KR20180112723A

KR20180112723A - 프로테아제 활성 분석용 프로브 및 이를 이용한 분석 방법

Info

Publication number: KR20180112723A
Application number: KR1020180039131A
Authority: KR
Inventors: 김영필; 이하원
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2017-04-04
Filing date: 2018-04-04
Publication date: 2018-10-12
Also published as: KR102018249B1

Abstract

본 발명은 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브, 상기 바이오 프로브를 이용한 프로테아제 활성 분석방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오 프로브는 프로테아제 존재시 프로테아제의 타겟 펩타이드의 절단으로 인해 발생하는 형광 공명 에너지 전이를 통해 프로테아제의 활성을 안정적이면서 간편하게 시각화할 수 있는 장점이 있다.

Description

프로테아제 활성 분석용 프로브 및 이를 이용한 분석 방법{A probe for analyzing the protease activity and detection method of protease using the same}

본 발명은 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브, 상기 바이오 프로브를 이용한 프로테아제 활성 분석방법에 관한 것이다.

프로테아제(protease)는 단백질을 분해하는 효소로써 인체의 생리학적 진행(단백질 이화작용, 혈액응고, 세포 성장과 이동, 단백질의 활성화, 세포조절과 신호, 조직의 발달) 및 병리학적 진행(염증, 암의 발생과 전이, 바이러스 감염)에 있어 핵심적인 역할을 수행한다. 따라서 프로테아제의 활성을 측정하는 것은 질병을 조기에 진단하거나 질병 관련 프로테아제의 활성을 저해하는 저해제를 의약품으로 개발할 수 있어 중요하다.

프로테아제의 활성을 측정하는 방법은 크게 기질의 종류에 따라 측정하고자 하는 프로테아제의 측정 단백질 전체를 이용하는 법과 프로테아제에 의해 분해되는 특정 아미노산 서열을 가진 합성 펩타이드를 이용하는 법으로 나눌 수 있다. 프로테아제의 기질 단백질 전체를 이용하는 방법은 프로테아제에 의해 분해된 단백질의 양을 대부분 HPLC나 겔 전기영동으로 정량화해야 하므로 대량의 시료를 처리하기에는 적합하지 않으며, 민감도가 낮기 때문에 장시간의 활성 측정 시간을 필요로 하는 단점이 있다.

펩타이드를 기질로 이용하는 방법은 특정 프로테아제에 의해 펩타이드가 분해되면서 발생하는 시료의 색 변화 또는 형광의 증감 정도를 UV-Vis spectrophotometer나 Fluorometer로 측정하기 때문에 대량의 시료를 처리하기에 가장 적합한 방법이다. 상기의 프로테아제 활성 측정법은 기질 펩타이드의 염기서열에 따라 측정 감도의 차이가 있으나 최대 나노몰 농도의 측정 민감도를 나타낸다. 따라서 프로테아제 활성 측정 민감도를 피코몰 농도로 향상시키고 측정 시간을 단축하고자 하는 연구가 시도되고 있다. 대표적으로 루시퍼라제(luciferase)를 이용하여 형광의 세기를 증폭하는 방법이 있으나, 루시퍼라제를 이용하는 단백질 분해효소 활성 측정법은 피코몰 농도 수준의 민감도를 얻기 위하여 24시간 이상의 측정 시간을 필요로 한다. 형광 고분자 전해질을 이용하는 방법은 양의 전하를 갖는 기질 펩타이드를 음의 전하를 갖는 형광 고분자 전해질(polyelectrolytes)로부터 분리되면서 증감하는 형광의 세기를 측정하기 때문에 펩타이드의 전하가 중성에 가깝거나 시료의 염의 농도가 높은 경우에는 단백질 분해효소 활성 측정에 적합하지 않은 문제점을 가지고 있다.

또한 선행연구인 "Immobilizing Reporters for Molecular Imaging of the Extracellular Microenvironment in Living Animals(ACS Chem . Biol ., 2011, 6(10), 1117-1126)"의 경우 CNA35(Collagen-Binding Adhesion protein 35)를 활용하여 콜라겐-I에의 부착성을 활용하여 프로테아제의 활성을 분석하였다는 점에서 본 발명과 유사한 점이 있으나, 본 발명과는 프로브 구성 및 결합 방법에서 차이가 있다. 구체적으로 상기 선행연구의 경우, CNA35를 포함한 발광 단백질(에너지 공여체)을 발현 후에 단백질 표면에 많이 존재해 있는 라이신(lysine) 잔기에 기질 펩타이드가 결합된 발광소거제(quencher, 에너지 수용체)를 무작위적으로 결합하는 방법으로 프로브를 구성하였기 때문에 1) 단백질 표면에 결합되어 있는 기질 펩타이드 및 발광소거제의 비율과 개수를 정확히 예측하기가 어려워 프로테아제 활성의 정량 분석이 어려운 점, 2) 결합 과정 특성상 반응조건에 따라 단백질 대비 펩타이드 및 발광소거제 결합 정도가 매번 다를 수 있기 때문에 재현성 있는 프로브 제작이 어려운 점, 3) 무작위적 결합 방식에 의해서 발광 단백질이 아닌 형광 단백질을 사용할 경우 해리되지 않고 단백질 표면에 결합되어 남아있는 펩타이드로 인하여 형광 공명 에너지 변화가 크게 제한되므로 형광 단백질에 적용하기가 어렵다는 점, 4) FRET(fluorescence resonance energy transfer)이 아닌 BRET(bioluminescence resonance energy transfer)에 기반하여 발광 단백질의 기질을 지속적으로 공급해주어야 하기 때문에 장시간의 프로테아제 활성을 모니터링 하기에 어렵다는 단점이 있다.

