KR20120115976A - 프로테아제 활성 저해제의 동정 방법 및 프로테아제 활성의 존재 분석 방법 - Google Patents

프로테아제 활성 저해제의 동정 방법 및 프로테아제 활성의 존재 분석 방법 Download PDF

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융-니엔 창
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Abstract

본 발명은 프로테아제 및 프로테아제 저해제 검출용 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 적어도 두개의 구성성분을 포함한다. 제1 구성성분은 적어도 하나의 결합부위와 전사 프로모터, 유도성 프로모터 영역, 및 적어도 하나의 리포터 유전자를 갖고 이들은 전사 활성 물질과 기능적으로 조정하여 리포터 유전자의 발현을 위해 기능적으로 연결된 리포터 구조체(construct)이다. 제2 구성성분은 핵산 결합 도메인, 적어도 하나의 프로테아제 기질 도메인, 및 적어도 하나의 유도성 프로모터를 위한 전사 활성 도메인을 포함하는 전사 활성 물질이다. 상기 시스템은 프로테아제 기질 도메인에 지시된(directed) 프로테아제 활성에 영향을 주는 물질의 검출 및 평가를 할 수 있다. 또한, 상기 시스템은 환경적인 시료에서 프로테아제의 존재를 검출할 수 있다.

Description

프로테아제 활성 저해제의 동정 방법 및 프로테아제 활성의 존재 분석 방법{Method for identification of protease activity inhibitors and assaying the presence of protease activity}
본 발명은 일반적으로 프로테아제 저해제 동정 분석의 분야에 관한 것이다.
프로테아제는 생물학적 과정(processes)에서 중요한 역할을 한다. 그러나, 프로테아제는 또한 생물학적 시스템들, 특히 바이러스, 독소(toxins) 및 병원성 미생물(pathogenic micro-organism)에 의하여 전염된 생물학적 시스템에 상당한 손상을 유발할 수 있다. 프로테아제 저해제를 개발하고, 특히 세포에서 프로테아제 활성을 분석하는 방법은 생명공학의 중요한 분야이다. 예를들어, 보툴리눔 신경독소(botulinum neurotoxins;BoNTS)는 가장 강력한 독소이다(S.S.Arnon, R. Schechter, et al. Jama 285;1059-70. (2001); 및 B.M. Paddle. J Appl Toxicol 23:139-70. (2003)). 보툴리눔 식중독(Botulism)은 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)에 오염된 식품의 섭취, 박테리아에 의한 벌어져 있는 상처(open wound)부위의 전이증식(colonization), 또는 독소의 호흡 또는 섭취에 의하여 유발될 수 있다. 이러한 독소들은 일반인 및 군인 모두에게 심각한 위협을 줄 수 있다(S.C. Clarke. Br J Biomed Sci 62:40-6(2005); R.P. Hicks, M.G. Hartell, et al . Curr Med Chem 12:667-90(2005); D. Josko. Clin Lab Sci 17:30-4(2004)). 인간에서 치사량은 <1ng/몸무게의 kg 이다(J.C.Burnett, E.A. Henchal, et al. Nat Rev Drug Discov 4:281-97(2005); J.C. Burnett, J.J. Schmidt, et . al.Bioorg Med Chem 13:333-41(2005); B.M. Paddle J Appl Toxicol 23:139-70(2003)). 질병 관리(Disease Control) 및 예방 센터는 이러한 독소들을 카테고리 A(가장 높은 순위) 생명-위협 물질(bio-threat agent)로 등재하였다. 비록 BoNTs는 위험할 수 있지만, 이들은 유용한 의학적 화합물로서 인식되었다. BoNTs는 현재, 신체 질병 및 미용 치료를 위한 정립된 생물학적 치료법(established biotherapeutics)이고, 국내 및 해외에서 증가된 양으로 생산하고 있다(R. Bhidayasiri, and D.D. Truong, J Neurol. Sci.235:1-9(2005); C.L. Comellaand and S.L. Pullman. Muscle Nerve 29:628-44(2004); K.A. Forster. Drug Discob today 10:563-9(2005); R.G. Glogau. Clin J Pain 18:S191-7(2002); J.D. Marks. Anesthesiol Clin North America 22:509-32, ⅶ.(2004); C. Montecucco and J. Molgo. Curr Opin Pharmacol 5:274-9(2005)). 그들의 유용성의 부정적 결과는 신경독소들을 오용(misuse)에 대한 신경독소의 증가된 유용성이다. 마찬가지로, 증가 사용량이, 치료 도중 상기 의도하지 않은 악영향의(adverse effect) 발생 가능성을 증가시킨다(T.R. Cote, A.K. Mohan, et al. J Am Acad Dermatol 53:407-15(2005)).
일단 폐로 흡입되거나 또는 위장관(gastrointestinal tract)으로 섭취되면, BoNTs는 호흡 기관의 상피세포(respiratory epithelium) 또는 점막을 통하여 혈류로세포통과되는데(transcytosed), 여기서 상기 BoNTs는 말초 콜린성 시냅스 앞 신경 말단(peripheral cholinergic presynaptic nerve endings)에 결합 및 유입에 앞서 세포 사이(intercellular)의 공간에 들어갈 수 있다. 현재, 뉴런들이 상기 독소의 영향으로 횡경막 근육의 기능을 멈추는 경우, 중요한 인공 호흡기(critical care mechanical ventilation)가 유일한 선택 치료법이다. 그러나, 내재화된(internalized) BoNTs의 효과는 한달동안 지속될 수 있다(R. Eleopra, V. Tugnoli, et al. Neurosci Lett 256:135-8(1998);F.A Meunier, G. Lisk, et al.Mol cell Neurosci 22:454-66(2003)). 따라서, 제한된 수의 개개인들이 동시에 독소에 영향을 받는다면, 장기간 인공 호흡기는 비현실적일 것이다.
다른 삼차구조 및 상당히 다른 서열을 갖는 7가지의 BoNT 혈청형(serotype; A-G)이 존재한다. 각각의 혈청형은 구조적으로 100KDa 중쇄(HC) 및 50KDa 경쇄(LC)로 구성되어있다. 이들은 초기에 단일 폴리펩티드 사슬로 합성되고, 이 후 박테리아 또는 숙주의 프로테아제에 의하여 절단된다. 신경 표적 세포(neuronal target cell)가 환원성 세포질 환경에 도달할 때까지 상기 사슬은 디설파이드 결합(disulfide bridge)에 의해 연결된 것으로 남아있다(D.B.Lacy, W. Tepp, et al. Nat Struct Biol 5:898-902(1998). L.L.Simpson. Annu Rev Pharmacol Toxicol 44:167-93(2004)). 상기 경쇄(LC)는 아연-의존성 엔도펩티다제(zinc-dependent endopeptidase)이다.
일단 폐로 흡입되거나 또는 위장관(gastrointestinal tract)으로 섭취되면 BoNTs는 호흡 기관의 상피세포(respiratory epithelium) 또는 점막을 통하여 혈류로 세포통과 되는데, 여기서 상기 BoNTs는 말초 콜린성 시냅스 앞 신경 말단들에 결합 및 유입에 앞서 세포 사이의 공간에 들어갈 수 있다. 상기 중쇄(HC)는 뉴런에 결합하고 LC를 HC(HCc)의 카르복실 말단 절반을 통하여 세포질로 이동시키고, LC를 HC(HCN)의 아미노 말단 절반에 의하여 형성된 구멍(pore)을 통하여 엔도솜으로부터 세포질로 이동시킴으로써 단백질 가수분해 LC의 전달 시스템 역할을 한다. 각각의 BoNT 혈청형의 LC는 신경근의 접합(junctions)에서, 아세트콜린 함유 소포체의 융합 및 방출의 원인인 SNARE 단백질의 성분을 절단하는 프로테아제이다(B.R. Singh Nat Struct Biol 7:617-9(2000); and K.J. Turton, A. Chaddock, and K.R. Acharya, Trends Biochem.Sci.27:552-8(2002)). BoNT 혈청형 A 및 E는 SNAP-25(synaptosomal-associated protein; 25kDa)를 절단한다(T. Binz, J. Blasi, et al. J Biol chem 269:1617-20(1994)). 혈청형 B, D, F 및 G는 VAMP(vesicle-associated membrane protein, 또는 시냅토브레빈(synaptobrevin) 및 VAMP-2라 함)을 절단한다(G. Schiavo, F. Benfentati, et al. Nature 359:832-5(1992); G. Schiavo, C. Malizio, et al. J. Biol. Chem 269:20213-6(1994); G. Schiavo, O. Rossetto, et al. J Biol Chem 268:23784-7(1993); G. Schiavo, C. C. Shone, et al, J Biol Chem 268:11516-9(1993); J.J. Schmidt, and R. G. Stafford. Biochemistry 44:4067-73(2005)). 혈청형 C는 SNAP-25 및 신택신1a(syntaxin1a)를 절단한다(J. Blasi, E.R. Chapman, et al. Embo J 12:4821-8(1993)). SNARE 단백질의 BoNT 매개 절단은, 운동 뉴런(motor neuron)이 신경근 접합에서 아세틸콜린의 방출과, 아세틸콜린 방출의 저해를 통해 자율신경의 기능의 방해를 막아 소아마비(flaccid paralysis)를 일으킨다. 일단 횡경막 근육이 침범되면, 호흡이 어려워지고 궁극적으로 질식이 일어난다.
상기 7가지 BoNT 혈청형은 아미노산 서열에서 상당히 차이가 있다. 그러나, 다른 혈청형들은 전체적으로 유사한 단백질 접힘(folds)를 채택하고 있고, 촉매활성의 중요 부위(aspect of the catalytic core)가 보전되어있다(M.A. Breidenbachand A.T. Brunger. Trends Mol Med 11:377-81(2005)). BoNT/A 및 BoNT/B의 X-선 결정 구조는 이러한 두가지 혈청형의 아연 결합 부위의 8Å 내의 영역은 22개 잔기 중 17개가 동일하여 높은 상동성을 나타낸다(S. Swaminathan & S. Eswaramoorthy, Nature Structural Biology 7:693-699(2000)). 그러나 아연-결합 주머니(pocket)를 포함하는 15Å 내에서 상당한 차이가 관찰되었는데, 이는 BoNT/B 보다 BONT/A에서 더욱 깊숙히 매장되어있다. 그러므로 활성부위는 혈청형들 사이에서 충분히 달라 광범위한 잠재적인 저해제(broad-spectrum potential inhibitors)가 존재하지 않는다. 또한, 기질이 효소에 결합시, 기질들은 BoNT LC의 주위를 감싸 특별히 큰 기질 효소 접착면(interface)를 형성한다(M.A. Breidenbachand A. T. Brunger. Nature 432:925-9(2004)). 또한, BoNT 기질 특이성은 "exosite" 결합이라고 불리는 활성 부위에 대한 부위 말단을 통한 긴 기질/LC 프로테아제 접착면에 기질의 결합에 의해 결정된다(M.A. Breidenbachand A.T. Brunger. Trends Mol Med 11:377-81(2005)).
백신 방법(Vaccine approaches)은 BoNT에 대한 생물방어(biodefense)에서 중요한 역할을 할 것이다(M.P. Byrne and L.A. Smith. Biochimie 82:955-66(2000). J.B. Park and L.L. Simpson. Expert RevVaccines 3:477-87(2004)). 그러나, 노출 전에위험 군집(populations)의 큰 규모를 갖는 모든 구성원(member)들의 동정 및 접종이 문제이다. 효과적인 사후-노출 치료(post-exposure treatment)의 치료법의 발전은 필수적이다. 저 분자량을 갖는 비-펩타이드성 저해제는 사후-노출 치료제의 개발을 위한 최상의 기회를 제공한다. 경로의 뒷부분 단계, 특히 단백질 가수분해 단계의 중단은 사후-노출 치료를 위하여 바람직하다. 이러한 화합물은 치료 조성물은 독성화 되지않은 뉴런의 세포질 속으로 침투될 수 있어야 하며, 특이성 있게 작용하여야 한다.
본 발명은 프로테아제 및 프로테아제 저해제의 동정을 위한 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 적어도 2개의 구성성분을 갖는다. 제1 구성성분은 적어도 하나의 결합부위, 전사 프로모터, 유도성 프로모터 영역, 및 적어도 하나의 리포터 유전자를 갖고, 이들은 전사 활성 물질과 기능적으로 조정하여 리포터 유전자의 발현을 위해 기능적으로 연결된 리포터 구조체(construct)이다. 제2 구성성분은 핵산 결합 도메인, 적어도 하나의 프로테아제 기질 도메인, 및 적어도 하나의 유도성 프로모터를 위한 전사 활성 도메인을 포함하는 전사 활성 물질이다. 상기 시스템은 프로테아제 기질 도메인에 지시된(directed) 프로테아제 활성에 영향을 주는 물질의 검출 및 평가를 할 수 있다. 또한, 상기 시스템은 적어도 하나의 프로테아제 또는 전사 활성 물질의 프로테아제 기질 도메인을 특이적으로 절단하는 프로테아제 후보물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 두번째 바람직한 구현예는 상기 기재된 시스템을 이용하여 프로테아제 저해제를 동정하는 방법이다. 본 발명의 또 다른 구현예는 상기 기재된 시스템을 이용하여 환경적 시료에서 프로테아제의 존재를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 수많은 이점은 하기에 수반된 도면을 참조하여 당업자에게 더욱 잘 이해될 수 있다:
도 1A 및 1B는 본 발명의 하나의 구현예에 따라 제조된 세가지 구조체 및 프로테아제 존재하에 리포터의 전사 신호의 변화를 평가하기 위한 다른 분자와 함께 상기 구조체의 상호작용을 나타낸 도이다. 하나의 구조체는 전사 활성 물질("TA")을 제공한다. 상기 TA 물질은 결합도메인("BD"), 프로테아제 기질("PS") 도메인 및 전사 활성 도메인("AD)을 포함한다. 두번째 구조체는 프로테아제 구조체("PC")이다. 상기 PC는 프로모터, 조절 서열, 예를들어 TetO, 및 프로테아제 서열을 포함하는데, 상기 단백질 가수분해 활성은 TA의 PC 부분을 절단한다. 세번째 구조체는 리포터 구조체("RC")이다. 상기 RC의 하나의 바람직한 구현예는 전사 프로모터 영역 및 리포터 유전자를 포함한다. 상기 전사 프로모터 영역은 적어도 두개의 요소를 포함한다: TA 물질의 BD 도메인에 기능적으로 대응하는 적어도 하나의 결합 부위("BS") 서열 및 적어도 하나의 TATA 박스 서열을 갖는 최소(minimal) 프로모터 영역. 이 도면에 도시된 시스템은 PC의 프로테아제가 PS를 절단하는 경우 전사가 중단되고 신호가 감소하기 때문에, 클리브 오프("cleave off") 시스템이라고 부른다.
