CN112980887A - 一种构建阿尔兹海默症细胞模型的方法及其用途 - Google Patents

一种构建阿尔兹海默症细胞模型的方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种构建阿尔兹海默症细胞模型的方法及其用途。所述方法包括：构建包含有APP蛋白编码基因的重组载体，再利用所述重组载体将所述APP蛋白的编码基因整合到宿主细胞的基因组中，进而构建形成所述细胞模型。本发明通过基因技术构建了过表达APP基因的CHO和HFF细胞系作为AD细胞模型，采取慢病毒转染的方式，可以保证AD细胞模型具有的AD病理特征的长久性和稳定性；并且，本发明的AD细胞模型可以稳定表达且能够分泌Aβ，可长久使用，并且具有稳定持续的Aβ沉积和tau蛋白磷酸化特征，可以很好的实现对阿尔兹海默症的病理特征的模拟，为阿尔茨海默症行相关药物的研发与筛选、机理的研究提供体外细胞研究平台可能。

Description

一种构建阿尔兹海默症细胞模型的方法及其用途
技术领域
本发明涉及一种构建阿尔兹海默症细胞模型的方法，具体涉及一种构建具有分泌Aβ和 Tau磷酸化能力的阿尔兹海默症细胞模型(Alzheimer's diseasecellmodel,AD cellmodel)的方法及其摸索优化，以及其在体外病理中分泌Aβ和Tau磷酸化能力检测中的用途，属于生物技术及基因工程技术领域。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer's Disease，以下简称为AD)是老年人中最常见且最具破坏性的系统退行性疾病之一。目前其主要有两种病理特征：1.细胞内淀粉样前体蛋白错误剪切产生淀粉样蛋白amyloid bata，Aβ分泌到胞外形成淀粉样蛋白斑块；2.tau蛋白过度磷酸化导致神经元之间相互黏连，阻碍神经传导，进而导致记忆衰退(AssociationA.Alzheimer's disease facts and figures.AlzheimersDement.,2012,8(2):131-168.)。目前针对AD的发病机理，科研工作者通过研究和探索，已构建了多种阿尔茨海默症细胞模型进行相关药物和机理的研究(Wang F., Jia Y.,Liu J.,et al.Dental pulpstem cells promote regeneration of damaged neuron cells on the cellular modelof Alzheimer's disease.Cell Biol Int.,2017,41(6):639-650；Arber C.,Lovejoy C.,Wray S.Stem cell models of Alzheimer's disease:progress andchallenges.Alzheimers Res Ther., 2017,9(1):42；Wang Y.P.,Li X.T.,etal.Melatonin amelioratedokadaic-acid induced Alzheimer-like lesions.ActaPharmacol Sin.2004,25(3):276-80.)。
1991年Kawabata S.发明了APP过表达载体嵌入转基因小鼠系统构建AD模型(Kawabata S.,Higgins G.A.,Gordon J.W.Amyloid plaques,neurofibrillary tanglesand neuronal loss in brains of transgenic mice overexpressing a C-terminalfragment of human amyloid precursor protein.Nature,1991,354(6353):476-478.)，其主要操作为：(1)构建了包含APPC端区域的神经元特异性表达载体；(2)利用转基因小鼠系统插入表达质粒，构建Thy-l-APP transgenic mice； (3)8个月大转基因小鼠新皮质淀粉样斑块和神经纤维缠结的银染色和免疫细胞化学染色实验证明这些斑块和缠结与AD患者大脑中的典型斑块和缠结非常相似。
现阶段AD细胞模型已经被普遍使用，但也存在一些不足和劣势，主要问题为：(1)AD 细胞模型分泌Aβ和Tau磷酸化能力参差不齐，导致淀粉样斑块和神经纤维缠结程度不能标准化；(2)一些AD细胞模型构建方式以药物处理为主，模型不够稳定，不能长时间；(3)部分AD细胞模型无法模拟出AD病理过程。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种构建可以长久使用并且性状稳定具有分泌Aβ和Tau磷酸化能力的阿尔兹海默症细胞模型的方法及其用途，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种构建阿尔兹海默症细胞模型的方法，其包括：
