CN109576227B - 一种基于荧光素酶报告病毒的自噬细胞系构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于荧光素酶报告病毒的自噬细胞系构建方法，该方法将AGT7启动子序列及LUC2基因整合入GTP载体上，并对该载体进行慢病毒包装，转染进入293T细胞，经抗性筛选，获得阳性细胞；利用超高速离心机浓缩获得高滴度的慢病毒。在此基础上，采用慢病毒侵染不同种类的细胞，通过荧光显微镜观察病毒转染效率，并通过基因检测验证侵染的细胞系中目的基因的表达。该方法构建的自噬相关的细胞系有助于研究化合物对细胞自噬的影响，为发育、衰老、细胞程序性死亡提供了新的研究思路和解决方案。

Description

一种基于荧光素酶报告病毒的自噬细胞系构建方法
技术领域
本发明属于分子生物学和细胞生物学技术领域，具体而言，涉及一种细胞系的构建方法，尤其涉及一种基于荧光素酶报告病毒的自噬细胞系构建方法。
背景技术
细胞自噬是一种细胞分解代谢过程，在细胞的生长、分化、体内平衡和营养缺乏的条件下细胞存活发挥着重要的作用，是一种机体重要的自我保护和防御机制。细胞自噬具体指细胞内的双层膜结构将部分细胞质、受损的蛋白质以及衰老或损伤的细胞器如线粒体、高尔基体、内质网等包裹形成自噬小体，递送至溶酶体，并与之融合形成自噬溶酶体，通过蛋白质水解酶水解内容物进行消化降解，以满足细胞自身的代谢及更新。
在衰老和各种神经退行性疾病模型如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病和肌萎缩侧索硬化症中自噬增强是有益的[参见：Tan,C.C.；Yu,J.T.；Tan,M.S.；Jiang,T.；Zhu,X.C.；Tan,L.Neurobiology ofaging 2014,35,941；Wolfe,D.M.；Lee,J.H.；Kumar,A.；Lee,S.；Orenstein,S.J.；Nixon,R.A.The European journal ofneuroscience 2013,37,1949；Menzies,F.M.；Fleming,A.；Rubinsztein,D.C.Nature reviews.Neuroscience2015,16,345.]。在所述疾病中,细胞自噬的增强可以增强由疾病引起的聚集物的清除,从而有助于治疗和减轻疾病的严重程度。对于癌症的治疗，自噬的增强起着双刃剑但非常重要的作用：激活自噬以响应放疗或化疗而保护癌细胞，并且已被证明可促进肿瘤细胞存活和产生抗药性；另一方面，当癌细胞在过度自噬引发自噬性细胞死亡时，自噬作为肿瘤抑制机制起作用[参见：Chen,N.；Debnath,J.FEBS letters 2010,584,1427]。有大量的证据证明自噬增强是治疗大范围疾病和紊乱的有效方法，因此开发基于自噬增强的药物有广阔的市场前景，这也对开发和优化自噬增强的检测方法提出了需求。
传统报告基因系统一般通过体外克隆目标基因的启动子来驱动报告基因表达，检测基因的表达主要采用Real Time-qPCR、Western Blot等方法。然而，Real Time-qPCR过程繁琐且不稳定，Western Blot抗体标记费时昂贵，因此这些都不利于高通量筛选。另外，由于基因组本身存在表观遗传学修饰，将启动子克隆到携带报告基因的表达检测载体中的方法也无法模拟基因组的真实状态，因此难以准确反映基因组上基因的表达情况。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种基于荧光素酶报告病毒的自噬细胞系构建方法。采用本发明的方法构建的细胞系稳定可靠，避免繁琐的筛选工作，可广泛用于筛选药物所构建的细胞系，并能准确的判断候选化合物的生物学活性。
为了实现本发明的目的，发明人通过构建PATG7-LUC2-GTP载体并采用慢病毒的包装，利用慢病毒的特性在细胞基因组插入启动子和报告基因，成功建立PATG7-luciferase细胞系，从而实现高通量检测细胞自噬水平，可用于化合物的筛选。具体地，本发明的技术方案概括如下：
一种基于荧光素酶报告病毒的自噬细胞系构建方法，该方法包括如下步骤：
1)ATG7启动子序列的扩增及获得：合成ATG7启动子序列，两侧加酶切位点SnaBI和NheI，将合成的ATG7启动子序列克隆进入PMD19-T-simple，筛选阳性克隆并测序，获得正确的ATG7启动子序列，所述的ATG7启动子序列如SEQ ID NO.1所示；
2)LUC2基因序列的扩增及获得：合成LUC2基因序列，两侧加酶切位点EcoRI和BamHI，将合成的LUC2基因序列克隆进入PMD19-T-simple，筛选阳性克隆并测序，获得正确的LUC2基因序列，所述的LUC2基因序列如SEQ ID NO.2所示；
3)PATG7-LUC2-GTP载体的构建：利用SnaBI和NheI对GTP载体和携带ATG7启动子的PMD19-T-simple进行双酶切，回收启动子片段及酶切完的质粒片段，酶连后得到PATG7-GTP载体，之后对PATG7-GTP载体和携带LUC2基因的PMD19-T-simple质粒利用EcoRI和BamHI进行双酶切，回收酶切完的质粒片段和LUC2基因片段，酶连后得到PATG7-LUC2-GTP载体；
