CN114252621A - 一种基于rbd与ace2相互作用实时检测新型冠状病毒刺突蛋白的方法 - Google Patents

一种基于rbd与ace2相互作用实时检测新型冠状病毒刺突蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于RBD与ACE2相互作用实时检测新型冠状病毒刺突蛋白的方法，属于生物分析检测领域。该方法通过实时采集新冠病毒受体结合蛋白(RBD)与其受体人源血管紧张素转化酶2(hACE2)相互作用时荧光信号的变化来检测病毒刺突蛋白(S蛋白)。具体的方法是，首先通过基因工程方法分别在新型冠状病毒RBD及hACE2上融合标签蛋白，带有标签蛋白专一底物的小分子荧光探针能够分别标记这两个蛋白，基于病毒S蛋白与hACE2结合力强于RBD与hACE2的结合力，实现了两种方式检测新冠病毒刺突蛋白：一种方法是在活细胞内通过荧光显微镜观察RBD‑hACE2相互作用，新冠病毒S蛋白能够抑制RBD‑hACE2的相互作用而产生差异的荧光信号；另一种方法是应用荧光检测仪器在体外检测RBD‑hACE2相互作用时产生的差异的荧光共振能量转移(FRET)的信号来检测新冠病毒S蛋白。

Description

一种基于RBD与ACE2相互作用实时检测新型冠状病毒刺突蛋 白的方法
技术领域
本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种基于RBD与ACE2相互作用实时检测新型冠状病毒刺突蛋白的方法。
背景技术
新型冠状病毒(COVID-19)感染已经成为全球性的流行疾病，严重威胁着人类的健康。截止到2020年8月，全球累计感染人数已经超过2300万，累计死亡人数超过80万。COVID-19是由核壳蛋白包裹单链RNA组成，其感染细胞的机制与SARS-CoV相似，都是通过病毒表面的刺突S蛋白与人细胞膜蛋白血管紧张素转化酶2(hACE2)结合，在蛋白酶的作用下，内呑进入细胞内而感染。目前急需快速精确的检测手段以及适当的诊疗方案，实现早发现、早治疗、精准治疗，及时控制感染的人数并且降低重症患者的死亡率。
目前常用的检测手段主要是RT-qPCR核酸检测法，即提取RNA后反转录成双链cDNA，然后通过PCR扩增，扩增后的双链DNA结合特殊荧光染料后发光，通过荧光信号对病毒进行定性和定量。但是根据临床反馈的信息，该方法普遍存在以下问题：(1)耗时长、即需要提取RNA，反转录，扩增等一套程序；(2)特异性和灵敏度欠缺，阳性病人阳性检出率只有50-80％，很多未被检出的阳性病人会给社会卫生防控带来巨大的安全风险和隐患。因此，以PCR技术为代表的核酸检测方法做作为确诊感染的“金标准”也受到多方质疑。为解决这一问题，科学家们开发了新的检测手段，包括IgM/IgG抗体检测法，但是病毒进入机体产生特异性的抗体需要一段时间，因此检测到病毒抗体肯定滞后于检测病毒本身。因此，急需开发能够直接检测病毒本体的快速检测方法。虽然已经有用于识别病毒表面蛋白的抗体被筛选出来，并用于病毒的实时检测，但是常用的双抗体或者受体-抗体夹心法检测抗原存在成本高，操作复杂，误差大等缺点。
COVID-19的刺突蛋白(S蛋白)是由S1和S2两个亚基组成，其中，S2亚基包含疏水单元，用于侵染细胞膜。而S1亚基包含一个受体结合部位RBD(receptor-binding domain)，用于识别宿主细胞的ACE2蛋白。本发明以ACE2为识别基团检测病毒，通过监控ACE2与RBD蛋白相互作用时的荧光信号变化来实时检测病毒S蛋白，进而检测病毒。
发明内容
本发明提供一种基于RBD与ACE2相互作用实时检测新型冠状病毒刺突蛋白的方法，其通过实时采集新冠病毒受体结合蛋白(RBD)与其受体人源血管紧张素转化酶2(hACE2)相互作用时荧光信号的变化来检测病毒刺突蛋白(S蛋白)。具体的方法是，首先通过基因工程方法分别在新型冠状病毒RBD及hACE2上融合标签蛋白，带有标签蛋白专一底物的小分子荧光探针能够分别标记这两个蛋白，基于病毒S蛋白与hACE2结合力强于RBD与hACE2的结合力，实现了两种方式检测新冠病毒刺突蛋白：一种方法是在活细胞内通过荧光显微镜观察RBD-hACE2相互作用，新冠病毒S蛋白能够抑制RBD-hACE2的相互作用而产生差异的荧光信号；另一种方法是应用荧光检测仪器在体外检测RBD-hACE2相互作用时产生的差异的荧光共振能量转移(FRET)的信号来检测新冠病毒S蛋白。