도 2A 및 2B는 도 1A 및 1B에 일반적으로 기재된 세 가지 구조체를 개략적으로 나타낸 도이며, 예증/예시를 위해 TA 물질의 부분으로써 도시된 도메인은 Gal4 오페론에 대한 전사 인자로부터 유래된 BD이고, 상기 PS는 VAMP2(아미노산 25-94) 또는 SNAP25(아미노산 104-206)이고, 상기 AD는 핵 인자(nuclear factor) кB("NFΚB/AD")이다. 도 1B에서 RC의 부분으로써 도시된 요소는 TA 물질의 Gal4 BD에 대응하는 적어도 하나의 BS로 이루어진 프로모터 및 TATA 박스를 포함하는 최소 아데노바이러스 프로모터 영역이다(E.D. Lewis, J.L.Manley, Mol. Cell Biol. 5:2433-2442(1985)). 상기 PC는 발현의 조절을 위한 TetO 서열을 갖는 CMV 포로모터 및 BoNT/A 경쇄의 발현을 위한 SBP-CFP-BoNT/LC-A 서열을 포함한다. 다른 구조체는 보툴리눔 독소 또는 TA 물질의 PS부분을 절단하는 프로테아제의 경쇄를 포함할 수 있다.
도 3A 및 3B는 TA 물질의 BD 및 AD가 PS의 말단에 부착되는 본 발명의 하나의 구현예에 따른 시스템을 개략적으로 나타낸 도이다. PS가 막에 위치하거나 세포의 핵 밖에 있다. 프로테아제가 시스템에 부가된 경우, PS를 절단하여 BD-AD 쌍을 방출하고, 리포터 유전자("RG")의 전사를 향상시킨다. 이런 시스템을 "클리브 온(cleave on)" 시스템이라 한다.
도 4a는 PS가 VAMP-2인 "클리브 온" 시스템의 개요도이고, 도 4b는 PS가 SNAP-25인 "클리브 온"의 개요도이다.
도 5는 최소 프로모터의 누출을 조절하는 추가적인 요소를 갖는 RC 및 TA 물질의 개요도이다. 추가적인 요소는 적어도 하나의 전사 조절자의 사본이고, 하나의 바람직한 구현예에서 전사 조절자는 TetO 프로모터 영역(5`-tccctatcagtgatagagatc-3`)이다. 특히, 도시된 구현예에서 구조체는 TetO 프로모터 서열의 4개의 사본을 이용한다.
도 6은 안정적으로 통합된 RCs의 테트라사이클린의 존재 유무하에 바이오발광 비율을 나타내는 실험 결과의 막대 그래프이다.
도 7은 TA 물질이 존재에 안정적 리포터의 테트라사이클린의 존재 유무하에 바이오발광 비율을 나타내는 실험 결과의 막대 그래프이다.
도 8은 테트라사이클린의 존재 유무하에 제시된 BD-VAMP-NFкB TA 물질 및 리포터 구조체를 포함하는 세포의 마이크로플레이트 세포 기반 분석(microplate cell-based assay)의 결과를 나타낸다.
도 9는 YFP(Venus) 및 GLuc 발현에 대한 제시된 TA 물질의 효과를 나타내는 본 발명의 하나의 바람직한 구현예에 따른 바이오발광 분석이다.
도 10은 안정적 BoNT/LC-B 지시자(indicator) 세포주의 평가를 나타내는 실험결과의 막대 그래프이다.
도 11은 TA 물질 구조체의 기능 실험의 바이오발광 결과의 그림 및 막대 그래프이다.
도 12는 클리브 오프 지시 시스템(indicator system)의 유효성을 나타내는 막대 그래프이다.
도 13은 안정적 세포주에서 클리브 온 시스템의 유효성을 나타내는 막대 그래프이다.
상기 요약된 본 발명은 다음 설명을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다. 상기 설명은 수반된 청구항 및 도면과 함께 읽어야 한다. 구현예들의 설명은 당업자가 발명을 제조하고 사용할 수 있도록 기술되었고, 이의 특정 실시예를 사용하나, 발명이 이에 한정되지 않는다. 당업자는 본 발명을 실시하기 위하여 대안, 요소, 방법 및 시스템을 변형 또는 설계를 기준으로 개시된 특별한 구현예 및 개념을 쉽게 이용할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 하나의 구현예는 신규한 프로테아제 저해제의 동정 및 프로테아제 활성 평가를 위한 세포 기반 시스템을 제공한다. 시스템의 구성성분은 다수의 구조체를 포함한다. 도 1 내지 도 5에 나타난 바와 같이, 세 개의 구조체는 시스템의 일부를 형성한다: 전사 활성 물질("TA"; 때때로 본 명세서에서 트랜스활성자(transactivator) 구조체로도 언급됨), 리포터 구조체("RC"), 및 프로테아제 구조체("PC"). 세가지 구조체는 프로테아제 평가 시스템의 두가지 유형에서 이용될 수 있다. 도 1 및 2에 나타난 바와 같이, "클리브 오프" 시스템에서 PC의 산물은 TA를 불활성화시키고, RC의 산물의 전사를 감소시킨다. 도 3 및 4에 나타난 바와 같이, "클리브 온" 시스템에서 RC의 리포터로부터 전사를 활성화 시키고 신호를 향상시키는 PC의 산물은 TA 물질의 활성 부분을 방출한다.
TA 물질은 세가지 요소를 포함하는 키메릭 단백질 분자를 발현하도록 제작되었다: DNA 결합 도메인("BD"), 적어도 하나의 프로테아제에 대한 절단 부위를 포함하는 프로테아제 기질 도메인(protease substrate domain;"PS"), 및 전사 활성 도메인("AD"). 본 발명의 하나의 바람직한 구현예에서, 도 1 및 2에 기재된 바와 같이, TA 물질은 BD 및 전사 활성 도메인 AD가 PS의 반대편에 있도록 설계되었다. 본 발명의 다른 구현예에서, 도 3 및 4에 나타난 바와 같이 PS는 TA 물질의 BD-AD 요소의 하나의 말단에 존재한다. 시스템이 "클리브 온" 또는 "클리브 오프" 시스템인지 여부는 TA 물질 내 PS의 위치에 의존한다.
하나의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 TA 물질은 SNAP-25 또는 VAMP-2와 같은 보툴리눔 독소의 기질을 이용한다. 이러한 구조체들에서 SNAP-25 및 VAMP-2의 선별된 도메인은 절단 활성을 갖는데 충분하다. 따라서, 일반적으로 각각의 기질을 절단하는 BoNT 프로테아제에 관한 각각의 단백질의 프로테아제 기질 도메인을 감싸는데 충분한 도메인이 제공된다. 더욱 바람직하게는, 제공된 PS 도메인은 적어도 엑소톡신(exotoxin) PS 부위를 감싸기에 충분히 크다(M.A.Breidenbach and A.T.B. TREND in Molecular Medicine 11:376-381(2005)). VAMP-2의 경우, PS 도메인은 VAMP-2의 아미노산 25-94을 포함한다(Cornille F, Martin L, et al.J Biol Chem. 272:3459-64(1997); Sikorra S, Henke T, et al. J Biol Chem. 283:21145-52(2008)). SNAP-25의 경우, 도메인은 SNAP-25의 아미노산 104-206을 포함한다(S. Chen and J.T.Barbieri, Journal of Biological Chemistry 281:10906-10911(2006)). 하나의 바람직한 구현예에서, AD 구조체의 서열은 BD-SNAP-25-NFкB 또는 BD-VAMP-NFкB이다. 이용된 VAMP-2 및 SNAP-25 단편은 이들의 팔미토화된(palmitoylated) 잔기가 결여되어, TA 물질이 플라스마 막 또는 세포 운반체로 각각 위치되는 것을 방지한다.
PC는 TA 물질내 프로테아제 기질("PS")을 인식하는 프로테아제를 포함한다. 도 1 내지 도 5에서 나타난 바와 같이, PC는 TA 및 RC를 포함하는 숙주세포에서 발현될 수 있고, 프로테아제를 발현하는 벡터일 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 하기의 실시예 3에 기재된 바와 같이, 프로테아제는 벡터에서 발현된다. 대안적인 구현예에서, PC는 프로테아제 또는 TA 및 RC를 발현하는 세포에 도입된 프로테아제 유사 분자일 수 있다. PC의 프로테아제는 TA 물질의 PS 도메인을 절단한다. 하나의 구현예에 따르면, TA 물질의 AD는 BD에 의해 RC의 프로모터 주변에 위치하여, 도 1 및 2에 나타난 바와 같이, RC의 BS로부터 전사적으로 다운스트림(downstream)에 위치하는 리포터의 전사를 촉진시킨다. PC가 활성화되는 경우, 또는 숙주 시스템에 존재하는 경우, 도 1B 및 도 2B에 나타난 바와 같이, 프로테아제의 단백질 가수분해 활성은 불활성화되도록 작용하고 AD로부터 BD를 분리함으로써 전사 인헨서로서 TA 물질을 비효율적으로 만든다. 바람직한 구현예에서, 프로테아제는 BoNT A, C 및 E 중에서 선택되고, PS는 SNAP-25이다. 대안적인 바람직한 구현예에서, 프로테아제는 BoNT B, D, F 및 G 중에서 선택되고, PS는 VAMP-2이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, BoNT 는 혈청형 C이고 PS는 신택신1a(syntaxin1a; Genbank:AAK54507.2)이다. 하나의 구현예에서, TA는 이의 C-말단 트랜스막(transmembrane) 도메인(BD-syntaxin1a(1에서 265)-AD)이 없는 신택신1a의 도메인을 포함할 수 있다. 프로테아제 기질은 어느 공지된 프로테아제 기질일 수 있다. 또한, 다양한 프로테아제가 이용 가능하다는 것을 예상할 수 있다. 상기 다양한 프로테아제에는 탄저병(anthrax) 프로테아제, 카스파제(caspases), 알파 바이러스 NSP2 프로테아제, HIV 프로세싱 프로테아제, 수모 프로세싱 프로테아제(Sumo processing protease), 유비퀴틴 프로세싱 프로테아제, ISG15 프로세싱 프로테아제, 자식자용(autophagy) 관련된 ATG4 유사 프로세싱 프로테아제 및 C형 간염 프로세싱 프로테아제를 포함한다.
다른 구현예에 따르면, 도 3B 및 도 4B에 나타난 바와 같이, PS 도메인의 절단은 리포터 유전자의 발현을 향상시킨다("클리브-온" 효과). 만일 절단이 기능적으로 연결된 BD 및 AD 요소들을 포함하는 단위(unit)를 방출한다면, 전사는 향상된다. 도 3B 및 4B에서 나타난 바와 같이, BD 및 AD로 이루어진 TA 물질은 프로테아제 기질(PS) 도메인의 팔미토화된 잔기에 의하여 핵 밖에 위치할 수 있다. 더욱 바람직한 구현예에서, BD-AD 쌍은 PC의 프로테아제가 BD-AD 구조체를 방출시킬때까지BD-AD 구조체가 세포의 핵 밖에 위치하도록 하는 다른 분자에 부착될 수 있고, 핵으로 이송한 다음, 리포터 유전자의 전사를 향상시킨다. 이러한 배열에서, 프로테아제 기질 도메인은 세포내 플라스마 막 또는 다른 소포막(vesicular membrane)에 부착될 수 있다. 프로테아제 절단 부위는 BD-AD 및 PS의 핵-밖 고정(extra-nuclear anchoring) 부위로 이루어진 TA에 위치된다. 따라서, 프로테아제에 의하여 PS가 절단되는 경우, BD-AD는 핵으로 들어가서, 프로테아제의 존재의 신호를 주는 지시자의 전사를 향상시킨다. 본 발명의 다른 구현예에서, PC 내 프로테아제의 발현은 조절된다. 예를들어, 적당한 조건이 존재하지 않는다면 TetO 조절 요소는 프로테아제의 발현을 방지하는 프로테아제 유전자의 업스트림(upstream)을 포함할 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 테트라사이클린가 존재하지 않는 경우 프로테아제의 발현을 억제하는 TetO 작동자(operator)가 이용된다. 당업자에게 알려진 다른 조절 기작이 숙주세포 내 프로테아제의 발현 조절에 적당할 것이라는 점이 고려된다.
RC는 핵산 기반의 구조체이다. 바람직하게는, TA 물질 및/또는 PC도 각각 트랜스-활성 분자(trans-activator molecule) 및 프로테아제를 발현하는 핵산 기반의 구조체이다. 그러나, 당업자는 TA 및/또는 PC가 기능적 포유류 세포에 미리-제조된(pre-made) 단백질로서 제공될 수 있는 것을 인식할 것이다. 마찬가지로, 당업자는 다른 배경의 세 가지 구조체 시스템의 적용을 이해할 수 있으며, 예를 들어 무세포 시스템(cell-free system)에서, TA 물질 및 PC 모두 또는 각각은 단백질 또는 핵산으로서 제공될 수 있고, 세 가지 구조체는 막 등에 고정될 수 있다. 하기의 설명에서, 바람직한 구현예에서, 구조체 각각은 포유류 세포, 바람직하게는 인간세포에 도입된 형질전환 유전 구조체이다.