4)构建携带PATG7-LUC2-GTP载体的慢病毒：采用脂质体转染的方法，将PATG7-LUC2-GTP质粒、pLP1、pLP2和pLP/VSVG共同转染293T细胞，转染后48-72h收集含病毒的上清液，去除细胞碎片，收集包装好的慢病毒；
5)病毒侵染：选取神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞或干细胞，分别经步骤4)包装好的慢病毒侵染24-72h，得到自噬细胞系。
进一步优选地，如上所述基于荧光素酶报告病毒的自噬细胞系构建方法，其中步骤4)的具体操作步骤为：
①取T25细胞培养瓶，加入1×107个293T细胞；
②取1.5ml灭菌EP管，加入6μgpLP1、pLP2和pLP/VSVG的包装混合载体和2μgPATG7-LUC2-GTP载体以及1mL的无血清培养基，轻柔混匀，室温孵育4-6min；
③取1.5ml灭菌EP管，将40μl脂质体LP3000溶于1mL无血清培养基中，轻柔混匀，室温孵育4-6min；
④将步骤②的载体混合液与步骤③的脂质体溶液轻柔混匀，室温孵育18-22min，得到DNA-脂质体复合物；
⑤将DNA-脂质体复合物加入步骤①备好的T25细胞培养瓶中转染293T细胞，37℃CO2孵箱中孵育过夜；
⑥移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以含丙酮酸钠和非必须氨基酸的DMEM培养基；
⑦转染后48-72h收获含病毒的上清液，去除细胞碎片，收集包装好的慢病毒。
进一步优选地，如上所述基于荧光素酶报告病毒的自噬细胞系构建方法，其中所述的肿瘤细胞为恶性黑色素瘤细胞A375或乳腺癌细胞SK-OV-3。
进一步优选地，如上所述基于荧光素酶报告病毒的自噬细胞系构建方法，其中所述的内皮细胞为脐静脉内皮细胞HUVEC。
与现有技术相比，本发明涉及的基于荧光素酶报告病毒的自噬细胞系构建方法，其具有如下优点和进步性：本发明可实现将ATG7启动子和luciferase报告基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。另外，luciferase报告基因的表达直接受内源靶基因启动子调控，能够真实反映细胞内真实的转录水平。并且，构建的细胞系稳定可靠，避免繁琐的筛选工作，同时将有助于研究化合物对细胞自噬的影响，为发育、衰老、细胞程序性死亡提供了新的研究思路和解决方案。
附图说明
图1为PATG7-LUC2-GTP质粒载体结构图；
图2为荧光显微镜观察病毒侵染后的细胞侵染照片，第一排为白光，第二排为荧光；
图3为三种细胞PATG7的表达量；
图4为三种细胞经Rapamycin诱导后luciferase的表达量。
具体实施方式
为了能够更清楚理解本发明的技术构思和技术手段，并可依照说明书的内容和本领域的常规技术手段予以实施，下面结合具体的实施例和附图对本发明做进一步详细说明，但是以下具体试验例是对本发明的解释而不是限定。
1.启动子序列合成及验证：
根据所获得的启动子序列信息，利用基因合成仪通过化学合成方式合成启动子全长序列(两侧加酶切位点SnaBI和NheI)，将合成的启动子序列克隆进入PMD19-T-simple，筛选阳性克隆并测序，获得正确的ATG7启动子DNA序列。该启动子的DNA序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.LUC2基因的合成及验证：
根据所获得的LUC2基因序列信息，利用基因合成仪通过化学合成方式合成LUC2基因全长序列(两侧加酶切位点EcoRI和BamHI)，将合成的LUC2基因克隆进入PMD19-T-simple，筛选阳性克隆并测序，获得正确的LUC2DNA序列。LUC2的DNA序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
3.PATG7-LUC2-GTP载体构建：
首先利用SnaBI和NheI对GTP载体和携带ATG7启动子序列的PMD19-T-simple进行酶切，将CMV启动子成功切掉，回收启动子片段及酶切完的质粒片段；利用T4连接酶(Promega)将酶切的目的片段与目的启动子序列连接，4℃过夜；将连接产物转化进入大肠杆菌DH5α感受态，摇菌，涂板(氨苄抗性)，37℃培养12-16h；挑取单克隆，摇菌，利用特异引物(F:5’-CCTTCTGAATTCCCATTCTTT-3’；R:5’-GAGCAGAGGCATGCCGGGGAAAT-3’)对单克隆菌液进行PCR扩增；将阳性菌液测序，确定目的序列的正确性，最终经过SnaBI和NheI酶切验证，完成PATG7-GTP载体构建。之后对构建好的PATG7-GTP载体和携带LUC2基因的PMD19-T-simple质粒利用EcoRI和BamHI进行酶切，回收酶切完的质粒片段和LUC2目的片段；利用T4连接酶(Promega)将酶切的目的片段与LUC2序列连接，4℃过夜；将连接产物转化进入大肠杆菌DH5α感受态，摇菌，涂板(氨苄抗性)，37℃培养12-16h；挑取单克隆，摇菌，利用特异引物(F:5’-ATGGAAGATGCCAAAAACATTAA-3’；R:5’-TTACACGGCGATCTTGCCGCCCT-3’)对单克隆菌液进行PCR扩增；将阳性菌液测序，确定目的序列的正确性，完成PATG7-LUC2-GTP载体构建(图1)。
