CN105593686A - 遗传编码的基于fret的mmp-9活性生物传感器及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明设计遗传编码的基于FRET的生物传感器以监测基质金属蛋白酶9(MMP-9)的活性。MMP-9是在生理学和病理学过程中涉及的在细胞外起作用的内肽酶。锚定于膜上的遗传编码的FRET生物传感器使得在细胞上MMP-9作用的精确区域以高时空分辨率研究MMP-9的蛋白裂解活性。所述生物传感器在活细胞中的体外和体内的应用性已经通过纯化的MMP-9自激活突变体对生物传感器的裂解进行比率分析得到证明。

Description

遗传编码的基于FRET的MMP-9活性生物传感器及其用途

本发明涉及遗传编码的基于FRET的基质金属蛋白酶9(MMP-9)活性生物传感器及其用途。

现有技术

在阐明控制基础细胞功能的机制方面的进展使研究者们的关注目标转移到细胞动力学上，并产生对灵敏且足够快速地追踪活细胞中动态进程的方法的需求不断增长。在大分子相互作用的亚细胞时空定位领域，基于福斯特共振能量转移(ResonanceEnergyTransfer，FRET)的方法尤其有用。

近来，已经开发了大量的不同的遗传编码的基于FRET的生物传感器。其可用于研究不同的现象如离子浓度[Miranda等人，2012；Burdette等人，2001；Esposito等人，2008]，有机化合物浓度[Gruenwald等人，2012]，GTPase活性[Kalab和Soderholm，2010]，蛋白质磷酸化[Violin等人，2003]以及细胞内的机械应力[Meng,F.和F.Sachs，2011]。其优势是在活细胞和生物体中实时追踪这些现象的能力。

MMP-9是一种细胞外分泌的92kDa的蛋白酶，属于锌钙依赖的内肽酶家族。其裂解大量的细胞外基质蛋白质和细胞粘附分子。大量研究表明MMP-9通过其在调控血管生成与裂解细胞外基质而使肿瘤进入转移的双重作用在癌症发展中起显著作用[Klein和Bischoff，2011；Deryugina和Quigley，2006；Kessenbrock等人，2010]。在大量不同肿瘤中都观察到MMP-9表达相比于健康受试者的增加，其中肿瘤侵袭性与MMP-9活性水平之间有明显的正向联系[Hanemaaijer等人，2000；Schmalfeldt等人，2001]。细胞外基质的MMP-9加工还可导致促进血管生成的细胞因子和生长因子的释放[等人，1998；Yu和Stamenkovic，2000]。事实上，研究指出，MMP-9活性水平是癌症中可能的预后因素(见Klein，等人，2004的综述)。

目前的研究还指出，MMP-9是突触可塑性以及延伸到被认为依赖于突触可塑性的过程——学习和记忆中的关键调控因子之一。突触可塑性是大脑中突触之间联接强度改变的能力。

通常运用的检测MMP-9蛋白裂解活性的方法如DQ-明胶(一种大量标记有荧光素的明胶衍生物，其完整时荧光素几乎完全淬灭——明胶酶活性导致荧光增加)或凝胶/原位酶谱法并不能对明胶酶活性的定位进行高时空分辨率的评估。此外，其都是基于明胶的并且检测基质金属蛋白酶明胶酶亚家族的另一个成员MMP-2(连同MMP-9)的活性。由于MMP-2表达水平远远高于MMP-9，所以这些方法检测出的主要裂解都来自MMP-2的蛋白裂解活性而非MMP-9。其他近期产生的荧光MMP-9活性生物传感器是完全合成的[Fudala等人,2011；Akers，等人，2012；RoopaliRoy等人，2011；Hawkins等人,2013；Leight等人，2013]，因此其预期是以类似DQ-明胶的方式使用的。