一种基于RBD与ACE2相互作用实时检测新型冠状病毒刺突蛋白的方法，通过实时采集新冠病毒RBD与人源ACE2蛋白相互作用时荧光信号的变化来检测病毒S蛋白，通过检测新冠病毒S蛋白抑制RBD-hACE2的相互作用而产生差异的荧光信号进而实现新冠病毒S蛋白的快速检测。
所述的实时检测新型冠状病毒刺突蛋白的方法，该方法在活细胞内通过荧光显微镜观察RBD-hACE2相互作用实现检测；或者应用荧光检测仪器在体外检测RBD-hACE2相互作用时产生的差异的荧光共振能量转移(FRET)的信号来检测新冠病毒S蛋白。
所述的在活细胞内检测新冠病毒S蛋白的步骤如下：
(1)在细胞内过表达hACE2蛋白质粒；
(2)加入含上述标签蛋白专一底物的荧光分子，孵育5-30min，洗一遍；
(3)对照组加入荧光标记的RBD蛋白，检测组加入待测样品和荧光标记的RBD蛋白的混合物，孵育5-30min；
(4)荧光成像，观察荧光变化。
所述的在体外检测的步骤如下：
(1)分别用FRET给-受体荧光分子标记hACE2和新冠病毒RBD蛋白；
(2)对照组只加入荧光标记后的hACE2和RBD蛋白，检测组加入荧光标记后的hACE2和RBD蛋白的同时加入待测样品；
(3)采集荧光光谱，分析数据，得出检测结果。
所述的hACE2蛋白为hACE2与标签蛋白的融合蛋白，是分别将SNAP、Halo或者CLIP标签蛋白融合在hACE2蛋白的N端或者C端。
所述的RBD蛋白为新型冠状病毒的S蛋白的RBD片段与标签蛋白的融合蛋白，是分别将SNAP、Halo或者CLIP标签蛋白融合在RBD蛋白的N端或者C端。
所述的荧光分子为带有标签蛋白专一底物的荧光分子。
所述的在活细胞内检测新冠病毒S蛋白的步骤(4)通过荧光成像检测S蛋白，具体的分析方法为：统计1-100个过表达hACE2细胞的hACE2和RBD通道的平均荧光强度
Figure BDA0002695751820000031
和
Figure BDA0002695751820000032
以及成像图片背景的平均荧光强度得到
Figure BDA0002695751820000033
和
Figure BDA0002695751820000034
Figure BDA0002695751820000035
Figure BDA0002695751820000036
以对照组的IFRBD/IFhACE2作为标准，检测组细胞成像的IFRBD/IFhACE2与该值作对比。若检测组的数值小于标准值，所测样品为含病毒S蛋白的样品；若检测组的数值大于或者等于标准值，所测则为不含病毒S蛋白的样品。
所述方法应用于新型冠状病毒的检测。
所述方法在新型冠状病毒检测试剂中的应用。
本发明的优点和有益效果为：
首先，本发明在体外通过在活细胞内检测荧光信号或者在体外采集FRET荧光信号变化检测病毒，具有实时、快速、灵敏的特点；其次，通过基因工程方法将蛋白标签融合到目标蛋白上，其优点是根据所用的仪器或者荧光通道不同，可以选择不同荧光小分子或者FRET给-受体荧光团标记到目标蛋白上应用。
附图说明
图1为不同染料标记各式hACE2蛋白的Hela细胞成像图。
图2为SNAP-RBD(308-553)，CLIP-RBD(308-553)，Halo-RBD(333-525)三个融合蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图。
图3为RBD蛋白荧光标记前后的SDS-PAGE电泳图。
图4为Hela细胞内SNAP-hACE2与RBD蛋白相互作用的荧光共聚焦成像。
图5为Hela细胞内Halo-hACE2，CLIP-hACE2分别与RBD蛋白相互作用的荧光共聚焦成像。
图6为转染了SNAP-hACE2的Hela细胞，加入S蛋白和RBD的混合溶液后的荧光共聚焦成像。
图7为Hela细胞内加假病毒前后SNAP-hACE2与RBD蛋白相互作用荧光共聚焦成像。
图8为hACE2蛋白荧光标记前后的SDS-PAGE电泳图；
图9为SNAP-hACE2-560Dye与RBD525-Halo-640Dye作用前后的荧光光谱图。
图10为加入假病毒前后SNAP-hACE2-560Dye与RBD525-Halo-640Dye相互作用的荧光光谱图。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1
hACE2和标签蛋白融合表达载体的构建与活细胞内荧光标记
用常规分子克隆方法先将hACE2的全长cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后分别将SNAP，CLIP，Halo标签蛋白的cDNA亚克隆到hACE2-的N端信号肽(hACE2的第1-51个碱基为信号肽)之后，得到pCMV-SNAP-hACE2,pCMV-CLIP-hACE2,pCMV-Halo-hACE2。
