CN102558310A

CN102558310A - 实时监测蛋白水解酶活性的指示剂的制备方法及应用方法

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Publication number: CN102558310A
Application number: CN2012100428547A
Authority: CN
Inventors: 李兵辉; 张矫
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-02-24
Filing date: 2012-02-24
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明公开了实时监测蛋白水解酶活性的指示剂的制备方法及应用方法，是通过对荧光蛋白结构的改造，插入蛋白水解酶的作用位点，观察荧光蛋白荧光的有无及强弱的变化，来实现蛋白水解酶活性的监测；具体如下：对荧光蛋白进行循环置换，用蛋白水解酶识别序列将N端和C端连接改变它们的空间结构，同时产生新的N端和C端，经循环置换后的荧光蛋白即为蛋白水解酶活性指示剂（PAI），在经相应的蛋白水解酶作用后，PAI变成由荧光蛋白的N端和C端两部分肽段组成，这两部分经荧光互补产生荧光。本发明以指示剂为工具在体内实时监测蛋白水解酶在生理及病理过程中的变化，在体外监测样品中蛋白水解酶的活性，灵敏、直观、便捷、省时。

Description

实时监测蛋白水解酶活性的指示剂的制备方法及应用方法

技术领域

本发明涉及监测指示剂的制备方法及应用方法，具体涉及实时监测蛋白水解酶活性的指示剂的制备方法及应用方法。

背景技术

随着科技水平的不断进步，生物化学逐渐成为探索活体细胞合成代谢、分解代谢基本原理的主要手段，使人们能够了解各种酶的功能，并通过晶体学从原子层面揭示蛋白质的结构，为深入研究及有效利用打下基础。然而，生物化学中并未能提供一种实验工具，用以定量并在实验中从时间、空间上精确地监控分子水平的细胞内或细胞外生理病理变化，从而确定活体系统的动态行为。为获得这些认识，实验方面及概念上的新工具必不可少。如今，在20世纪60年代分离自维多利亚多管水母的绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP ）以及经改造获得的突变体构成的“GFP 家族”蛋白，使这样一种工具成为现实并得到飞速发展(Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol,1962（59）:223-239)。

荧光蛋白常用于基因转录或作为一种与目的基因结合的报告基因。荧光蛋白基因在N端或C端与异源基因接合够成编码融合蛋白的嵌合基因，其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出与天然荧光蛋白相似的荧光特性（Jones JJ, Bridges AM, Fosberry AP,et al.Potential of real-time measurement of GFP-fusion proteins. J Biotechnol,2004（109）:201–211）。荧光蛋白的这种特性为蛋白质提供了一种荧光标记，不仅可以用来在活体内追踪某一特定蛋白的合成、运输和定位，还用于细胞器的动态观察、有丝分裂的研究、细胞骨架的成分分析和细胞分泌过程观察等，甚至也可以对某些DNA序列在活细胞的动态变化进行分析研究（Chalfie M，Tu Y, Euskirchen G,et al。Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science,1994（263）:802-805.）。与传统抗体标记技术相比具有更高的灵敏度、简化细胞固定、渗透压调整、抗体培养等操作步骤，可用荧光显微镜直接进行观察，而且荧光蛋白没有毒性，在不同的生物中都能高水平表达且不影响其生理机能。

