JP2016526926A

JP2016526926A - 遺伝子的にコードしたｆｒｅｔベースのｍｍｐ−９活性バイオセンサおよびその使用

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Publication number: JP2016526926A
Application number: JP2016533982A
Authority: JP
Inventors: スタワロスキーミハル; ヴウォダルチクヤコブ; カチマレクレシェック
Original assignee: Instytut Biologii Doswiadczalnej Im Marcelego Nenckiego Polska Akademia Nauk
Current assignee: Instytut Biologii Doswiadczalnej Im Marcelego Nenckiego Polska Akademia Nauk
Priority date: 2013-08-12
Filing date: 2014-08-12
Publication date: 2016-09-08
Also published as: US20160194681A1; WO2015022646A4; WO2015022646A2; PL405046A1; US9914955B2; CN105593686A; WO2015022646A3; EP3033621A2

Abstract

本発明は、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（MMP-9）の活性をモニターするための、遺伝子的にコードしたFRETベースのバイオセンサに関する。MMP-9は、生理学的および病理学的プロセスの両方に関係する細胞外作用エンドペプチターゼである。細胞膜に固定した、遺伝子的にコードしたFRETバイオセンサは、細胞におけるMMP-9の正確な活動範囲において、高い時空間解像度でMMP-9のタンパク質分解活性を研究することを可能にする。バイオセンサの、in vitroおよび生体細胞のin vivoの両方での適用可能性を、バイオセンサの切断を精製自己活性化MMP-9によりレシオメトリック分析することで実証した。

Description

本発明は、遺伝子的にコードしたFRETベースのマトリックスメタロプロテイナーゼ９（MMP-9）活性バイオセンサおよびその使用に関する。

基本細胞機能を制御するメカニズムの解明が進んだことにより、研究者の焦点が細胞力学に移ることが可能になり、高感度で十分迅速に生体細胞内の力学的プロセスを追跡する方法に対する需要が高まっている。高分子相互作用の細胞内時空間局在の領域では、接近に基づくフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）が特に有用である。

最近、かなり多数で多様な、遺伝子的にコードしたFRETベースのバイオセンサが開発された。これはイオン濃度[Miranda et al., 2012; Burdette et al., 2001; Esposito et al. 2008]、有機化合物濃度[Gruenwald et al., 2012]、GTPアーゼ活性[Kalab and Soderholm, 2010]、タンパク質リン酸化[Violin et al., 2003]および細胞内の機械的応力といった種々の現象を研究するのに使用することが可能である。該バイオセンサの利点は、現象を生体細胞および有機体においてリアルタイムで追跡できることである。

MMP-9は、亜鉛およびカルシウム依存性エンドペプチターゼファミリーに属する、細胞外に分泌される92kDaプロテアーゼである。これは多数の細胞外マトリックスタンパク質および細胞接着分子を切断する。大規模に行った調査で、MMP-9は血管形成を調整し、細胞外マトリックスを切断するという二重の役割を通じてガンの発病に重要な役割を果たし、腫瘍が転移し始めることを可能にすることが示された[Klein and Bischoff, 2011; Deryugina and Quigley, 2006; Kessenbrock et al., 2010]。腫瘍の攻撃性とMMP-9活性レベルの間での明らかな正の関係とともに、MMP-9の発現の増加が健常者と比較して多数の異なる腫瘍で観察された[Hanemaaijer et al., 2000; Schmalfeldt et al., 2001]。細胞外マトリックスのMMP-9プロセシングはまた、血管形成を促すサイトカインおよび成長因子の放出につながり得る[Schonbeck, et al., 1998; Yu and Stamenkovic, 2000]。実際に調査は、MMP-9活性レベルをガンにおける予想予後因子であると指摘する（確認のためKlein, et al., 2004を参照）。

最新の調査はまた、MMP-9を、シナプス可塑性、および、ひいてはシナプス可塑性に依存していると考えられるプロセス―学習および記憶において、重要な調節器の一つであると指摘する。シナプス可塑性とは、脳内のシナプス間結合の強さを変える機能である。

DQ-ゼラチン（フルオレセインで多大に標識され、その蛍光は無傷の場合ほぼ完全に消光される―ゼラチナーゼ活性は蛍光の増加につながる、ゼラチン誘導体）またはgel/in situザイモグラフィーなどの、MMP-9タンパク質分解活性を検出するために通常使用する方法では、高い時空間解像度でゼラチン活性の局在を評価することはできない。さらに、これは両方ともゼラチンベースであり、MMP-2、つまり、マトリックスメタロプロテイナーゼのゼラチナーゼサブファミリーのもう一つの構成要素の活性を（MMP-9と共に）検出する。MMP-2の発現レベルはMMP-9のそれよりずっと高いことから、この方法により検出される切断の大部分はMMP-9よりもMMP-2のタンパク質分解活性に由来する。別の最近作成された蛍光MMP-9活性バイオセンサは、完全に合成であり[Fudala, et al., 2011; Akers, et al., 2012; Roopali Roy, et al., 2011; Hawkins, et al., 2013; Leight et al., 2013]、それ自体、DQ-ゼラチンと同様の方法で使用されることを意図していた。