将Hela细胞分别传代于3个共聚焦成像皿，24小时后，按照说明书用Lipofectamine 2000试剂分别将500ng质粒载体pCMV-SNAP-hACE2,pCMV-CLIP-hACE2,pCMV-Halo-hACE2转入Hela细胞，4小时后将培养液换成含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，37℃ 5％CO2培养箱中继续培养48小时。将SNAP-561、Halo-488以及CLIP-488荧光染料分别溶于DMEM高糖培养基中，终浓度为1μM。用该探针溶液孵育细胞30min，然后用DMEM洗两遍，加入1mL DMEM培养基。用荧光共聚焦显微镜在100倍油镜下成像，如图1所示。
图1a为转染了pCMV-SNAP-hACE2质粒并且在561nm激发下的Hela细胞成像，图1b为转染了pCMV-Halo-hACE2质粒并且在488nm激发下的Hela细胞成像，图1c为转染了pCMV-CLIP-hACE2质粒并且在488nm激发下的Hela细胞成像，从图1中可见，染料均标记在细胞膜上，说明其标记的是在细胞膜上过表达的hACE2蛋白。
实施例2
SNAP-RBD(308-553)融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化
用常规分子克隆方法先将连接了6His标签的新型冠状病毒RBD(308-553)cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将SNAP标签蛋白的cDNA亚克隆到RBD的N端，得到pCMV-SNAP-RBD-6His。
用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-SNAP-RBD-6His，然后用Ni-NTA柱子纯化蛋白，用含100mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量为50.7kDa的目的蛋白SNAP-RBD-6His约1mg。跑SDS-PAGE凝胶电泳，如图2所示，第1道为SNAP-RBD-6His蛋白的纯化后表达条带，分子量介于标准蛋白44.3kDa与66.4kDa之间。
实施例3
CLIP-RBD(308-553)融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化
用常规分子克隆方法先将新型冠状病毒RBD(308-553)-6His cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将CLIP标签蛋白的cDNA亚克隆到RBD的N端，得到pCMV-CLIP-RBD-6His。
用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-CLIP-RBD-6His，然后用Ni-NTA柱子纯化蛋白，用含200mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量为47.8kDa的目的蛋白CLIP-RBD(308-553)约1mg。跑SDS-PAGE凝胶电泳，如图2所示，第2道为CLIP-RBD(308-553)蛋白的纯化后表达条带，分子量介于标准蛋白44.3kDa与66.4kDa之间。
实施例4
Halo-RBD(333-525)融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化
用常规分子克隆方法先将新型冠状病毒RBD(333-525)-6His cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将Halo标签蛋白的cDNA亚克隆到RBD的N端，得到pCMV-Halo-RBD-6His。
用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-Halo-RBD-6His，然后用Ni-NTA柱子纯化蛋白，用含200mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量为56.1kDa的目的蛋白Halo-RBD(333-525)约1mg。跑SDS-PAGE凝胶电泳，如图2所示，第3道为Halo-RBD(333-525)蛋白的纯化后表达条带，分子量介于标准蛋白44.3kDa与66.4kDa之间。