表1.酶切体系
Figure BDA0001924767310000041
Figure BDA0001924767310000051
表2.连接体系
Figure BDA0001924767310000052
4.病毒包装
4.1取T25细胞培养瓶，加入1×107个293T细胞。
4.2取1.5ml灭菌EP管，加入6μg pLP1、pLP2和pLP/VSVG的包装混合质粒和2μgPATG7-LUC2-GTP表达质粒以及1mL的无血清培养基。轻柔混匀，室温孵育5min。
4.3取1.5ml灭菌EP管，取40μl脂质体LP3000溶于1mL无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5min。
4.4将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20min。
4.5将DNA-脂质体复合物加入准备好的T25细胞培养瓶中转染293T细胞，37℃CO2孵箱中孵育过夜。
4.6移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以DMEM(含丙酮酸钠和非必须氨基酸)。
4.7转染后48-72h收获含病毒的上清。3000rpm离心20min，去除沉淀。
4.8超速离心浓缩病毒，滴度约为3×108，病毒存储于-80℃。
5.侵染细胞
5.1取T25细胞培养瓶，分别加入1×106个恶性黑色素瘤细胞(A375)、脐静脉内皮细胞(HUVEC)及乳腺癌细胞(SK-OV-3)细胞。
5.2按照细胞的MOI值加入相应的病毒量，同时加入5ug/mL的Polybrene。
5.3把细胞放回培养箱孵育；
5.4待8-12小时以后观察细胞状态。如果细胞状态与未感染组无明显差异，表明慢病毒对细胞没有明显毒性作用，请不要换液，继续培养，24小时后更换为新鲜培养基。
5.5感染72h后，观察荧光表达情况(图2)。
5.6结果显示，病毒转染效率超过90％，细胞均表达绿色荧光。
6.转染效率验证
6.1胞内RNA提取：
6.1.1将完全弃去培养基，加入1mL预冷的TRIzol，用1mL蓝枪头反复吹打至无颗粒透明装溶液；
6.1.2将上述充分裂解的细胞液转移至1.5mL离心管中，在室温下放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
6.1.3加入氯仿(每使用1mL TRIzol加0.2mL氯仿)，盖紧离心管管盖，用手上下振荡15s，溶液呈乳白状，无分层现象，室温静置3min；
6.1.412,000g，4℃离心15min；
6.1.5取出离心管，样品分为三层：无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相；
6.1.6小心吸取无色上清水相移至另一离心管，水相体积约为所用Trizol试剂的60％；
6.1.7向得到的上清水相加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min；12,000g，4℃离心10min；
6.1.8小心去除上清，缓慢沿管壁加入1mL 70％的乙醇(用DEPC处理过的水配制)，轻轻混匀；
6.1.9转速12,000g，4℃离心10min；
6.1.10小心吸尽上清，室温干燥沉淀5min左右，适量而定(不可晾得太干，否则RNA将会很难溶解)，加入30～50μL的无RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-70℃保存。
6.2cDNA第一链合成(20μL体系)：
6.2.1使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s；
6.2.2取灭过菌且无核酸酶的0.2mLPCR管，依次加入如下组份：
RNA(2μg) 2μL
5×PrimeScript RT Master Mix 2μL
无核酸酶的双蒸水至总体积 10μL
6.2.3轻轻混匀后，然后2000rpm离心20s；
6.2.4先在37℃保温15min，然后85℃保温5s，然后置于冰上5min；
6.2.5上述产物可立即进行下一步的PCR反应或-20℃保存。
6.3Real time-PCR正式实验
6.3.1按照一定的顺序，一个样本基因做3个复孔；
6.3.2往0.1ml PCR管，依次加入如下组份：
Figure BDA0001924767310000071
6.3.3PCR程序
第一步:95℃30sec
循环阶段
循环数:40
第一步:95℃5sec
第二步:60℃30sec
产物溶解。
6.4结果统计
如图3所示，以NC组为对照，PATG7-LUC2慢病毒侵染后，细胞中PATG7的表达明显高于对照组，表明病毒侵染后的细胞能够稳定表达PATG7基因。