双分子荧光互补技术（Bimolecular fluorescence complementation，BiFC）是由荧光蛋白研究发展而来的一项新技术。将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N端与C端2个多肽，称为N片段和C片段。这两个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发的组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。但当这两个荧光蛋白的片段分别连接到一组相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这两个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的两个片段在空间上相互靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，散发荧光（Kerppola T K．Visualization of molecular interactions using bimolecular fluorescence complementation analysis: characteristics of protein fragment complementation． Chem Soc Rev，2009( 10) : 2876- 2886．）。BiFC技术一经出现迅速得到广泛应用，已经成功用于多种蛋白质的相互作用，如大肠杆菌（Morell M, Espargaró A, Avilés FX,et al. Detection of transient protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation: the Abl-SH3 case. Proteomics. 2007(7):1023-1036）、酵母细胞(Sung MK, Huh WK. Bimolecular fluorescence complementation analysis system for in vivo detection of protein- protein interaction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 2007(9):767-775)、丝状真菌(Hoff B, Kück U. Use of bimolecular fluorescence complementation to demonstrate transcription factor interaction in nuclei of living cells from the filamentous fungus Acremonium chrysogenum. Curr Genet,2005(2):132-138)、哺乳动物细胞(Kerppola TK . Bimolecular fluorescence complementation: visualization of molecular interactions in living cells.Methods Cell Biol,2008(85):431-470)等。此技术的优点在于适用范围广泛，所研究的蛋白处于其天然的环境之中，能够直观的观察蛋白质的相互作用，并且与应用广泛研究体内蛋白质相互作用的酵母双杂交技术相比耗时比较短。

荧光共振能量转换技术（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）是荧光蛋白研究过程中发展的另一项研究蛋白质相互作用的技术。当一个荧光分子(如荧光蛋白，作为供体)的发射谱与另一个荧光分子(作为受体)的吸收谱有重叠时，若这两个荧光分子距离靠近，则会通过供体和受体之间电磁偶极相互作用发生非辐射的能量转移。由于要发生能量转移要求供体和受体之间的距离小于10纳米（Day R N，Davidson M W．The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.Chem Soc Rev，2009( 10 ):2887-2921．），因此可用于研究分子的空间关系及相互作用。现已经发展了数十种不同吸收发射谱的荧光蛋白，已有许多实用的荧光蛋白组合(Shcherbo D，Souslova E A，Goedhart J，et al． Practical and reliable FRET /FLIM pair of fluorescent proteins．BMC Biotechnol，2009(9):24.)，使得基于荧光蛋白的 FRET 成为应用最广泛的荧光技术之一。而且随着更多长波荧光蛋白的出现，发射谱在不断拓宽，又发展出了多色荧光共振转移技术进一步拓展了该技术的应用(Galperin E，Verkhusha V V，Sorkin A．Three- chromophore FRET microscopy to analyze multi-protein interactions in living cells．Nat Methods，2004(3): 209-217.)。

对荧光蛋白研究的不断深入，使得荧光蛋白在生物科学中的应用得到极大的推进，实际上在各类期刊杂志上有大量关于荧光蛋白的文章，这对生物科学实验的如何实施、如何解释都有巨大的影响，也为新的实验方法、技术的出现创造条件。

发明内容

本发明的目的是：提供一种实时监测蛋白水解酶活性的指示剂的制备方法及应用方法，是在荧光蛋白的结构和功能的基础上，对其进行结构改造，产生蛋白水解酶活性指示剂（PAI），正常情况下没有荧光，被蛋白水解酶水解后产生荧光，以此为工具在体内实时监测蛋白水解酶在生理及病理过程中的变化，在体外监测样品中蛋白水解酶的活性。

本发明的技术解决方案是：用于实时监测蛋白水解酶活性的工具为由荧光蛋白改造而成的蛋白水解酶活性指示剂（PAI），该指示剂的制备方法是对荧光蛋白进行循环置换，用蛋白水解酶识别序列将N端和C端连接改变它们的空间结构，同时产生新的N端和C端，经循环置换后的荧光蛋白即为蛋白水解酶活性指示剂（PAI），PAI没有荧光，在经相应的蛋白水解酶作用后，PAI变成由荧光蛋白的N端和C端两部分肽段组成，这两部分经荧光互补产生荧光，PAI能由基因直接编码；