도 1 내지 4에 나타난 바와 같이, RC는 TA 물질의 BD에 의하여 인식된 하나이상의 BS, TATA 박스를 포함하는 프로모터 서열 및 적어도 하나의 리포터 유전자를 가진다. 상기 TA 물질의 BD 요소는 하나 이상의 BS 요소에 결합한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, Gal4 BD는 TA 물질에 사용되고, 상응하는 Gal4 BS는 RC에 사용된다. 다른 바람직한 구현예에서, LexA BD 및 상응하는 BS 서열이 사용된다. 유사하게, B42 산성 방울 도메인(B42 acidic blob domain), VP16 산성 활성(acidic activity), 및 p53 산성 활성 도메인(acidic activation domain)과 같은 트랜스활성자들로부터 다른 활성 도메인을 이용할 수 있다(J Estojak, R. Brent, E.A.Golemis Molecular and Cellular Biology 15:5820-5829(1995); 및 H.Lee, K Hun Mok et al. JBC 275:29426-29423(2000)). 하나의 바람직한 구현예에서, IPR은 아미노산 1 내지 148에 위치한 Gal4 인식 DNA 결합 서열의 5개 사본을 가진다. 다른 결합 도메인 인식 서열의 다수의 사본이 이용될 수 있다는 점이 고려될 수 있다. 예를들어, LexA 결합 도메인 서열(BD). 결합 부위는 일반적으로 TATA 박스의 10 내지 500bp 업스트림에 위치한다.
바람직한 구현예에서, BS 및 프로모터 서열은, 최소 프로모터로부터 최소한 단독 및 업스트림으로 기능하는 최소 프로모터 TATA 박스(minimal promoter TATA box)인 제 1 성분 및 BS에 결합한 온전한 TA 물질의 존재하에 두 부분의 프로모터로부터 전사를 상당히 증가시키는 적어도 하나의 BS인 제 2 성분을 갖는 필수적으로 두 부분인 유도성 프로모터 영역("IPR")을 구성한다. 바람직한 구현예에서 IPR은 최소 아데노바이러스 프로모터 영역을 갖는다(E.D.Lewis, J.L. Manley, Mol Cell Biol 5:2433-2442(1985)). TA 물질의 BD에 의하여 인식된 BS의 몇몇 사본을 이용하는 것은 RC에 TA 물질의 더 강한 결합을 허용한다. BS의 수는 1 내지 8, 바람직하게는 약 5 개를 제공된다. 상기에 따르면, 바람직한 BD 요소, 상응하는 BS는 BD에 의하여 인식된 DNA 서열이다(K.H. Young, Biol.Reprod. 58:302-311(1998)). 이러한 배열에서, 최소 TATA 박스 프로모터 영역은 BD-AD 키메릭 단백질에 의해 제공된 경우, 추가적인 전사 활성자에 의한 BD 영역에 결합이 없어서 단지 매우 최소한의 전사를 촉진시킬 수 있을 것이다.
어떤 경우, TATA 박스와 같은 최소 프로모터로 이루어진 이분의(bipartite) 전사 조절 영역의 첫번째 요소는 BS 서열에 BD-AD를 포함하는 전사활성자의 결합이 없어서 바람직하지 않은 높은 수준의 전사 활성을 이끌 수 있다. 전사활성자에 의한 BS의 결합이 없을 경우 최소 프로모터 TATA 박스로부터 전사의 억제를 통하여 조절 수준을 더 높이기 위하여, 도 5에 나타난 바와 같이, 추가적인 테트라사이클린 조절 억제자(tetracycline regulated repressor) 또는 바람직하게는 테트라사이클린 조절 억제 요소(tetracycline regulated suppressor element)가 최소 프로모터의 다운스트림에 위치한다. 도 5에 나타난 바와 같이, 테트라사이클린이 없는 경우, TetO라 불리는 이러한 DNA 서열 요소는 테트라사이클린 리프레서 단백질(tetracycline repressor protein) 또는 테트라사이클린 서프레서 단백질(tetracycline suppressor protein)에 결합할 것이다. 테트라사이클린이 존재하는 경우, 테트리사이클린 반응 리프레서 또는 서프레서 단백질은 TetO 요소로부터 방출되고 BS 및 최소 TATA 영역을 포함하는 이분의 전사 조절 영역으로부터 전사의 억제가 완화될 것이다. 다른 조절 요소가 사용될 수 있다는 점이 고려된다.
하나의 예시적인 구현예에서, 전사 조절 영역은 프로모터 영역 및 BS 영역의 다운스트림에 위치한다(상기 프로모터영역은 TATA 박스를 포함할 수 있다). 바람직한 구현예에 따르면, 리포터 구조체의 프로모터 영역의 요소 다운스트림(element downstream)은 적어도 하나의 사본의 21-뉴클레오티드 TetO 프로모터 영역이다(N.F.K. van Poppel, J. Welagen, et al, International Journal for Parasitology 36:443-452(2006)). 바람직하게는, RC는 적어도 하나에서 약 6개의 TetO 프로모터 반복 서열, 더욱 바람직하게는 약 4개의 TetO 프로모터 반복 서열을 포함한다. RC가 tTS 유전자 산물을 포함하는 TetS 세포에 위치하는 경우, TetO 프로모터 영역 위의 전사를 차단한다. 바람직한 이러한 TetS/tTS 세포주는 HeLa 세포 주에서 유래된 것, 예를들어 Clontech로부터의 세포주이다: HEK 293 tTS, Catalog #631146; 또는 HeLa 293 tTS, Catalog # 631147. 테트라사이클린을 가하면, TetO 프로모터는 tTS에 의해 결합하지 않는다. 본 발명의 하나의 바람직한 구현예에서, 리포터 구조체는 프로테아제 활성을 평가하는 방법의 효율성을 향상시키는 추가적인 구성을 포함한다. 적당한 조건이 존재하지 않는다면, 이러한 성분은 리포터 산물의 전사를 억제하는데 사용되는 전사 침묵(silencing) 또는 저해(inhibition) 서열로 이루어진다. 예를들어, 도 5에 나타난 바와 같이, Tet 오페론(TetO)의 여러 사본들은 프로모터의 다운-스트림에 위치한다(N.F.J. van Poppel, J. Welagen, et al. International Journal for Parasitology. 36:443-452(2006)). 만일 RC가 전사 침묵자(silencer) tTS를 발현하는 세포주에 도입되는 경우, 리포터의 전사가 억제될 것이다. 테트라사이클린의 추가는 TetO의 결합으로부터 tTS를 제거할 것이고, 프로모터는 매우 활성화될 것이다. 당업자는 다른 유사한 전사 저해제가 이용될 수 있다는 것을 인식할 수 있을 것이다. 더 많은 수의 저해제가 영역에 더 단단히 결합됨에 따라, TetO의 사본 수의 증가는 직접적으로 리포터의 전사 수준에 관련있다고 생각된다.
TA 물질의 AD 요소(상기 기재된 바람직한 구현예에 따르면, AD는 NFкB이다)는 전사를 촉진시키기 위해 자유롭다. 이러한 추가적인 조절 수준은 단단히 조절된 시스템을 허용한다. 예를들어, 테트라사이클린이 없는 경우, 리포터 유전자 산물이 존재하지 않고, 발현은 특별하게 "리키(leaky)"되지 않는다. TA의 발현이 없는 경우 또는 BD-NFкB 키메라의 방출이 없는 경우, 배경 전사 수준을 측정할 수 있다.
상기 요소들을 포함하는 IPR은 하나 이상의 리포터 유전자의 업스트림에 위치하고, 전사를 조절한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 리포터는 프로테아제 활성을 측정하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 두 개의 다른 형광 분자 서열을 포함할 수 있다. 형광 리포터 및 항생제 내성 서열과 같은 다른 리포터 커플들도 이용될 수 있다. 상기 두 개의 서열은 별개의 분자로서 번역될 수 있고, 키메릭 산물을 생성할 수도 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 두 개의 리포터는 단일 번역 산물의 일부일 수 있다. 더욱 바람직한 구현예에서, 두 개의 리포터 분자들은 절단될 수 있는 링커(linker)에 의하여 분리된다. 도 2 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 하나의 예는 비너스(Venus) 유전자 산물이 가우시아 루시퍼라제 유전자(Gaussia luciferase gene; GLuc) 산물에 융합되고, 두 개의 리포터 단백질들은 구제역 바이러스(foot and mouth disease virus;FAMV)의 "자가-절단(self-cleavage)" 펩타이드 2A 서열에 의하여 연결된다(M.D. Ryan and J. Drew, foot-and-mouth disease virus 2A oligopeptide mediated cleavage of an artificial polyprotein, The EMBO Journal 13:928-933(1994)). 당업자는 다른 자가-절단 펩타이드들이 두개의 리포터를 연결하는데 사용될 수 있거나 또는 두 개의 리포터들이 두 개의 단백질 산물로 분리될 필요 없이 융합 단백질 산물의 일부로서 활성일 수있다는 것을 인식할 것이다. 상기 2A 절단 부위는 배지 안에서 분비된 GLuC 활성을 생성하게 하고 비너스(VENUS) 발현으로부터 세포가 형광화 되게 한다. 두 개의 리포터 유전자의 포함은 플레이트 리더(plate readrs)에서 바이오발광의 검출 및 현미경으로 비너스(Venus) YFP 생성에 대한 세포의 즉각적인 실험을 허용하게 한다. GLuc 산물이 세포가 자라는 배지로 방출되기 때문에, GLuc 리포터의 과-발현은 당업자에 의해 인식된 방법으로 쉽게 측정될 수 있다. 하나의 전사체(하나의 프로모터로부터 발현된 하나의 RNA)로부터 두 개의 단백질을 발현하는 대안 방법은 IRES(Internal Ribosome Entrance Site)를 두개의 유전자 사이에 삽입하는 것이다(Yury A. Bochkov and Ann C. Palmenberg BioTechnique 41:283-292(2006)).
시스템은 in vivo에서 TA 물질의 PS를 특이적으로 인식하는 프로테아제의 활성을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 구조체가 RC를 포함하는 발현되는 경우, 리포터 산물의 발현 수준은 키메릭 BD-AD 산물의 존재를 나타내고, 이는 동일한 세포에서 프로테아제의 활성의 기능이다.
프로테아제 기질이 트랜스-막(membrane) 성분들을 포함하는 경우, BD-AD 성분의 효과를 약화시킨다. 예를들어, 야생형의 보툴리눔 신경독소 프로테아제 기질은 단백질이 소포막에 단백질을 배치하는 팔미토화된 잔기를 포함한다(Lane, S.R. and Y.C.Liu. Journal of Neurochemistry 69:1864-1869(1997)). 그 결과, 상기 기재된 BD-PS-AD 구조체에 이용된 PS는 기질의 팔미토화된 잔기를 배제한다. 세포막에 배치하는 것은 구조체로부터 팔미토화된 잔기를 제거함으로써 간단하게 피할 수 있다. 당업자는 어떤 구현예에서, 구조체로부터 팔미토화된 잔기를 배제하는 대신구조체를 잔기들의 팔미토화를 방지하고 소포막에 구조체가 위치하는 것을 방지하도록 제작할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
그러나, 본 발명의 바람직한 대안 구현예에서 팔미토화 및 이로 인한 세포막에 위치화(localization)도 이용할 수 있다. 이러한 구현예에서, 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 팔미토화된 프로테아제 기질은 전사 인헨서 도메인에 부착될 수 있다. 이러한 배열는 BD-AD 및 AD-BD의 순서가 호환 가능한 BD-AD-PS 또는 AD-BD-PS로 하기에 기재된다. 대안적으로, 프로테아제 기질은 PS-BD-AD 배열을 갖는 전사 인헨서 요소에 부착될 수 있다. 이러한 바람직한 구현예의 예에서, 보톨리눔 신경독소의 기질은 도 4a(BD-NFкB-VAMP) 및 도 4b(SNAP-25-BD-NFкB)에 나타난 바와 같이 제공되며, 바람직한 구현예로서, BD는 Gal4 결합 도메인이다. 다른 바람직한 구현예에서, BD-AD 도메인을 갖는 전장 신택신1a(syntaxin1a)는 신택신1a N-말단에 융합된다. 신택신1a의 C-말단 트랜스막(transmembrane) 도메인은 BD-AD-신택신1a 전장 분자를 시냅스 전 말단(presynaptic terminal)에 고정(anchor)시킨다.
클리브-온 BoNT/A 절단 분석의 잠재적 한계로 인하여, 본 발명의 별개의 구현예를 표시하는 하나의 잠재적인 해결책은, 전체 융합 분자 BD-AD-SNAP25(104 내지 206)-신택신1a 전장(1-288)을 고정하기 위해, 신택신 1a의 전장 분자에 더 융합된 SNAP25 아미노산 104-206(SNAP25에 존재하는 팔미토화된 시스테인 잔기가 없는, 아미노산 95 내지 103), BD-AD 도메인은 프로테아제 기질 PS와 융합될 수 있다. 이러한 배열은 BoNT/A의 경우 SNAP25 전장(1-206)-BD-AD 클리브 온 시스템의 잠재적 한계를 처리할 뿐 아니라 BD-AD-SNAP25(104 내지 206)-신택신1a 전장(1-288)은 SNAP 25에서 SNAP-25 및 신택신1a 분자들의 절단으로 인한 BoNT/C1 및 BoNT/E를 위한 클리브-온 지시자로서 기능할 것이다. BD-AD-SNAP25 분자를 시냅스 전 막에 고정시키기 위하여 신택신1a를 사용하는 것에 대한 잠재적인 이점이 존재한다. 주요 이점은 SNAP25와 동등하게 시냅스 전 막에 표적화(targeting) 및 위치화(localization)되는 신택신1a가 SNAP25 기질의 올바른 위치화를 제공한다. 추가적으로 BoNT/A LC는 프로테아제 기질 및 BD-AD-SNAP25(104 내지 206)-신택신1a 전장(1-328)을 허용하는 신택신1의 트래픽킹(trafficking)과 유사하게 시냅스전 막에 트랙픽킹된다. 본 발명의 다른 구현예에서, TA 물질은 BD-AD-SNAP25(104-206)-VAMP-2 구조체이다. BD-AD-SNAP25(104-206)-VAMP-2 구조체는 필수적으로 모든 BoNT 혈청형의 분석으로서 이용될 수 있는 일반적인 보툴리눔 프로테아제 시스템이다(BoNT/A, C1 및 E는 SNPA-25를 절단하고, BoNT/B,D,F 및 G는 VAMP-2를 절단한다).