DQ-蛋白质(染料淬灭)底物是市售可得的广泛使用的MMP-9活性探针。DQ底物是用荧光染料过量标记的天然底物的类似物。所述过量标记形成的染料分子紧邻位置是对完整底物的荧光信号进行淬灭的原因。MMP-9对DQ底物的水解导致染料分子的分离及荧光信号的增加。DQ-明胶和IV型DQ-胶原已经成功用于在凝胶和原位酶谱上以及在活细胞显微成像中体外检测蛋白酶活性(明胶酶活性测定试验)(见Cavallo-Medved等人，2009和Sameni等人，2009)。DQ-明胶和IV型DQ-胶原使得能够在活细胞中ECM降解及细胞内降解过程的追踪可视化。然而，由于鉴别负责降解的蛋白酶和含有这些蛋白酶及降解产物的细胞分区需要其他技术，这是其用途的限制。即使与活细胞成像联合使用，DQ底物至多只能提供对蛋白裂解活性的总体测量(globalmeasure)。由于DQ-蛋白质底物受到多种蛋白酶裂解，在局部使用的用途不大，又需要考虑到超结构形态学变化，且DQ-蛋白质底物不适于体内成像，因此其不能促进未来对MMP-9基础生理学和病理学功能的研究。

因此，设计出大量新分子探针以解决DQ-蛋白质底物的不足。由于MMP有可能成为癌症的预后标记物，因此在用于检测MMP-9蛋白裂解活性的诊断和分析探针领域做了大量工作(见RoopaliRoy等人，2011，其调查了几种MMP-9活性探针及其用作检测癌症的诊断工具的适宜性，以及Scherer等人，2008，其综述了癌症中MMP活性检测领域中近期发展)。近红外或NIRF探针引起了人们极大的兴趣，因为对近红外光的躯体通透性并因此有可能用于体内，尽管也开发了正电子发射断层扫描探针。大量NIRF探针显示出自淬灭特性，以增加信噪比。一种2009年开发并起初意欲用于检测MMP-2活性的称为Cy5.5-C6的环肽NIRF探针[Wang，等人，2009]被成功用于关联结直肠癌进展与MMP-2和MMP-9水平[Lee，等人，2012]。该探针的独特属性是其结合于MMP-9并抑制其活性。市售可得的MMPSense680是另一种用于在体内检测MMP-9的NIRF探针[Kaijzel等人，2010，和WallisdeVries等人，2009]，但在蛋白酶特异性方面，探针自身相当难以区分，其可被MMP-2、-3、-9和-13裂解。最后，研究者通过对携带移植瘤小鼠注射自组装的三螺旋近红外探针(探讨于Akers等人，2012)观察到注射24小时后肿瘤相关的荧光有强烈(五倍)增加。在施用GM6001光谱金属蛋白酶抑制剂后，荧光则消除。

尽管上文描述的NIRF探针相对DQ-蛋白质底物有明显的进步，但是其在设计理念上用途都狭窄不少——只是作为诊断工具而非研究工具使用。加上其中一些显示出低的蛋白酶特异性，另一些有不期望的MMP抑制特性，且依赖于合成荧色物，很明显其不适合于在细胞超结构水平(质膜结构域，树突棘，等等)上对MMP-9进行定位。

Fudala等人，2011和Fudala等人，2012，描述的MMP-9活性探针通过利用人工MMP-9裂解位点解决了低蛋白酶特异性的问题。该分析探针由两种荧光染料(5-FAM和Cy5)构成，二者被可由MMP-9裂解的短肽分隔开。在完整的探针中，FRET引起5-FAM荧光的淬灭，而Cy5荧光得到强烈增强。MMP-9(而非MMP-2)的裂解导致荧色物的分离且5-FAM荧光的显著增加。尽管Fudala等人开发的MMP-9活性探针更可能在将来以聪明的方式使用(如DQ-蛋白质底物的例子)，然而其具有和NIRF探针相同的缺点，这使之不能用于研究生理学和病理学条件下的MMP-9的基础功能。