该指示剂的具体制备步骤如下：

（1）将荧光蛋白游离的N端与C端通过分子生物学技术缩短，但保证荧光蛋白发荧光的功能，产生的N端和C端命名为N₁和C₁；

（2）在荧光蛋白内部的某位点将肽键切断，形成新的游离的N端与C端，命名为N₂和C₂；

（3）用蛋白水解酶识别位点（较短的多肽序列）连接缩短后的荧光蛋白的N₁端与C₁端，构成一个完整的蛋白，该蛋白即为蛋白水解酶活性指示剂，Protease Activity Indicator，命名为：PAI。

本发明的指示剂的应用方法包括以下步骤：

（1）构建质粒：

（a）将荧光蛋白游离的N端与C端通过分子生物学技术缩短，保证荧光蛋白功能较短序列，最短最好，但不是必须的；

（b）在荧光蛋白的某特定位点，在EGFP及其衍生的荧光蛋白的不限与此的第154与155残基之间，将其切断，形成N端与C端两部分多肽片段；

（c）连接缩短后的N端与C端，同时插入某一蛋白水解酶的识别位点，使两个多肽成为一个完整的蛋白，即为蛋白水解酶活性的指示剂（PAI）；

（d）将表达以上指示剂（PAI）的cDNA连接到合适的载体上，构建完整质粒，用于在生命体系中表达；

（2）在体内或体外通过指示剂（PAI）荧光的有无强弱的变化，监测蛋白水解酶活性的变化。

本发明涉及的核苷酸序列和氨基酸序列如下：

目前发现的所有的荧光蛋白都有相似的空间结构，即β-桶装结构，而发光基团则位于桶装结构中与外部环境相对独立，蛋白两端（尤其是N端）的氨基酸结构及空间位置对荧光发光基团的自发形成至关重要；因此，本发明以具有β-桶装结构的任何荧光蛋白为基础进行创新改造，包括GFP及其衍生的荧光蛋白（如EGFP、ECFP、EBFP、EYFP、Venus、Cerulean等）、copGFP、DsRed及其衍生的荧光蛋白（mRFP、mCherry）。

下面为一种以Venus为基础生产的用于监测蛋白水解酶Caspase-3活性的蛋白水解酶活性指示剂（PAI-C3）的cDNA（基因）：

该基因对应编码的氨基酸序列为：

划单下划线的序列编码Venus荧光蛋白的C端多肽；划双下划线的序列编码Venus荧光蛋白的N端多肽；中间的序列编码Caspase-3水解酶的识别和水解位点（DEVDG）。

此处荧光蛋白的C端和N端可替换为其它具有β-桶装结构的荧光蛋白；Caspase-3的水解位点可替换为其它水解蛋白的位点，如Caspase-1—Caspase13、Trypsin、HIV-1 Protease、site-1 Protease等。

本发明具有以下优点：

1、各种生理、病理原因引起相应的蛋白水解酶活化后，识别作用位点并将其水解切断；活化后的蛋白水解酶同样能水解含其识别序列的PAI，并将PAI水解成N端和C端两部分多肽，由于这两部分多肽片段空间上相互靠近互补，会自发地通过疏水相互作用重新构建成一个具有空间结构的蛋，（N₁端可自由移动，并且通过双分子荧光互补自发地形成荧光发光基团，在该荧光蛋白的激发光激发下，发射荧光。

2、能发荧光的蛋白经过循环置换插入蛋白水解酶识别序列，同时产生新的N₂端和C₂端，游离的N端与C端对荧光蛋白中心的发光基团的自发形成起决定性的作用，在用蛋白水解酶的识别序列强行连接N₁端与C₁端时，改变了N₁和C₁的空间位置，引起荧光蛋白空间构像的改变。

3、本发明的指示剂能在体内（在细胞内和动物上）导入该基因，通过表达蛋白来实时监测蛋白水解的活性（即蛋白水解酶的激活），不需要破坏样品、收集样品，灵敏、直观、便捷、省时。