RC의 리포터 서열은 형광 단백질, 바이오발광 단백질 또는 유전자가 발현하는 경우 신호의 양을 측정할 수 있는 어느 다른 단백질 서열에 상응할 수 있다. 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein;YFP), 녹색 형광 단백질(GFP), 청록색 형광 단백질(cyan fluorescent protein; CFP); 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein;BFP), 적색 형광 단백질(RFP) 및 이의 형광 돌연 변이체가 이용될 수 있다는 것이 고려된다. 또한, 가우시아 루시퍼라제(Gaussia luciferase), 레닐라 루시퍼라제(renilla luciferase), 방아벌레(click beetle) 및 반딧불 루시퍼라제와 같은 바이오발광 단백질을 사용하여 리포터 벡터의 활성을 정량화할 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 리포터 서열은 비너스(Venus) 황색 형광 단백질로 이루어질수 있다(Nagai T., Ibata K., Park E.S., et al. Nature Biotechnol 20:87-90(2002)).
상기 기재된 하나 이상의 구조체를 포함하는 유전적으로 조작된 세포주를 제조하기 위하여 시스템을 이용할 수 있다. 상기 구조체는 특별한 종류의 세포에서 발현하도록 하나 이상의 벡터에 포함시킬 수 있다. 상기 구조체는 안정적으로 세포에 통합될 수 있고, 또는 형질전환 벡터들에 존재할 수 있다. 상기의 방법 및 벡터는 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 세포로 형질감염 및 형질도입에 사용된 방법론은 당해 분야에서 잘 알려져 있다(Laura Bonetta, The Inside scoop-Evaluating Gene Delivery Methods, Nature Methods 2:875-883(2005)). 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 구조체는 렌티 바이러스 벡터를 통하여 통합된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 렌티 바이러스 벡터는 자가-비활성화("SIN", self-Inactivated) 렌티 바이러스 벡터이다. 당업자는 구조체가 포함되어있는 세포를 구조체가 포함되지 않은 세포를 구분하기 위하여 항생제 내성 마커와 같은 다른 선택 마커를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 유전적으로 조작된 세포주의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법의 첫번째 단계에서, 293-tTS 세포와 같은 진핵세포는 5개의 사본의 Gal4 BS에 의하여 조절된 최소 프로모터로부터 발현된 조절된 리포터 유전자를 포함하는 RC를 포함하는 벡터로 형질도입된다. 다른 바람직한 구현예에서, 합성 테트라사이클린 작동자의 4개의 사본들도 상기 기재된 바와 같이 포함된다("G5TO4 프로모터")
시스템을 사용하여 보툴리눔 신경독소와 같은 특정 프로테아제의 활성을 측정한다. 첫번째 단계에서, Gal5/TO4 프로모터 및 비너스 및 GLuc 유전자를 갖는 RC를 포함하는 렌티 바이러스 벡터는 포유류 293-Ts 세포에 형질감염된다. 그 다음, 상기 세포를 BD-SNAP-25-AD 구조체 또는 BD-VAMP-2-AD 구조체를 포함하는 렌티 바이러스 벡터를 형질감염시킨다. 구조체는 안정하게 통합된다(integrated). 다양한 보툴리눔 신경독소 프로테아제의 활성을 평가하기 위하여, 상기 세포주를 BoNT/LC-B를 인코딩하는 유전자 구조체를 더 포함하도록 제조하여 최종 리포터 세포주(final repoter cell line)를 만들 수 있다. 이러한 최종 세포 균주(strains)에서, BoNT/NC의 발현은 SNAP-25 또는 VAMP-기반 트랜스활성자 융합 단백질을 절단하여 D활성 도메인으로부터 DNA 결합 도메인을 분리시키고, 결과적으로, 세포는 비너스 및 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하지 못한다. 대안적으로, 프로테아제는 세포에 형질도입될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 다른 프로테아제-기질 또는 결합 도메인-결합 부위 커플의 활성을 동정하기 위하여 동일한 방법이 사용될 수 있다.
RC, TA 물질, 및 PC를 포함하는 리포터 세포주는 프로테아제 저해제를 동정하기 위하여 이용될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 보툴리눔 신경독소 저해제와 같은 프로테아제 저해제의 고속 대량 스크리닝(high throughput screening)을 위하여 세포주가 사용될 수 있다. 온전한 상태에서, 키메릭 전사 인자는 G5 또는 G5TO4 프로모터를 활성화시켜 Venus 및 GLuc 리포터 유전자를 발현하게 하고, 보툴리눔 신경독소 경쇄에 의하여 절단되는 경우, 리포터 유전자는 발현하지 않는다. 이전에 기재된 바와 같이, 이런 시스템은 "클리브 오프" 시스템이라고 칭하고, BoNT의 저해가 리포터 신호("신호 이득(gain-of-signal)" 분석)를 증가시키기 때문에, 긍정 오류(false positives)가 검출되는 빈도 수를 감소시켜 소 분자 BoNT/LC 저해제 스크리닝에 이상적이다. BoNT/LC 저해제의 존새 시, 전사 인자는 더 이상 절단되지 않고, 비너스 및 GLuc 지시자의 발현을 회복시킨다.
상기 세포주는 시스템이 잠재적인 저해제에 노출되는 고속 대량 스크리닝 분석에 사용된다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 시스템은 이용가능한 화학 라이브러리에 존재하는 저해제의 동정 또는 특정 관심 분자의 시험에 사용될 수 있다. 라이브러리를 이용하는 하나의 방법은 실시예 4 내지 6에서 논의된다.
본 발명의 하나의 구현예는 세포, 신호 이득(gain-of-signal), 바이오발광, 리포터 스크린을 제시한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 세포 기반 리포터 HTS를 통하여 BoNT/A LC 및 BoNT/B LC와 같은 신경독소의 엔도펩티다제 저해제를 동정한다. 이러한 엔도펩티다제 저해제는 신경독소를 저해하는 BoNT/A 또는 BoNT/B와 같은 소 분자이다. 하나의 바람직한 구현예에 따라 사용된 제작된 세포주는 낮은 기저 리포터 신호를 나타내나, 소 분자들이 BoNT/LCs의 펩티다제 활성을 저해할 때, 더욱더 높은 증폭된 빛 신호를 생성한다(>10X). 이런 방법은 세포에서 SNAP-25, VAMP-2, 신택신1a 및 다른 신경독소와 상호작용하는 BoNT/LC에 대한 활성이 있는 저해제를 동정하는 방법을 제공한다. 각각의 세포 기반의 BoNT/LC 또는 HTS 스크리닝 분석은 다른 분석을 위한 편리한 카운터(counter) 스크린을 제공한다. 마찬가지로, 클리브 온 및 클리브 오프 분석을 순차적으로 이용하는 것은 카운터 스크리닝 분석으로서 제공할 수 있다. 이러한 카운터 스크린 분석의 목적은 예를들어, 일반적인 독성 현상에 반대하는 본 발명에 따른 작용 메카니즘을 결정하기 위한 것이다. 시스템의 이러한 시험은 세포독성 분석 또는 절단된 전사 활성 분자의 결정을 포함하고, 그리고 빠르게 양성 오류를 제거하고 빠르게 많이 선별되고 비-독성 신경독소 저해제를 동정한다. 양성 오류 스크리닝의 하나의 방법은 리포터 분자의 발현에 영향을 주는 것으로 보이는 시스템에서 전사 활성 분자의 분석을 포함한다. 양성 오류를 위한 스크린은(예를들어, TA 분자의 방출 또는 분해와 관련되지 않은 어떤 기작에 의하여 작용되는 저해제), 예를들어, 분리 칼럼(separation column) 및 TA 분자를 인식하는 항체에 의한 TA 분자의 크기 분석에 의존한다. 그러므로, 본 발명의 하나의 구현예는 세포 기반 HTS를 통하여 뉴런에서 SNAP-25, VAMP-2, 신택신1a와 같은 이의 기질의 신경독소 절단을 저해하는 "drug-like" 소 분자의 동정 방법을 제공한다.
화합물들이 반드시 세포 내 환경에 도달하고 BoNT/A 또는 BoNT/B와 같은 신경독소가 SNAP-25, VAMP-2, 신택신1a와 같은 이의 기질이 시토졸(cytosol)에서 절단 되는 것을 저해하기 때문에, 본 명세서에 기재된 세포-기반 스크리닝 방법은 어떤 in vitro 효소 스크린(enzymatic screen)에 대해 상당한 이점을 제공한다. 그러므로, 독소 및 이의 기질 모두 임상(clinical), in vivo 환경에 있다. 독소의 기능은 무 세포 효소적 활성(cell free enzymatic activity)과 대조적으로 세포안에서 매우 다를 수 있다. 70-100 아미노산 잔기의 큰 기질 단편의 사용은 이러한 세포 기반 분석에서 중요한 이점 중 하나이다. 활성 부위가 엑소사이트(exosite)보다 더 큰 단백질을 감쌀 수 있기 때문에, 일반적으로 엑소사이트로 간주되지 않는 부위에 절단의 검출을 허용한다.
본 명세서에 기재된 방법 및 시스템은 치료에 최적화를 위하여 보툴리눔 신경독소 A 및 B와 같은 다양한 신경독소의 저해제를 검출하고 우선적으로 처리하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 다양한 화합물의 라이브러리에 BoNT/A 및 BoNT/B와 같은 신경독소의 저해제의 포유류 세포-기반 주요(primary)리포터 스크린을 제조하고(construct), 입증하고(validate), 및 적용하는데 더 사용될 수 있다. 히트(Hits)는 3중의 재-분석(re-assay)으로 재확인할 수 있고, 양성 오류는 다수의 BoNT-기반 분석 또는 서로에 대해 카운터-스크린으로서 비-독성 분석 및 상기 기재된 대로 다른 방법을 이용함으로써 제거할 수 있다. 이 출원에 개시된 방법은 세포(cellular), 신호 이득, 리포터 스크린을 더 제공한다. 이러한 스크린을 화합물의 라이브러리와 후속으로 이차 검증(secondary validation)방법으로써 생화학적 분석에 적용하여 잠재적인 저해제를 동정할 수 있다. 검증된 유효물질(Validated hits)은 이들이 in vitro 및 신경 세포 모델 시스템 모두에서 보툴리눔 신경독소들에 특이적으로 작용하고, 최소 세포 독성을 나타내는 것을 확인하기 위하여 완전히 특징지워질 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 명세서에 기재된 시스템 및 방법은 BoNT 유발 중독(poisoning)의 치료를 위해 매우 강력한 소 분자 저해제의 동정 및 개발을 제공한다. 소 분자 BoNT LC 저해제는 뉴런에 침투할 수 있고 사전(pre) 및 사후(post)-독소 노출 모두의 보호를 제공할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 명세서에 기재된 시스템 및 방법은 병원성 상태(pathogenic state)를 유발하는데 중요할 수 있는 다른 프로테아제 기질 쌍(pair)에 대한 소 분자 저해제의 동정에(identification)사용될 수 있다. 이러한 프로테아제 기질 쌍은 탄저 치사 인자(anthrax lethal factor), 카스파제(caspases), 유비퀴틴 프로테아제, 수모 프로테아제(sumo protease), 유비퀴틴-유사 분자 프로세싱 프로테아제(ubiquitin-like molecule processing protease), ATG4와 같은 자식작용 관련 프로세싱 프로테아제(autophagy related processing protease), 알파 바이러스 NSPS와 같은 바이러스 인코딩된 프로테아제(viral encoded protease) 및 HIV 프로테아제를 포함할 수 있다.
그러나, BoNT는 프로테아제 저해제를 동정하는 시스템을 이용할 수 있는 많은 방법들 중 하나의 예이다. 당업자는 본 명세서에 기재된 구조체 및 방법이 다른 프로테아제, 이의 활성 및 이의 저해제의 평가에 이용될 수 있다는 점을 인식할 것 이다. 가능성의 범위는 거의 모든 기질 및 프로테아제 조합을 포함할 수 있는 반면에, 어떤 특정 예는 탄저 치사 아연 메탈로프로테아제(metalloprotease;LF) 및 이의 인식 기질 MAPKK, 알파 바이러스의 NSP2 프로테아제와 같은 바이러스 프로세싱 프로테아제 및 이의 인식 기질 NSP1-4, 유비퀴틴 및 유비퀴틴 유사 분자 프로세싱 프로테아제, 카스파제, 유비퀴틴 프로테아제, 수모 프로테아제, 유비퀴틴-유사 분자 프로세싱 프로테아제, ATG4와 같은 자식작용 관련 프로세싱 프로테아제, 알파 바이러스 NSP2와 같은 바이러스 인코딩된 프로테아제 및 HIV 프로테아제를 포함할 것이다. 소 분자 저해제의 스크리닝의 경우, 프로테아제가 세포에서 활성화되는 경우 신호가 억제되나, 프로테아제가 세포에서 소 분자에 의하여 저해되는 경우 세포의 신호가 증가되는 세포 기반의 시스템은 소 분자 저해제의 빠른 고속 대량 스크린이 바람직하다. 이러한 선호도는 "포지티브 히트"(positive hit)의 존재 또는 활성 프로테아제 저해제 화합물의 존재시 신호의 증가가 고속 대량 스크리닝(HTS)에서 일반적으로 더욱 효과적이라는 사실 때문이다.
