低与钙(Ca2+)的结合亲和力(并且优选地其使与钙(Ca2+)的结合减少或消失)的突变
-测量所述第二样品中结合到钙(Ca2+)的钙调蛋白的量
-比较所述第一和第二样品中结合到钙(Ca2+)的钙调蛋白的量，从而与所述第二样品相比，所述第一样品中结合到钙(Ca2+)的钙调蛋白的量更高指示所述测试化合物增强了钙调蛋白与钙(Ca2+)的结合。
61.根据权利要求60所述的方法，其中与野生型钙调蛋白显示的结合相比，降低与钙(Ca2+)的结合亲和力的突变优选地使与钙(Ca2+)的结合减少或消失。
62.根据权利要求58至61任一项所述的方法，其中所述钙调蛋白与SEQ ID NO:4或其部分具有至少90％的序列同一性。
63.根据权利要求62所述的方法，其中具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4或其部分具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列中的所述至少一个突变是Asn97Ser。
64.一种通过权利要求58至63任一项所述的方法鉴定的化合物，所述化合物用于治疗患有心脏失调的个体，所述心脏失调与CALM1(SEQ IDNO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQ ID NO:3)中，和/或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3或其部分具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列中的至少一个突变相关，其中所述至少一个突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的突变的钙调蛋白。
65.根据权利要求64所述的化合物，其中所述一个或多个改变的功能特性为选自包含以下特性的列表的一个或多个特性：与RYR2受体的异常结合、与钙(Ca2+)的异常结合、异常的钙调蛋白-钙结合解离速率(如钙调蛋白-钙结合解离速率的增加)、异常的钙调蛋白/RYR2复合物钙结合亲和力、钙调蛋白折叠稳定性。
66.根据权利要求65所述的化合物，其中所述突变的钙调蛋白包含导致钙调蛋白与所述RyR2受体之间的异常结合的突变。
67.根据权利要求66所述的化合物，其中所述异常结合为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加的结合或下降的结合或减少的结合或消失的结合。
68.根据权利要求65所述的化合物，其中所述突变的钙调蛋白包含导致钙调蛋白与Ca2+之间的异常结合的突变。
69.根据权利要求68所述的化合物，其中所述异常结合为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，增加的结合或下降的结合或减少的结合或消失的结合。
70.根据权利要求68或69任一项所述的化合物，其中所述至少一个突变导致钙调蛋白与RyR2之间的结合亲和力降低。
71.根据权利要求64至70任一项所述的化合物，其中所述突变的钙调蛋白包含导致氨基酸替换Asn97Ser的突变。
72.根据权利要求64至70任一项所述的化合物，其中所述突变的钙调蛋白包含导致氨基酸替换Asn53Ile的突变。
73.一种药物组合物，所述药物组合物用于治疗患有心脏失调的个体，所述心脏失调与CALM1(SEQ ID NO:1)、CALM2(SEQ ID NO:2)和/或CALM3(SEQ ID NO:3)中的至少一个突变相关，其中所述突变产生与野生型钙调蛋白相比，具有一个或多个改变的功能特性的突变的钙调蛋白，并且其中所述组合物包含能够将所述改变的功能特性恢复和/或改进至野生型钙调蛋白中的水平的试剂。
74.根据权利要求73所述的药物组合物，其中所述一个或多个改变的功能特性为选自包含以下特性的列表的一个或多个特性：与RYR2受体的异常结合、与钙(Ca2+)的异常结合、异常的钙调蛋白-钙结合解离速率(如钙调蛋白-钙结合解离速率的增加)、异常的钙调蛋白/RYR2复合物钙结合亲和力、钙调蛋白折叠稳定性。
75.根据权利要求74所述的药物组合物，其中所述突变的钙调蛋白包含导致钙调蛋白与所述RyR2受体之间的异常结合的突变。
76.根据权利要求75所述的药物组合物，其中所述异常结合为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，下降的结合或减少的结合或消失的结合。