DQ-タンパク質（染料消光）基質は、広く使用されているMMP-9活性プローブで、これは商業的に利用可能なものである。DQ基質は、蛍光染料で過度に標識されている天然基質の類似物である。この過度な標識により引き起こされた染料分子の近接近が、無傷基質の蛍光シグナルの消失の要因である。MMP-9によるDQ基質の溶解は、染料分子の分離と蛍光シグナルの増加を引き起こす。DQ-ゼラチンとDQ-コラーゲンIVは、ゲルならびにin situザイモグラフィー、および、ライブセルイメージング顕微鏡においてと同様に、in vitroでプロテアーゼ活性を検出するため（ゼラチナーゼ活性評価テスト）うまく使用されてきた（Cavallo-Medved, et al., 2009およびSameni, et al., 2009参照）。DQ-ゼラチンおよびDQ-コラーゲンIVは、生体細胞におけるECM分解および分解産物の細胞内追跡の視覚化を可能にした。しかしながら、これが分解の要因であるプロテアーゼを同定する際の有用性の限界であり、このプロテアーゼと分解産物の両方を含む細胞内区画は追加技術を必要とした。DQ基質は、ライブセルイメージングと組み合わせて使用したとしても、タンパク質分解活性の包括的測定をせいぜい提供するだけである。DQ-プロテイン基質は複数のプロテアーゼにより切断され、局所的で超微細構造的な形態変化が関係する場合はほとんど無益で、in vivoイメージングには不適切であることから、DQ-プロテイン基質はMMP-9の基礎的な生理学的役割および病理学的役割の将来の研究を容易にすることはないだろう。

そのため、DQ-タンパク質基質の欠点に対処しようとする多数の新しい分子プローブが設計されてきた。ガンの予後マーカーとしてのMMPの可能性のため、かなりの研究がMMP-9のタンパク質分解活性検出向け診断および分析プローブ領域で行われてきた（いくつかのMMP-9活性プローブ、および、ガンを検出するための診断用ツールとしてのその適正の調査についてはRoopali Roy, et al., 2011を、ガンにおけるMMP活性検出領域における最近の進展に関する全体確認についてはScherer, et al., 2008を参照）。ポジトロン放出断層撮影プローブも開発されたが、近赤外すなわちNIRFプローブが、身体の近赤外光に対する透過性と、それによりin vivoで使用される可能性から、かなりの関心を呼んだ。NIRFプローブの多くは自己消光特性を示し、シグナルのノイズに対する比率を増加する。2009年に開発され[Wang, et al., 2009]、元来はMMP-2活性を検出することを意図していたCy5.5-C6という環状ペプチドNIRFプローブをうまく使用し、大腸ガンの進行とMMP-2およびMMP-9のレベルとを互いに関係付けた[Lee, et al., 2012]。該プローブに固有の特性は、それがMMP-9に結合し、その活性を阻害するということである。商業的に利用可能なMMPSense 680がもう一つのNIRFプローブであり、該プローブ自体は、プロテアーゼの特異性に関してはかなり無差別である―それはMMP-2、-3、-9、および-13により切断される―が、これを使用してin vivoでMMP-9を検出した [Kaijzel, et al., 2010, and Wallis de Vries, et al., 2009]。最終的に、異種移植腫瘍を持つネズミにAkers, et al., 2012で議論された自己組織化三重ヘリックス近赤外プローブを注入することにより、研究者らは注入後２４時間で腫瘍関連蛍光の堅調な（5倍）増加を観察した。蛍光はGM6001広スペクトルメタロプロテイナーゼ阻害剤を投与することで減少した。

上記のNIRFプローブはDQ-タンパク質基質に対し明確な前進であるが、これは、より狭い範囲を念頭において―研究ツールとしてというより診断ツールとして設計された。該NIRFプローブのいくつかにより示される低プロテアーゼ特異性、他の不所望なMMP阻害剤特性および合成蛍光色素への依存と相まって、NIRFプローブは細胞超微細構造（形質膜ドメイン、樹状突起棘など）のレベルでのMMP-9活性の局在には適切ではないことは明らかである。

Fudala, et al., 2011およびFudala, et al., 2012に記載されたMMP-9活性プローブは、人工MMP-9切断部位を利用することにより、低プロテアーゼ特異性の課題を解決する。この分析プローブは、MMP-9により切断可能な短鎖ペプチドにより分離した２つの蛍光染料（5-FAMおよびCy5）からなる。無傷プローブにおいて、FRETは5-FAMの蛍光を消光させ、Cy5蛍光を強く強調する。MMP-9（MMP-2ではない）切断は蛍光色素の分離と5-FAMの蛍光のかなりの増加をもたらす。Fudalaらにより開発されたMMP-9活性プローブは、（DQ-タンパク質基質と同様に）今後より上手い方法で使用される可能性が高いが、NIRFプローブと同じ短所をもち、該短所は、MMP-9活性プローブを生理学的および病理学的条件におけるMMP-9の基礎的役割の研究に利用することを妨げている。

病理学的条件（腫瘍の悪性進行、てんかん）と同様に生理学的条件（細胞外マトリックスの再形成、血管形成、シナプス可塑性）においてMMP-9により行われる種々の機能を理解するには、そのタンパク質分解活性の評価を可能にするツールが必要である。近年、生体細胞におけるMMP-9活性を測定し局在化する手段を提供する多数の機能的イメージング技術の開発が目にされる。しかしながら、この方法は全て、MMP-9により切断することが可能な、体外から適用された蛍光プローブに依存する。遺伝子的にコードし、膜に固定したFRETベースのMMP-9活性バイオセンサが、生理学的および病理学的プロセスにおけるMMP-9のタンパク質分解活性の役割を解明するのにより適切であろう。そのため、細胞におけるMMP-9の正確な活動範囲において、高い時空間解像度でMMP-9のタンパク質分解活性の検査を可能にし、in vitroおよび生体細胞のin vivoの両方で使用することができるバイオセンサを開発する必要性が存在する。

本発明は、遺伝子的にコードしたFRETベースのMMP-9活性バイオセンサを提供し、これは、現在利用可能なバイオセンサの限界を克服し、MMP-9の基礎的な生理学的および病理学的役割についての検査を可能にする。

本発明の遺伝子的にコードしたMMP-9活性バイオセンサは、FRETドナー蛍光タンパク質と、柔軟なリンカーにより分離した２つのFRETアクセプター蛍光タンパク質とを含み、ドナータンパク質とアクセプタータンパク質の間のリンカーは合成MMP-9切断部位を含み、バイオセンサ全体は形質膜に固定されている。