了解MMP-9在生理学(细胞外基质重塑、血管生成、突触可塑性)以及病理学条件(肿瘤恶性进展、癫痫)下进行的多种功能需要能够评估其蛋白裂解活性的工具。近年来，人们目睹了大量功能成像技术的发展，其提供了在活细胞中测量并定位MMP-9活性的方式。然而，所有这些方法都依赖于外部应用可被MMP-9裂解的荧光探针。遗传编码的、锚定于膜的基于FRET的MMP-9活性生物传感器可能更适合于阐明生理学和病理学过程中MMP-9的蛋白裂解活性。因此，需要开发一种生物传感器，使得在细胞上MMP-9作用的精确区域以高时空分辨率研究MMP-9的蛋白裂解活性成为可能，且其可在活细胞中进行体外和体内应用。

发明概述

本发明提供了一种遗传编码的基于FRET的MMP-9活性生物传感器，其克服了目前可得的生物传感器的局限，使得对MMP-9的基础生理学和病理学作用的研究成为可能。

本发明的遗传编码的MMP-9活性生物传感器包含被变连接子隔开的一个FRET供体荧光蛋白和两个FRET受体荧光蛋白，其中供体和受体之间的连接子含有合成的MMP-9裂解位点，并且整个生物传感器锚定于质膜上。

优选地，本发明生物传感器中的所述FRET供体荧光蛋白选自单体蓝绿色(teal)荧光蛋白mTFP1[Li和Elledge，2007]和三叶草荧光蛋白[Lam等人，2012]。最优选地，所述FRET供体荧光蛋白为mTFP1。mTFP1从四聚体青色(cyan)荧光蛋白cFP484(其分离自属于羽珊瑚属(Clavularia)的珊瑚)生成的蛋白质。

优选地，所述FRET受体荧光蛋白选自Venus荧光蛋白和mRuby2荧光蛋白。最优选地，所述FRET受体荧光蛋白为Venus荧光蛋白。Venus荧光蛋白是黄色荧光蛋白的改进型变体。

用于本发明生物传感器的供体-受体FRET对的特征在于高的福斯特半径及光稳定性。

本发明的生物传感器中的MMP-9裂解位点优选地为合成的裂解位点。可用作MMP-9裂解位点(即，这些序列可被MMP-9裂解)的氨基酸序列的实例包括PRSLS[Fudala等人，2011]、PLGLAG[Tsien2013]、PLFYSV、KIPRTLT、PLRLSW和PRAVST、KGPRQIT[Kridel等人，2001]。优选的MMP-9裂解位点包含PRSLS。

在优选的实施方式中，本发明的生物传感器通过血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的转膜结构域锚定于质膜上。

优选地，本发明的生物传感器中的可变连接子选自α-螺旋连接子、包含1-8个GGTGGT六肽重复片段的连接子和包含1-8个GGSGSR六肽重复片段的连接子。

在一个优选的实施方式中，供体蛋白质和受体蛋白质之间的连接子为α-螺旋连接子，其优选地包含序列PRSLS(α-螺旋的位点以黑体标出)。

备选地，供体蛋白质和受体蛋白质之间的连接子除MMP-9裂解位点外包含仅仅一个GGTGGT或GGSGSR六肽，且优选地其包含仅仅一个GGTGGT六肽。所述连接子也称为环状连接子。在最优选的实施方式中，所述连接子由以下序列组成：LKGSKLK(GGTGGT/GGSGSR)LK(MMP-9裂解位点以黑体标出)。

其他连接子，即两个受体蛋白质之间的连接子，优选地包含7个GGSGSR六肽重复片段。

图1A中示例给出本发明的具体优选的生物传感器的结构。在一个实施方式中，在本发明的生物传感器包含两个Venus荧光蛋白，其被包含7个GGSGSR六肽重复片段的可变连接子隔开，其中一个Venus荧光蛋白与mTFP1被包含合成的MMP-9裂解位点的α-螺旋连接子隔开。在另一个优选的实施方式中，本发明的生物反应器包含两个Venus荧光蛋白，其被包含7个GGSGSR六肽重复片段的可变连接子隔开，其中一个Venus荧光蛋白与mTFP1被包含合成的MMP-9裂解位点和仅仅一个GGTGGT六肽的连接子隔开。