实施例5
RBD(333-525)-Halo融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化
用常规分子克隆方法先将新型冠状病毒RBD(333-525)cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将C端带有6His的Halo标签蛋白的cDNA亚克隆到RBD的C端，得到pCMV-RBD-Halo-6His。
用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-RBD-Halo-6His，然后用Ni-NTA柱子纯化蛋白，用含200mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量为57kDa的目的蛋白RBD(333-525)-Halo约0.5mg。
实施例6
荧光标记RBD(333-525)-Halo蛋白并纯化
RBD(333-525)-Halo蛋白溶于PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液中，制成1.1mg/mL的母液。Halo640荧光染料溶于DMSO配置成2mM的母液。取RBD(333-525)-Halo蛋白溶液20μL，加入Halo640荧光染料0.6μL，使得蛋白与探针的摩尔比值为1:3，室温下反应2h得到RBD(333-525)-Halo-640dye。然后用PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液过葡聚糖凝胶柱G-25除盐，洗脱下来的RBD(333-525)-Halo-640dye用浓缩柱浓缩，用考马斯亮蓝染色法测出纯化后的RBD(333-525)-Halo-640dye蛋白浓度为0.17mg/mL，摩尔浓度约为3μM。
取RBD(333-525)-Halo和RBD(333-525)-Halo-640dye少量，跑SDS-PAGE电泳，其考马斯亮蓝染色图像以及紫外光激发成像如图3所示。图3的左图为考马斯亮蓝染色，右图为紫外激发的荧光成像，其中第3和4道分别为RBD(333-525)-Halo和RBD(333-525)-Halo-640dye。蛋白RBD(333-525)-Halo的分子量约为57kDa，介于标准蛋白44.3kDa与66.4kDa之间，荧光标记后的RBD(333-525)-Halo-640dye在紫外光激发下显示出红色的荧光。
实施例7
RBD(319-541)-Halo融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化
用常规分子克隆方法先将新型冠状病毒RBD(319-541)cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将C端带有6His的Halo标签蛋白的cDNA亚克隆到RBD的C端，得到pCMV-RBD-Halo-6His。
用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-RBD-Halo-6His，然后用Ni-NTA柱子纯化蛋白，用含200mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量为59.6kDa的目的蛋白RBD(319-541)-Halo约0.5mg。
实施例8
荧光标记RBD(319-541)-Halo蛋白并纯化
RBD(319-541)-Halo蛋白溶于PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液中，制成0.55mg/mL的母液。Halo640荧光染料溶于DMSO配置成2mM的母液。取RBD(319-541)-Halo蛋白溶液20μL，加入Halo640荧光染料0.6μL，使得蛋白与探针的摩尔比值为1:3，室温下反应2h得到RBD(319-541)-Halo-640dye。然后用PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液过葡聚糖凝胶柱G-25除盐，洗脱下来的RBD(319-541)-Halo-640dye用浓缩柱浓缩，用考马斯亮蓝染色法测出纯化后的RBD(319-541)-Halo-640dye蛋白浓度为0.18mg/mL，摩尔浓度约为3.1μM。
