CN113336859B

CN113336859B - 一种识别cd105的生物探针

Info

Publication number: CN113336859B
Application number: CN202110568429.0A
Authority: CN
Inventors: 刘波; 姜清云; 李娜; 张郑瑶; 张航与
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2021-05-25
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2041-05-25
Also published as: CN113336859A

Abstract

本发明属于细胞生物学及分子生物学技术领域，涉及一种识别CD105的生物探针，其是基于环化重排荧光蛋白技术和亚克隆技术设计制备的生物探针。该探针包括环化重排荧光蛋白和识别CD105的互作蛋白两个部分，与表达载体质粒构成重组质粒。将探针转染到活细胞后，能够在活细胞内自行表达，当细胞有CD105表达时，探针显示出荧光，即可通过动态实时检测荧光信号有无来反应细胞膜蛋白CD105变化，实现无损伤可视化检测CD105；也可通过原核表达系统实现探针融合蛋白表达，进而通过扫描荧光发射波长强度检测CD105，进而实现检测液体中的CD105。

Description

一种识别CD105的生物探针

技术领域

本发明属于细胞生物学及分子生物学技术领域，涉及一种识别CD105的生物探针，具体地，涉及一种基于环化重排荧光蛋白(circularly permuted fluorescent proteins,cpFP)技术的检测细胞膜蛋白CD105的生物探针。

背景技术

CD105也称为endoglin，是透明带蛋白(ZP)家族的一种90kDa的I型跨膜糖蛋白糖蛋，同时它也是TGFβ超家族配体的Ⅲ型受体蛋白。CD105在增生的血管内皮细胞、软骨细胞和合体滋养层细胞上高表达，在造血干细胞、间充质干细胞和神经嵴干细胞、活化的单核细胞以及淋巴和髓系白血病细胞上亦有表达。因此CD105的检测对于多种细胞鉴定以及肿瘤等方面应用十分广泛，目前其检测手段虽多样化，但原理都是基于抗原抗体反应，存在准确率低、无法实现无损伤检测以及高成本等缺点。因此，本发明提出一种基于荧光技术的生物探针，用于检测细胞膜蛋白CD105。它具有时间分辨率高、成本低、精准实现单细胞水平的无伤检测等优点。

发明内容

本发明提供一种基于cpFP技术的检测细胞膜蛋白CD105的生物探针，其基于环化重排荧光蛋白(circularly permuted fluorescent proteins,cpFP)技术和生物工程亚克隆技术设计制备探针工具。该生物探针蛋白在活细胞内可自行表达，基于蛋白构象与互作特异蛋白的关系，通过荧光信号的有无及强度定量地反映活细胞膜蛋白CD105的表达水平，应用于活细胞内检测CD105；也可通过原核表达系统实现探针融合蛋白表达，进而通过扫描荧光发射波长强度实现检测CD105，应用于液体中的CD105检测。

本发明通过构建生物探针，基于特异性互作蛋白特异性，实现细胞膜蛋白CD105的可视化。CD105蛋白可视化cpFP探针工具包含环化重排荧光蛋白、骨形态发生蛋白(bonemorphogenetic protein,BMP)与CD105特异性互作的结构域两个部分，运用亚克隆技术，即聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)、核酸特异性酶切和连接实验技术，对这两个部分的DNA序列进行剪切和拼接重构，并与pcDNA3.1(+)或pRSET-B载体形成重组质粒也可直接通过基因合成构成重组质粒。其中探针设计截取的BMP9序列仅为其与CD105结合的必需部分，其可以特异性与细胞膜蛋白CD105结合，减少使用BMP9序列全长而导致的多实验难点以及其他结构域有可能其他蛋白结合的干扰。检测原理为，当检测结构域BMP9-R和BMP9-F特异性与CD105结合后，荧光蛋白形成闭合环状结构后发出荧光，从而实现检测CD105的目的。