세포에서 프로테아제 활성의 존재를 검출하는 방법은 중요할 수 있다. 예를 들어, 만일 BoNT에 대해 대량 노출이 일어나면, 제한된 자원으로 즉각적인 치료가 요구되는 사람들과 실제 BoNT에 노출되지는 않았지만 몸이 안 좋음을 느끼는 사람('walking well'이라고 부름)들 사이를 빠르게 선별하는 것이 필요할 것이다. 유사하게 BoNT의 약학적 제제의 유효성 및 효능을 분석하는 현재의 "표준 검사(gold standard)" 또는 주요 방법은 마우스 LC50 단위의 수립을 위해 독소를 마우스에 주입하는 것을 필요로 한다. 이러한 방법은 치사 시험(lethal assay)에서 살아있는 동물을 대규모로 활용할 필요가 있다. 이러한 살아있는 동물 시험의 이용을 제한 또는 제거하는 것이 바람직할 것이다. 확실하게 BoNT의 존재를 검출하고 활성을 정량화할 수 있는 세포 기반 분석이 필요하다. 세포에서 BoNT LC 프로테아제와 같은 프로테아제의 존재를 검출하기 위한 세포 기반의 분석은 세포에서 프로테아제 존재시 지시자 신호 또는 신호들을 켜는 시스템과 함께 최적의 환경을 설정한다. 본 발명의 하나의 구현예에서, "클리브-온" 배열(BD-AD-PS)에서 TA 물질 및 RC를 발현하는 세포를 이용하여 시료에서 공지의 프로테아제의 존재를 동정할 수 있다. 이러한 구현예에서, 환경적 시료는 TA 및 RC 구조체를 포함하는 세포에 제시된다. 표적 프로테아제, 예를들어 BoNT/LC A가 존재하는 경우, 이것은 세포에 들어가서 TA에서 PS를 절단하고, AD-BD 조각을 방출하여, 차례로 RC에서 리포터 유전자의 전사를 향상시킨다.
[ 실시예 1] 포유류세포에서 pBD - NF кB의 발현
본 발명의 하나의 구현예에 따른 합성 프로모터 G5/TO4를 포함하는 RC는, 렌티 바이러스 벡터에 의해 세포에 형질감염되었다. 상기 RC를 융합된 NFĸB 활성자 융합체(pBD-NFкB)(TA물질)에 융합된 Gal4 결합 도메인을 발현하는 플라스미드와 함께 HeLa-tTS 세포에 공형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 본질적으로 테트라사이클린 전사 침묵자 tTS(Clontech)를 발현한다. 상기 세포를 6 웰 플레이트에서 대략 80%로 컨플루언스(confluence)까지 배양하였다. 형질감염 6시간 후, 1ug/ml의테트라사이클린을 실험세포의 배지에 가하였다. 대조군(control)으로 사용된 세포의 배지에는 테트라사이클린을 가하지 않았다. 가우시아 루시퍼라제 분석(Gaussia luciferase assay; GLuc assay)를 위하여 형질감염 이틀 후에 배양배지를 수집하였다(Monique Verhaegen and Theodore K. Christopoulos Anal. Chem., 74:4378-4386(2002)). 비너스(Venus) 발현을 형광현미경으로 관찰하였다. 1ug/ml의 테트라사이클린을 포함하는 배지에서 배양된 세포의 RLU(relative light unit)가 테트라사이클린을 포함하지 않고 배양된 세포의 RLU보다 16배 더 높음을 광도계(luminometer)를 이용하여 측정하였다. 추가적으로, 테트라사이클린을 포함하는 배지에서 성장한 세포들에서 비너스의 발현이 있으나, 테트라사이클린을 포함하지 않은 배지에서 성장한 세포에서 비너스의 발현이 없다. 따라서, (1)합성 프로모터 G5T04는 기능적(functional)이다. 이것은 Gal4 결합 부위에 결합하는 BD-NFкB와 같은 트랜스활성자에 의하여 크게 활성화될 수 있다. GLuc 및 YFP 발현 모두 테트라사이클린의 존재하에 크게 활성화된다; (2)GLuc 유전자는 매우 민감하고 편리한 리포터이다. 이 실험에서, 가우시아 루시퍼라제의 95 퍼센트는 배양배지로 분비되었다; 따라서, GLU의 활성을 광도계를 이용하여 배양배지로부터 직접 측정할 수 있다. 조절된 리포터 유전자 발현, 리포터 유전자 발현의 낮고 측정가능한 배경, 및 편리한 이용성에 비추어, 이 출원에 기재된 프로모터-리포터 시스템은 고속 대량 스크리닝에 유용하다.
신규한 RC는 렌티바이러스 벡터에 의해 293-tTS 세포에 도입되었다. RC를 운반하는 렌티바이러스 벡터 입자를 100mm 플레이트에서 배양된 80-90% 콘플루언트(confluent) 293FT 세포(Invitrogen) 위에서 3.5ug의 형질도입하는 플라스미드와 7.1ug HIV-1 gag-pol helper 구조체(Synaptic research) 및 2.8ug VSV-G 발현 플라스미드(Synaptic research)를 함께 공형질감염시켜 생성하였다. 싹튼(budded) 바이러스 벡터를 포함하는 배양배지는 형질감염 48시간 후에 수집하였고, 2,000RPM에서 4℃에서 10분동안 원심분리(Sorvall RT 600D)하여 세포 잔해를 세척하였다. 세척된 바이러스 상층액을 4℃에서, 90분동안, 25,000RPM에서 초 원심분리하여 더 농축하였다(Beckman Coulter OptimaTM XL-100K). 마지막으로, 바이러스 벡터 펠렛을 50ul(본래의 부피의 1/200)의 배양 배지에 하룻밤 동안 담그고, 재현탁하고, 형질도입이 요구될때 까지 -85℃에서 보관하였다. 결과로 얻은 바이러스 벡터 입자를 사용하여 테트라사이클린 전사 침묵자 tTS를 본질적으로 발현하는 293T-tTS 세포(Clontech®)에 형질도입하였다. 단일 세포 콜로니를 클로닝 링(cloning ring)에 의하여 클론하였고, 키메릭 트랜스활성자 BD-NFкB를 발현하는 pBD-NFкB 구조체로 확장된 세포(expanded cells)의 일시적인 형질감염에 의한 기능성(funtionality)을 시험하였다. 형질감염된 세포를 1ug/ml의 테트라사이클린의 존재 및 부재하에 배양하였다. 테트라사이클린을 도입하고 이틀 후, YFP 형광(비너스(Venus) 유전자 발현)을 형광 현미경을 통하여 관찰하였고, 가우시아 루시퍼라제 유전자의 발현을 광도계로 측정하였다.
우리는 25개의 클론을 분석하였고, 6개의 클론의 결과를 도 6에 나타내었다. 우리는 매우 낮은 기저 활성을 나타내는 클론 #17을 선별하였고, 테트라사이클린을 가함으로써 14배 이상이 활성화될 수 있다. 따라서, 리포터 분자들은 활성 물질에 의하여 유도되었고, 시스템은 고속 대량 스크리닝을 위한 필요한 속성을 갖는다.
[ 실시예 2] RC TA 물질을 포함하는 tTS 세포
Gal4 DNA 결합 도메인(아미노산 1-148;Gal4/BD 또는 BD) 및 NFкB 트랜스활성화 도메인(NFкB/AD 또는 AD) 사이에 샌드위치된, 적당한 BoNT 기질로 이루어진 트랜스활성자 키메릭 융합 단백질인 조절 성분의 유전자, 예를들어, BoNT/A의 경우 SNAP-25 및 BoNT/B의 경우 VAMP-2를 실시예 1에서 기재된 바와 같이, 신규한 리포터 구조체를 갖는 세포에 형질도입하였다.
[ 실시예 2A]
단백질 기질이 팔미토화된 잔기를 갖고 있지 않은 BD-PS-AD 구조체는 합성적으로 제작하였고, RC를 포함하는 세포에 도입하였다. Gal4 DNA 결합 도메인 및 NFкB 전사활성 도메인 사이에 융합된 SNAP-25(104-206 잔기)의 절단 부위 주위의 103 아미노산 잔기들 또는 VAMP-2(25-94 잔기)의 절단 부위 주위의 70 아미노산 잔기들을 인코딩하는 TA 물질을 사용하였다. 실시예 1로부터 리포터 세포주 클론 #17을 BD-VAMP-NFкB 트랜스활성자 유전자 구조체를 운반하는 렌티 바이러스 벡터로 더 형질도입하였다. 6개의 단일 세포 클론을 선별하였고, 테트라사이클린 존재 및 비존재 하에 바이오발광의 비율을 분석하였다(도 7 참조). 형질도입된 세포를 적당하게 선별하였고(G418, blasticidin, 및 puromycin), 및 리포터 및 VAMP-2 트랜스활성자 융합체 모두의 안정된 통합을 운반하는 단일-세포 클론을 수득하였다. 1ug/ml의 테트라사이클린을 배양배지에 가하였을 때, 클론 #32에서 리포터 유전자는 관례대로/반복적으로(routinely/repeatedly) 200 배 이상으로 활성화되었다.
유사한 과정을 사용하여 다른 키메릭 트랜스활성자 구조체를 포함하는 세포주를 제조하였다. 예를들어, 리포터 벡터를 포함하는 세포주를 BD-SNAP25-NFкB 또는 BD-syntaxin1a-NFкB 유전자 구조체와 함께 더 형질감염시켰다. 대안적으로, 하나이상의 전사 활성자 구조체, 다른 BoNT 기질을 포함하는 각각의 구조체를 제조하였다. 또한, 결합 도메인(BD) 및 전사활성 도메인(NFкB)은 리포터 구조체의 결합 부위가 상응하게 변화되는 한, 어느 DNA 결합 도메인 및 전사활성 도메인으로 대체될 수 있다. RC 및 TA 물질을 운반하는 단일 세포 클론을 선별하였고, 이의 기능성을 클론 #32에서 기술한 바와 같이 평가하였다.
신호의 강도 및 신호: 배경 비율이 고속 대량 스크리닝에 적합한지 입증하기 위하여, 클론 #32의 기능성을 96-웰 마이크로플레이트에서 분석하였다: 3 웰 각각의 세개군의 사본(duplicate)에 낮은 (1군), 중간 (2군), 및 높은 (3군) 밀도의 세포를 접종하였다. 1ug/ml 테트라사이클린 존재 또는 비존재 시 세포를 배양하고 하루 후, 5ul의 5 배 희석된 배양배지를 이차 마이크로플레이트에 이동하여, 플레이트 리더로 발광을 측정하였다. 테트라사이클린으로 처리된 세포의 배지에서 루시퍼라제 활성이 테트라사이클린으로 처리되지 않은 세포의 배양배지로부터 관찰된 루시퍼라제 활성보다 200-배 더 높았다(도 8 참조). 상기의 결과는 세개의 군 각각의 각 멤버와 일치하였다. 또한, 테트라사이클린을 처리하지 않은 세포의 기저 활성은 매우 낮았다. 발광을 측정하였다. 발광은 테트라사이클린 및 온전한 DB-PS-TA 구조체 존재하에 트랜스활성에 의하여 200배 증가하였다(도 8 참조).
[ 실시예 2B]
도 3 및 4에 나타난 바와 같이, "클리브-온(cleave-on)" 방법은 키메릭 트랜스활성자 BD-NFкB/AD의 업스트림 또는 다운스트림 각각에 융합된 SNAP-25(104-206 잔기)의 절단 부위 주위의 103 아미노산 잔기들 또는 VAMP-2(25-94 잔기)의 절단 부위 주위의 70 아미노산 잔기를 인코딩하는 전사 활성자 구조체에 의하여 평가되었다. 보툴리눔 기질의 팔미토화된 잔기의 결과로서, SNAP-25 및 VAMP-2 단편은 막에 BD-NFкB/AD가 고정(tethering)시킨 시냅스전 세포의 플라스마 막 위에서 발현되었다. 도 9는 상기 두개의 배열을 사용하여 수행된 실험의 결과를 나타낸다.
[ 실시예 3] 안정적인 세포주에서 구조체의 추가 검증
VAMP2-기반 TA 구조체 및 PC로서 BoNT/LC-B, 및 RC를 포함하는 TetO를 이용하는 클리브 오프(cleave off) 시스템의 검증을 안정적인 세포주에서 수행하였다. 리포터 및 VAMP2 트랜스활성자 모두 안정한 통합을 운반하는 클론 #32를 사용하여 BoNT/LC-B PC의 렌티 바이러스 형질도입에 의하여 최종 유도성 지시자 세포주를 제작하였다. 지시자 시스템(RC, TA, 및 PC)의 모든 3개의 성분을 안정적으로 완전세포주(클론 #12)에 통합(incorporated)한, 시스템을 테트라사이클린을 투입하고, 48시간 후 즉시 GLuc의 발현이 감소하는 것을 측정하여 시험하였다. 매 24시간마다 배지를 신선한 배양배지로 대체하기전에 GLuc 분석을 수행하였다. RLU에 의하여 발현된 GLuc 활성을 광도계를 사용하여 측정하였고, Tet-조절된(regulated) PC로부터 BoNT/B LC의 도입 48시간 후 GLuc 신호가 대략 15배 감소됨을 나타내었다(도 10 참조). 이 결과는 RC, 클리브-오프 TA, 및 PC를 갖는 완전히 조립된(assembled) 시스템이 BoNT/B LC 저해제의 고속 대량 스크리닝에 적합하다는 것을 입증하였다. 이러한 배열(configuration)의 시스템은 LC 프로테아제의 저해와 함께 신호의 증가를 나태낼 것이다.