取RBD(319-541)-Halo和RBD(319-541)-Halo-640dye少量，跑SDS-PAGE电泳，其考马斯亮蓝染色图像以及紫外光激发成像如图3所示。图3的左图为考马斯亮蓝染色，右图为紫外激发的荧光成像，其中第1和2道分别为RBD(319-541)-Halo和RBD(319-541)-Halo-640dye。蛋白RBD(319-541)-Halo的分子量约为59.6kDa，介于标准蛋白44.3kDa与66.4kDa之间，荧光标记后的RBD(319-541)-Halo-640dye在紫外光激发下显示出红色的荧光。
实施例9
荧光标记的RBD-Halo与荧光标记的SNAP-hACE2的相互作用成像。
将Hela细胞传代于共聚焦成像皿，24小时后，按照说明书用Lipofectamine 2000试剂分别将500ng质粒载体PCMV-SNAP-hACE2转入Hela细胞，4小时后将培养液换成含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，37℃ 5％CO2培养箱中继续培养48小时。将SNAP-561荧光染料溶于DMEM高糖培养基中，终浓度为0.2μM。用该探针溶液孵育细胞15min，然后用DMEM洗一遍，加入1mL DMEM培养基，加入RBD(333-525)-Halo-640dye至终浓度为20nM，同时，加入细胞核染料Hoechst 33342终浓度为0.5μM，在37℃ 5％CO2培养箱中孵育10min。用荧光共聚焦显微镜在100倍油镜下成像，如图4a-d所示。
图4a为405nm激发下的Hela细胞核成像，显示的是Hoechst 33342染料的荧光；图4b为561nm激发下的Hela细胞成像，显示的是SNAP-561染料的荧光，SNAP-561标记在细胞膜过表达的SNAP-hACE2蛋白上，因此561通道显示的是荧光标记的SNAP-hACE2蛋白；图4c为640nm激发下的Hela细胞成像，显示的是RBD525-Halo-640dye的荧光；图4d为图4a-c叠加的图像，可见图4b和图4c的荧光能够很好地重叠，证明了hACE2蛋白与RBD蛋白能够相互作用。
实施例10
荧光标记的SNAP-RBD(308-553)蛋白与Halo-hACE2的相互作用成像
将Hela细胞传于共聚焦成像皿，24小时后，后，按照说明书用Lipofectamine2000试剂分别将500ng质粒载体pCMV-Halo-hACE2转入Hela细胞，4小时后将培养液换成含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，37℃ 5％CO2培养箱中培养45小时。将Halo-561荧光染料溶于DMEM高糖培养基中，终浓度为0.2μM。用该探针溶液孵育细胞15min，然后用DMEM洗一遍，将培养基换成1mL DMEM培养基，加入SNAP-RBD(308-553)-488dye至终浓度为50nM，在37℃5％CO2培养箱中孵育30min。用荧光共聚焦显微镜在100倍油镜下成像，如图5a-c所示。
图5a为561nm激发下的Hela细胞成像，显示的是Halo-561染料的荧光，Halo-561标记在细胞膜过表达的Halo-hACE2蛋白上，因此561通道显示的是荧光标记的Halo-hACE2蛋白；图5b为488nm激发下的Hela细胞成像，显示的是SNAP-RBD(308-553)-488dye的荧光；图5c为图5a,b叠加的图像，可见图5a和图5b的荧光能够很好地重叠，证明了hACE2蛋白与RBD蛋白能够相互作用。
实施例11
荧光标记的RBD(319-541)-Halo蛋白与CLIP-hACE2的相互作用成像
将Hela细胞传代于共聚焦成像皿，24小时后，按照说明书用Lipofectamine 2000试剂分别将500ng质粒载体pCMV-CLIP-hACE2转入Hela细胞，4小时后将培养液换成含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，37℃ 5％CO2培养箱中培养45小时。将CLIP-488荧光染料溶于DMEM高糖培养基中，终浓度为0.5μM。用该探针溶液孵育细胞60min，然后用DMEM洗一遍，将培养基换成1mL DMEM培养基，加入RBD(319-541)-Halo-640dye至终浓度为100nM，在37℃5％CO2培养箱中孵育30min。用荧光共聚焦显微镜在100倍油镜下成像，如图5d-f所示。