本发明的技术方案为：

一种识别CD105的生物探针，其为基于cpFP技术的检测细胞膜蛋白CD105的生物探针，如图1(a)所示，其包括环化重排荧光蛋白cpFP以及识别目的蛋白的互作蛋白BMP9-R和BMP9-F，其中，环化重排荧光蛋白cpFP是利用一段接头(Linker)将荧光蛋白本体FP原有的N和C端连接，并在其发色团附近重新打开一个N和C端，从而形成环化重排荧光蛋白cpFP。

其中，BMP9-R蛋白功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸如SEQ IDNO.4所示。

BMP9-F蛋白功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸如SEQ ID NO.6所示。

接头(Linker)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸如SEQ ID NO.8所示。

BMP9-R的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：

QTLVHLKFPTKVGKACCVPTKLSPISVLYKDDMGVPTLKYHYEGMSVAECGCR

对应的DNA序列(SEQ ID NO.4)：

CAGACCCTGGTGCATCTCAAGTTCCCCACAAAGGTGGGCAAGGCCTGCTGTGTGCCCACCAAACTGAGCCCCATCTCCGTCCTCTACAAGGATGACATGGGGGTGCCCACCCTCAAGTACCATTACGAGGGCATGAGCGTGGCAGAGTGTGGGTGCAGG

BMP9-F氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：

SHCQKTSLRVNFEDIGWDSWIIAPKEYEAYECKGGCFFPLADDVTPTKHAIV

对应的DNA序列(SEQ ID NO.6)：

AGCCACTGTCAAAAGACCTCCCTGCGGGTAAACTTCGAGGACATCGGCTGGGACAGCTGGATCATTGCACCCAAGGAGTATGAAGCCTACGAGTGTAAGGGCGGCTGCTTCTTCCCCTTGGCTGACGATGTGACGCCGACGAAACACGCTATCGTG

Linker氨基酸序列为(SEQ ID NO.7)：

GGTGGS

对应的DNA序列为(SEQ ID NO.8)：

GGCGGCACCGGCGGCAGC

进一步地，所述的环化重排荧光蛋白cpFP的荧光蛋白本体选自蓝色荧光蛋白(bluefluorescent protein,BFP)、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)及其变体(EGFP,mClover3,mNeonGreen,mCerulean和mVenus)、红色荧光蛋白(red fluorescentprotein,RFP)及其变体(mCherry,mRuby3,mRuby2和mRuby)、青色荧光蛋白(cyanfluorescent protein,CFP)及其变体(mTurquoise2,mCerulean3,mTFP1,Aquamarine和ECFP)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)及其变体(EYFP,Venus,Citrine,sEYFP和YPet)；以上荧光蛋白作为本体，进行环化重排而形成新的不同颜色的cpFP，作为识别CD105的生物探针中的环化重排荧光蛋白cpFP部分。

在一个优选的实施方案中，所述的环化重排荧光蛋白cpFP的荧光蛋白本体为发射红色荧光的mCherry荧光蛋白。

在一个优选的实施方案中，识别CD105的生物探针，即基于cpFP技术的检测细胞膜蛋白CD105的生物探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基于cpFP技术的检测细胞膜蛋白CD105的生物探针完整氨基酸序列为(SEQ IDNO.1)：

QTLVHLKFPTKVGKACCVPTKLSPISVLYKDDMGVPTLKYHYEGMSVAECGCRLARQGAYNVDIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEVRHSTGGMDELYKGGTGGSMVSKGVEDNMAFIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQLMYGSKAYVKHPADIPDYWKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNGIDSHCQKTSLRVNFEDIGWDSWIIAPKEYEAYECKGGCFFPLADDVTPTKHAIV