好適には、本発明のバイオセンサにおけるFRETドナー蛍光タンパク質は、単量性青緑色蛍光タンパク質mTFP1[Li and Elledge, 2007]およびクローバ蛍光タンパク質[Lam et al., 2012]を含む群より選択する。最も好適には、FRETドナー蛍光タンパク質はmTFP1である。mTFP1はClavularia属に属するサンゴ色より分離した四量体シアン色蛍光タンパク質cFP484より生成したタンパク質である。

好適にはFRETアクセプター蛍光タンパク質は、Venus蛍光タンパク質およびmRuby2蛍光タンパク質を含む群より選択する。最も好適にはFRETアクセプター蛍光タンパク質はVenus蛍光タンパク質である。Venus蛍光タンパク質は黄色蛍光タンパク質の改良型バリアントである。

本発明のバイオセンサで使用するドナー―アクセプターFRETペアは、フェルスター半径および光安定性により特徴づけるべきである。

本発明のバイオセンサにおけるMMP-9切断部位は、好適には、合成切断部位である。MMP-9切断部位として使用可能なアミノ酸シーケンス、つまり、MMP-9により切断することが可能なこのシーケンスの例には、PRSLS [Fudala, et al., 2011]、PLGLAG [Tsien 2013]、PLFYSV、KIPRTLT、PLRLSW、および、PRAVST、KGPRQIT [Kridel, et al., 2001]が含まれる。好適なMMP-9切断部位はPRSLSシーケンスを含む。

好適な実施形態において、本発明のバイオセンサは血小板由来成長因子レセプター（PDGFR）の貫膜ドメインにより形質膜に固定される。

好適には、本発明のバイオセンサにおける柔軟なリンカーは、α-ヘリックスリンカー、GGTGGTヘキサペプチドの１回〜８回の反復を含むリンカー、GGSGSRヘキサペプチドの１回〜８回の反復を含むリンカーからなる群より選択する。

一つの好適な実施形態において、ドナータンパク質とアクセプタータンパク質の間のリンカーはα-ヘリックスリンカーであり、これは、好適には、シーケンス
（α-ヘリックスの部位は太字で表示）を含む。

あるいは、ドナータンパク質とアクセプタータンパク質の間のリンカーは、MMP-9切断部位に加え、1つのみのGGTGGTヘキサペプチドまたはGGSGSRヘキサペプチドを含み、好適には、該リンカーは１つのみのGGTGGTヘキサペプチドを含む。このリンカーはまた、ループ状リンカーとも呼ばれる。最も好適な実施形態において、リンカーは以下のシーケンス：
（MMP-9切断部位は太字で表示）からなる。

もう一方のリンカー、つまり、２つのアクセプタータンパク質の間のリンカーは、好適には、GGSGSRヘキサペプチドの７回の反復を含む。

本発明の特に好適なバイオセンサの構造を、図１Aに図式的に示す。一実施形態において、本発明のバイオセンサは、GGSGSRヘキサペプチドの７回の反復を含む柔軟なリンカーにより分離した２つのVenus蛍光タンパク質を含み、該Venus蛍光タンパク質の一方は、合成MMP-9切断部位を含むα-ヘリックスリンカーによりmTFP1から分離している。他の好適な実施形態において、本発明のバイオセンサは、GGSGSRヘキサペプチドの７回の反復を含む柔軟なリンカーにより分離した２つのVenus蛍光タンパク質を含み、該Venus蛍光タンパク質の一方は、合成MMP-9切断部位および１つのみのGGTGGTヘキサペプチドを含むリンカーにより、mTFP1より分離している。

本発明のバイオセンサは、MMP-9に対し高FRET効率および高選択性を示す。バイオセンサのMMP-9切断は、アクセプタータンパク質の細胞膜からの放出と、FRETの減少を引き起こし、これはアクセプターのドナーに対する蛍光強度比率の低下として観察される。そのため、本発明はまた、本発明の遺伝子的にコードしたMMP-9活性バイオセンサを、in vitroおよび生体細胞のin vivoでのMMP-9のタンパク質分解活性の検査用システムとして使用することに関する。