构建包含有APP蛋白编码基因的重组载体，再利用所述重组载体将所述APP蛋白的编码基因整合到宿主细胞的基因组中，进而构建形成所述细胞模型。
在一些实施例中，所述方法具体包括：将APP蛋白的编码基因连接到pLVX-IRES-Puro 载体的多克隆位点上，从而构建形成所述重组载体。
在一些优选实施方案中，所述方法具体包括：
利用慢病毒包装系统，使所述载体转染293T细胞，并经培养获得重组病毒；
以所述重组病毒侵染宿主细胞，之后筛选出能稳定表达APP蛋白的细胞系，即为所述细胞模型。
本发明实施例还提供了由前述方法构建形成的阿尔兹海默症细胞模型，所述阿尔兹海默症细胞模型具有分泌Aβ蛋白和Tau磷酸化能力。
本发明实施例还提供了一种阿尔兹海默症细胞模型，所述细胞模型是以重组慢病毒颗粒为基础，感染宿主细胞而构建得到；
其中所述重组慢病毒颗粒是利用包含有APP蛋白编码基因的重组载体，经慢病毒包装系统转染293T细胞，并经培养后获得；
所述重组载体是将APP蛋白的编码基因连接到pLVX-IRES-Puro载体的多克隆位点上而构建形成。
本发明实施例还提供了由前述方法构建的阿尔兹海默症细胞模型在用于制备检测或治疗阿尔兹海默症的产品中的用途。
本发明实施例还提供了一种药物组合物，其包括由前述方法构建的阿尔兹海默症细胞模型。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少在于：
1)本发明通过基因技术构建了过表达APP基因的CHO和HFF细胞系作为AD细胞模型，采取慢病毒转染的方式，可以保证AD细胞模型具有的AD病理特征的长久性和稳定性；
2)本发明提供的构建AD细胞模型的技术简便快捷、成本较低；
3)本发明提供的AD细胞模型可以稳定表达且能够分泌Aβ，可以长久使用，并且具有稳定持续的Aβ沉积和tau蛋白磷酸化特征，可以很好的实现对阿尔兹海默症的病理特征的模拟，为阿尔茨海默症行相关药物的研发与筛选、阿尔兹海默症机理的研究提供体外细胞研究平台可能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型实施方案中载体的构建流程示意图。
图2是本发明一典型实施方案中病毒包装流程示意图。
图3A-图3B分别是本发明一典型实施方案中AD稳转细胞系的QPCR验证结果示意图。
图3C-图3D分别是本发明一典型实施方案中AD稳转细胞系的WB验证结果示意图。
图3E-图3H分别是本发明一典型实施方案中AD稳转细胞系的ELISA验证结果示意图。
图4A-图4D分别是本发明一典型实施方案中AD细胞模型老年斑形成情况示意图。
图5A-图5B分别是本发明一典型实施方案中AD细胞模型tau蛋白磷酸化情况示意图。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术的诸多缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是提供一种构建长久使用并且性状稳定阿尔兹海默症细胞模型的方法，阿尔兹海默症细胞模型可以模拟出AD的病理过程，为阿尔兹海默症药物的研发与筛选、阿尔兹海默症机理的研究提供体外细胞研究平台。
首先需说明的是，本发明说明书中述及的术语的释义均是本领域技术人员所知悉的。例如，其中一些术语的定义如下：
1.阿尔兹海默症(Alzheimer's Disease,AD)：一种以β淀粉样蛋白斑块、神经元纤维缠结作为主要病理特征的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上具体表现为记忆退化、语言障碍、认知下降等痴呆特征。
2.Aβ(amyloid precursor protein,APP)：β-淀粉样蛋白，由39-43个氨基酸组成，是大脑皮质老年斑的主要成分之一。Aβ可以有效削弱突触结构和功能，是引起阿尔茨海默症的重要因素。
3.Tau磷酸化(AD p-Tau)：微管系统是神经细胞骨架成分，可参与多种细胞功能。微管由微管蛋白及微管相关蛋白组成，Tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白。阿尔茨海默症患者脑的Tau蛋白异常过度磷酸化，每分子Tau蛋白可含5～9个磷酸基，并丧失正常生物功能。