基于cpFP技术的检测细胞膜蛋白CD105的生物探针完整核苷酸序列为(SEQ IDNO.2)：

CAGACCCTGGTGCATCTCAAGTTCCCCACAAAGGTGGGCAAGGCCTGCTGTGTGCCCACCAAACTGAGCCCCATCTCCGTCCTCTACAAGGATGACATGGGGGTGCCCACCCTCAAGTACCATTACGAGGGCATGAGCGTGGCAGAGTGTGGGTGCAGGTTGGCGCGCCAAGGCGCCTACAACGTGGACATCAAGCTGGACATCACCAGCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAGCAGTACGAGAGGGCCGAGGTGAGGCACAGCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGCGGCACCGGCGGCAGCATGGTGAGCAAGGGCGTGGAGGACAACATGGCCTTCATCAAGGAGTTCATGAGGTTCAAGGTGCACATGGAGGGCAGCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCAGGCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGAGCCCCCAGCTGATGTACGGCAGCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTGGAAGCTGAGCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGAGGGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACAGCAGCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGAGGGGCACCAACTTCCCCAGCGACGGCCCCGTGATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCAGCAGCGAGAGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCCGAGGTGAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGGCATCGATAGCCACTGTCAAAAGACCTCCCTGCGGGTAAACTTCGAGGACATCGGCTGGGACAGCTGGATCATTGCACCCAAGGAGTATGAAGCCTACGAGTGTAAGGGCGGCTGCTTCTTCCCCTTGGCTGACGATGTGACGCCGACGAAACACGCTATCGTG

另一方面，本发明提供了一种重组质粒，其包含编码上述的识别CD105的生物探针的核苷酸序列。

进一步地，编码识别CD105的生物探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述的重组质粒的载体为真核表达载体或者原核表达载体。其中，真核表达载体选自pcDNA3.1(+)载体、pcDNA^TM 3.3载体、pCMVp-NEO-BAN载体和CMV4载体；原核表达载体选自pET-32a(+)载体、pET-30a载体、pRSET-B载体和PGEX载体。

在一个优选的实施方案中，所述的重组质粒的载体为pcDNA3.1(+)载体或者pRSET-B载体。

本发明的有益效果：

本发明提供一种基于cpFP技术的检测细胞膜蛋白CD105可视化检测的生物探针，该探针将CD105蛋白是否表达及表达量变化通过荧光信号有无和强度反映出来，从而实现膜蛋白CD105的可视化检测。将构建的探针工具转染入活细胞，自行表达出荧光蛋白重构融合探针结构，使用荧光显微镜或荧光分光光度仪动态检测分析荧光信号的变化，从而检测细胞膜蛋白CD105表达变化。该探针实现了在活体细胞内及细胞外动态检测膜蛋白CD105表达水平，具有操作简便、成本低、对细胞无损伤、核查结果简单等特点，为研究检测细胞膜蛋白CD105提供了一种可视化监测工具。

附图说明

图1(a)是基于cpFP技术的检测细胞膜蛋白CD105生物探针结构图。

图1(b)是基于cpFP技术的检测细胞膜蛋白CD105生物探针的工作原理图。

图2(a)至图2(c)是基于cpFP技术的检测细胞膜蛋白CD105生物探针转入不同细胞的荧光图像。

图3(a)是基于cpFP技术的检测细胞膜蛋白CD105生物探针在不同蛋白下荧光光谱扫描结果。

图3(b)是基于cpFP技术的检测细胞膜蛋白CD105生物探针在不同pH值下荧光光谱扫描结果。

图3(c)是基于cpFP技术的检测细胞膜蛋白CD105生物探针在不同温度下荧光光谱扫描结果。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

本发明主要通过在武汉金开瑞公司合成探针DNA序列获得重组质粒，然后将重组质粒转化入DH5α进行筛选和扩增等实验获取目的探针。

测试例

通过实施例中武汉金开瑞公司合成序列构成重组质粒，基于蛋白构象与互作特异蛋白的关系和cpFP原理检测细胞膜蛋白CD105。将构建的探针转染入活细胞，细胞自行翻译表达出重构融合探针蛋白结构，使用荧光显微镜动态检测荧光信号变化，通过荧光信号有无及强度来检测细胞膜有无CD105表达和表达水平的变化；同时可将探针转入原核表达感受态BL21中表达和纯化探针融合蛋白后，利用荧光光度仪检测荧光蛋白发射波长强度即可检测液体中细胞膜蛋白CD105。