図１Aは、本発明の好適なバイオセンサの全体構造を示す。一実施形態（（i）と表示）では、Venus蛍光タンパク質はMMP-9切断部位を含むα-ヘリックスリンカーにより、７回のGGSGSR反復と、Venus FPと、mTFP1とに分離し、別の実施形態（（ii）と表示）では、Venus蛍光タンパク質をMMP-9切断部位と１つのGGTGGTヘキサペプチドにより、７回のGGSGSR反復と、Venus FPと、mTFP1とに分離し、蛍光タンパク質の間により小さい数のヘキサペプチド反復を有するバリアントセンサを、センサの遺伝子シーケンスを部分的に切断することにより生成した。図１Ｂは、APより計算したFRET効率値を表し、薄い灰色のバーはFLIMで分析したセンサを示す。図１Ｃは、本発明のバイオセンサを発現するHEK293のライブセルイメージングを示す。図１Ｄは、本発明のバイオセンサを発現するHEK293細胞株の分画結果を示す。バイオセンサに対するWBをanti-cmyc抗体を使用して実行した。コントロールWBは下記に示す。図２Aは、ループ状リンカー付きバイオセンサを発現するHEK293細胞の、AP前後の画像を示す。mTFP1は458nmのレーザーで、Venusは514nmのレーザーのVenusで励起した。右側のパネルは最適化したバイオセンサのAP前後の発光スペクトルを示す。アクセプターのピークの消失とドナーの蛍光強度の増加を見ることができる。図２Ｂは、α-ヘリックスリンカーを有するバイオセンサのAP結果を示す。 α-ヘリックスリンカー付きセンサのin vitro切断、および、ネガティブコントロール―ベースライン切断と、不活性MMP-9を用いた切断と、自己活性化MMP-9を用いたバイオセンサ切断におけるGM6001メタロプロテイナーゼ阻害剤の影響を示す。バイオセンサ切断はanti-GFP抗体を用いてWBで分析し、定量化プロットにおいて強度を正規化し、コントロールレーンにおいて完全長バイオセンサにした。コントロールレーンにおける切断産物の強度は、３０分、１時間、４時間、o/nレーンの切断産物強度から正規化前に差し引いた。 α-ヘリックスリンカー付きバイオセンサを発現するHEK293細胞について、自己活性化MMP-9（aaMMP-9）を用いた処理前後で記録したスペクトルを示す。該処理は短い波長へのスペクトルシフトを引き起こし、これはセンサの切断を示す。エラーバーはSEM値を表す。挿入物はバイオセンサを発現するHEK293の代表的なラムダスタックの最大投影図を示す。長方形はおおよその関心範囲を示し、ここから発光スペクトルを得た。各細胞に対し３つのROIを使用して平均発光スペクトルを計算した。 α-ヘリックスリンカー付きバイオセンサを発現するHEK293細胞のライブイメージング時に撮った画像を示す。線形分離（linear unmixing）をZeiss LSM780で得た細胞画像で行い、mTFP1とVenus FPの間のスペクトル重複の影響を取り除く。分離したデータはその後、実験の各時点での画像の各ピクセルについて、蛍光強度比率を計算するのに使用した。図５Ａは、蛍光強度比率値（OY軸）とそのピクセルにおける蛍光強度（OX軸）を相互に関係づけたマップを示す。該マップは図５Bで示す細胞について作成した。図５Ｂは、表示した時点で撮ったHEK293細胞の画像を示す。各ピクセルには、そのピクセルの蛍光強度比率に対応する色と色相をあてた。自己活性化MMP-9を５分で培養物に添加した。Venus/mTFP1蛍光強度比率において緩やかな減少が観察された。図５Ｃは、モック処理した、または、不活性MMP-9あるいは自己活性化MMP-9のいずれかで処理した細胞の蛍光強度を示す。値は正規化して、処理開始前の時点について計算した平均蛍光強度比率値にする。各線は３つの細胞の平均化した比率を表す。自己活性化MMP-9で処理した細胞の比率値において緩やかな減少が観察された。この減少は、モック処理した、または不活性MMP-9のいずれかで処理した細胞には観察されなかった。エラーバーはSEM値を表す。

本発明の、遺伝子的にコードしたFRETベースのMMP-9活性バイオセンサは、MMP-9検出の分野において重要な隙間市場を占めている。今まで、MMP-9活性プローブは臨床診断を念頭において作成されたが、これは、ガンの発症におけるMMP-9の役割を考えれば理解できる。しかしながら、近年明らかになったように、MMP-9は他のプロセス、例えば脳の生理学において重要な役割を果たす。DQ-ゼラチンなどのプローブはMMP-9のその役割面を研究するのに非常に有用であるが、それは、生じてきた多数の疑問に答えるのに必要な時空間解像度を容易に提供するものではない。本発明の、遺伝子的にコードされ、膜に固定されたFRETベースのMMP-9活性バイオセンサは、生理学的、および、病理学的プロセスにおけるMMP-9のタンパク質分解活性の役割を明らかにするのにより適切である。

本発明のバイオセンサは新規の単量性青緑色蛍光タンパク質（mTFP1）を使用し、これはCFPに対し優れたスペクトル特性を有する[Day, et al., 2008]。mTFP1は黄色蛍光タンパク質とともにより効率的なFRETペアを形成することが最近明らかにされた[Li and Elledge, 2007]。しかしながら、Clover FP [Lam et al., 2012]などの他の蛍光タンパク質もまた、本発明のバイオセンサに使用することが可能である。

mTFP1はエネルギーのドナーとして機能する一方、二重Venus蛍光タンパク質はエネルギーアクセプターとして機能する。Venus蛍光タンパク質、つまり、黄色蛍光タンパク質の改良バリアントをFRETアクセプターとして選択した。他のFP、例えば上記のLamらにより開示されたmRuby2もアクセプターFPとして使用することが可能である。

FRETベースのセンサの大部分は１つのドナータンパク質と１つのアクセプタータンパク質を含むが、２つのアクセプターFPタンパク質をセンサに導入してそのFRET効率を高めた。単一ドナーおよび単一アクセプターのシステムのFRET効率は以下のように定義される。

ここにおいて、k_Tはエネルギー伝達速度、k_Rは他の全ての非活性化プロセスの速度定数、k_Fは蛍光減衰速度である。

単一ドナーおよび２つのアクセプターシステムのFRET効率は次式により与えられる。

FRETバイオセンサにおける第２アクセプターの導入は、次式より、そのFRET効率を高める。

本発明のバイオセンサにおける蛍光タンパク質の間の距離を最適化し、有効FRET効率を最大化した。FRET効率はドナーとアクセプターの間の距離だけでなく配向によっても決定されるが、GGSGGSまたはGGTGGTのいくつかの反復により形成された柔軟なリンカーを使用し、該リンカーはFRET効率の向上に効果的であることが分かった。２つのグリシン残渣がリンカーにその柔軟性を与える一方、より大きいアミノ酸がタンパク質間の直線距離を決定する。