图5d为488nm激发下的Hela细胞成像，显示的是CLIP-488染料的荧光，CLIP-488标记在细胞膜过表达的CLIP-hACE2蛋白上，因此488通道显示的是荧光标记的CLIP-hACE2蛋白；图5e为640nm激发下的Hela细胞成像，显示的是RBD(319-541)-Halo-640dye的荧光；图5f为图5d,e叠加的图像，可见图5d和图5e的荧光能够很好地重叠，证明了hACE2蛋白与RBD蛋白能够相互作用。
实施例12
新冠病毒S蛋白的检测
将Hela细胞传于2个共聚焦成像皿，24小时后用Lipo2000试剂瞬时转入PCMV-SNAP-hACE2质粒，37℃ 5％CO2培养箱中培养48小时。将SNAP-561荧光染料溶于DMEM高糖培养基中，终浓度为0.2μM。用该探针溶液孵育细胞15min，加入1mL DMEM培养基，然后2个成像皿分别加入RBD525-Halo-640dye至终浓度为20nM，同时，在第2个皿中加入新冠病毒S蛋白50nM。在37℃ 5％CO2培养箱中孵育30min。用荧光共聚焦显微镜在10倍镜下成像，如图6所示。图6中第一行为640nm激发的RBD525-Halo蛋白成像通道，第二行为561nm激发的SNAP-ACE2蛋白的成像通道，其中图6a只加入20nM RBD525-Halo-640dye；图6b加入20nM RBD525-Halo-640dye和50nM新冠病毒S蛋白，其成像的红色通道的细胞荧光与图6a比减弱，从而检测S蛋白。
实施例13
假病毒的检测
将Hela细胞传于4个共聚焦成像皿，24小时后用Lipofectamine2000试剂瞬时转入PCMV-SNAP-hACE2质粒，37℃ 5％CO2培养箱中培养48小时。将SNAP-561荧光染料溶于DMEM高糖培养基中，终浓度为0.2μM。用该探针溶液孵育细胞30min。成像皿1和3加入1mL DMEM培养基，成像皿2和4加0.5mL DMEM和0.5mL假病毒(假病毒母液浓度为3E+10TU/mL)，第1和2成像皿分别加入RBD525-Halo-640dye至终浓度为20nM，第3和第4个成像皿分别加入RBD541-Halo-640dye至终浓度为20nM。培养箱中孵育60min。用荧光共聚焦显微镜在10倍镜下成像，如图7所示。
图7中第一行为640nm激发的RBD-Halo蛋白成像通道，第二行为561nm激发的SNAP-ACE2蛋白的成像通道，其中图7a只加入20nM RBD525-Halo-640dye；图7b加入20nM RBD525-Halo-640dye和假病毒溶液，可见其红色通道的细胞荧光微弱，说明假病毒有抑制ACE2和RBD525结合的作用；图7c加入20nM RBD541-Halo-640dye；图7d加入20nM RBD541-Halo-640dye和假病毒溶液，可见其红色通道的细胞荧光微弱，说明假病毒有抑制ACE2和RBD541结合的作用。证明了本发明构建的方法能够通过检测活细胞内的RBD通道的荧光信号的变化来检测假病毒。
实施例14
hACE2和标签蛋白融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化
用常规分子克隆方法先将hACE2的非跨膜区域M1-S740氨基酸的cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将C端带有6His的SNAP标签蛋白的cDNA亚克隆到hACE2的C端，得到pCMV-hACE2-SNAP-6His。用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-hACE2-SNAP-6His，然后用Ni-NTA柱子纯化蛋白，用含200mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量约为117.4kDa的目的蛋白hACE2-SNAP约0.65mg。
实施例15
荧光标记hACE2-SNAP蛋白并纯化
hACE2-SNAP蛋白溶于PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液中，制成0.25mg/mL的母液。SNAP560荧光染料溶于DMSO配置成2mM的母液。取hACE2-SNAP蛋白溶液100μL，加入SNAP560荧光染料0.32μL，使得蛋白与探针的摩尔比值为1:3，室温下反应1小时得到hACE2-SNAP-560dye。然后用PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液过葡聚糖凝胶柱G-25除盐，洗脱下来的hACE2-SNAP-560dye用浓缩柱浓缩，用考马斯亮蓝染色法测出纯化后的hACE2-SNAP-560dye蛋白浓度为0.18mg/mL，摩尔浓度约为1.7μM。