本发明实施例的一个方面提供的一种构建阿尔兹海默症细胞模型的方法，其包括：
构建包含有APP蛋白编码基因的重组载体，再利用所述重组载体将所述APP蛋白的编码基因整合到宿主细胞的基因组中，进而构建形成所述细胞模型。
在一些实施例中，所述方法具体包括：将APP蛋白的编码基因连接到pLVX-IRES-Puro载体的多克隆位点上，从而构建形成所述重组载体。
进一步地，所述多克隆位点可以是Spe I和Xba I酶切位点。
在一些更为优选的实施例中，所述方法具体包括：
利用慢病毒包装系统，使所述载体转染293T细胞，并经培养获得重组病毒；
以所述重组病毒侵染宿主细胞，之后筛选出能稳定表达APP蛋白的细胞系，即为所述细胞模型。
进一步地，所述方法具体包括：将所述重组载体与pRSV-rev载体及pCMV-VSV-G载体共转染293T细胞，并经培养获得重组病毒。
进一步地，本发明采用三质粒包装系统，如pMDL载体、pREV载体、VSVG载体。
在一些更为具体的实施例中，本发明实施例的一个方面提供的一种构建长久使用并且性状稳定的具有分泌Aβ蛋白和Tau磷酸化能力的阿尔兹海默症细胞模型的方法，其包括：
(1)用引物通过聚合酶链式反应对APP基因的cDNA进行扩增，再根据引物所选用的酶切位点将扩增出来的基因和原始载体骨架同时进行双酶切反应，之后回收酶切片段，并使酶切片段与载体酶切片段在DNA连接酶的作用下进行酶连反应，酶连反应结束后，酶连产物转化进入感受态细胞中并扩增质粒，之后进行PCR扩增，构建得到重组质粒或重组表达载体；
(2)通过病毒包装体系将重组质粒或重组表达载体整合到细胞基因组中，构建含有过表达APP基因的AD细胞模型，使其稳定表达APP基因，并产生Aβ蛋白，获得稳转细胞系；
(3)对稳定表达Aβ蛋白的细胞系进行培养，以提取液进行提取，获得具有分泌Aβ蛋白和Tau磷酸化能力的阿尔兹海默症细胞模型。
在一些实施例中，所述引物的序列分别如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示。
在一些实施例中，所述载体骨架可以是慢病毒载体，还可以是非病毒的载体，但不限于此。
进一步地，所述载体骨架可以是PLVX，但不限于此。
在一些实施例中，所述宿主细胞选用间充质干细胞，例如，可以是鼠源细胞CHO(Chinese hamster ovary cell,CHO)或人源细胞HFF(human foreskinfibroblast,HFF)等，但不限于此。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法构建的阿尔兹海默症细胞模型，所述阿尔兹海默症细胞模型具有分泌Aβ蛋白和Tau磷酸化能力。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种阿尔兹海默症细胞模型，所述细胞模型是以重组慢病毒颗粒为基础，感染宿主细胞而构建得到；
其中所述重组慢病毒颗粒是利用包含有APP蛋白编码基因的重组载体，经慢病毒包装系统转染293T细胞，并经培养后获得；
所述重组载体是将APP蛋白的编码基因连接到pLVX-IRES-Puro载体的多克隆位点上而构建形成。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法构建的阿尔兹海默症细胞模型在用于制备检测或治疗阿尔兹海默症的产品中的用途。
进一步地，所述用途包括：将所述阿尔兹海默症细胞模型用作研究阿尔兹海默症的动物模型。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种药物组合物，其包括由前述方法构建的阿尔兹海默症细胞模型。
藉由上述技术方案，本发明通过基因技术构建了过表达APP基因的CHO和HFF细胞系作为AD细胞模型，采取慢病毒转染的方式，可以保证AD细胞模型具有的AD病理特征的长久性和稳定性；同时，本发明提供的AD细胞模型可以稳定表达且能够分泌Aβ，可以长久使用，并且具有稳定持续的Aβ沉积和tau蛋白磷酸化特征，可以很好的实现对阿尔兹海默症的病理特征的模拟，为阿尔茨海默症行相关药物的研发与筛选、阿尔兹海默症机理的研究提供体外细胞研究平台可能。
以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例提供的一种构建可以长久使用并且性状稳定阿尔兹海默症细胞模型(ADcell model)的方法，主要技术流程可分为四个步骤：1、载体构建；2、细胞构建；3、Matrigel基质胶培养；4、刚果红淀粉样染色和蛋白印记实验检测AD病理特征。
下面将对每个步骤进行详细描述：
1、载体构建(利用分子生物学技术构建PLVX-APP重组载体)