本発明のバイオセンサの機能性を決定する他の要因は、MMP-9切断シーケンスである。既知のMMP-9基質のスクリーンからは、MMP-9切断部位により想定されるコンセンサスシーケンスも二次構造も得られなかった。Kridelら[Kridel, et al., 2001]は、ELISAフォーマットのファージディスプレイ技術を使用してMMP-9により切断可能な短鎖ペプチドのファミリーを報告した。したがって、発明者はそこで提示されたコンセンサスシーケンスN'-PRSLS-C'を選択し、これを本発明のバイオセンサにクローニングした。このシーケンスはMMP-9により実際に認識されるものとして以前明らかにされている[Fudala et al., 2011]。しかしながら、他のアミノ酸シーケンスもまた、（上記で述べた通り）MMP-9切断部位として使用することが可能である。

タンパク質分解切断効率は、切断部位のアクセスのしやすさに強く依存し、該アクセスのしやすさは次に、二次および三次構造に影響を受けることから、発明者は、本発明のバイオセンサにおいてリンカーがmTFP1とVenus蛍光タンパク質の間に位置する構造を、２つのα-ヘリックスの間にMMP-9切断部位を置くことで変更することにした。

発明者は、生成バイオセンサを即座にスクリーンし、FRETが起きているか否かについて全体指摘をするため、アクセプター光退色（acceptor photobleaching、AP）実験を実行した。この実験は、FRET現象について確実な定量化を提供することを意図したわけでは決してなかった。最もFRET効率の高いバイオセンサのFRET特性についての緻密な分析を、蛍光寿命イメージング顕微鏡法（fluorescence lifetime imaging microscopy、FLIM）を用いて行った。AP実験とFLIM実験から計算したFRET効率値の間にはわずかな差異がある。しかしながら、APに基づいたFRET効率値は細胞全体について計算する（そのため、それには細胞形質が含まれるが、ここにおいてFRETはバイオセンサの膜局在により無視できるほど小さい）一方、FLIM測定法に基づいたFRET効率値はずっと小さい範囲について計算し、ここでFRETは最も顕著であった。

この分析の結果として、α-ヘリックスリンカー付きバイオセンサは、ループ状リンカー付きバイオセンサより高いFRET効率を有することが分かった。この差はおそらく、ループ状リンカーとα-ヘリックスリンカーにより想定される異なるより高次の構造によるものであり、後者はよりコンパクトであり、したがって、ドナーとアクセプターとを互いにより近くする。

MMP-9タンパク質分解活性は、二重Venusタンパク質の細胞膜からの放出と、VenusのmTFP1に対する比率の低下を引き起こす。バイオセンサは大部分が細胞膜に存在する。細胞形質におけるバイオセンサの小分画の存在は、ある程度のセンサの分解を意味することがある。バイオセンサはin vitroアッセイにおいてMMP-9により切断する。切断はタンパク質の自発的分解によるものではなく、広スペクトルのMMP阻害剤の添加により阻止することが可能である。バイオセンサのベースライン切断が未処理溶解物において観察できる。細胞溶解をいかなる種類のプロテアーゼ阻害剤もなしに実行したため、観察された切断はHEK293細胞溶解物に存在する内在性MMP-9により引き起こすことができる。ベースライン切断は、少なくとも部分的に、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤―広スペクトルのもの（MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8ならびにMMP-9を阻止するGM6001）および特異的なもの（MMP-9ならびにMMP-13を選択的に阻止する阻害剤I）のいずれでも阻止することが可能である。

バイオセンサを発現する固定HEK293細胞の細胞膜より収集し、自己活性化MMP-9で処理した蛍光発光スペクトルは、未処理細胞から記録した蛍光発光スペクトルとは異なる。蛍光シグナルに対するmTFP1の寄与は高まり、バイオセンサの切断を意味する。バイオセンサの構造に対するMMP-9の影響は、ライブセルイメージング顕微鏡で追った。

これは、本発明のバイオセンサが、生体細胞のin vivoでと同様に、in vitroでのMMP-9のタンパク質分解活性の検査に有用であることを示す。

〔実施例で使用する材料〕
遺伝子的にコードしたFRETベースのMMP-9活性バイオセンサをpDisplayプラスミド（Clontech）でアセンブルした。mTFP1遺伝子をpmTFP1-N1プラスミド（Allele Biotech)より増幅した。Venus遺伝子をコードするプラスミドは、Jacek Jaworski（The International Institute of Cell Biology, Warsaw）より提供された。

Phusion Hot Start IIポリメラーゼをThermo Scientific（以前のFinnzymes）より購入した。XmaI、SacII、Nhel、AflII、AgeI、XbaI、ApaI、および、BglII制限酵素は、New England BiolabsおよびThermo Scientific (以前のFermentas)で得た。SLICクローニングで必要なT4 DNAポリメラーゼはThermo Scientific (以前のFermentas)より得た。DMEM+GlutaMAX (高グルコース4.5 g/L)、ウシ胎児血清、および、ペニシリン／ストレプマイシン混合物は、Sigma-Aldrichより購入した。HEK293細胞株導入に使用するポリエチレンイミンはFlukaより得た。Proteoextract Subcellular Proteome KitはCalbiochemより、EndoFree Plasmid DNA Maxi KitはQiagenより得た。a-GFP抗体はMBLより（#498）、a-myc抗体はSanta Cruz Biotechnologiesより（#sc-40）、a-N-cadherin抗体はBD Biosciences（#610920）より、a-N-cadherin抗体はBD Biosciences（#610920）より、a-hsp90抗体はStressgen （#SPS-771）より、a-histone H3抗体はAbcam（#ab10799）より購入した。

ガラスカバースリップをコーティングするのに使用するポリ-L-リジンはSigma Aldrichより購入した。自己活性化MMP-9は、前述のように設計および精製した[Michaluk, et al., 2007]。オリゴヌクレオチドはSigma AldrichまたはGenomedのいずれかで注文した。