取hACE2-SNAP和hACE2-SNAP-560dye少量，跑SDS-PAGE电泳，其考马斯亮蓝染色图像以及紫外光激发成像如图8所示。图8的左图为考马斯亮蓝染色，右图为紫外激发的荧光成像，其中第1和2道分别为hACE2-SNAP和hACE2-SNAP-560dye。蛋白hACE2-SNAP的分子量约为117.4kDa，略大于标准蛋白116.0kDa，荧光标记后的hACE2-SNAP-560dye在紫外光激发下显示出黄红色的荧光。
实施例16
hACE2和标签蛋白融合表达载体的构建，蛋白的表达与纯化
用常规分子克隆方法先将hACE2的非跨膜区域M1-S740氨基酸的cDNA亚克隆到商业pcDNA3.1载体中，然后将N端带有10His的SNAP标签蛋白的cDNA亚克隆到hACE2的N端信号肽(hACE2的第1-51个碱基为信号肽)之后，得到pCMV-10His-SNAP-hACE2。用常规真核HEK293T细胞过表达pCMV-10His-SNAP-hACE2，然后用Ni-NTA柱子纯化蛋白，用含200mM咪唑盐的PBS缓冲液洗脱柱子，得到分子量为117.4kDa的目的蛋白SNAP-hACE2约0.7mg。
实施例17
荧光标记SNAP-hACE2蛋白并纯化
SNAP-hACE2蛋白溶于PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液中，制成1.5mg/mL的母液。SNAP560荧光染料溶于DMSO配置成2mM的母液。取SNAP-hACE2蛋白溶液20μL，加入SNAP560荧光染料0.4μL，使得蛋白与探针的摩尔比值为1:3，室温下反应1小时得到SNAP-hACE2-560dye。然后用PBS(20mM，pH＝7.4)缓冲液过葡聚糖凝胶柱G-25除盐，洗脱下来的SNAP-hACE2-560dye用浓缩柱浓缩，用考马斯亮蓝染色法测出纯化后的SNAP-hACE2-560dye蛋白浓度为0.37mg/mL，摩尔浓度约为3.2μM。
取SNAP-hACE2和SNAP-hACE2-560dye少量，跑SDS-PAGE电泳，其考马斯亮蓝染色图像以及紫外光激发成像如图8所示。图8的左图为考马斯亮蓝染色，右图为紫外激发的荧光成像，其中第3和4道分别为SNAP-hACE2和SNAP-hACE2-560dye。蛋白SNAP-hACE2的分子量约为117.4kDa，略大于标准蛋白116.0kDa，荧光标记后的SNAP-hACE2-560dye在紫外光激发下显示出黄红色的荧光。
实施例18
SNAP-hACE2-560Dye与RBD525-Halo-640Dye相互作用荧光检测。
在PBS(20mM,pH＝7,4)缓冲液中配置SNAP-hACE2-560Dye母液3.5μM，RBD525-Halo-640Dye母液4.2μM。在96孔板A1孔加7μL SNAP-hACE2-560Dye和43μLPBS缓冲液，A2孔中加入6μL RBD525-Halo-640Dye和44μL PBS缓冲液，A3孔中加入7μL SNAP-hACE2-560Dye，6μL RBD525-Halo-640Dye，和37μL PBS缓冲液。使得A1，A2，和A3孔中的SNAP-hACE2-560Dye和RBD525-Halo-640Dye均为0.5μM。静置10分钟后，在500nm激发光下检测A1,A2,和A3孔的荧光光谱，得到图9。
图9中，黑色实线为500nm激发下SNAP-hACE2-560Dye荧光光谱，且在590nm左右发射较强的荧光；黑色虚线为500nm激发下RBD525-Halo-640Dye荧光光谱，在670nm左右发射较弱的荧光；黑色点连成的线为500nm激发下SNAP-hACE2-560Dye和RBD525-Halo-640Dye相互作用之后的荧光光谱，其在590nm左右的发射峰强度比黑色实线弱，而670nm左右发射峰强度比黑色点线强，说明hACE2和RBD蛋白相互作用时，560Dye和640Dye之间发生荧光共振能量转移。
实施例19
假病毒的检测
在PBS(20mM,pH＝7,4)缓冲液中配置SNAP-hACE2-560Dye母液3.5μM，RBD525-Halo-640Dye母液4.2μM。在96孔板A1孔加入7μL SNAP-hACE2-560Dye，6μL RBD525-Halo-640Dye，和37μL PBS缓冲液。A2孔中加入7μL SNAP-hACE2-560Dye，6μL RBD525-Halo-640Dye，30μL假病毒溶液(3E+10TU/mL)和7μL PBS缓冲液，使得A1和A2孔中的SNAP-hACE2-560Dye和RBD525-Halo-640Dye均为0.5μM。静置20分钟后，在520nm激发光下检测A1和A2孔的荧光光谱，得到图10。