한국등록특허 제10-1103548호 한국공개특허 제10-2012-0114329호

본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 노력한 결과, 세포외 기질에 존재하는 콜라겐에 높은 친밀도를 가지는 단백질, 형광단백질, 프로테아제의 타겟 펩타이드 및 유기형광염료를 포함하는 바이오 프로브에 프로테아제를 처리하면, 형광 공명 에너지 전이가 유도되어 이를 측정함으로써 안정적으로 세포외 기질로 분비되는 효소의 활성을 분석할 수 있다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에서는 상기와 같은 문제점들을 극복하기 위하여, 1) CNA35 단백질, 형광단백질(에너지 공여체), 기질 펩타이드, In 단백질을 하나의 벡터에 결합하여 대장균에서 손쉽게 대량발현 하고, 합성된 짧은 서열의 Ic-TAMRA (유기염료) 만을 상기 발현 단백질과 간단히 37℃의 온도 조건에서 2시간 동안 배양시키면 인테인 스플라이싱(intein splicing) 방법을 통해 빠르게 단백질 말단에 염료(dye)를 1:1로 결합시킴으로써 재현성 있고 빠른 결합 방법을 구축하였고, 2) 이를 프로테아제 활성에 활용할 경우 MMP-2 기질 펩타이드 전후에 존재하는 에너지 공여체와 에너지 수용체 에너지 간의 거리 변화가 명확하게 구분되므로 프로테아제 활성을 정량적으로 측정할 수 있게 된다. 3) 또한, 형광 단백질에 기반한 FRET 프로브로서 in vivo 연구에는 일부 제한이 될 수 있으나, 세포 배양시 분비되는 프로테아제의 활성을 장기간 모니터링 할 수 있다는 점을 제공하여 선행연구와의 주된 차이를 보이는 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 CNA35(Collagen-Binding Adhesion protein 35), 형광 단백질 및 프로테아제의 타겟 펩타이드를 포함하는 융합 단백질; 및 상기 타겟 펩타이드에 결합되어 있는 유기형광염료;를 포함하는 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적으로는 CNA35, 형광 단백질 및 프로테아제의 타겟 펩타이드를 포함하는 융합단백질을 생산하고, 상기 타겟 펩타이드에 유기형광염료를 특이적으로 결합시키는 것을 포함하는 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 바이오 프로브를 프로테아제가 포함된 시료에 처리하고, 상기 프로테아제에 의한 타겟 펩타이드의 절단에 의해 발생된 형광 공명 에너지 전이를 측정하는 것을 포함하는 프로테아제 활성 분석 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 바이오 프로브를 유효성분으로 포함하는 프로테아제 활성 분석용 조성물을 제공하는데 있다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는 프로테아제 활성 분석용 키트를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CNA35(Collagen-Binding Adhesion protein 35), 형광 단백질 및 프로테아제의 타겟 펩타이드를 포함하는 융합 단백질; 및 상기 타겟 펩타이드에 결합되어 있는 유기형광염료;를 포함하는 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브를 제공한다.

한 구체예에 있어서, 상기 바이오 프로브는 프로타아제에 의한 타겟 펩타이드의 절단시 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer; FRET)를 나타내는 것일 수 있다.

한 구체예에 있어서, 상기 프로테아제는 세포외 기질로 분비되는 것일 수 있다.

한 구체예에 있어서, 상기 프로테아제는 MMP 1, MMP 2, MMP 3, MMP 7, MMP 8 및 MMP 9으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

한 구체예에 있어서, 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광 단백질(ECFP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

한 구체예에 있어서, 상기 유기염료는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, VIC, JOE, ROX, HEX, NED, PET, LIZ, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

한 구체예에 있어서, 상기 형광 단백질과 유기염료는 형광 단백질과 유기염료는 에너지 공여체 및 에너지 수용체로서, 에너지 공여체의 방출 파장이 에너지 수용체의 흡수 파장과 10㎚ 이상 중첩되는 것인 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브 일 수 있다.

본 발명은 CNA35, 형광 단백질 및 프로테아제의 타겟 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 생산하고, 상기 타겟 펩타이드에 유기형광염료를 특이적으로 결합시키는 것을 포함하는 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브 제조방법을 제공한다.

한 구체예에 있어서, 상기 특이적 결합은 인테인 스플라이싱(intein splicing)을 이용하여 수행되는 것일 수 있다.

본 발명은 CNA35, 형광 단백질 및 프로테아제의 타겟 펩타이드를 포함하는 융합 단백질; 및 상기 타겟 펩타이드에 결합되어 있는 유기형광염료;를 포함하는 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브를 프로테아제가 포함된 시료에 처리하고, 상기 프로테아제에 의한 타겟 펩타이드의 절단에 의해 발생된 형광 공명 에너지 전이를 측정하는 것을 포함하는 프로테아제 활성 분석 방법을 제공한다.

본 발명은 CNA35, 형광 단백질 및 프로테아제의 타겟 펩타이드를 포함하는 융합 단백질; 및 상기 타겟 펩타이드에 결합되어 있는 유기형광염료;를 포함하는 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브를 유효성분으로 포함하는 프로테아제 활성 분석용 조성물을 제공한다.

본 발명은 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브를 유효성분으로 포함하는 프로테아제 활성 분석용 조성물을 포함하는 프로테아제 활성 분석용 키트를 제공한다.