(1)合适载体骨架的选取。本发明选取的是慢病毒载体pLVX-IRES-Puro(以下简称为 PLVX)作为重组载体基本骨架。
(2)国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)网站 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查寻APP基因的编码序列(codingsequence,CDS)。
(3)利用Primer5引物设计软件设计针对APP基因扩增引物，再交由公司合成引物，引物列表如表1所示。
表1：本发明构建载体所需引物列表
Figure BDA0002319215420000061
(4)进行重组质粒构建(如图1所示)：
①通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)将APP基因的cDNA从正常细胞中扩增出来并进行cDNA回收；PCR反应所需模板由厦门大学韩家淮老师实验室提供的 cDNA，使用设计好的引物，利用KOD酶进行扩增。所用扩增反应体系如表2。
表2：扩增体系(50μl)
Figure BDA0002319215420000062
PCR反应程序如下：
Figure BDA0002319215420000063
②PCR扩增出来的基因和原始载体分别进行双酶切反应，再回收酶切片段；
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以检测条带是否单一，大小是否正确，单一条带可直接进行PCR产物回收，有杂带，可进行切胶回收。利用Axygen公司的胶回收试剂盒按照说明书进行回收。具体步骤如下：
(1)在弱紫外灯下将PCR产物的目的条带从琼脂糖凝胶中切下，切碎后放置于放入事先准备好的EP管中，称重(1μg＝1μl)；
(2)按照胶回收试剂盒的说明操作，加3倍胶体积的bufferDE-A，75℃加热融化，间断混合(2-3min混合一次)；
(3)加0.5倍缓冲液DE-A体积的缓冲液DE-B，混匀；
(4)吸取3)中的混合液转移到放置在2ml离心管的DNA制备管中，12000g离心1min；
(5)弃废液，制备管放回离心管，加500μl缓冲液W1，12000g离心1min；
(6)弃废液，制备管放回离心管，加500μl缓冲液W2，12000g离心1min，再重复清洗一次；
(7)将制备管放入洁净的1.5ml离心管中，向制备管加20-25μl灭菌水，溶解2-3min；
(8)12000g离心1min，吸取离心管中滤液，加入制备管，再离心；
(9)测OD确定片段浓度。
酶切
将PCR产物和载体利用引物设计时采用的酶切位点所对应的内切酶进行双酶切，37℃水浴2h，
酶切体系如表3，酶切产物利用Axygen公司的胶回收试剂盒进行回收。
表3双酶切体系(50μl)
Figure BDA0002319215420000071
③PCR扩增基因酶切片段与载体酶切片段在T4DNA连接酶的作用下进行酶连反应；
将目的片段与载体进行连接，连接体系如表4；
表4连接体系(20μl)
Figure BDA0002319215420000072
Figure BDA0002319215420000081
④酶连产物转化进入感受态细胞中，再涂板培养阳性单菌落；
将连接产物转化到Stbl3感受态中，第二天挑取5-10个单菌落的部分菌进行菌落PCR，鉴定目的片段是否连接到载体上，菌落PCR体系如表5。
表5菌落PCR体系(10μl)
Figure BDA0002319215420000082
PCR反应程序如下：
Figure BDA0002319215420000083
⑤挑取单菌落进行菌落PCR，检测出成功转入PLVX-APP质粒的阳性单菌落；
电泳检测PCR产物是否有条带，挑取条带大小正确的菌落3-5个，摇菌，送测序。plvx 载体上的测序引物序列如表6。
表6载体上的测序引物序列
Figure BDA0002319215420000084
Figure BDA0002319215420000091
⑥挑取阳性单菌落进行菌落扩大培养，提取质粒测序，确定APP基因成功连接到PLVX 载体上，并且没有突变，载体构建完成。
2、细胞构建
(1)选择合适的细胞。本发明选择的是鼠源细胞CHO(Chinese hamster ovarycell,CHO) 及人源细胞HFF(human foreskinfibroblast,HFF)，构建过表达APP基因的AD细胞模型。