VAMP2 기반 TA 구조체 및 PC로서 BoNT/LC-B, 및 RC를 포함하는 TetO를 이용하는 클리브-온 시스템의 검증도 상기 기재된 동일한 과정을 이용하여 안정적인 세포주에서 수행하였다. 상기 결과는 48시간 후 GLuC 신호가 거의 40배 증가함을 보여준다(도 10). 만일 BoNT/LC-B 프로테아제의 존재를 검출하는데 더욱 적당하다면, 이러한 배열의 시스템은 LC 프로테아제의 저해와 함께 신호의 감소를 나타낼 것이다.
[ 실시예 4] 클리브 오프 시스템은 유전자의 발현을 감소시킨다
이의 기능성(functionality)를 입증하기 위하여, SNAP-25 및 VAMP-2 키메릭 전사 활성자를 자가-불활성화(SIN) 렌티 바이러스 벡터에 클론화하였고, 다양한 BoNT/LC 유전자 구조체(야생형 LC-A, 불활성 돌연변이체 LC-A, 및 야생형 LC-B)와 함께 리포터 구조체를 293T-tTS에 형질감염시켰다. 상기 세포들을 1ug/ml의 테트라사이클린으로 처리하였다. 가우시아 루시퍼라제(GLuc) 활성을 광도계로 측정하였고, 비너스 YFP 발현을 형광 현미경으로 관찰하였다. 상기 결과를 도 9에 나타내었다. 결과는 리포터가 트랜스활성자의 절단에 의해 꺼진(turned off) 것을 확인하였다. 강력한 BoNT/LC-A 저해제의 존재를 모방하는데 사용된 불활성 돌연변이 BoNT/A-LC mLC-A 및 Gal4/BD-SNAP25-NFкB/AD와 함께 공형질감염시킨 경우, 키메릭 BD-SNAP25-NFкB 트랜스활성자는 강하게 G5TO4 프로모터를 활성화시키나, Gal4/BD-SNAP25-NFкB/AD 및 야생형 BoNT/A-LC LC-A와 함께 공-형질감염시킨 경우는 G5TO4 프로모터를 활성화시키지 않는다. 플라스미드를 발현하는 BoNT/A-LC로 형질감염되는 경우, BoNT/A-LC에 의하여 절단되지 않기 때문에, 키메릭 Gal4/BD-VAMP-NFкB 트랜스활성자/AD는 GSTO4 프로모터를 전사촉진시킨다. 키메릭 전사 활성자 구조체 Gal4/BD-VAMP-NFкB/AD는 야생형 BoNT/LC-B LC-B 및 Gal4/BD-VAMP-NFкB/AD와 함께 공형질감염되는 경우 전사 인자가 절단되기 때문에, 리포터를 활성화시키지 못한다. RLU 값으로써 표현되는 가우시아 루시퍼라제 활성은 시각화되는 YFP 형광과 일치하고, 절단되지 않은 트랜스활성자 대 절단된 트랜스활성자에 대해 리포터 반응에 대한 양적 측정을 제공한다.----SNAP-25 및 VAMP 트랜스활성자 시스템에서 각각 20 배 및 23 배.
2개의 BoNT 구조체는 스트렙타비딘 결합 단백질(streptavidin binding protein; SBP), 청록색 형광 단백질(CFP), 및 BoNT/A-LC 또는 BoNT/B-LC가 순차적으로 융합되어 뼈대가 완성된(in frame)것으로 이루어진다. 이러한 두가지 구조체, SBP-CFP-BoNT/A-LC 및 SBP-CFP-BoNT/B-LC는 렌티 바이러스 벡터 pLenti4/TO/V5-DEST(Invitrogen, Inc., Catalog No.K4965-00)에 클론되었다. 상기 융합 유전자는 TATA 박스의 업스트림에 바로 삽입된 2개의 사본의 Tet 작동자를 갖는 CMV 프로모터로부터 발현된다. Tet 반응 리프레서(Tet responsive repressor; TRex, Invitrogen)의 결합 또는 전사 침묵자 tTS(Clontech)는 프로모터를 침묵시킨다(silence). 그러나, 테트라사이클린 존재시, TRex 또는 tTS는 Tet 작동자에 결합하지 못하고, CMV 프로모터는 완전히 활성화된다. 상기 구조체를 6-웰 플레이트에 접종된 293-tTS 세포에 형질감염시켰다. BoNT/LC의 발현은 형광 현미경으로 CFP 발현을 관찰하여 검출하였다. 이러한 BoNT/A-LC 및 BoNT/B-LC의 렌티바이러스 구조체를 사용하여 리포터 세포주의 제조를 완성할 수 있다.
[ 실시예 5] TA PC 를 갖는 안정적인 리포터 세포주의 완성
A) VAMP 클리브-오프
TetO가 없는 리포터 구조체(RC)의 생물학적 기능성을 평가하기 위하여, 이의 RC를 이전에 기재된 대로 렌티 바이러스 벡터와 함께 HEK 293 세포에 안정하게 통합하였다. 이러한 안정한 리포터 세포주를 플랫폼으로 사용하여, 일시적 형질감염을 이용하여 상응하는 PC(BoNT/LC-B) 및 TA(BD-VAMP2-AD) 플라스미드와 함께 보완하여 VAMP 클리브-오프 시스템을 시험하였다. 즉시 다음 형질감염에 따라, 리포터 구조체로부터 비너스(Venus;YFP) 및 GLuc 모두의 시간적-추이(time-course) 발현을 분석하였다. 특히, 리포터 세포를 2ml의 완전 성장 배지내에서 대략 70% 컨플루언스(confluence)까지 멸균된 폴리리신(polylysine)이 코팅된 6-웰 플레이트에서 성장시켰다. 전사 활성자 BD-VAMP2(25-94)-NFкB 플라스미드 단독으로 형질감염시킨 경우, 4ug의 플라스미드 DNA를 CalPhos Kit(Clontech Laboratories Inc)를 이용하여 형질감염시켰다. BD-VAMP2-AD 및 BoNT/LC-B를 함께 공-형질감염된 세포의 경우, 1:3 비율의 TA:PC 플라스미드 DNA를 사용하였다. 플레이트를 CO2 배양기에서 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 12시간 후, 배지를 2ml의 신선한 완전 성장 배지로 대체하였고, 5ug/ml의 테트라사이클린을 배지에 가하여 BoNT-LC-B의 발현을 시작하였다. LC-B 발현을 위한 양성 대조군으로 BoNT/LC-B로만 형질감염된 세포를 사용하였다. 대조군으로는 BD-VAMP2-AD로만 형질감염된 세포의 배지에 테트라사이클린을 가하지 않은 것을 사용하였다. 매 24시간마다, 배지를 신선한 배양배지로 대체하기 전에, 가우시아 루시퍼라제(GLuc) 분석을 위하여 배양배지의 분취량(aliquot)을 24시간, 48시간 및 72시간에서 수집하였다. RLU에 의하여 표현되는 GLuc 활성을 광도계를 이용하여 측정하였고, 비너스 YFP 형광을 형광현미경으로 관찰하였다. 각각 다른 웰에서 24시간, 48시간, 72시간 간격으로 플레이트 표면에서 긁어모은(scraped) 세포를 PBS로 두번 세척하였고, 10,000rpm에서 10분동안 4℃에서 원심분리한 다음, 겔(gel)로딩 완충액으로 용해하였다. 시료를 SDS-PAGE 겔 위에서 수행한 다음, 일차항체로 토끼 항-GFP(Santa Cruz biotechnology) 및 이차항체로 AP-접합된(conjugated) 항-토끼 IgG로 웨스턴 블롯 분석을 위하여 PVDF 막으로 옮겼다(도 11 참조). BoNT/B LC에 의하여 VAMP TA의 절단으로 신호가 감소하는 것을 입증하기 위해 TetO, 클리브-오프 VAMP TA, 및 BoNT/B LC PC가 결여된 RC를 갖는 세포 시스템의 성공은, 이러한 시스템도 BoNT/B LC 저해제의 고속 대량 스크리닝에 적당하다는 것을 입증한다.
B)SNAP25 클리브-오프
이전에 기재된 것과 동일한 안정한 리포터 세포를 사용하여, 일시적인(transient) 형질감염을 이용하여 상응하는 PC 및/또는 TA 플라스미드로 보완하여 SNAP25 클리브-오프 시스템을 시험하였다. 다시, 즉시 다음 형질감염에 따라, 리포터 구조체로부터 비너스(Venus;YFP) 및 GLuc 모두의 시간적 추이 발현을 분석하였다. 특히, 항생제를 포함하지 않고 세륨을 포함하는 2ml의 완전 성장 배지 내에서 대략 70% 컨플루엔스(confluence)까지 멸균된 폴리리신(polylysine)이 코팅된 6-웰 플레이트에서 리포터 세포를 성장시켰다. 전사 활성자 BD-SNAP25(104-206)-NFкB 플라스미드 단독으로 형질감염시킨 경우, 4ug의 플라스미드 DNA를 LipofectamineTM(Invitrogen)를 이용하여 형질감염시켰다. BD-SNAP25-NFкB 및 BoNT/LcA로 공-형질감염된 세포의 경우 웰 당 4ug의 각각의 플라스미드 DNA를 이용하였다. 형질감염 6시간 후, 5ug/ml의 테트라사이클린을 배지에 가하고 BoNT-LC-A의 발현을 시작하였다. LC-A 발현을 위한 양성 대조군으로 BoNT/LC-A로만 형질감염된 세포를 사용하였다. 대조군으로는 BD-SNAP25-AD로만 형질감염된 세포의 배지에테트라사이클린을 가하지 않은 것을 사용하였다. 매 24시간마다, 배지를 신선한 배양 배지로 대체하기 전에, 가우시아 루시퍼라제(GLuc) 분석을 위하여 배양 배지의 분취량(aliquot)을 24시간, 48시간 및 72시간에서 수집하였다. RLU에 의하여 표현되는 GLuc 활성을 광도계를 이용하여 측정하였고, 비너스 형광을 형광현미경으로 통하여 관찰하였다. 다른 웰에서 24시간, 48시간, 72시간 간격으로 플레이트 표면에서 긁어모은(scraped) 세포를 PBS로 두번 세척하였고, 10,000rpm에서 10분동안 4℃에서 원심분리한 다음, 겔(gel) 로딩 완충액으로 용해하였다. 시료를 SDS-PAGE 겔위에서 수행한 다음, 일차항체로 토끼 항-GFP(Santa Cruz biotechnology) 및 이차항체로 AP-접합된(conjugated) 항-토끼 IgG를 사용하는 웨스턴 블롯 분석을 위하여 PVDF 막으로 옮겼다(도 11 참조).
C)SNAP25 클리브 오프- RC를 갖는 안정된 세포주(조절된 테트라사이클린)
TetO에 의하여 조절된 안정된 리포터 세포주(클론 #17)를 검증하기 위하여, 유사한 실험과정을 수행하였다. 이 경우, 클론 #17는 BD-SNAP25-AD를 갖는 렌터바이러스에 의해 형질도입 되었고, 순차적으로 일시적 형질감염에 의해 BoNT/LC-A tet-유도성 PC를 보충하였다. 테트라사이클린 노출 시, GLuc 신호는 첫번째 48시간 동안 현저하게 감소하였다. BoNT/LC-A LC의 도입에 의한 이러한 신호의 큰 감소는 시스템이 BoNT/LC-A의 감소를 평가하고 약물 스크리닝 방법에 작용할 것이라는 것을 보여준다.
[ 실시예6 ] 테트라사이클린 존재 또는 부재시의 발현
일시적인 형질감염 및 TetO 없는 RC, TA 로서 SNAp25(1-206)-BD-AD, 및 PC로서 BoNT/E LC의 안정된 형질도입에서, 루시퍼라제 신호는 도 13에서 나타난 바와 같이 높은 기저 신호 수준에도 불구하고 BoNT/E LC에의한 SNAP25(1-206)-BD-AD의 절단 후, 적어도 2배가 증가한다. BoNT/E LC에 의한 절단 후 카르복실 말단 SNAP25 절단 산물은 안정하다. 따라서, BoNT/A 절단이 있는 경우와 유사하게 절단 후, BD-AD의 분해는 없다. SNAP25(1-206)-BD-AD의 높은 기준 선 신호(base line signal) 및 C-말단 SNAP25(1-206)-BD-AD 빠른 분해로 인해, 다른 SNAP23 클리브 온 시스템이 사용된다. 이러한 시스템은 BD-AD-SNAP25(104-206)-VAMP 전장 또는 BD-AD-SNAP25(104-206)-신택신1a 전장으로 이루어진다.
[ 실시예 7] SNAP25 클리브 -온 분석을 수행하는 대안적 지시자 시스템
SNAP25(104-206)의 절단된 형태로 구성된 어느 TA 구조체는 팔미토화가 결여되었고, 그 결과, 본질적으로 막 위치화할 수 없다. VAMP2 또는 신택신1a와 같은 TA의 막 고정물(anchor)에 융합은 클리브-온 연구를 수행하는 대안적 방법을 고려한다. 가능한 TA 배열(configuration)은 BD-AD-SNAP25(104-206)-VAMP2 또는 BD-AD-SNAP25(104-206)-신택신1a이다.