본 발명의 바이오 프로브는 프로테아제 존재시 프로테아제의 타겟 펩타이드의 절단으로 인해 발생하는 형광 공명 에너지 전이를 통해 프로테아제의 활성을 안정적이면서 간편하게 시각화할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 세포외 기질로 분비되는 기질 분해 효소인 MMP-2를 측정하는 바이오 프로브의 제작 및 활용 모식도이다.
도 2a 내지 도 2d는 Ic-TAMRA 농도에 따른 CEM-I와 CEM-T의 반응 결과로, CEM-I의 크기는 77767.1 Da, CEM-Tsms 63481.8 Da를 크기를 가지며, Ic-TAMRA의 농도가 높아질수록 스플라이싱 및 형광 에너지 전이가 잘 일어나는 것을 확인한 결과이다(Peptide 1과 Peptide 2는 모두 Ic-TAMRA의 서열을 가지고 있는 동일한 펩타이드(peptide)로서, Peptide 1(Ic-TAMRA 서열 중 aspartic acid(D) 또는 asparagine(N)이 methionine(M)으로 치환된 서열이 일부 포함되어 있음)은 Peptide 2(Mass spectrometry 분석 결과 펩타이드 서열이 모두 맞음)에 비해 순도(purity)가 낮다는 차이점이 있음).
도 3a 내지 도 3b는 MMP-2 처리 시간, MMP-2 처리 농도에 따른 CEM-T의 형광 신호 변화를 측정한 결과이다.
도 4a 내지 도 4b는 콜라겐-I와 CEM-T의 결합을 확인한 결과이다.
도 5a 내지 도 5c는 MMP-2 처리시간 및 농도에 따른 CEM-T 형광 신호 변화 측정 결과이다. (5a) MMP-2 처리 농도가 높아질수록 CEM-T의 에너지 전이가 감소하는 것을 확인한 결과이다. (5b) 1.0ng/㎕ 농도의 MMP-2를 처리한 CEM-T의 형광분석기 이용 형광신호 변화 측정 결과이다. (5c) 2.0ng/㎕ 농도의 MMP-2를 처리한 CEM-T의 형광분석기 이용 형광신호 변화 측정 결과이다.
도 6a 내지 도 6c는 MMP-2를 과발현시킨 세포의 배양액에서 CEM-T의 활성을 측정한 결과이다.
도 7a 내지 도 7d는 MMP-2를 과발현시킨 세포의 배양액에서 장시간 동안의 CEM-T 바이오 프로브의 형광 신호 변화를 분석한 결과이다.
도 8은 MMP-2를 과발현시킨 세포에서 CEM-T의 활성 여부를 확인한 공초점 현미경(confocal microscope) 촬영 사진이다.
도 9는 세포 상에서 CEM-T의 콜라겐-Ⅰ과의 결합능 정도를 확인한 형광 현미경 촬영 사진이다.

본 발명자들은 세포외 기질에 존재하는 콜라겐에 높은 친밀도를 가지는 단백질, 형광 단백질 및 프로테아제의 타겟 펩타이드를 포함하는 융합 단백질 및 상기 타겟 펩타이드에 결합되어 있는 유기형광염료를 포함하는 바이오 프로브에 프로테아제를 처리하면 형광 공명 에너지 전이가 발생하고, 이를 측정함으로써 안정적으로 프로테아제의 활성을 측정할 수 있다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 CNA35, 형광 단백질 및 프로테아제의 타겟 펩타이드를 포함하는 융합 단백질; 및 상기 타겟 펩타이드에 결합되어 있는 유기형광염료;를 포함하는 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브를 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오 프로브는 프로타아제에 의한 타겟 펩타이드의 절단시 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer; FRET)를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 'CNA35(Collagen-Binding Adhesion protein 35)'는 세포외 기질에 풍부하게 존재하는 콜라겐에 높은 친밀도로 부착할 수 있는 단백질로, CNA35는 세포외 기질에 분포되어 있는 콜라겐에 부착됨으로써, 세포외 기질에서 안정적으로 고정시키기 위한 것일 수 있으며, 상기 콜라겐은 콜라겐-I일 수 있다.

본 발명의 '형광 공명 에너지 전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer; FRET)'는 서로 다른 발광 파장대의 두 형광물질 사이에서 발생하는 비방사성(non-radiative) 에너지 전이 현상으로, 여기(excitation)된 상태의 형광 공여체의 여기 준위 에너지가 형광수용체로 전달되어 형광 수용체로부터 발광(emission)이 관찰되거나, 형광 공여체의 형광감소가 관찰되는 현상이다.

본 발명의 '형광 단백질'은 외부에서 흡수한 에너지를 전달하는 물질로서 FRET의 원리상 형광 단백질과 융합된 융합 단백질을 말하며, 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광 단백질(ECFP) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 '유기염료'는 외부에서 흡수한 에너지를 전달하는 물질을 말하며, 형광물질 또는 광원으로부터 에너지 또는 빛을 흡수하는 물질을 의미한다. 상기 유기염료는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, VIC, JOE, ROX, HEX, NED, PET, LIZ, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 '프로테아제'는 MMP 1, MMP 2, MMP 3, MMP 7, MMP 8 및 MMP 9 등이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 '프로테아제의 타겟 펩타이드'는 프로테아제가 인식하여 절단시키는 절단 부위 펩타이드로서, 분석하고자 하는 목적의 프로테아제가 분해할 수 있는 어떠한 염기 또는 아미노산 서열도 포함할 수 있다.

한편, 상기 프로테아제는 세포외 기질로 분비되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 형광 단백질과 유기염료는 에너지 공여체 및 에너지 수용체로서, 에너지 공여체의 방출파장이 에너지 수용체의 흡수파장과 10㎚ 이상 중첩되는 것이면 사용 가능하다.

또 하나의 다른 양태로서, 본 발명은 CNA35, 형광 단백질 및 프로테아제의 타겟 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 생산하고, 상기 타겟 펩타이드에 유기형광염료를 특이적으로 결합시키는 것을 포함하는 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 바이오 프로브를 구성하는 융합 단백질은 CNA35, 형광 단백질 및 프로테아제의 타겟 펩타이드를 포함하고, 상기 타겟 펩타이드에 유기염료를 특이적으로 결합시키는 것을 포함하는 형태로서, 상기 형광 단백질과 유기염료는 프로테아제 타겟 펩타이드의 양 말단에 결합될 수 있다.

한편, 상기 특이적 결합은 인테인 스플라이싱(intein splicing)을 이용하여 수행되는 것일 수 있고, 인테인 스플라이싱을 이용하여 유기염료를 결합시킬 경우, 타겟 펩타이드의 말단에 보다 정확하게 결합시킬 수 있다.

본 발명의 '인테인(intein)'은 단백질이 완성된 형태의 모습으로 접히기(folding) 전에 단백질 전구체의 일부가 제거되는 해독 후 과정인 단백질 스플라이싱(splicing) 과정에서 잘려져 나가는 영역으로, 일부 단백질에서는 번역 후 전구체 단백질이 자기촉매반응에 의해 그 일부가 잘려지고 나머지 부분이 재결합하여 성숙 단백질이 되는 것으로 알려져있다. 이때 잘려지는 영역을 인테인(intein), 성숙 단백질로 남는 영역을 엑스테인(extein)이라고 한다.