测试例1：

使用脂质体转染法将本实施例中制备的探针转染到活细胞体内后，细胞能够表达出重构的融合荧光蛋白。本探针具有稳定性特征，可以在多种活细胞体内工作，在人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、人软骨细胞C-28/I2 CELL、间充质干细胞MSCs内都能正常表达并产生荧光，如图2(a)至图2(c)所示。

测试例2：

将探针利用原核表达系，即利用BL21感受态将探针融合蛋白进行表达后，提纯获得探针融合蛋白，在体外利用不同细胞膜蛋白来检测探针的特异性实验中，结果表明探针可特异性检测CD105如图3(a)所示；在检测探针在不同温度和pH值下检测CD105稳定性实验中，也发现探针具有良好稳定性如图3(b)和图3(c)所示。

综上，本探针转染细胞后可以在活细胞内稳定表达探针蛋白，对转染后的细胞给予580nm波长的激发光，利用荧光显微镜同时采集610nm波长的发射荧光图像，通过发射荧光信号的有无来检测细胞膜蛋白CD105，当出现红色荧光则表明细胞有CD105表达，否则，则表明细胞无CD105表达；同时当将本探针利用原核表达系统表达提纯后，利用荧光分光度仪，扫描不同激发波长下的荧光蛋白发射波长的荧光强度值即可检测液体中是否含有CD105。

以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。

序列表

<110> 大连理工大学

<120> 一种识别CD105的生物探针

<130> 2021

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 识别CD105的生物探针氨基酸序列

<400> 1

Gln Thr Leu Val His Leu Lys Phe Pro Thr Lys Val Gly Lys Ala Cys

1 5 10 15

Cys Val Pro Thr Lys Leu Ser Pro Ile Ser Val Leu Tyr Lys Asp Asp

20 25 30

Met Gly Val Pro Thr Leu Lys Tyr His Tyr Glu Gly Met Ser Val Ala

35 40 45

Glu Cys Gly Cys Arg Leu Ala Arg Gln Gly Ala Tyr Asn Val Asp Ile

50 55 60

Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Glu Arg Ala Glu Val Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu

85 90 95

Tyr Lys Gly Gly Thr Gly Gly Ser Met Val Ser Lys Gly Val Glu Asp

100 105 110

Asn Met Ala Phe Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu

115 120 125

Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly

130 135 140

Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly

145 150 155 160

Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Leu Met Tyr

165 170 175

Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Trp

180 185 190

Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe

195 200 205

Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp

210 215 220

Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser

225 230 235 240

Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser

245 250 255

Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln

260 265 270

Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr

275 280 285

Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Gly

290 295 300

Ile Asp Ser His Cys Gln Lys Thr Ser Leu Arg Val Asn Phe Glu Asp

305 310 315 320

Ile Gly Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr

325 330 335

Glu Cys Lys Gly Gly Cys Phe Phe Pro Leu Ala Asp Asp Val Thr Pro

340 345 350

Thr Lys His Ala Ile Val

355

<210> 2

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 识别CD105的生物探针核苷酸序列

<400> 2

cagaccctgg tgcatctcaa gttccccaca aaggtgggca aggcctgctg tgtgcccacc 60

aaactgagcc ccatctccgt cctctacaag gatgacatgg gggtgcccac cctcaagtac 120

cattacgagg gcatgagcgt ggcagagtgt gggtgcaggt tggcgcgcca aggcgcctac 180

aacgtggaca tcaagctgga catcaccagc cacaacgagg actacaccat cgtggagcag 240

tacgagaggg ccgaggtgag gcacagcacc ggcggcatgg acgagctgta caagggcggc 300

accggcggca gcatggtgag caagggcgtg gaggacaaca tggccttcat caaggagttc 360

atgaggttca aggtgcacat ggagggcagc gtgaacggcc acgagttcga gatcgagggc 420

gagggcgagg gcaggcccta cgagggcacc cagaccgcca agctgaaggt gaccaagggc 480

ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg agcccccagc tgatgtacgg cagcaaggcc 540