(2)参见图2所示，通过慢病毒包装技术(如表7所示)将重组载体整合到细胞基因组中，构建PLVX-HFF,PLVX-APP-HFF，PLVX-CHO，PLVX-APP-CHO等过表达APP的AD 细胞模型，使其稳定表达APP基因，并产生Aβ蛋白。
表7：本发明选用的病毒包装体系
Figure BDA0002319215420000092
1)病毒的包装
本实施例选用GeneTranTM III(以下简称：GeneT)作为转染293T细胞的转染试剂。
转染前24h：将一个10cm培养皿培养的细胞密度达到95％的293T，消化传代成3个10cm 培养皿。
转染当天：细胞密度长到90％左右，按一定的转染体系(如表2.10)进行转染。
具体转染步骤如下：
(1)按上述比例，将转染试剂GeneT与Opti-medium培养基混匀，静置5min。
(2)将包装载体和重组质粒按比例加入Opti-medium培养基中轻轻混匀，再将混合物加入含GeneT的离心管中混匀，同时以Turbo GFP作为阳性对照。
(3)每隔5min轻轻混匀一次，共计5次。
(4)在加入预混物10min左右，把培养基换成5ml的Opti-medium。
(5)将预混物均匀地滴加到细胞中，轻轻摇晃混匀。
表2.10转染体系
Figure BDA0002319215420000101
(6)细胞放入细胞培养箱中培养3-4h，之后换取无双抗且含1％丙酮酸钠的新鲜生长培养基，继续培养24h，此时在荧光显微镜下观察TurboGFP质粒转染293T细胞的荧光强弱，判断其转染效率。若转染效率高于50％，可继续培养，若低于50％，则说明转染效率不高，可终止培养。
(7)再培养24h左右后换取新鲜培养基，继续培养至48h。在4℃，4000rpm离心收集上清，将上清经0.22μm过滤器过滤除菌转移至另一离心管。病毒悬液放于4℃冰箱，需保证在两天内侵染目的细胞，亦可放于-80℃长期保存。
2)病毒侵染细胞
(1)目的细胞前一天接种，第二天细胞密度生长到40-60％。
(2)吸去培养基，PBS清洗一遍。
(3)病毒悬液与生长培养基按2:1混合，再加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺，充分混匀，加入细胞培养皿中，同时TurboGFP质粒侵染相应靶细胞作为阳性对照。
(4)培养12h-24h后，换取新鲜生长培养基继续培养至48h。此时可在荧光显微镜下观察病毒包装的效率，有绿色荧光说明，细胞稳转了病毒颗粒。
(3)病毒侵染细胞24h后，加入1μg/ml的嘌呤霉素进行药筛3天以上，获得稳转细胞系。
(4)本发明中，采用实时荧光定量核酸扩增反应(Real-time Quantitative PCR,QPCR)证明 APP其对应的信使RNA过表达；采用蛋白印记实验(Western Blot,WB)检测到APP蛋白也过表达；采用ELISA检测AD细胞模型的淀粉样蛋白分泌情况。以上结果说明，所构的AD细胞模型Aβ蛋白均高表达，结果可参见图3A-图3H所示。
3、AD细胞模型的AD病理特征检测，首先基质胶培养，然后刚果红淀粉样染色检测老年斑的形成(请参阅图4A-图4D所示)；最后蛋白印记实验检测Tau磷酸化(请参阅图5A-图5B所示)。刚果红淀粉样染色检测老年斑具体步骤为：
1)24孔板每孔加入200μL含10％基质胶的完全培养基；
2)细胞培养箱孵育半小时；
3)细胞消化重悬并调节细胞密度到2×106/ml左右；
4)细胞悬液与含4％基质胶的完全培养基以1:1的比例混合后接种到底部预先铺好基质胶的24孔板中，每孔约200μL；
5)两天后换液，每孔加500μL含2％基质胶的完全培养基，之后约两天换次液，所换培养基为含2％基质胶的完全培养基；
6)用4％的甲醛固定3D培养的细胞1h；
7)0.5％的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)通透0.5h；
8)加入改良Highman染色液(又称甲醇刚果红染色液)浸染10min，弃液；
9)加入Highman分化液分化，立即入水终止分化，水洗2次后镜下控制至恰当程度；
10)自来水冲洗；
11)加入Mayer苏木素染色液浅染细胞核；
12)自来水冲洗；
13)逐级常规乙醇脱水，镜检拍照。以上结果证明所构AD细胞模型的具有老年斑和Tau 磷酸化的AD病理特征。
藉由上述技术方案，本发明通过基因技术构建了过表达APP基因的CHO和HFF细胞系作为AD细胞模型，采取慢病毒转染的方式，可以保证AD细胞模型具有的AD病理特征的长久性和稳定性；同时，本发明提供的AD细胞模型可以稳定表达且能够分泌Aβ，可以长久使用，并且具有稳定持续的Aβ沉积和tau蛋白磷酸化特征，可以很好的实现对阿尔兹海默症的病理特征的模拟，为阿尔茨海默症行相关药物的研发与筛选、阿尔兹海默症机理的研究提供体外细胞研究平台可能。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