本发明的生物传感器显示出对MMP-9有高的FRET效率(efficiency)和选择性。MMP-9对所述生物传感器的裂解导致受体蛋白质从细胞膜上释放和FRET的降低，观察到的是受体对供体荧光强度比率的下降。因此，本发明还涉及本发明的遗传编码的MMP-9活性生物传感器用作系统的用途，所述系统用于活细胞中体内和体外的MMP-9蛋白裂解活性的研究。

附图简述

图1A呈现本发明的优选生物传感器的一般结构；在一个实施方式(标记为(i))中，Venus荧光蛋白被7个GGSGSR重复片段隔开，而VenusFP和mTFP1被包含MMP-9裂解位点的α-螺旋连接子隔开；在另一个实施方式中(标记为(ii))，Venus荧光蛋白被7个GGSGSR重复片段隔开，而VenusFP和mTFP1被MMP-9裂解位点和1个GGTGGT六肽隔开；在荧光蛋白之间六肽重复片段数量较低的变体传感器是通过对所述传感器的遗传序列进行部分裂解而生成的。图1B呈现由AP计算出的FRET效率；浅灰色条指示传感器通过FLIM进行分析。图1C呈现表达本发明的生物传感器的HEK293的活细胞成像。图1D呈现表达本发明的生物传感器的HEK293细胞系的分级结果；使用抗-cmyc抗体进行针对生物传感器的WB；对照WB在下文表示。

图2A呈现表达具有环状连接子的HEK293细胞在AP前后的成像；mTFP1通过458nm激光进行激发，Venus通过514nm激光进行激发；右图呈现优化的生物传感器在AP前后的发射光谱；可见受体峰的消失及供体荧光强度的增加。图2B呈现具有α-螺旋连接子的生物传感器的AP结果。

图3呈现具有α-螺旋连接子的生物传感器的体外裂解情况以及阴性对照——基线裂解，使用无活性MMP-9的裂解，以及GM6001金属蛋白酶抑制剂对自激活MMP-9的生物传感器裂解的影响。在用抗-GFP抗体的WB上分析生物传感器的裂解；在定量时，以对照泳道全长生物传感器对所有点的强度进行定量；在标准化前，将30min、1h、4h，o/n泳道中裂解产物的强度减去对照泳道中裂解产物的强度。

图4呈现在用自激活MMP-9(aaMMP-9)处理前后，表达具有α-螺旋连接子的生物传感器的HEK293细胞中记录的光谱；所述处理引起光谱向较短波长移动，表明传感器受到裂解。误差线代表SEM值。插入部分为表达所述生物传感器的HEK293细胞的代表性的lambda堆栈的最大投影(projection)。矩形指示目标近似区域，发射光谱即是从中采集。对每个细胞，使用3个ROI计算平均发射光谱。

图5呈现表达具有α-螺旋连接子的生物传感器的HEK293细胞的活体成像期间采集的图片。对在ZeissLSM780上获取的细胞图像进行线性离析以移除mTFP1和VenusFP之间光谱重叠的影响。然后用离析后的数据计算实验各个时间点的图片中各像素点的荧光强度比率。图5A呈现关联该像素点中荧光强度比值(OY轴)和荧光强度(OX轴)的图谱。该图谱是针对图5B中的细胞生成的。图5B呈现所示时间点拍摄的HEK293细胞的图像。各像素点被赋予对应该像素点荧光强度的颜色和色调。在5min时将自激活的MMP-9加入到培养物。观察到Venus/mTFP1荧光强度比率逐渐降低。图5C呈现阴性处理、用无活性MMP-9或自激活MMP-9处理的细胞的荧光强度比率。这些数值都相对处理开始前的时间点计算的平均荧光强度比率数值进行标准化。每条线代表3个细胞的平均比率。观察到在用自激活MMP-9处理的细胞的比值逐渐降低。而在空白处理或用无活性MMP-9处理的细胞中未观察到所述降低。误差线代表SEM值。