또 하나의 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 바이오 프로브를 프로테아제가 포함된 시료에 처리하고, 상기 프로테아제에 의한 타겟 펩타이드의 절단에 의해 발생된 형광 공명 에너지 전이를 측정하는 것을 포함하는 프로테아제 활성 분석 방법을 제공한다.

본 발명의 '시료'는 분석하고자 하는 프로테아제를 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 조성물을 의미하며, 생물학적 시료일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

구체적으로, 시료 중의 프로테아제 활성 분석은 형광 단백질 및 유기염료의 발광량을 형광분석장비 등으로 측정함으로써 수행되며, 형광분석장비로는 필터방식 및 모노크롬 방식의 형광분광기 등을 이용할 수 있다. 이때, 시료 중 프로테아제가 존재하는 경우 상기 형광 단백질과 유기염료의 발광량 변화가 감지되는바, 이로써 프로테아제를 검출할 수 있게된다.

또 하나의 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 바이오 프로브를 유효성분으로 포함하는 프로테아제 활성 분석용 조성물을 제공한다.

또 하나의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 프로테아제 활성 분석용 키트를 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 세포외 기질 분해효소 측정용 바이오 프로브의 제작

1-1. 콜라겐 특이적 결합 단백질의 준비

세포외 기질에 안정적으로 고정되고 세포외액에 대한 저항성을 획득하기 위해, 세포외 기질에 풍부하게 존재하는 콜라겐에 높은 친밀도로 부착할 수 있는 단백질인 CNA35(Collagen-Binding Adhesion protein 35; 서열번호 1)를 준비하였다.

서열번호 1 (5'-3'):

gcacgagatatttcatcaacgaatgttacagatttaactgtatcaccgtctaagatagaagatggtggtaaaacgacagtaaaaatgacgttcgacgataaaaatggaaaaatacaaaatggtgacatgattaaagtggcatggccgacaagcggtacagtaaagatagagggttatagtaaaacagtaccattaactgttaaaggtgaacaggtgggtcaagcagttattacaccagacggtgcaacaattacattcaatgataaagtagaaaaattaagtgatgtttcgggatttgcagaatttgaagtacaaggaagaaatttaacgcaaacaaatacttcagatgacaaagtagctacgataacatctgggaataaatcaacgaatgttacggttcataaaagtgaagcgggaacaagtagtgttttctattataaaacgggagatatgctaccagaagatacgacacatgtacgatggtttttaaatattaacaatgaaaaaagttatgtatcgaaagatattactataaaggatcagattcaaggtggacagcagttagatttaagcacattaaacattaatgtgacaggtacacatagcaattattatagtggacaaagtgcaattactgattttgaaaaagcctttccaggttctaaaataactgttgataatacgaagaacacaattgatgtaacaattccacaaggctatgggtcatataatagtttttcaattaactacaaaaccaaaattacgaatgaacagcaaaaagagtttgttaataattcacaagcttggtatcaagagcatggtaaggaagaagtgaacgggaaatcatttaatcatactgtgcacaatattaatgctaatgccggtattgaaggtactgtaaaaggtgaattaaaagttttaaaacaggataaagataccaaggct

1-2. CEM -T 바이오 프로브 제작

6개의 히스티틴을 태그한 CNA35 유전자 서열에, EGFP(서열번호 2), MMP-2 기질(서열번호 3)과 N 말단의 npu DnaE 단백질 서열 Intein N(서열번호 4)을 유전자 재조합을 통해 융합시켜 CEM-I(CNA35-EGFP-MMP2S-InteinN; 서열번호 6) 단백질을 제조하였다. 상기 CEM-I를 1mM IPTG와 함께 20℃에서 16시간 반응시켜(IPTG induction) 박테리아 세포에서 융합 단백질을 과발현시킨 후, Ni-NTA 정제법을 이용하여 이를 정제하였다. 그 후 이 단백질을 PD-10 컬럼(Invitrogen)을 이용하여 스플라이싱 버퍼 (splicing buffer; 50 mM Tris (pH 7.2), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT)로 탈염(desalting) 하였다. 한편, ㈜펩트론을 통해 합성한 C 말단의 npu DnaE에 TAMRA 유기염료를 결합시킨 작은 크기의 펩타이드 Ic-TAMRA(서열번호 5)와 이 CEM-I 단백질을 스플라이싱 버퍼 상에서 37℃, 2시간 반응시켰을 때 그림과 같이 npu DnaE의 N 말단과 C 말단 단백질 간에 스플라이싱(splicing) 반응이 일어나서 원 단백질로부터 이탈하고, 그 자리에 TAMRA가 위치 특이적으로 수정(modify)되어 최종 산물인 CEM-T(CNA35-EGFP-MMP2S-TAMRA; 서열번호 7) 바이오 프로브가 형성된 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조). CEM-I 단백질은 77767.1 Da의 예측된 크기를 가지며, 스플라이싱 반응 후 TAMRA와 결합된 본 바이오 프로브 CEM-T는 63481.8 Da의 예측된 크기를 가지게 된다(도 2a 참조). 도 2b에 의하면 10 μM의 CEM-I 단백질과 0, 5, 10, 20, 40 uM의 Ic-TAMRA를 반응시켰을 때 Ic-TAMRA의 농도가 높아질수록 점점 CEM-T 프로브의 합성량이 증가하는 것을 확인하였고, 도 2c에서 특히 40 μM를 반응시켰을 때 위쪽의 초록 형광을 보이던 CEM-I 단백질이 거의 100% 가까이 사라지고 대신 아래쪽의 붉은 형광을 나타내는 CEM-T 프로브가 합성된 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 Ic-TAMRA의 농도가 높아질수록 스플라이싱 반응 및 에너지 전이가 더 잘 일어나는 것을 확인하였다.