（実施例１MMP-9活性バイオセンサ（ループ状リンカー）の構築）
[Li, and Elledge, 2007]に記載してあるSLICクローニング方法論を使用してバイオセンサをクローニングした。蛍光タンパク質遺伝子を以下のプライマーを使用し、Phusion Hot Start II High Fidelityポリメラーゼ（Thermo Scientific）を用いて増幅した：
Venus1
フォワードプライマー：
(SEQ ID NO: 1)
リバースプライマー：
(SEQ ID NO: 2)
Venus2
フォワードプライマー：
(SEQ ID NO: 3)
リバースプライマー：
(SEQ ID NO: 4)
mTFP1
フォワードプライマー：
(SEQ ID NO: 5)
リバースプライマー：
(SEQ ID NO: 6)

pDisplayプラスミドをXmalおよびSacll酵素で切断し、一本鎖末端を生成した。Venus-Venus-mTFP1タンデム構造の適切なアセンブリを、制限酵素分析およびシーケンシングを使用して確かめた。

２つの制限酵素部位をタンデム構造に取り入れた。Nhel部位がVenus1蛍光タンパク質とVenus2蛍光タンパク質を分離する一方、Venus2とmTFP1遺伝子の間（プライマーシーケンスにおいて太字で印をつけた部位）にAflIIをクローニングした。２つのオリゴヌクレオチドをこの部位にクローニングした。それぞれは、柔軟で、蛍光タンパク質の間に空間的分離を与えるように設計されたペプチドリンカーをコードする。オリゴヌクレオチドは、制限酵素切断部位（AgelおよびXbal）で分離した反復セグメントにより構成され、その長さの迅速で容易な調整を可能にする。以下のシーケンスを有する（リンカーLN1をコードする）オリゴヌクレオチドをAflII部位にクローニングした：

(SEQ ID NO: 7)。
(SEQ ID NO:8)。
AgeI制限部位は太字フォントであり、MMP-9切断部位をコードするシーケンスには下線を引いた。以下の（リンカーLN2をコードする）オリゴヌクレオチドをNheI部位にクローニングした：

XbaI制限部位は太字である。上記のように構築したバイオセンサは非構造ループ内にMMP-9切断部位を持ち、したがって、ループ状リンカー付きバイオセンサという名称であった。

（実施例２MMP-9活性バイオセンサ（α-ヘリックス切断部位）の構築）
α-ヘリックス構造内に位置したMMP-9切断部位を有するバリアントMMP-9活性バイオセンサを構築するため、ループ状リンカー付きバイオセンサにおいてVenusとmTFP1の間のリンカーをAflII酵素で切り離し、以下のオリゴヌクレオチド（SEQ NO ID: 9）と交換した：
。
それは以下のペプチド（+1 Open Reading Frame）をコードする：
（SEQ ID NO: 10）。ここにおいて、太字にしたシーケンスはα-ヘリックスを表す。

（実施例３FLIMに必要である膜に固定されたmTFP1の構築）
膜に固定されたmTFP1をpDisplayプラスミドにおいて構築した。mTFP1遺伝子を以下のプライマーで増幅した。
フォワードプライマー：
（SEQ ID NO: 11）
リバースプライマー：
（SEQ ID NO: 12）

制限部位―フォワードプライマーのApal、リバースプライマーのBglIIはそれぞれ太字にした。PCR産物をこの部位の間でpDisplayプラスミドにクローニングした。

（実施例４可変リンカー長付きMMP-9活性バイオセンサの構築）
一連の変化リンカー長付きバリアントバイオセンサを生成し、バイオセンサのFRET効率最適化を行った。完全長リンカー付きバイオセンサをコードするプラスミドを、AgelまたはXbal酵素のいずれかで部分切断、再連結し、大腸菌に形質転換した。制限酵素切断反応を、量を増加した酵素で行った。LN1リンカーを、１〜４つの制限部位を切るのに十分な量のAgelで２時間切断した―0.85U、1U、1.5U、2U、2.5U、3U、3.5UのAgelを使用した。同様に、LN2リンカーを２時間、6U、8U、10U、12U、14U、16U、18Uまたは20Uで切断し、プラスミドを１〜４つのXbal部位に切断した。クローンをPCRを使用して分析してバイオセンサ内のリンカー長を決定し、配列を決定した。

以下のバイオセンサを手にした：1-1、2-1、3-1、4-1、5-1、6-1、7-1、8-1、1-2、2-2、8-2、1-3、2-3、3-3、4-3、5-3、6-3、7-3、8-3、1-4、2-4、8-4、1-5、2-5、8-5、1-6、2-6、8-6、1-7、8-7、1-8、2-8、3-8、4-8、5-8、6-8、7-8、8-8。ここにおいて、バイオセンサバリアントを示す数値ペアの第１桁はLN2リンカーにおけるGGSGGRヘキサペプチドの反復数を示し、数値ペアの第２桁はLN1リンカーにおけるGGTGGTヘキサペプチドの反復数を示す。

（実施例５MMP-9活性バイオセンサのHEK293細胞への導入）
通常のFRET最適化およびセンサのテストをHEK293細胞株において行った。細胞は、３７°C、５％CO₂で、DMEM (4.5g/Lグルコース)+10%FBS+1%P/Sにおいて培養した。センサをコードするプラスミド（続く実施例において特定する）をQiagen Endo Free Plasmid Maxi Kitで精製した。導入するDNAを純DMEMおよびポリエチレンイミン（PEI）（5mg/mL）と混ぜ、室温で１０分間おき、その後、細胞培養物に移した。細胞はDNA-PEI複合体と共に４時間インキュベートし、その後、培地を新しいものと交換した。共焦点顕微鏡で画像化する予定の細胞を、ポリ-L-リジンをコーティングしたガラスカバースリップ上で培養した。