이러한 융합 구조체는 이전과 같은 방법으로 시험하였다: 융합체 TA 및 BoNT/LC-A 또는 -B를 갖고 TetO가 결여된 안정된 리포터 세포주의 일시적 형질감염에 의한. 모든 클리브-온 시스템에서와 같이, 리포터 신호는 테트라사이클린이 없는 기저수준(baseline)에서 리포터 신호는 낮으나, TA의 단백질 가수분해 절단이 있는 경우 증가한다. 테트라사이클린을 가한 후, 배지를 신선한 배양 배지로 대체하기 전에, 가우시아 루시퍼라제 분석을 위하여 24시간, 48시간, 72시간 후에 배양 배지의 분취량을 수집하였다. RLU에 의하여 표현되는 GLuc 활성을 광도계를 이용하여 측정하였고, 비너스 형광을 형광현미경으로 관찰하였다. 이러한 융합된 TA 구조체의 주요한 이점은, 다수의 BoNT/LC 혈청형의 일반적인 검출기(detector)로서 작용에 대한 그들의 능력이다. 따라서, 어느 LC의 존재를 검출하기 위해 단일 지시자 세포주의 가능성이 현실화되었다. 만일 시스템이 BoNT 독소에 대한 수용체를 갖는세포주에서 제조되고, 독소를 효율적으로 내재화할 수 있다면, 이러한 세포주는 완전히 활성 BoNT의 존재에 대한 높은 친화력의 민감한 세포기반의 바이오 검출기로서 기능할 수 있다. 만일 적당한 세포주가 민감하게 독소를 검출하는 환경으로부터 독소를 취할 적당한 능력이 있는 적당한 세포주를 찾을 수 없다면, 독소에 대한 세포주의 친화도 및 민감도는 필요한 단백질 수용체 및 BoNT 독소 세포의 리포터의 간글리오사이드(ganglioside) 성분을 세포 과발현하는 안정한 세포주를 제조하여 증가시킬 수 있다.
[ 실시예 8] 탄저 프로테아제의 저해제를 검출하는 지시자 시스템
하나의 예에서, TA는 PS가 BS-MEK1-AD의 형태의 전장 미토겐-활성 단백질 키나제 키나제(mitogen-activation protein kinase kinase;MEK1; NCBI Reference Sequence:NP_002746)가 되도록 제작된다(A.P, Chopra, S.A. Boone, et al. JBC 278:9402-9406(2003)). 이러한 TA 구조체는 일시적 형질감염에 의해 TetO가 결여된 안정한 리포터 세포주에 유사하게 이동된다. -RC를 갖는 안정한 세포주(테트라사이클린 조절되지 않음)실시예에서 사용된-. 따라서, 이 경우에 Tet-유도성 PC는 MEK1을 절단하는 탄저 치사 인자(anthrax lethal factor;LF) 프로테아제(NCBI reference sequence:AAY15237)이다. 리포터 세포에서 존재하는 모든 구조체와 함께 탄저 LF 프로테아제의 저해제를 스크리닝(screened)하고, 성공적인 후보물질을 비너스 및 GLuc로부터의 리포터 신호 증가를 기준으로 선택한다.
[ 실시예 9] 유비퀴틴 -관련 프로테아제의 저해제를 검출하는 지시자 시스템.
다른 예에서, TA는 PS가 카르복실 말단 5-AA(NCBI Reference Sequence:ABM87155)를 갖는 인간의 작은 유비퀴틴-관련 변형자1(human small ubiquitin-related modifier1; SUMO1) 단백질이 되도록 TA를 제작된다. 상기 5-AA C-말단 펩타이드는 (유비퀴틴-유사)-특이적 단백질(ULP1)에 의하여 절단되고, 따라서 PC 구조체는 프로테아제로서 ULP1(NCBI Reference Sequence: AAG33252)과 함께 제작된다. PC 및 TA 구조체 모두 일시적 형질감염에 의해 TetO가 결여된 안정한 리포터 세포주에 유사하게 옮겨진다. RC, TA 클리브-오프 수모(Sumo) 구조체, 및 ULP1 PC의 모든 세개의 성분이 발현되는 경우, 루시퍼라제 신호는 감소된다. 이러한 시스템은 SUMO 프로테아제 저해제의 고속 대량 스크리닝에 적합하다.
[ 실시예 10] 프로테아제 저해제의 스크리닝
최종 리포터 세포주는 siRNA 넉-다운(knock-down)의 소 분자 저해제에 의하여 기능적으로 검증되었다. BoNT/A-LC 스크리닝 분석의 경우, 수립된 저해제(예를들어, 히드록사메이트(hydroxamate) 화합물)를 사용하였다. BoNT/B-LC에 대해 알려진 소 분자 저해제가 없기 때문에, Dahrmacon/Thermo-Fisher로부터 BoNT/B-LC를 표적화하는 siRNA를 사용하였다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 표적 당 세가지 siRNA들을 개발할 수 있다. 또한, 대조군으로 스크램블된(scrambled) siRNA를 사용하였고, 넉-다운이 실제, 특이적이고, 오프 타겟(off-target)효과가 없다는 것을 확인한다. 293T 세포는 siRNA 및 BoNT/A-LC 또는 BoNT/B-LC 플라스미드를 함께 공-형질감염되고, 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 최종 리포터 세포주를 확인하기 위한 가장 효과적인 siRNA를 선택한다. 그 다음, 효과적이고 siRNA 또는 스크램블된 siRNA 모두를 사용하여 최종 리포터 세포를 형질감염하였다. 1ug/ml의 테트라사이클린울 배양 배지에 가하여 형질감염시킨 후 즉시 BoNT/LC의 발현을 시작한다. 배양배지의 분취량을 루시퍼라제 분석동안 1일에서 4일 동안 수집하였다. 비너스 형광은 형광현미경으로 관칠될 수 있다. 최종 리포터 세포에서 리포터(루시퍼라제 및 비너스 형광 모두)의 발현은 효과적인 siRNA에 의하여 회복되었다.
반 양성(half positive;BoNT/A-LC 저해제 또는 BoNT/B-LC에 대한 siRNA) 및 반 음성(half negative; DMSO only) 대조군들과 함께 마이크로플레이트를 실행하고 Z`값을 측정하여 리포터 스크린을 최적화하였다. 각각의 리포터 균주(strain)의 효과를 결정하는데 사용된 조건은 마이크로플레이트(96-웰 또는 384-웰)의 밀도, 시험된 화합물의 농도, DMSO 농도 허용성(tolerance), 온도, 시험 화합물의 첨가 전의 리포터 균주의 컨플루언스(confluence)의 정도, 발광(luminescence)을 읽기 전 마이크로플레이트에서 배양 시간, 및 루시퍼라제 분석을 위한 회수된 배지의 양(quantity of mediun withdrawn)을 포함한다. 조건은 최적의 Z' 인자>0.5을 달성하기 위하여 변경될 수 있다(J.H.Zhang, T.D. Chung, 및 K.R.Oldenburg, J Biomol. Screen 4:67-73(1999)). 본 발명의 하나의 바람직한 구현예에서, 스크린은 384-웰 디쉬에서 수행된다. 96-웰 디쉬는 적당한 Z` 인자 값을 유지하기 위하여 필요하다면 사용될 수 있다.
리포터 균주를 성장시키고 멸균 Wellmate Microplate reagent dispencer(ThermoFisher, INC)를 이용하여 96-또는 384-웰 불투명한 백색 스크리닝 플레이트에 접종한다. 저해제 스크리닝의 경우, 화합물 마스터 플레이트(compound master plate)를 실온에서 스크린날에 실온에서 해동시켰으며, 미리정해진 양의 화합물을 Sciclone ALH 3000 liquid handling robot(Caliper,Inc.) 및 Twister Ⅱ Microplate Handler(Caliper, Inc)를 이용하여 첨가하였다. 그 다음, 플레이트를 설정된 최적의 시간 및 온도의 조건으로 배양하였다. 그 다음, 미리정해진 양의 세포 배지를 Sciclone robot을 이용하여 신선한 마이크로플레이트에 옮겨서 적당히 희석하였다. 루시퍼라제 기질을 Wellmate reagent dispenser를 이용하여 첨가하고, 발광을 Envision Multilabel microplate reader(PerkinElmer)로 측정하였다.
[ 실시예 11] 저해제의 최적화된 스크리닝
저해제를 스크린하기 위하여 사용된 시스템은 스크리닝 조건을 평가하기 위해 파이럿 스크린(pilot screen)이 있어야한다. 최적화된 분석 배열은 2-3의 다른 농도의 ~2000개의 화합물의 파일럿 스크린에서 시험 된다. 대조군은 각각의 플레이트에 포함된다.--0% 저해의 경우 8웰(DMSO만) 및 거의 완전 저해의 경우 8웰(BoNT/A-LC 저해제 또는 BoNT/B-LC에 대한 siRNA). 상기 기재된 프로토콜에 따라, 분석 플레이트는 적당한 리포터 세포 및 시험되는 화합물을 수용한다. 이러한 스크린에서 얻어진 데이터를 사용하여 편차(variation; (%CV)) 및 다양한 z-스코어 컷오프(z-score cutoff)에서 히트 비율(hit rate)을 결정, HTS를 시작하기 전에 해상도(resolution)를 필요로하는 분석과 함께 문제를 확인할 수 있다. 0.1%에서 1% 사이의 히트 비율을 확립하기 위하여, 파일럿 스크린으로부터 수득된 데이터를 사용하여 스크린을 위한 화합물의 농도(바람직하게는 25-40uM의 범위)를 결정한다. 히트로서 화합물을 지명하는 기준은 파일럿 스크린에서 결정될 수 있다; 그러나. z-스코어>3 또는 >5가 적당하다. 각각의 시료에 대한 z-스코어는 평균 음성 대조군 RLU로부터 시료의 RLU를 빼고, 차이를 음성 대조군 표준 편차(standard deviation)로 나눈다.
[ 실시예 12] 저해제의 스크리닝
본 발명에 하나의 구현예에 따른 방법은 ≤10uM의 IC50`를 갖는 프로테아제 저해제를 동정 및 확인하기 위하여, 다양한 화합물 라이브러리를 스크린하는데 사용될 수 있다.
이러한 보톨리눔 신경독소 각각에 대한 강력한 저해 활성을 갖는 화합물을 동정하기 위하여, 상기 기재된 고속 대량 세포의 BoNT/A-LC 및 BoNT/B-LC 스크린을자연적 산물 및 별개의 소 분자의 라이브러리에 적용한다. 스크린으로부터 히트는 이들이 BoNT/B-LC 또는 BoNT/A-LC를 저해하는 것을 확인할 수 있지만, 모두에 대하여는 확인할 수 없는 재-분석을 통하여 확인할 수 있고, 농도 의존성 저해 연구(IC50)에서 그들의 가능성을(potency)를 입증함으로써 확인할 수 있다.
A. 화합물 라이브러리 및 시료 처리
NERCE 라이브러리. 하버드 메티칼의 NERCE/BEID(NEW England Regional Center for Excellence for Biodefence and Emerging Infectious Disease)의NSRB(National Screening Laboratory)의 화합물 수집이 클리브 오프 세포 기반 BoNT 스크리닝 시스템에서 스크린된 소 분자 라이브러리의 하나의 예로서 사용된다. 이러한 라이브러리는 않 좋은(poor) 용해도, 잠재적 세제-유사 활성(potential detergent-like activity), 수용액에서 안정성의 결여 및 화학적 반응성과 같은 바람직하지 않은 특성을 갖는 화합물을 가려내 NERCE의 화학 컨설턴트 그룹이 조립되 었다(assemble). 현재, 우리의 인-하우스 수집과 오버랩되는 것을 포함하는 이용가능한 165,000 화합물이 존재한다. 두 개의 라이브러리 사이의 오버랩은 ≤10% 이다. 그러므로, 모아진 라이브러리 자원은 ~300,000개의 별개의 화합물을 제시한다.
B. 주요 BoNT/A&B-LC 스크린의 적용. 후보 화학 라이브러리 내 화합물은 96 또는 384-웰 포맷 대, 상기 기재된 세포 기반 BoNT/A-LC 및 BoNT/B-LC 세포 기반 HTS에서 실험하였다. 스크리닝 라이브러리 화합물은 -20℃에서 100% DMSO 2.5mM에서 96-웰 마스터 플레이트에 보관하였다. 마스터 플레이트를 해동시키고, 상기 기재된 파일럿 스크린에서 결정된 조성물의 양을 SciClone ALH3000 liquid handling robot(Caliper, InC.) 및 Twister Ⅱ Microplate Handler(Caliper, Inc.)를 이용하여 분석 플레이트에 가하였고, 동시에, 4×96 웰 소스(source) 플레이트를 하나의 384-웰 분석 플레이트에 합하였다. 상기 파일럿 스크린에서 기술한 바와 같이, 스크리닝 플레이트는 첫번째 및 마지막 컬럼에 양성 및 음성 대조군을 포함한다.
플레이트 리더에 의하여 생성된 미가공 데이터(raw data)는 다음과 같은 과정으로 처리하였다: 상대적인 발광 장치(RLU; relative luminescence unit) 데이터를 수득(capture)하고, 데이터베이스 입력(entry)의 플레이트의 일련 번호를 관련시키고, 각각의 화합물 입력의 수치판독(numerical readout)을 연관시키고, z-점수 및 % 저해를 계산함으로써, 반자동화된 과정으로 수립하고 분석한다. 또한, Z`-인자 계산은 양성 및 음성 대조군을 기반으로 각각의 플레이트에서 수행된다; >0.6 의 Z`값(Z`s values of >0.6)이 적당하다고 여겨지고, 상기 플레이트의 화합물로부터의 데이터는 데이터베이스로 승인된다. % 저해, z-점수 및 50% 저해 농도(IC50)와 같은 확인/검증 데이터를 포함하는 모든 스크리닝 데이터 및 카운터-스크린 결과는 하나의 중앙 데이터베이스에 저장된다(CambridgeSoft`s ChemBioOffice). 조사된 화학 시리즈에 대한 구조-활성 관계는 빠르게 분석된다. 또한, 유사(analog)화합물은 상업적 데이터베이스로부터 빠르게 확인되고, 수득되고, 데이터베이스에 기록되고, 생물학적 시험(testing)을 위하여 제공된다(submitted).