图10中，黑色实线为520nm激发下SNAP-hACE2-560Dye和RBD525-Halo-640Dye相互作用之后的荧光光谱，黑色虚线为520nm激发下SNAP-hACE2-560Dye，RBD525-Halo-640Dye和假病毒，三者相互作用之后的荧光光谱，其在590nm左右的发射峰强度比黑色实线的增强，而670nm左右发射峰强度比黑色实线的弱，说明假病毒抑制了hACE2和RBD蛋白的相互作用时，因此560Dye和640Dye之间发生的荧光共振能量转移效率减弱。同时，证明了这一体系可以用于假病毒的检测。

Claims (10)

1.一种基于RBD与ACE2相互作用实时检测新型冠状病毒刺突蛋白的方法，其特征在于，该方法通过实时采集新冠病毒RBD与人源ACE2蛋白相互作用时荧光信号的变化来检测病毒S蛋白，通过检测新冠病毒S蛋白抑制RBD-hACE2的相互作用而产生差异的荧光信号进而实现新冠病毒S蛋白的快速检测。
2.根据权利要求1所述的实时检测新型冠状病毒刺突蛋白的方法，其特征在于，该方法在活细胞内通过荧光显微镜观察RBD-hACE2相互作用实现检测；或者应用荧光检测仪器在体外检测RBD-hACE2相互作用时产生的差异的荧光共振能量转移(FRET)的信号来检测新冠病毒S蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种基于RBD与ACE2相互作用实时检测新型冠状病毒刺突蛋白的方法，其特征在于，在活细胞内检测新冠病毒S蛋白的步骤如下：
(1)在细胞内过表达hACE2蛋白质粒；
(2)加入含上述标签蛋白专一底物的荧光分子，孵育5-30min，洗一遍；
(3)对照组加入荧光标记的RBD蛋白，检测组加入待测样品和荧光标记的RBD蛋白的混合物，孵育5-30min；
(4)荧光成像，观察荧光变化。
4.根据权利要求2所述的一种基于RBD与ACE2相互作用实时检测新型冠状病毒刺突蛋白的方法，其特征在于，在体外检测的步骤如下：
(1)分别用FRET给-受体荧光分子标记hACE2和新冠病毒RBD蛋白；
(2)对照组只加入荧光标记后的hACE2和RBD蛋白，检测组加入荧光标记后的hACE2和RBD蛋白的同时加入待测样品；
(3)采集荧光光谱，分析数据，得出检测结果。
5.根据权利要求3或4所述的基于RBD与ACE2相互作用实时检测新型冠状病毒刺突蛋白的方法，其特征在于：所述的hACE2蛋白为hACE2与标签蛋白的融合蛋白，是分别将SNAP、Halo或者CLIP标签蛋白融合在hACE2蛋白的N端或者C端。
6.根据权利要求3或4所述的一种基于RBD与ACE2相互作用实时检测新型冠状病毒刺突蛋白的方法，其特征在于：所述的RBD蛋白为新型冠状病毒的S蛋白的RBD片段与标签蛋白的融合蛋白，是分别将SNAP、Halo或者CLIP标签蛋白融合在RBD蛋白的N端或者C端。
7.根据权利要求3或4所述的一种基于RBD与ACE2相互作用实时检测新型冠状病毒刺突蛋白的方法，其特征在于：所述的荧光分子为带有标签蛋白专一底物的荧光分子。
8.根据权利要求3所述的一种基于RBD与ACE2相互作用实时检测新型冠状病毒刺突蛋白的方法，其特征在于：步骤(4)所述通过荧光成像检测S蛋白，具体的分析方法为：统计1-100个过表达hACE2细胞的hACE2和RBD通道的平均荧光强度
Figure FDA0002695751810000021
和
Figure FDA0002695751810000022
以及成像图片背景的平均荧光强度得到
Figure FDA0002695751810000023
和
Figure FDA0002695751810000024
Figure FDA0002695751810000025
以对照组的IFRBD/IFhACE2作为标准，检测组细胞成像的IFRBD/IFhACE2与该值作对比。若检测组的数值小于标准值，所测样品为含病毒S蛋白的样品；若检测组的数值大于或者等于标准值，所测则为不含病毒S蛋白的样品。
9.一种如权利要求1-8任一所述方法用于新型冠状病毒的检测。
10.一种如权利要求1-8任一所述方法在新型冠状病毒检测试剂中的应用。
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