서열번호 2 (5'-3'):

ggaggaggaggagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag

서열번호 3 (5'-3'):

ggaggaatcccagtgtccctgcgatccggaggagga

서열번호 4 (5'-3'):

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서열번호 5 (5'-3'):

DHNFALKNGFIASNCFNGTK-[TAMRA]

서열번호 6 (5'-3'):

atgcggggttctcatcatcatcatcatcatggtatggctagcgcacgagatatttcatcaacgaatgttacagatttaactgtatcaccgtctaagatagaagatggtggtaaaacgacagtaaaaatgacgttcgacgataaaaatggaaaaatacaaaatggtgacatgattaaagtggcatggccgacaagcggtacagtaaagatagagggttatagtaaaacagtaccattaactgttaaaggtgaacaggtgggtcaagcagttattacaccagacggtgcaacaattacattcaatgataaagtagaaaaattaagtgatgtttcgggatttgcagaatttgaagtacaaggaagaaatttaacgcaaacaaatacttcagatgacaaagtagctacgataacatctgggaataaatcaacgaatgttacggttcataaaagtgaagcgggaacaagtagtgttttctattataaaacgggagatatgctaccagaagatacgacacatgtacgatggtttttaaatattaacaatgaaaaaagttatgtatcgaaagatattactataaaggatcagattcaaggtggacagcagttagatttaagcacattaaacattaatgtgacaggtacacatagcaattattatagtggacaaagtgcaattactgattttgaaaaagcctttccaggttctaaaataactgttgataatacgaagaacacaattgatgtaacaattccacaaggctatgggtcatataatagtttttcaattaactacaaaaccaaaattacgaatgaacagcaaaaagagtttgttaataattcacaagcttggtatcaagagcatggtaaggaagaagtgaacgggaaatcatttaatcatactgtgcacaatattaatgctaatgccggtattgaaggtactgtaaaaggtgaattaaaagttttaaaacaggataaagataccaaggctggatccggaggaggaggagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagctcgagggaggaatcccagtgtccctgcgatccggaggaggactgcagtgtttaagctatgaaacggaaatattgacagtagaatatggattattaccgattggtaaaattgtagaaaagcgcatcgaatgtactgtttatagcgttgataataatggaaatatttatacacaacctgtagcacaatggcacgatcgcggagaacaagaggtgtttgagtattgtttggaagatggttcattgattcgggcaacaaaagaccataagtttatgactgttgatggtcaaatgttgccaattgatgaaatatttgaacgtgaattggatttgatgcgggttgataatttgccgaatatcaaaatagccacacgtaaatatttaggcaaacaaaatgtctatgacattggagttgagcgctga

서열번호 7 (5'-3'):

MRGSHHHHHHGMASARDISSTNVTDLTVSPSKIEDGGKTTVKMTFDDKNGKIQNGDMIKVAWPTSGTVKIEGYSKTVPLTVKGEQVGQAVITPDGATITFNDKVEKLSDVSGFAEFEVQGRNLTQTNTSDDKVATITSGNKSTNVTVHKSEAGTSSVFYYKTGDMLPEDTTHVRWFLNINNEKSYVSKDITIKDQIQGGQQLDLSTLNINVTGTHSNYYSGQSAITDFEKAFPGSKITVDNTKNTIDVTIPQGYGSYNSFSINYKTKITNEQQKEFVNNSQAWYQEHGKEEVNGKSFNHTVHNINANAGIEGTVKGELKVLKQDKDTKAGSGGGGVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKLEGGIPVSLRSGGGLQC-[TAMRA]

< 실시예 2> CEM -T 바이오 프로브와 MMP -2의 반응에 의한 형광 신호 변화 분석

상기 실시예 1에서 제작한 CEM-T 바이오 프로브가 MMP-2(Matrix metalloproteinase-2)와 반응하여 형광 공명 에너지 전이 상태가 변화하는지 시험하고자, 20 μM의 CEM-I 단백질과 40 μM의 Ic-TAMRA 단백질을 스플라이싱 버퍼에서 반응시켜 CEM-T 바이오 프로브를 합성한 후, 반응하지 않은 Ic-TAMRA를 제거하기 위하여 다시 한번 Ni-NTA 정제법으로 정제하였다. 상기 정제된 단백질을 amicon 필터 (Millipore)에서 농축시켜 20 μM의 농도로 조정한 후 CEM-T와 활성화된 2.5 ng/㎕의 MMP-2를 37℃에서 2시간 동안 반응시키고 형광 스펙트럼을 분석하였다(Ex: 480 ㎚, Em: 500-650 ㎚).

그 결과, 형광 공명 에너지 전이가 시간이 지날수록 감소하는 것을 확인하였다(도 3a 참조). 또한 상기 CEM-T와 1.0 ng/㎕, 2.5 ng/㎕의 MMP-2를 각각 37℃에서 2시간 반응시킨 후 Kodak image station을 통하여 이미징 하였을 때, MMP-2의 농도가 높아짐에 따라 형광 공명 에너지 전이가 현저히 감소하는 것을 시각적으로 확인할 수 있었다(도 3b 참조).

< 실시예 3> CEM -T의 콜라겐-I 결합능 분석

콜라겐-I(collagen-I)에 CEM-T 바이오 프로브가 부착되는지 확인하기 위하여 20mM의 초산나트륨 버퍼(sodium acetate buffer : pH 4.5)에 녹아 있는 50㎍/㎖의 콜라겐-I (Gibco)을 96웰 플레이트에 상온에서 1시간 코팅하였다. PBS 100㎕로 3번 세척(washing)하고, 이 플레이트에 PBS에 녹아 있는 BSA 50㎍/㎖를 다시 상온에서 1시간 코팅하여 부동화(passivation) 시키고 PBS로 3번 세척하였다. 그 후 여기에 각각 0, 20, 40, 100, 200 μM 농도의 CEM-I 단백질과 CEM-T 바이오 프로브를 2시간 동안 고정시킨 후 다시 PBS로 3번 세척하였다. 이렇게 콜라겐-I 위에 CEM-I 단백질 및 CEM-T 바이오 프로브를 부착시킨 플레이트를 Kodak image station 및 형광 분석기 (Ex: 480 ㎚/ Em: 500-640 ㎚)를 사용하여 분석하였다.