除非另外具体陈述，否则术语“包含(include、includes、including)”、“具有(have、has或 having)”的使用通常应理解为开放式的且不具限制性。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。
序列表
<110> 上海大学
中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所
<120> 一种构建阿尔兹海默症细胞模型的方法及其用途
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ggactagtgc caccatgctg cccggtttgg cac 33
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
tgctctagac tagttctgca tctgctcaaa gaacttg 37
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
gctgttttga cctccataga agaca 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
cggcaatatg gtggaaaata acata 25
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
acgccatcca cgctgttttg acct 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
aagcggcttc ggccagtaac gtta 24

Claims (10)

1.一种构建阿尔兹海默症细胞模型的方法，其特征在于包括：
构建包含有APP蛋白编码基因的重组载体，再利用所述重组载体将所述APP蛋白的编码基因整合到宿主细胞的基因组中，进而构建形成所述细胞模型。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于具体包括：将APP蛋白的编码基因连接到pLVX-IRES-Puro载体的多克隆位点上，从而构建形成所述重组载体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于具体包括：
利用慢病毒包装系统，使所述载体转染293T细胞，并经培养获得重组病毒；
以所述重组病毒侵染宿主细胞，之后筛选出能稳定表达APP蛋白的细胞系，即为所述细胞模型。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于具体包括：将所述重组载体与pRSV-rev载体及pCMV-VSV-G载体共转染293T细胞，并经培养获得重组病毒。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞包括鼠源细胞CHO或人源细胞HFF。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞包括间充质干细胞。
7.由权利要求1-6中任一项所述方法构建形成的阿尔兹海默症细胞模型，所述阿尔兹海默症细胞模型具有分泌Aβ蛋白和Tau磷酸化能力。
8.一种阿尔兹海默症细胞模型，其特征在于：所述细胞模型是以重组慢病毒颗粒为基础，感染宿主细胞而构建得到；
其中所述重组慢病毒颗粒是利用包含有APP蛋白编码基因的重组载体，经慢病毒包装系统转染293T细胞，并经培养后获得；
所述重组载体是将APP蛋白的编码基因连接到pLVX-IRES-Puro载体的多克隆位点上而构建形成。
9.由权利要求1-6中任一项所述方法构建的阿尔兹海默症细胞模型或权利要求8所述的阿尔兹海默症细胞模型在用于制备检测或治疗阿尔兹海默症的产品中的用途。
10.一种药物组合物，其特征在于包括由权利要求1-6中任一项所述方法构建的阿尔兹海默症细胞模型或权利要求8所述的阿尔兹海默症细胞模型。
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王芬等: "稳定表达人野生型淀粉样前体蛋白细胞模型的建立与鉴定", 《中国现代神经疾病杂志》 *

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