4、本发明的指示剂PAI能在体外以PAI为底物方便、快速、准确地监测样品中的蛋白水解酶的活性。

5、本发明的指示剂可以应用于任何蛋白水解酶活性的监测，特别是对于特定蛋白水解酶在生理及病理过程中活性改变的监测，为了解蛋白水解酶的功能及在生理病理过程中的作用提供有效方法；对于那些作为治疗靶点的蛋白水解酶，相应的PAI能成为它们有效的底物，由于荧光的方便检测和操作，因此能方便地建立这些蛋白水解酶抑制剂的高通量筛选平台。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术解决方案的限制。

正常情况下，体内蛋白水解酶以酶原的形式存在，即无活性的前体；在病理或某些特殊的生理条件下，这些前体会被活化成有功能的形式即蛋白水解酶，发挥重要的生物学功能；通常情况下，传统的方法是收集生物样品，然后进行免疫蛋白印迹检测蛋白水解酶的活性；传统的方法费时费力，然而用我们在发明专利中描述的方法，能十分方便、快速、实时地检测蛋白水解酶的活性，而不破坏生物样本的完整性。

实施例1：以细胞凋亡中的关键酶caspase-3为例说明对此蛋白水解酶的监测，Caspase-3在细胞凋亡中起了重要作用，用我们描述的方法能方便、实时地监测细胞中Caspase-3的活性，具体操作如下（本实施例中采用的荧光蛋白为Venus）：

（1）构建质粒：

（a）将荧光蛋白游离的N端与C端通过分子生物学技术缩短，保证荧光蛋白功能的较短序列；

（b）在荧光蛋白的154与155之间将其切断，形成N端与C端两部分；

（c）连接原来的、经缩短后的N端与C端，同时插入caspase-3的识别位点DEVD-G（Asp、Glu、Val、Asp、Gly），即为PAI；

（d）将表达该蛋白（PAI）的cDNA连接到合适的载体上，构建完整质粒表达PAI（此质粒命名为ｐＰＡＩ）；

（2）将ｐＰＡＩ转染进细胞，以宫颈癌细胞HeLa为例），表达PAI；

（3）用H₂O₂诱导细胞凋亡；

（4）用荧光显微镜或荧光分光光度计监测细胞样品中荧光的变化。

结果表明见表一，与对照相比，未诱导凋亡前，细胞没有荧光产生，在诱导细胞凋亡后，细胞出现荧光，而且Capases-3的抑制剂Z-VAD能抑制细胞荧光的产生；说明在凋亡过程caspase-3被激活，作用于PAI，使PAI产生荧光；PAI能作为细胞内敏感的蛋白水解酶Caspase-3活性的指示剂。

表一：双氧水（H2O2）诱导HeLa细胞凋亡，激活Caspase-3，可通过PAI检测

pPAI-C3为表达含Caspase-3识别序列的PAI的质粒；Z-VAD为Capase-3的抑制剂；在扣除环境的背景荧光后，HeLa的自发背景荧光定义为1，其它样品的荧光强度以倍比表示。

同样，将PAI基因通过质粒转染或病毒感染的方法导入动物体内，或制备含PAI的转基因动物，即可实时监测动物体内的蛋白水解酶的活性。

抗癌药物能诱导癌细胞凋亡，因此，利用我们发明的方法能非常方便地在细胞和动物水平上筛选特异的抗癌药物。

在蛋白表达体系（如细菌或昆虫细胞中）表达并纯化PAI蛋白，以PAI作为相应的蛋白水解酶的底物，在体外、合适的缓冲液中和蛋白水解酶样品混合在一起，孵育，然后用光分光光度计检测反应液的荧光强度，根据荧光强度确定待检蛋白水解酶的活性。

实施例2：纯化含有Caspase-3水解位点（DEVDG，氨基酸序列）的PAI-C3作为Caspase-3的底物，将Caspase-3样品和PAI-3底物混合在反映体系里，检测反映体系中的荧光强度，即可知样品Caspase-3的活性，结果见表二。