그 결과, 콜라겐-I을 코팅한 웰 플레이트에서만 CEM-I 단백질 및 CEM-T 바이오 프로브의 형광이 관찰된 것을 확인하였으며, CEM-I 단백질 및 CEM-T 바이오 프로브의 농도가 높아질수록 형광 강도가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 즉, CNA35를 포함하는 CEM-I 단백질이나 CEM-T 바이오 프로브가 콜라겐-I에 잘 부착되어 웰 플레이트 표면에 고정되는 것을 확인할 수 있었으며, 농도가 증가함에 따라 점점 더 많은 CEM-I 단백질 및 CEM-T 바이오 프로브가 웰 플레이트 표면에 부착되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4> CEM -T의 MMP -2 검출능 분석

CEM-T 바이오 프로브가 고정된 96웰 플레이트에 MMP-2를 각각 다양한 농도 (0, 1.0, 2.5 ng/㎕)로 처리하고 2시간 후에 형광 분석기를 통하여 분석하였다.

그 결과, MMP-2의 농도가 높을수록 CEM-T 바이오 프로브의 형광 공명 에너지 전이가 감소하는 것을 확인하였다(도 5a 참조). 또한 각각 1.0, 2.5 ng/㎕의 MMP-2를 CEM-T 바이오 프로브에 처리하고 이를 시간별로 형광 분석기를 통하여 분석하였을 때, 시간이 지날수록 점점 CEM-T 바이오 프로브의 형광 에너지 전이가 저해되는 것을 확인하였다(도 5b 및 c 참조).

< 실시예 5> MMP -2 과발현 세포 배양액에서의 CEM -T 활성 평가 분석

MMP-2를 과발현시킨 세포 배양액에서 CEM-T 바이오 프로브의 활성을 측정할 수 있는지 연구하기 위하여, 우선 HeLa 세포주 (ATCC)에 pCMV-MMP-2 플라스미드 벡터를 형질주입(transfection)시켜 MMP-2를 과발현되게 한 후 이를 확인하고자 RNA를 정제하여 역전사 효소를 통해 cDNA를 합성하고 200ng의 cDNA 템플레이트(template)를 이용하여 RT-PCR 하였다. 또한 MMP-2를 과발현시킨 후 무혈청 배지(serum free media)에서 48시간 동안 배양하여 이 배지(media)를 50 μM의 농도로 농축하고 MMP-2 항체(Ab) (abcam)와 β-액틴(β-actin) Ab (Bioworld)를 이용하여 웨스턴 블롯팅(western blotting) 함으로써 MMP-2가 HeLa 세포주에서 과발현되는 것을 확인하였다. 이처럼 과발현시킨 MMP-2가 포함된 컨디션드 배지(conditioned media)를 CEM-T가 고정된 96웰(well) 플레이트에 2시간 동안 반응시킨 후 Kodak image station 및 형광분석기로 분석하였다.

그 결과, MMP-2가 과발현된 세포의 컨디션드 배지를 사용하였을 때 형광 공명 에너지 전이가 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 6a 내지 6c 참조).

< 실시예 6> MMP -2 과발현 세포 배양액에서 장시간 동안의 CEM -T 활성 평가 분석

MMP-2를 과발현시킨 세포 배양액에서 장시간 동안 CEM-T 바이오 프로브의 활성을 측정할 수 있는지 검증하기 위하여, 우선 HeLa 세포주 (ATCC)에 pCMV-MMP-2 플라스미드 벡터를 형질주입(transfection)시켜 MMP-2가 6웰 플레이트 상에서 과발현되도록 하였다. 이후, 무혈청 배지(serum free media)에서 48시간 동안 배양하여 HeLa 세포주로부터 분비된 MMP-2가 포함되어 있는 컨디션드 배지(conditioned media)를 획득하였다. 이 배지를 50kDa amicon 필터(filter)를 이용하여 50 μM의 농도로 농축한 뒤 이를 CEM-T가 고정된 96웰 플레이트에 처리하여 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 각각 2시간, 8시간, 및 24시간 동안 반응시킨 후 형광분석기로 480㎚에서 여기(excitation) 시킨 후 510㎚ 및 580㎚에서 발광(emission) 신호를 측정하였다(도 7a 내지 도 7b). 즉, 580㎚의 형광은 EGFP로부터 전이 받은 TAMRA 신호를 나타내는 것으로, 이 강도(intensity)가 높을수록 MMP-2의 활성이 없는 것이며, 반면 510㎚의 형광 강도가 높을수록 MMP-2에 의해 프로브가 더 많이 분해되었음을 확인할 수 있다.

분석 결과, 시간에 따라 MMP-2에 대한 510㎚/580㎚의 발광(emission) 신호가 점점 더 증가하는 것을 확인하였으며, MMP-2가 과발현되지 않은 컨디션드 배지를 사용한 대조군과 비교하였을 때도 510㎚/580㎚ 값이 현저히 증가하는 것을 확인하였다(도 7b 내지 도 7d).

< 실시예 7> MMP -2 과발현 세포에서 CEM -T 활성 평가 분석

상기 실시예 5 및 실시예 6에서는 HeLa 세포주로부터 분비된 MMP-2가 포함되어 있는 배양액, 즉 컨디션드 배지(conditioned media)를 이용하여 CEM-T 바이오 프로브의 활성을 검증하였다. 이에, 실질적으로 직접 배양한 세포를 대상으로 CEM-T 바이오 프로브의 활성을 평가하고자, 우선 6웰 플레이트에 시딩(seeding)한 HeLa 세포주를 pCMV-MMP2 플라스미드와 pCMV mock 벡터를 이용하여 형질주입(transfection)한 뒤 24시간 동안 배양하였다. 한편, 상기 실시예 3과 같은 방법으로 콜라겐-Ⅰ(collagen-I)으로 코팅시킨 24웰 플레이트에 CEM-T 리포터(reporter)를 고정시킨 후, HeLa 세포를 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA)를 이용하여 떼어내었다. 이 24웰 플레이트에 1.0×10⁵개의 세포를 시딩(seeding)하고 2시간 동안 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후 공초점 현미경(confocal microscope)을 이용해 형광을 이미징하였다. 이때, EGFP의 경우 480㎚에서 여기(excitation) 하여 520㎚에서 발광(emission) 하였다. 또한, TAMRA의 경우 530㎚에서 여기(excitation) 하여 580㎚에서 발광(emission) 신호를 측정하였다. FRET 신호의 경우 500㎚에서 여기(excitation) 시킨 후 580㎚에서 발광(emission)을 이미징하였다.