（実施例６MMP-9活性バイオセンサを発現する細胞のAP/FLIM分析）
導入して２日後に、実施例５で得た細胞をPBS中の４％PFA、３％スクロースで固定し、顕微鏡スライドを準備した。アクセプター光退色（AP）実験を63x NA (1.4)油浸対物レンズ付きLeica SP5顕微鏡上で行った。画像を1024x1024ピクセルで得た。mTFP1を２０％に設定したアルゴンレーザーの458nmラインで画像化した。センサのFRET効率を、高出力の514nmレーザーで行ったVenusのAPと、mTFP1の蛍光強度の増加を測定することにより求めた。最も高いFRET効率を有すると判断したセンサを、Leica SP2顕微鏡で蛍光寿命イメージング顕微鏡法（FLIM）を用いてさらに分析した。

APデータからのバリアントセンサの明白なFRET効率値を次式を用いて計算した。

(1)
f_DはFRET複合体に関係するドナーの画分であり、F_DAおよびF_Dは、それぞれ、バックグラウンドを差し引き、取得退色を補正した、退色する前後でのmTFP1の蛍光強度である。退色後のmTFP1の蛍光強度は次のように計算する。

(2)
ここにおいて、
および
は対象となる退色範囲および参照範囲のmTFP1強度を表し、preおよびpostは退色前測定値および退色後測定値を表す。

FLIMデータからのFRET効率値は次式で計算した。

(3)
ここにおいて、τ_Dはアクセプターがない場合のドナーの寿命であり（この場合、膜に固定されたmTFP1）、τ_DAはFRETベースのMMP-9活性バイオセンサの寿命であり、A_DAおよびA_Dは個別の減衰成分の振幅を表す[Zeug, et al., 2012]。エラー値はガウスノイズ伝搬式を用いて推定した。

(4)

（実施例７MMP-9活性バイオセンサを導入した細胞についての蛍光発光スペクトル収集）
ラムダスタック取得を63xNA (1.4)油浸対物レンズを備えたZeiss LSM780顕微鏡上で、1024x1024ピクセルで行った。9nmステップで、アルゴンレーザーの458nmラインを励起のために使用し、３２ラムダチャネルを得た。得たラムダスタックはFiji ImageJ softwareを用い、各チャネルの形質膜の平均輝度を測定することにより分析した。回復センサスペクトルを、領域を１と同等のスペクトルプロットの下に置くことにより正規化した。

（実施例８HEK293の分画）
細胞分画実験を、Calbiochem ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction kitを用いて行った。センサをanti-myc抗体を用いてウエスタンブロットで検出した。細胞分画の質を以下の抗体：anti-hsp90、anti-N-cadherinおよびanti-histone H3を用い、ウエスタンブロットでテストした。

（実施例９MMP-9活性バイオセンサのin vitroでの切断）
導入して２日後のHEK293細胞はPBSで洗浄したものであり、プレートから解体し、以下のバッファー：50mM、pH7.5のTris-CI、1%のトリトンX-100、10mMの塩化カルシウム、0.02%のアジ化ナトリウム、1μMの塩化亜鉛を用い、4°Cで１時間溶解した。溶解は、プロテアーゼ阻害剤なしで行った。これは、プロテアーゼ阻害剤は自己活性化MMP-9の活性を阻止する恐れがあるためである。溶解物をその後、4°Cで１５分間、13400rpmで遠心分離し、細胞残屑を取り除いた。同量の、澄んだ溶解物を続く反応に使用した。400ng（最終濃度10μg/mL）、1.2mg（最終濃度30mg/mL）の自己活性化MMP-9、または、400ng（最終濃度10μg/mL）の不活性MMP-9のいずれかを反応に添加した。GM6001阻害剤を最終濃度25mMで使用した。反応は、SDS-PAGEサンプルバッファーを添加して100°Cまで１０分間加熱し、３０分、１時間、４時間のいずれかで、または一晩37°Cでインキュベートした後、停止した。センサをanti-GFP抗体を用いウエスタンブロットで検出した。

（実施例１０細胞培養物におけるMMP-9活性バイオセンサの切断）
MMP-9活性バイオセンサを用いた導入の２日後に、培養物の培地を純DMEMと交換した。細胞は３０分間、400ngの自己活性化MMP-9（最終濃度−800ng/mL）を用いてインキュベートし、PBS中の4％PFA、3％のスクロースで固定した。ラムダスタックは前述のように得た。

（実施例１２MMP-9活性バイオセンサを導入した細胞のライブイメージング−レシオメトリック分析）
HEK293細胞株をGlass Bottom Microwell Dishes（MatTek Corporation）で培養した。細胞に、α-ヘリックスリンカー付きバイオセンサをコードするプラスミドを導入した。導入して２日後に、細胞をインキュベータを装着したZeiss LSM780顕微鏡に移し、40xの水浸対物レンズを用いて画像化した。細胞の単一光切片を1024x1024ピクセルの解像度で３０秒毎に、ドナーとアクセプター蛍光のスペクトルの線形分離（linear unmixing）をリアルタイムで行いながら、取り込んだ。取得は３０分間行った。画像取得開始５分後に、細胞は純DMEM、DMEMで希釈した自己活性化MMP-9（最終濃度−460ng/mL）、または、DMEMで同一の最終濃度まで同様に希釈した不活性MMP-9のいずれかでモック処理した。データ分析はMatlabスートの下、特注ソフトウェアで行った。Venus/mTFP1比率は各ピクセルについて計算し、実験開始からの経過時間に対してプロットした。

〔結果〕
I．バイオセンサのFRET効率（APおよびFLIM研究）
長さを調整したリンカーの導入により、３８個のバイオセンサバリアントの迅速な形成が可能になった。最高のFRET効率を持つ本発明のバイオセンサを、AP技術（図１B）で特定し、FLIMを使用して分析してAPベースのFRET効率計算を確かめた。