C. 히트 배열 및 검증(verification). 주요 히트(primary hits)로 지정을 위한 기준을 만족하는 화합물은 이전에 기술된 3-단계의 확인 과정을 거친다. 첫번째, 주요 히트는 스톡 플레이트(stock plate)로부터 확인 스톡 플레이트로 선별되고, 복제되어 4세트의 확인 분석 플레이트를 생산한다. 4개의 확인 분석 플레이트는 주요 스크리닝 분석에서 사용되어 각각의 화합물에 대해 4개의 새로운 데이터 포인트를 생성한다. 확인된 히트는 4개의 복제된 분석(replicated assay)중 적어도 3개가 50% 초과의(>50%) 저해를 보이고, 3 초과(>3) z-점수를 보인다. 두번째, 확인된 히트는 다른 보툴리눔 신경독소의 저해를 위한 복제(replicate)에서 카운터 스크린(counter-screened)된다. 세번째, 확인된 히트는 BoNT/A-LC 및 BoNT/B-LC의 저해에 대한 FRET 분석에서 농도-의존적 활성을 조사할 수 있다; IC50은 각각의 효능의 순서를 결정한다.
신호 이득 세포-기반의 분석의 신뢰도 때문에, 스크리닝 과정을 통하여 Z`인자가 0.5 초과(>0.5)인 경우, 스크린에서 양성 오류가 거의 나타나지 않는다. 음성-오류는 보툴리눔 신경독소 및 바이오발광의 발생에 필요한 과정의 저해로 인해 일어날 수 있다. 그러나, 이들이 검출되었을지라도, 이러한 히트는 무차별적이고 실행하기에 충분한 질이 아닐 수 있다. 대안적인 보툴리눔 신경독소를 갖는 카운터-스크린을 거친 히트는 무차별적이지 않을 수 있다. 주요 히트를 검증하고 우선화하기 위하여, 여러 개의 이차(secondary)분석을 하기에 기재된 대로 적용하며, 스크린으로부터 히트를 더 적합하게 한다. 히트 비율이 위에서 확립된 기준을 이용하여 0.1% 이하이면, 스크리닝 플레이트에 대한 Z`값이 양성 및 음성대조군 사이의 넓은 분리 밴드를 보이는 ~0.6 이상인 한 히트비율이 더욱 낮은 히트 저해 수준을 허용함으로써 증가될 수 있고, 각각의 히트는 완전히 활성 대조군 이하의 적어도 3개의 표준편차이다.
본 발명의 하나의 구현예에 따른 방법의 다음 단계에서, 각각 동정된 저해제를 검증할 수 있고 다수의 히트는 효능 및 선택도에 의하여 우선순위를 매긴다. BoNT/A 및 BoNT/B의 검증된 저해제는 10uM 이하(≤10uM)의 IC50, 선택도 지수가 CC50/IC50≥10, 상당한 세포독성이 없고, 초기 신경 세포 모델(primary neuronal cell model)에서 입증된 활성을 가질 수 있다는 점이 고려된다.
본 발명에 하나의 구현예에서 이러한 단계는, 위에서 기술된 HTS 분석에서 발견된 스크리닝 히트/또는 화학타입(chemotype)을 우선순위를 매기는데(prioritize) 필요한 특이성(specificity) 정보 및 효능(potency) 정보를 생성한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 네가지 유형의 활성을 평가할 수 있다:(a)in vitro 효능(in vitro에서 BoNT/A 및 BoNT/B 엔도펩티다제 활성의 저해에 대한 IC50), (b)특이성(specificity; in vitro에서 BoNT/F, 탄저 치사 인자(AT-LF), 및 인간의 기질 메탈로프로테아제(MMP`s)와 같은 다른 엔도 펩티다제의 저해 효능에 대한 특이성(IC50); 및 킬레이트화 특헝의 시험의 IC50), (c)세포독성(즉, 배양시 포유류 세포에 대한 화합물의 CC50), 및 (d)생체내(in vivo) 효능(즉, 초기(primary)래트 뉴런에서 VAMP 절단 활성의 BoNT/A SNAP-25 절단의 저해 또는 BoNT/B 저해에 대한 IC50; 및 신경돌기(axonal)성장 저해의 회복). 성공적인 화합물은 다른 관련없는 엔도펩티다제에 대한 검출가능한 세포독성 또는 활성을 거의 보이지 않으나, in vitro 및 분리된 뉴런에서 BoNT/A 또는/및 BoNT/B의 작용의 강력하고 특이적인 회복(rescue)을 제공한다.
래트(rat) 신경 세포 SNAP-25 절단 분석. 이전에 기술된 것 같이, 세포는 7-8일령 래트 소뇌로부터 수확하고, 세척하고 6-웰 플레이트에 배양하였으며, 배지를 교체하면서 1주일 이상 성장시켰다. 일단 세포들이 중립적으로 네트워크화 되면, 이들을 15분동안 화합물 또는 희석제(DMSO)와 함께 전배양하였다. 세포들을 BoNT/A와 함께 접종하였고, 37℃, 5%의 CO2에서 3시간동안 배양 후, 수확하였다. 세포들을 1M NaOH로 처리하여 BoNT를 비활성화시키고, 세포들을 원심 분리 및 젤 로딩 완충액으로 용해하기 앞서 플레이트 표면에서 긁어모았다. 시료들을 SDS-PAGE 젤에 수행한 다음 토끼 항-SNAP-25 및 HRP-접합된(conjugated) 염소 항-토끼 IgG를 이용한 면역블롯 분석을 위하여 막으로 옮겼다. 밴드의 강도를 읽고 스캐닝 밀도측정(densitometry)을 이용하여 정규화시켰다.
본 발명은 바람직한 구현예를 참조하여 기술되었다. 특정 값, 관계, 물질, 및 단계가 발명의 개념을 기술하기 위한 목적을 위하여 개시하였고, 구체적인 구현예에 나타난바와 같이, 본 발명에 대하여 폭넓게 기술된 본 발명의 작동 원리 및 기본 개념의 범위 또는 정신으로부터 벗어나지 않고, 수많은 변화 및/또는 변경을 할 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 상기 가르침에 비추어 본 발명의 가르침으로부터 벗어남 없이 당업자가 이러한 특이성(specifics)을 변경할 수 있다는 점이 인식되어야 한다. 본 발명에 기초한 개념의 특정한 변경 및 바람직한 구현예를 개시함으로써, 여기서 보여주고 기술하는 구현예의 변경 및 특정 변화뿐 아니라 다양한 다른 구현예를 당업자가 이 같은 기반(underlying) 개념이 친숙해짐으로써 구현할 수 있을 것이다. 변경, 대안 및 다른 구현예의 범위는 추가된(appended)청구 항 또는 이의 균등물의 범위안에 있으므로 모든 상기와 같은 변경, 대체 및 다른 구현예의 범위를 포함하는 것이 의도되었다. 본 발명은 여기서 특별하게 설명된 바와 같이 다른 방법으로 실용화될 수 있다고 이해해야 한다. 결과적으로, 본 구현예들은 모든 면에서 예시적으로 간주될 뿐 이에 한정되는 것은 아니다.
[산업상 이용가능성]
본 발명은 생명공학에 적용할 수 있고, 프로테아제 및 프로테아제 저해제를 동정하는 시스템 및 방법을 개시한다. 상기 시스템 및 방법은 생명공학 분야에서 산업적으로 제조되고 실용화될 수 있다.

Claims (20)

  1. 적어도 하나의 결합부위, 유도성 프로모터 영역, 및 적어도 하나의 리포터 유전자를 포함하고, 리포터 유전자의 발현을 위해 모두 기능적으로 연결되고, 전사활성 물질과 기능적으로 조정된 리포터 구조체;
    핵산 결합 도메인, 적어도 하나의 프로테아제 기질 도메인, 및 적어도 하나의 유도성 프로모터를 위한 전사활성 도메인을 포함하는 전사 활성 물질을 포함하는, 프로테아제 및 프로테아제 저해제의 동정을 위한 시스템.
  2. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 프로테아제 또는 프로테아제 후보물질을 더 포함하며, 프로테아제 또는 프로테아제 후보물질이 프로테아제 기질 도메인을 특이적으로 표적화하는 것을 특징으로 하는, 시스템.
  3. 제 2항에 있어서, 적어도 하나의 전사 활성 물질 또는 프로테아제/프로테아제 후보물질을 핵산 구조체의 산물로서 시스템에 제공되는 것을 특징으로 하는, 시스템.
  4. 제 2항에 있어서, 적어도 하나의 전사 활성 물질 또는 프로테아제/프로테아제 후보물질은 단백질로서 시스템에 제공되는 것을 특징으로 하는, 시스템.
  5. 제 1항에 있어서, 비너스 황색 형광 단백질, 황색 형광 단백질(YFP), 녹색 형광 단백질(GFP), 청록색 형광 단백질(CFP); 청색 형광 단백질(BFP), 적색 형광 단백질(RFP), 이의 형광을 내는 돌연변이체, 바이오발광 단백질, 가우시아 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제, 방아벌레 루시퍼라제, 및 반딧불 루시퍼라제로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나의 리포터 유전자를 더 포함하되, 리포터 벡터의 활성을 정량화하는데 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는, 시스템.
  6. 제 5항에 있어서, 하나의 유도성 프로모터로부터 전사된 적어도 두개의 리포터 유전자를 포함하는, 시스템.
  7. 제 1항에 있어서, 리포터 유전자 구조체는 하나에서 여덟개의 결합 부위 서열 반복을 포함하는 것을 특징으로 하는, 시스템.
  8. 제 1항에 있어서, 리포터 유전자 구조체는 5개의 결합 부위 서열 반복을 포함하는 것을 특징으로 하는, 시스템.
  9. 제 1항에 있어서, 결합 부위는 Gal4 및 LexA로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 시스템.
  10. 제 1항에 있어서, 유도성 리포터 영역은 TATA 프로모터 영역을 포함하는 것을 특징을 하는, 시스템.
  11. 제 1항에 있어서, 프로테아제 기질은 BoNT 프로테아제 기질, 탄저 프로테아제, 카스파제, 알파 바이러스 NSP2 프로테아제, HIV 프로세싱 프로테아제, 수모 프로세싱 프로테아제, 유비퀴틴 프로세싱 프로테아제, ISG15 프로세싱 프로테아제, 자식작용 관련 ATG4 유사 프로세싱 프로테아제, 간염 바이러스 프로세싱 프로테아제 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 시스템.
  12. 제 10항에 있어서, 프로테아제 기질은 SNAP-25, VAMP-2, 신택신1a 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 시스템.
  13. 제 10항에 있어서, 프로테아제 기질은 SNAP-25 및 VAMP-2 프로테아제 기질 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 시스템.
  14. 제 11항에 있어서, 프로테아제는 BoNT 프로테아제인 것을 특징으로 하는, 시스템.
  15. 제 1항에 있어서, 프로테아제 기질은 결합 도메인 및 전사 활성 도메인 사이의 전사 활성 물질에 위치되고, 상기 전사활성 물질은 전사가 일어나는 세포의 부분에 위치하는 것을 특징으로 하는, 시스템.
  16. 제 1항에 있어서, 프로테아제 기질 도메인은 분자의 한쪽 말단에 위치하고 상기 결합 도메인 및 전사 활성 도메인은 기능적으로 서로 근접하여 위치하고, 프로테아제 기질 도메인으로부터 전사 활성 물질의 반대편 말단에서 프로테아제 기질 도메인의 절단이 결합 도메인 및 기능적인 전사 활성 물질 단편이 되는 전사 활성자를 방출하는 것을 특징으로 하는, 시스템.
  17. 제 15항에 있어서, 전사 활성 물질이 세포 핵의 밖에 격리되나 프로테아제에 의하여 절단되면, 전사 활성이 일어나는 세포 내 부분으로 도달하는 능력을 갖고, 결합 도메인 및 전사 활성 도메인을 포함하는 기능적으로 활성이 있는 전사 활성 물질 단편이 방출되도록 제작된 것임을 특징으로 하는, 시스템.
  18. 제 2항에 있어서, tTS 세포에 있는 것을 특징으로 하는, 시스템.
  19. 적어도 하나의 결합 부위, 전사 프로모터, 유도성 프로모터 영역, 및 적어도 하나의 리포터 유전자를 포함하고, 전사 활성 물질과 기능적으로 조정된 리포터 유전자의 발현을 위해 모두 기능적으로 연결된 리포터 유전자 구조체,
    핵산 결합 도메인, 적어도 하나의 프로테아제 기질 도메인, 및 유도성 프로모터를 위한 적어도 하나의 전사 활성 도메인을 포함하는 전사 활성 물질, 및
    프로테아제 기질 도메인에 특이적인 프로테아제를 포함하는 시스템에 적어도 하나의 시험 분자 또는 화합물을 도입하는 단계; 및
    리포터 분자의 발현수준에 대한 효과를 측정하는 단계를 포함하는, 프로테아제 저해제의 동정 방법.
  20. 적어도 하나의 결합 부위, 전사 프로모터, 유도성 프로모터 영역, 및 적어도 하나의 리포터 유전자를 포함하고, 전사 활성 물질과 기능적으로 조정된 리포터 유전자의 발현을 위해 모두 기능적으로 연결된 리포터 유전자 구조체,
    핵산 결합 도메인, 적어도 하나의 프로테아제 기질 도메인, 및 유도성 프로모터를 위한 적어도 하나의 전사 활성 도메인을 포함하는 전사 활성 물질을 포함하는 시스템에 적어도 하나의 시험 분자 또는 화합물을 도입하는 단계; 및
    리포터 분자의 발현수준에 대한 효과를 측정하는 단계를 포함하는, 프로테아제의 동정 방법.
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