77.根据权利要求75或76所述的药物组合物，其中所述组合物包含能够恢复和/或增加钙调蛋白与RYR2之间的结合的试剂。
78.根据权利要求74所述的药物组合物，其中所述突变的钙调蛋白包含导致钙调蛋白与Ca2+之间的异常结合的突变。
79.根据权利要求78所述的药物组合物，其中所述异常结合为与野生型钙调蛋白显示的结合相比，下降的结合或为减少的结合或消失的结合。
80.根据权利要求78或79所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含能够恢复和/或增加钙调蛋白与钙(Ca2+)之间的结合的试剂。
81.根据权利要求73至80任一项所述的药物组合物，其中所述多核苷酸包含导致氨基酸替换Asn97Ser的突变。
82.根据权利要求73至80任一项所述的药物组合物，其中所述多核苷酸包含导致氨基酸替换Asn53Ile的突变。
83.根据权利要求73至82中任一项所述的药物组合物，其中所述心脏失调选自：劳累诱导的或运动诱导的心脏事件、心脏性猝死、心脏骤停、心室纤维性颤动、室性心动过速、室性期外收缩、室性期前收缩、室性二联律、心律失常、室性心动过速，如多形性室性心动过速或儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)、药物诱导的心律失常、婴儿猝死综合征(SIDS)、突发性猝死综合征(SUDS)、晕厥、癫痫发作、心脏事件。
84.一种用于检测编码钙调蛋白(CaM)或钙调蛋白(CaM)的至少一部分的多核苷酸中的至少一个突变的试剂盒，其中所述试剂盒包含至少一种寡核苷酸，所述寡核苷酸与所述钙调蛋白编码基因的序列互补，使得如果所述多核苷酸中存在所述突变，则从所述寡核苷酸的链延伸产生包含所述突变的延伸产物。
85.根据权利要求84所述的试剂盒，其中所述多核苷酸与选自SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3或其部分的多核苷酸具有至少90％的序列同一性。
86.根据权利要求84或85所述的试剂盒，其还包含一个或多个多核苷酸模板分子，所述一个或多个多核苷酸模板分子包含突变的钙调蛋白多核苷酸序列的部分或全部。
87.根据权利要求86所述的试剂盒，其中所述一个或多个多核苷酸模板分子包含钙调蛋白多核苷酸序列，所述钙调蛋白多核苷酸序列具有编码Asn97Ser和/或Asn53Ile的突变。
88.一种用于检测钙调蛋白多肽序列或钙调蛋白多肽序列的一部分中的至少一个突变的试剂盒，所述试剂盒包含能够特异性结合包含突变的钙调蛋白多肽序列的可检测试剂。
89.根据权利要求88所述的试剂盒，其中所述钙调蛋白多肽序列中的突变包含Asn97Ser和/或Asn53Ile突变。
90.根据权利要求89所述的试剂盒，其中所述可检测试剂为抗体，所述抗体能够特异性结合包含Asn97Ser和/或Asn53Ile突变的钙调蛋白多肽序列。
91.根据权利要求88或89任一项所述的试剂盒，其还包含一个或多个多肽分子，所述一个或多个多肽分子包含突变的钙调蛋白多肽序列的部分或全部。
92.根据权利要求91所述的试剂盒，其中所述一个或多个多肽分子包含钙调蛋白多肽序列(例如，由SEQ ID NO:4所定义的)，所述钙调蛋白多肽序列具有Asn97Ser和/或Asn53Ile突变。
93.一种用于检测与野生型钙调蛋白相比钙调蛋白与RYR2受体的结合下降的试剂盒，所述试剂盒包含RYR2受体(或其部分)、野生型钙调蛋白多肽以及一个或多个多肽分子，所述一个或多个多肽分子包含突变的钙调蛋白多肽序列的部分或全部，所述突变的钙调蛋白多肽序列显示与RYR2受体的结合减少。
94.一种用于检测与野生型钙调蛋白相比钙调蛋白与钙(Ca2+)的结合下降的试剂盒，所述试剂盒包含野生型钙调蛋白多肽以及一个或多个多肽分子，所述一个或多个多肽分子包含突变的钙调蛋白多肽序列的部分或全部，所述突变的钙调蛋白多肽序列显示与钙(Ca2+)的结合减少。
95.根据权利要求93或94所述的试剂盒，其中所述一个或多个多肽分子包含具有Asn97Ser和/或Asn53Ile突变的钙调蛋白多肽序列。
96.一种基本上如本文参照所附的实施例和附图描述的多核苷酸或多肽或方法或用途或化合物或药物组合物或试剂盒。
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