그 결과, MMP-2가 과발현된 세포와 CEM-T 리포터(reporter)를 반응시킨 경우, MMP-2가 과발현되지 않은 세포를 반응시킨 경우에 비해 EGFP 신호는 증가하였으며, TAMRA 신호는 감소하는 것을 확인하였다(도 8).

< 실시예 8> 세포 상에서 CEM -T의 콜라겐-Ⅰ 결합능 분석

본 발명의 CEM-T 바이오 프로브가 고정되는 데 있어서, 콜라겐-Ⅰ(collagen-I)과 CNA35(Collagen-Binding Adhesion protein 35)의 결합이 중요하다는 사실을 확인하기 위하여, 유전자 재조합을 통해 CNA35 부분이 존재하지 않는 돌연변이(mutant; EM-T) 플라스미드를 제작하여 BL21 박테리아 세포에 형질전환(transformation)하고, IPTG 유도(induction)를 통해 과발현시켰다. 이후 Ni-NTA 비드(bead)를 이용하여 정제한 후, 이를 CEM-T 리포터(reporter)와 같은 방법(실시예 1-2 참조; 20 μM의 EM-I 단백질과 40 μM의 Ic-TAMRA 펩타이드 반응)으로 인테인 스플라이싱(intein splicing)을 이용하여 TAMRA와 컨쥬게이션(conjugation) 시켰다. 이렇게 준비된 CEM-T 리포터(reporter)와 EM-T를 각각 콜라겐-Ⅰ(collagen-I)이 코팅된 24웰 플레이트에 담아 형광 현미경을 이용하여 플레이트 표면을 관찰하였다.

그 결과, CNA35가 없는 돌연변이(mutant)의 경우 콜라겐-Ⅰ(collagen-I)에 결합하지 않으므로 세척(washing)을 통해 쉽게 제거된 반면, CNA35가 있는 바이오 프로브의 경우 세척 후에도 많은 양이 잔류하는 것으로 나타났다(도 9).