7.Rapamycin诱导后luciferase的检测
7.1恶性黑色素瘤细胞(A375)、脐静脉内皮细胞(HUVEC)及乳腺癌细胞(SK-OV-3)细胞经Rapamycin(100ng/mL)诱导24h后，取5×104个细胞装入1.5mL EP管中。
7.2裂解细胞：每管加入lysis buffer 500ul，裂解5min，产物分装，至于-70℃保存。
7.3将样本、萤火虫荧光素酶检测液平衡至室温后再进行以下操作；
7.4加入10ul样本，每孔加入100ul萤火虫荧光素酶检测液，混合均匀；
7.5多功能酶标仪读数；
7.6如图4所示，正常表达PATG7-LUC2的细胞中，luciferase的表达处较低。采用Rapamycin诱导24h后，细胞的luciferase的表达处较高，其中Rapamycin为已知的自噬诱导剂，所以经本方法改造后的细胞具有指示细胞自噬水平的作用。
序列表
<110> 江苏凯基生物技术股份有限公司
<120> 一种基于荧光素酶报告病毒的自噬细胞系构建方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2000
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccttctgaat tcccattctt tgcctcataa atgattacag agctgcttgt ctccattgac 60
cagttggaaa aaatgcttat taaccaaact tgggttaagc ttctttcctt tccccaggct 120
ccttacttta acctactctc agcttgaact agcatactgt ctcatgtgtc cgtgtgaaga 180
gactaccaaa caggctttgt gtgagcaaca aggctgttta tttcacctgg gtgcaggtgg 240
gctgagtcca aaaagagagt cagcaaaggg tggtgggatt atcattggtt cttataggtt 300
ttgggatagg cggtggagtt aaaagcaatg ttttgggggt agggggtgga tctcacaaag 360
tacattctca agggtggtga gaattacaaa gaaacttctt aagggtgggg gagactataa 420
aagaaccttc ttaagggtgg gggagattac aaagtacatt gatcagttag ggtggggcag 480
aaacaaatca caatggtgga atgtcatcag ttaaggctat tttcacttct gcggatcttc 540
agttgctgca agccatctgg atgtatacgt gcaggtcact ggggatatga tggcttagct 600
tgggctcaga gactgacaca cacaacccct actgagaata ggttggcctc aagataaaac 660
attctctaat ctactatctg atcaagccac cccttcatcc cacttcccat attcggttgt 720
ttccagcctt gtttacctgc ctttggggag ggtggggggt gggggaaccc tctttttccc 780
taaccattga aacatctgcg gatgttttgg tcagagtgat ctcactattg caatagtctc 840
cctctgctat tgcacggttc cttctctccc acctctctca cttcttgcag taatcctttc 900
tttttttttt tttttgagac ggagtctcgc tctgtcgccc aggctggagt gcagtggtgg 960
gatctcggct cactgcaagc tccgcctccc gggttcacgc cattctcctg cctcagcctc 1020
ccaagtagct gggactacag gcgcccgcca ccacgcccgg ctaatttttt tgtattttta 1080
gtagagacgg ggtttcaccg ttttagccgg gatggtctcg atctcctgac ctcgtgatcc 1140
gcccgcctcg gcctcccaaa gtgctgtgat tacaggcgtg agccaccgcg ccgggcctgc 1200
agtaatcctt tctaataagt atccttatta gtctggattt gttttcttat ttgccagaat 1260
caaacaaact tcagattacg ttcctggccc aaaagccctt taactttcag caagccacct 1320
aacttttctt agattctgtt ctttcatata taacttgggg atatgtttca ggactcttgt 1380