表１は、AP実験において最高のFRET効率を有するバイオセンサバリアントについて、FLIMデータより計算したFRET効率値を示す。エラー値をガウスノイズ伝搬式を用いて推定した。バリアントの命名規則は次の通りである：X-Y（X−Venus FP（リンカーLN2）同士の間のヘキサペプチドの反復数、Y−Venus FPとmTFP1（リンカーLN1）の間のヘキサペプチドの反復数）。

バリアントのFRET効率

２つのVenus FPの間に長いリンカーを有し（そのDNAシーケンスにおいて、
（SEQ ID NO: 13）が７回反復する）、第２VenusとmTFP1の間に短いリンカーを有する（そのDNAシーケンスにおいて、
（SEQ ID NO: 14）が１回反復する）バイオセンサ（表１中の7-1）が、得られた全てのバイオセンサループ状リンカーバリアントの中で最高のFRET効率を有し、FRET効率は、E = 0.20±0.03（標準偏差値）―図２Aであることが分かった。α-ヘリックスリンカー付きバイオセンサは、ループ状リンカー付きバイオセンサに比べ、より高い、取得―退色補正有効FRET効率0.26±0.02を有する―図２B。より高いFRET効率がα-ヘリックスリンカー付きバイオセンサにより提示されると仮定し、それはさらなる研究で使用した。

II．細胞膜局在
本発明のMMP-9活性バイオセンサは細胞膜に局在する。これは、HEK293生体細胞においてバイオセンサを直接可視化することにより（図１C）、そして、細胞分画の後に続く収集画分のウエスタンブロット分析（図１D）を通して確かめた。分画により、バイオセンサの大部分（87％±6％）が膜に局在し、ごく一部が細胞形質に局在することを確かめた。核にはバイオセンサは観察されなかった。コントロールウエスタンブロットにより、収集した画分の純度を確かめた。

III．in vitroでのバイオセンサ切断
MMP-9活性バイオセンサをヒト自己活性化MMP-9によりin vitroで切断した（図３）。さらに多量の酵素ををこの反応に使用して（実験における自己活性化MMP-9の標準濃度は400ng/mL[Michaluk et al., 2009]である）、バイオセンサプール全体が切断されたことを確認した。

バイオセンサは、導入以外は未処理のHEK293細胞株において、すでに部分的に切断されており（14.2±0.4％−図３B、コントロールレーン；コントロールレーンにおいて完全長バイオセンサ強度に正規化した値を参照）、これはウエスタンブロットで容易に確かめることが可能である（図３）。切断された形をしたバイオセンサの量のわずかな増加は時間の経過とともに観察されるが（図３）、α-ヘリックスリンカー付きバイオセンサのin vitroでの切断はタンパク質の自発的分解によるものではない。不活性ヒトMMP-9はバイオセンサを切断しない（図３）。切断は、広スペクトルGM6001マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤を添加して最終濃度を25mMにすることにより阻止することが可能である（図３）。

IV．HEK293細胞培養物におけるバイオセンサ切断−固定細胞の蛍光発光スペクトル
自己活性化MMP-9を用い３０分間インキュベートしたHEK293細胞より収集した蛍光発光スペクトルの分析により、バイオセンサは細胞膜において切断されていることを確認する（図４）。バイオセンサ切断は、膜内のバイオセンサの発光スペクトルの変化として観察することが可能である。自己活性化MMP-9を用いた処理は、スペクトルのより短い波長へのシフト、Venusの蛍光シグナルに対する寄与（アクセプターピーク）の減少、および、mTFP1寄与（ドナーピーク）の対応する増加の原因となる。

V．HEK293細胞培養物におけるバイオセンサ切断−ライブセルイメージング
バイオセンサの切断は、VenusのmTFP1に対する蛍光強度比率の低下（図５）として、HEK293細胞のライブイメージングで観察することが可能である（図５）。自己活性化MMP-9の培養物培地への添加は比率の低下の原因となる一方、純培地を用いたモック処理または不活性MMP-9を用いた処理は小幅で緩やかな増加の原因となる（図５B）。

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Claims

形質膜に固定されている、遺伝子的にコードされたＭＭＰ−９活性バイオセンサであって、該バイオセンサは、ＦＲＥＴドナー蛍光タンパク質としての青緑色蛍光タンパク質ｍＴＦＰ１と、柔軟なリンカーにより全て分離しているＦＲＥＴアクセプタータンパク質としての２つのＶｅｎｕｓ蛍光タンパク質とを含み、
前記２つのＶｅｎｕｓ蛍光タンパク質は、ＧＧＳＧＳＲヘキサペプチドの７回の反復を含む柔軟なリンカーにより分離しており、
前記Ｖｅｎｕｓ蛍光タンパク質の一方は、合成ＭＭＰ−９切断部位を含むα−ヘリックスリンカー、または、合成ＭＭＰ−９切断部位および１つのみのＧＧＴＧＧＴヘキサペプチドを含むリンカーにより、前記青緑色蛍光タンパク質ｍＴＦＰ１から分離している、バイオセンサ。
前記Ｖｅｎｕｓ蛍光タンパク質の一方は、シーケンスＥＥＥＩＲＥＡＦＲＶＦＰＲＳＬＳＬＲＨＶＭＴＮＬを含むα−ヘリックスリンカーにより、青緑色蛍光タンパク質ｍＴＦＰ１から分離している、請求項１に記載のバイオセンサ。
前記合成ＭＭＰ−９切断部位が、ＰＲＳＬＳシーケンスに対応している、請求項１または２のいずれかのバイオセンサ。
ＰＤＧＦＲ貫膜ドメインにより形質膜に固定されている、請求項１〜３の何れか１項に記載のバイオセンサ。
請求項１〜４の何れか１項で定義された遺伝子的にコードされたＭＭＰ−９活性バイセンサの、ＭＭＰ−９のタンパク質分解活性をｉｎｖｉｔｒｏおよび生体細胞のｉｎｖｉｖｏで検査するためのシステムとしての使用。