表二：以PAI-C3为底物体外检测Caspase-3的活性

PAI-C3以Venus荧光蛋白（一种黄色荧光蛋白）为模板改造；反映体系为2毫升磷酸缓冲液（pH7.5）；荧光强度的计算中，扣除所有背景荧光，以任意值为单位；结果显示PAI-C3的荧光强度和Caspase的量成正比例，表明以PAI-C3为底物能非常准确的检测Caspase-3的活性。

实施例3：在PAI（以Venus为模板）中插入HIV-1 Protease水解酶识别序列Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Val-Val，在细菌体系中表达纯化后得蛋白PAI-HP；PAI-HP作为HIV-1 Protease的底物检测其活性；结果见表三。

表三：以PAI-HP为底物监测HIV-1 Protease的活性

底物PAI-HP的荧光强度和反应体系中的HIV-1 Protease的量成正比关系，显示PAI-HP的荧光强度能真实反应HIV-1 Protease的活性；HIV-1 Protease 在HIV病毒（引起艾滋病）入侵宿主时起了重要作用，抑制HIV-1 Protease的活性能阻止HIV病毒的繁殖，因此，HIV-1 Protease的抑制剂可做为治疗艾滋病的重要药物；以PAI-HP为底物能方便地在体外及体内建立HIV-1 protease抑制剂的高通量筛选平台。

序列表1

< 110 ＞李兵辉

< 120 ＞实时监测蛋白水解酶活性的指示剂的制备方法及应用方法

< 160 > l

< 210 > PAI-C3

< 211 > ６９３

< 212 > DNA

< 222 > 人工序列

< 400 > PAI-C3

ATGGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCGACGAGGTGGACGGCGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGCTGATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCACCGCCTGA

序列表２

< 110 ＞李兵辉

< 160 > l

< 210 > PAI-C3

< 211 > ２３０

< 212 > ＰＲＴ

< 222 > 人工序列

< 400 > PAI-C3

MDKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIDEVDGELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKLICTTGKLPVPWPTLVTTLGYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITA

Claims

1.实时监测蛋白水解酶的指示剂的制备方法，用于实时监测蛋白水解酶活性的工具为由荧光蛋白改造而成的蛋白水解酶活性指示剂（PAI），其特征在于该指示剂的制备方法是：对荧光蛋白进行循环置换，用蛋白水解酶识别序列将N端和C端连接改变它们的空间结构，同时产生新的N端和C端，经循环置换后的荧光蛋白即为蛋白水解酶活性指示剂（PAI），PAI没有荧光，在经相应的蛋白水解酶作用后，PAI变成由荧光蛋白的N端和C端两部分肽段组成，这两部分经荧光互补产生荧光，PAI能由基因直接编码。

2.根据权利要求1所述的实时监测蛋白水解酶的指示剂的制备方法，其特征在于该指示剂的具体制备步骤如下：

3.根据权利要求1所述的实时监测蛋白水解酶的指示剂的制备方法，其特征在于：以Venus为基础生产的用于监测蛋白水解酶Caspase-3活性的蛋白水解酶活性指示剂（PAI-C3）的cDNA（基因）：

该基因对应编码的氨基酸序列为：

4.根据权利要求3所述的实时监测蛋白水解酶的指示剂的制备方法，其特征在于：此处荧光蛋白的C端和N端可替换为其它具有β-桶装结构的荧光蛋白；Caspase-3的水解位点可替换为其它水解蛋白：Caspase-1—Caspase13、Trypsin、HIV-1 Protease、site-1 Protease。

5.实时监测蛋白水解酶的指示剂的应用方法，其特征在于该应用方法包括以下步骤：

（1）构建质粒：

6.根据权利要求3所述的实时监测蛋白水解酶的指示剂的制备方法，其特征在于：以权利要求3中所述的基因（cDNA）为基础衍生的各种表达载体制备成的监测蛋白水解酶活性的试剂或试剂盒。

7.根据权利要求2所述的实时监测蛋白水解酶的指示剂的制备方法，其特征在于：以权利要求4中所述的PAI为基础生产的监测蛋白水解酶活性的试剂或试剂盒。