gaggattaga gatgtaaaac cctgaaaaca tggtggctag ttaattaata gcagtcatcg 1440
ctcttgttgt tatgagtcta gagtggtata tcagagttaa tttgtgaaag gccttacagg 1500
ccagacagag aaacttgtca taatcactgc tgtatcttca acacctgtcc agtgctttgc 1560
acgcgcagag tatctaacca agtattgaga gggaataact ttatctcact gacagtgagg 1620
agctgtgaga atgatggctg gtttagaaaa ggcaggttgg tcactgtcga cgttcactgg 1680
ccttttccta ctaaaattct catctcctgg ctctccacac ctgccaccct gatggcccct 1740
gtgctgcgtt tgatgccgcc tctcctggag aatgaccatg gtgatcattc ctgtcatcct 1800
ctgaaatcaa aagagagaac gtgggcactt tcttaaaagc ctgaagggaa tgtagacatt 1860
ccgacatctg gtaagggaga cgctctccat cgcttccccc gggggcgtca ccgccccctg 1920
atgccccgcc ctcctcacga ctcaagttcc tcccacttag ctcggtgcta ggggcgcatt 1980
tccccggcat gcctctgctc 2000
<210> 2
<211> 1653
<212> DNA
<213> pmirGLO质粒(pmirGLO plasmid)
<400> 2
atggaagatg ccaaaaacat taagaagggc ccagcgccat tctacccact cgaagacggg 60
accgccggcg agcagctgca caaagccatg aagcgctacg ccctggtgcc cggcaccatc 120
gcctttaccg acgcacatat cgaggtggac attacctacg ccgagtactt cgagatgagc 180
gttcggctgg cagaagctat gaagcgctat gggctgaata caaaccatcg gatcgtggtg 240
tgcagcgaga atagcttgca gttcttcatg cccgtgttgg gtgccctgtt catcggtgtg 300
gctgtggccc cagctaacga catctacaac gagcgcgagc tgctgaacag catgggcatc 360
agccagccca ccgtcgtatt cgtgagcaag aaagggctgc aaaagatcct caacgtgcaa 420
aagaagctac cgatcataca aaagatcatc atcatggata gcaagaccga ctaccagggc 480
ttccaaagca tgtacacctt cgtgacttcc catttgccac ccggcttcaa cgagtacgac 540
ttcgtgcccg agagcttcga ccgggacaaa accatcgccc tgatcatgaa cagtagtggc 600
agtaccggat tgcccaaggg cgtagcccta ccgcaccgca ccgcttgtgt ccgattcagt 660
catgcccgcg accccatctt cggcaaccag atcatccccg acaccgctat cctcagcgtg 720
gtgccatttc accacggctt cggcatgttc accacgctgg gctacttgat ctgcggcttt 780
cgggtcgtgc tcatgtaccg cttcgaggag gagctattct tgcgcagctt gcaagactat 840
aagattcaat ctgccctgct ggtgcccaca ctatttagct tcttcgctaa gagcactctc 900
atcgacaagt acgacctaag caacttgcac gagatcgcca gcggcggggc gccgctcagc 960
aaggaggtag gtgaggccgt ggccaaacgc ttccacctac caggcatccg ccagggctac 1020
ggcctgacag aaacaaccag cgccattctg atcacccccg aaggggacga caagcctggc 1080
gcagtaggca aggtggtgcc cttcttcgag gctaaggtgg tggacttgga caccggtaag 1140
acactgggtg tgaaccagcg cggcgagctg tgcgtccgtg gccccatgat catgagcggc 1200