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> A probe for analyzing the protease activity and detection method of protease using the same <130> P18U10C0376 <150> KR 10-2017-0043695 <151> 2017-04-04 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 945 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen-Binding Adhesion protein 35 <400> 1 gcacgagata tttcatcaac gaatgttaca gatttaactg tatcaccgtc taagatagaa 60 gatggtggta aaacgacagt aaaaatgacg ttcgacgata aaaatggaaa aatacaaaat 120 ggtgacatga ttaaagtggc atggccgaca agcggtacag taaagataga gggttatagt 180 aaaacagtac cattaactgt taaaggtgaa caggtgggtc aagcagttat tacaccagac 240 ggtgcaacaa ttacattcaa tgataaagta gaaaaattaa gtgatgtttc gggatttgca 300 gaatttgaag tacaaggaag aaatttaacg caaacaaata cttcagatga caaagtagct 360 acgataacat ctgggaataa atcaacgaat gttacggttc ataaaagtga agcgggaaca 420 agtagtgttt tctattataa aacgggagat atgctaccag aagatacgac acatgtacga 480 tggtttttaa atattaacaa tgaaaaaagt tatgtatcga aagatattac 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aatagccaca cgtaaatatt taggcaaaca aaatgtctat gacattggag 360 ttgagcgc 368 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> npu DnaE <400> 5 Asp His Asn Phe Ala Leu Lys Asn Gly Phe Ile Ala Ser Asn Cys Phe 1 5 10 15 Asn Gly Thr Lys 20 <210> 6 <211> 2139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEM-I <400> 6 atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcgcacgaga tatttcatca 60 acgaatgtta cagatttaac tgtatcaccg tctaagatag aagatggtgg taaaacgaca 120 gtaaaaatga cgttcgacga taaaaatgga aaaatacaaa atggtgacat gattaaagtg 180 gcatggccga caagcggtac agtaaagata gagggttata gtaaaacagt accattaact 240 gttaaaggtg aacaggtggg tcaagcagtt attacaccag acggtgcaac aattacattc 300 aatgataaag tagaaaaatt aagtgatgtt tcgggatttg cagaatttga agtacaagga 360 agaaatttaa cgcaaacaaa tacttcagat gacaaagtag ctacgataac atctgggaat 420 aaatcaacga atgttacggt tcataaaagt gaagcgggaa caagtagtgt tttctattat 480 aaaacgggag atatgctacc agaagatacg acacatgtac gatggttttt aaatattaac 540 aatgaaaaaa gttatgtatc gaaagatatt actataaagg atcagattca aggtggacag 600 cagttagatt taagcacatt aaacattaat gtgacaggta cacatagcaa ttattatagt 660 ggacaaagtg caattactga ttttgaaaaa gcctttccag gttctaaaat aactgttgat 720 aatacgaaga acacaattga tgtaacaatt ccacaaggct atgggtcata taatagtttt 780 tcaattaact acaaaaccaa aattacgaat gaacagcaaa aagagtttgt taataattca 840 caagcttggt atcaagagca tggtaaggaa gaagtgaacg ggaaatcatt taatcatact 900 gtgcacaata ttaatgctaa tgccggtatt gaaggtactg taaaaggtga attaaaagtt 960 ttaaaacagg ataaagatac caaggctgga tccggaggag gaggagtgag caagggcgag 1020 gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 1080 aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 1140 ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc 1200 tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 1260 tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 1320 tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 1380 aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 1440 aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 1500 aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 1560 acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 1620 gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 1680 gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagc tcgagggagg aatcccagtg 1740 tccctgcgat ccggaggagg actgcagtgt ttaagctatg aaacggaaat attgacagta 1800 gaatatggat tattaccgat tggtaaaatt gtagaaaagc gcatcgaatg tactgtttat 1860 agcgttgata ataatggaaa tatttataca caacctgtag cacaatggca cgatcgcgga 1920 gaacaagagg tgtttgagta ttgtttggaa gatggttcat tgattcgggc aacaaaagac 1980 cataagttta tgactgttga tggtcaaatg ttgccaattg atgaaatatt tgaacgtgaa 2040 ttggatttga tgcgggttga taatttgccg aatatcaaaa tagccacacg taaatattta 2100 ggcaaacaaa atgtctatga cattggagtt gagcgctga 2139 <210> 7 <211> 590 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEM-T <400> 7 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Ala Arg 1 5 10 15 Asp Ile Ser Ser Thr Asn Val Thr Asp Leu Thr Val Ser Pro Ser Lys 20 25 30 Ile Glu Asp Gly Gly Lys Thr Thr Val Lys Met Thr Phe Asp Asp Lys 35 40 45 Asn Gly Lys Ile Gln Asn Gly Asp Met Ile Lys Val Ala Trp Pro Thr 50 55 60 Ser Gly Thr Val Lys Ile Glu Gly Tyr Ser Lys Thr Val Pro Leu Thr 65 70 75 80 Val Lys Gly Glu Gln Val Gly Gln Ala Val Ile Thr Pro Asp Gly Ala 85 90 95 Thr Ile Thr Phe Asn Asp Lys Val Glu Lys Leu Ser Asp Val Ser Gly 100 105 110 Phe Ala Glu Phe Glu Val Gln Gly Arg Asn Leu Thr Gln Thr Asn Thr 115 120 125 Ser Asp Asp Lys Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Asn Lys Ser Thr Asn 130 135 140 Val Thr Val His Lys Ser Glu Ala Gly Thr Ser Ser Val Phe Tyr Tyr 145 150 155 160 Lys Thr Gly Asp Met Leu Pro Glu Asp Thr Thr His Val Arg Trp Phe 165 170 175 Leu Asn Ile Asn Asn Glu Lys Ser Tyr Val Ser Lys Asp Ile Thr Ile 180 185 190 Lys Asp Gln Ile Gln Gly Gly Gln Gln Leu Asp Leu Ser Thr Leu Asn 195 200 205 Ile Asn Val Thr Gly Thr His Ser Asn Tyr Tyr Ser Gly Gln Ser Ala 210 215 220 Ile Thr Asp Phe Glu Lys Ala Phe Pro Gly Ser Lys Ile Thr Val Asp 225 230 235 240 Asn Thr Lys Asn Thr Ile Asp Val Thr Ile Pro Gln Gly Tyr Gly Ser 245 250 255 Tyr Asn Ser Phe Ser Ile Asn Tyr Lys Thr Lys Ile Thr Asn Glu Gln 260 265 270 Gln Lys Glu Phe Val Asn Asn Ser Gln Ala Trp Tyr Gln Glu His Gly 275 280 285 Lys Glu Glu Val Asn Gly Lys Ser Phe Asn His Thr Val His Asn Ile 290 295 300 Asn Ala Asn Ala Gly Ile Glu Gly Thr Val Lys Gly Glu Leu Lys Val 305 310 315 320 Leu Lys Gln Asp Lys Asp Thr Lys Ala Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val 325 330 335 Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu 340 345 350 Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly 355 360 365 Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr 370 375 380 Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr 385 390 395 400 Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His 405 410 415 Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr 420 425 430 Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys 435 440 445 Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp 450 455 460 Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr 465 470 475 480 Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile 485 490 495 Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln 500 505 510 Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val 515 520 525 Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys 530 535 540 Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr 545 550 555 560 Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Leu Glu Gly 565 570 575 Gly Ile Pro Val Ser Leu Arg Ser Gly Gly Gly Leu Gln Cys 580 585 590

Claims

CNA35(Collagen-Binding Adhesion protein 35), 형광 단백질 및 프로테아제의 타겟 펩타이드를 포함하는 융합 단백질; 및 상기 타겟 펩타이드에 결합되어 있는 유기형광염료;를 포함하는 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브.
제1항에 있어서,
상기 바이오 프로브는 프로테아제에 의한 타겟 펩타이드의 절단시 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer;FRET)를 나타내는 것인 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브.
제1항에 있어서,
상기 프로테아제는 세포외 기질로 분비되는 것인 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브.
제1항에 있어서,
상기 프로테아제는 MMP 1, MMP 2, MMP 3, MMP 7, MMP 8 및 MMP 9으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브.
제1항에 있어서,
상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광 단백질(ECFP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브.
제1항에 있어서,
상기 유기염료는 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, VIC, JOE, ROX, HEX, NED, PET, LIZ, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브.
제1항에 있어서,
상기 형광 단백질과 유기염료는 에너지 공여체 및 에너지 수용체로서,
에너지 공여체의 방출파장이 에너지 수용체의 흡수파장과 10 ㎚ 이상 중첩되는 것인 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브.
CNA35, 형광 단백질 및 프로테아제의 타겟 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 생산하고,
상기 타겟 펩타이드에 유기형광염료를 특이적으로 결합시키는 것을 포함하는 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 특이적 결합은 인테인 스플라이싱(intein splicing)을 이용하여 수행되는 것인 프로테아제 활성 분석용 바이오 프로브 제조방법.
제1항의 바이오 프로브를 프로테아제가 포함된 시료에 처리하고,
상기 프로테아제에 의한 타겟 펩타이드의 절단에 의해 발생된 형광 공명 에너지 전이를 측정하는 것을 포함하는 프로테아제 활성 분석 방법.
제1항에 따른 바이오 프로브를 유효성분으로 포함하는 프로테아제 활성 분석용 조성물.
제11항의 조성물을 포함하는 프로테아제 활성 분석용 키트.