tacgtgaagc accccgccga catccccgac tactggaagc tgagcttccc cgagggcttc 600

aagtgggaga gggtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg tgaccgtgac ccaggacagc 660

agcctgcagg acggcgagtt catctacaag gtgaagctga ggggcaccaa cttccccagc 720

gacggccccg tgatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg ccagcagcga gaggatgtac 780

cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc aagcagaggc tgaagctgaa ggacggcggc 840

cactacgacg ccgaggtgaa gaccacctac aaggccaaga agcccgtgca gctgcccggc 900

gcctacaacg gcatcgatag ccactgtcaa aagacctccc tgcgggtaaa cttcgaggac 960

atcggctggg acagctggat cattgcaccc aaggagtatg aagcctacga gtgtaagggc 1020

ggctgcttct tccccttggc tgacgatgtg acgccgacga aacacgctat cgtg 1074

<210> 3

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BMP9-R的氨基酸序列

<400> 3

Gln Thr Leu Val His Leu Lys Phe Pro Thr Lys Val Gly Lys Ala Cys

1 5 10 15

Cys Val Pro Thr Lys Leu Ser Pro Ile Ser Val Leu Tyr Lys Asp Asp

20 25 30

Met Gly Val Pro Thr Leu Lys Tyr His Tyr Glu Gly Met Ser Val Ala

35 40 45

Glu Cys Gly Cys Arg

50

<210> 4

<211> 159

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BMP9-R的核苷酸序列

<400> 4

cagaccctgg tgcatctcaa gttccccaca aaggtgggca aggcctgctg tgtgcccacc 60

aaactgagcc ccatctccgt cctctacaag gatgacatgg gggtgcccac cctcaagtac 120

cattacgagg gcatgagcgt ggcagagtgt gggtgcagg 159

<210> 5

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BMP9-F的氨基酸序列

<400> 5

Ser His Cys Gln Lys Thr Ser Leu Arg Val Asn Phe Glu Asp Ile Gly

1 5 10 15

Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Glu Cys

20 25 30

Lys Gly Gly Cys Phe Phe Pro Leu Ala Asp Asp Val Thr Pro Thr Lys

35 40 45

His Ala Ile Val

50

<210> 6

<211> 156

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BMP9-F的核苷酸序列

<400> 6

agccactgtc aaaagacctc cctgcgggta aacttcgagg acatcggctg ggacagctgg 60

atcattgcac ccaaggagta tgaagcctac gagtgtaagg gcggctgctt cttccccttg 120

gctgacgatg tgacgccgac gaaacacgct atcgtg 156

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Linker氨基酸序列

<400> 7

Gly Gly Thr Gly Gly Ser

1 5

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Linker核苷酸序列

<400> 8

ggcggcaccg gcggcagc 18

Claims

1.一种识别CD105的生物探针，其特征在于，所述的识别CD105的生物探针的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述的识别CD105的生物探针包括环化重排荧光蛋白、以及与环化重排荧光蛋白相互连接的识别目的蛋白CD105的互作蛋白BMP9-R蛋白功能结构域和BMP9-F蛋白功能结构域；其中，

BMP9-R蛋白功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示；

BMP9-F蛋白功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。

2.一种重组质粒，其包含编码权利要求1所述的识别CD105的生物探针的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，编码识别CD105的生物探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

4.根据权利要求2或3所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒的载体为真核表达载体或者原核表达载体；其中，

真核表达载体选自pcDNA3.1（+）载体、pcDNA™ 3.3载体、pCMVp-NEO-BAN载体和CMV4载体；

原核表达载体选自pET-32a(+)载体、pET-30a载体、pRSET-B载体和PGEX载体。

5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒的载体为pcDNA3.1（+）载体或者pRSET-B载体。