tacgttaaca accccgaggc tacaaacgct ctcatcgaca aggacggctg gctgcacagc 1260
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cccgccgcag tcgtcgtgct ggaacacggt aaaaccatga ccgagaagga gatcgtggac 1500
tatgtggcca gccaggttac aaccgccaag aagctgcgcg gtggtgttgt gttcgtggac 1560
gaggtgccta aaggactgac cggcaagttg gacgcccgca agatccgcga gattctcatt 1620
aaggccaaga agggcggcaa gatcgccgtg taa 1653

Claims (3)

1.一种基于荧光素酶报告病毒的自噬细胞系构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1）ATG7启动子序列的扩增及获得：合成ATG7启动子序列，两侧加酶切位点SnaBI和NheI，将合成的ATG7启动子序列克隆进入PMD19-T-simple，筛选阳性克隆并测序，获得正确的ATG7启动子序列，所述的ATG7启动子序列如SEQ ID NO.1所示；
2）LUC2基因序列的扩增及获得：合成LUC2基因序列，两侧加酶切位点EcoRI和BamHI，将合成的LUC2基因序列克隆进入PMD19-T-simple，筛选阳性克隆并测序，获得正确的LUC2基因序列，所述的LUC2基因序列如SEQ ID NO.2所示；
3）PATG7-LUC2-GTP载体的构建：利用SnaBI和NheI对GTP载体和携带ATG7启动子的PMD19-T-simple进行双酶切，回收启动子片段及酶切完的质粒片段，酶连后得到PATG7-GTP载体，之后对PATG7-GTP载体和携带LUC2基因的PMD19-T-simple质粒利用EcoRI和BamHI进行双酶切，回收酶切完的质粒片段和LUC2基因片段，酶连后得到PATG7-LUC2-GTP载体；
4）构建携带PATG7-LUC2-GTP载体的慢病毒：采用脂质体转染的方法，将PATG7-LUC2-GTP质粒、pLP1、pLP2和pLP/VSVG共同转染293T细胞，转染后48-72h收集含病毒的上清液，去除细胞碎片，收集包装好的慢病毒；
5）病毒侵染：选取神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞或干细胞，分别经步骤4）包装好的慢病毒侵染24-72h，得到自噬细胞系；
步骤4）的具体操作步骤为：
①取T25细胞培养瓶，加入1×107个293T细胞；
②取1.5ml灭菌EP管，加入6μg pLP1、pLP2和pLP/VSVG的包装混合载体和2μg PATG7-LUC2-GTP载体以及1 mL的无血清培养基，轻柔混匀，室温孵育4-6min；
③取1.5ml灭菌EP管，将40μl 脂质体LP3000溶于1 mL无血清培养基中，轻柔混匀，室温孵育4-6min；
④将步骤②的载体混合液与步骤③的脂质体溶液轻柔混匀，室温孵育18-22min，得到DNA-脂质体复合物；
⑤将DNA-脂质体复合物加入步骤①备好的T25细胞培养瓶中转染293T细胞，37℃ CO2孵箱中孵育过夜；
⑥移除含有DNA-脂质体复合物的培养基，代之以含丙酮酸钠和非必须氨基酸的DMEM培养基；
⑦转染后48-72h收获含病毒的上清液，去除细胞碎片，收集包装好的慢病毒。
2.根据权利要求1所述基于荧光素酶报告病毒的自噬细胞系构建方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞为恶性黑色素瘤细胞A375或乳腺癌细胞SK-OV-3。
3.根据权利要求1所述基于荧光素酶报告病毒的自噬细胞系构建方法，其特征在于，所述的内皮细胞为脐静脉内皮细胞HUVEC。
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Norcantharidin alone or in combination with crizotinib induces autophagic cell death in hepatocellular carcinoma by repressing c-Met-mTOR signaling;Sun, CY et al.;《Oncotarget》;20171204;第8卷(第70期);第114953页左栏第2段 *
Quantitation of selective autophagic protein aggregate degradation in vitro and in vivo using luciferase reporters;Jeong-Sun Ju et al.;《Autophagy》;20090516;第5卷(第4期);摘要，第518页右栏第2段 *

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