发明详述

本发明的遗传编码的基于FRET的MMP-9活性生物传感器填补了MMP-9检测领域的缺口。直到现在，MMP-9活性探针的发明都是以临床诊断为目的的，这是可以理解的，因为MMP-9在癌症发展中起作用。然而，近年来发现MMP9在其他过程中例如在大脑生理学中起关键作用。尽管探针如DQ-明胶在研究MMP-9所述方面的作用上极为有用，然而其恰恰不能提供回答大量已经提出问题所需的时空分辨率。本发明的遗传编码的膜锚定的基于FRET的MMP-9活性生物传感器更适于阐明MMP-9的蛋白裂解活性在生理学和病理学进程中的作用。

本发明的生物传感器利用了一种新型单体蓝绿色荧光蛋白(mTFP1)，其具有超越CFP的光谱特性[Day，等人，2008]。先前已经表明mTFP1与黄色荧光蛋白形成更有效的FRET对[Li和Elledge，2007]。然而，其他荧光蛋白如三叶草FP[Lam等人，2012]也可用于本发明的生物传感器。

mTFP1起能量供体的作用，而双重的Venus荧光蛋白起能量受体作用。选择黄色荧光蛋白的改善型变体Venus荧光蛋白作为FRET受体。其他FP也可用作受体FP，例如Lam等人公开的mRuby2，见上文。

尽管大多数基于FRET的传感器含有一个供体蛋白质和一个受体蛋白质，但所述传感器中引入两个受体FP蛋白质以增加其FRET效率。单一供体和单一受体系统的FRET效率由下式确定: $E_1=\frac{k_T}{k_T+k_R+k_F},$

其中k_T为能量转移速率，k_R为所有其他失活过程的常数，k_F为荧光衰退速率。

单一供体和两个受体系统的FRET效率由下式确定: $E_2=\frac{2k_T}{2k_T+k_R+k_F},$

在FRET生物传感器中引入第二个受体增加了其FRET效率，因为 $E_2=\frac{2E_1}{1+E_1}\≥E_1.$

本发明的生物传感器中荧光蛋白之间的距离是经过优化的，以使有效FRET效率最大化。由于FRET效率不仅由供体和受体蛋白质之间的距离确定，还由方向决定，因此采用了通过数个GGSGGS或GGTGGT重复片段形成的可变连接子，并且这被证明有效提高FRET效率。两个甘氨酸残基赋予所述连接子可变性，而稍大的氨基酸决定蛋白质之间的线性距离。

决定本发明的生物传感器的功能性的其他因素为MMP-9裂解序列。对已知MMP-9底物进行筛选发现MMP-9裂解位点并无之前想象的保守序列或二级结构。Kridel等人[Kridel等人，2001]使用以ELISA形式的噬菌体展示技术，报道了可由MMP-9裂解的短肽家族。因此，本发明人选择了其中提出的保守序列N'-PRSLS-C'，并将其克隆至本发明的生物传感器中。先期已经报道[Fudala等人，2011]该序列确实被MMP-9识别。然而，其他氨基酸序列也可用作MMP-9裂解位点(如上文讨论的)。

由于蛋白裂解效率强烈依赖于裂解位点的可及性，这进而受到其二级和三级结构的影响，所以本发明人决定改变位于本发明生物传感器中mTFP1和Venus荧光蛋白之间的连接子的结构，这是通过在两个α-螺旋之间置放MMP-9裂解位点。

本发明人进行了受体光漂白(AP)实验以快速筛选生成的生物传感器并总体表明FRET是否发生。这些实验并不意欲为FRET现象提供可靠的定量。用荧光寿命显微成像显微术(fluorescencelifetimeimagingmicroscopy，FLIM)对FRET效率最高的生物传感器进行FRET特性的深度分析。发现由AP和FLIM实验计算的FRET效率值之间有微小差别。然而，基于AP的FRET效率值是针对整个细胞进行计算的(因此包括细胞质，其中FRET是可忽略不记的，因为所述生物传感器定位于膜上)，而基于FLIM的FRET效率值是针对小得多区域(其中FRET最丰富)进行计算的。

本分析的结果发现具有α-螺旋连接子的生物传感器比具有环状连接子的生物传感器具有更高的FRET效率。此差异可能是由于环状和α-螺旋连接子预计的不同更高级结构，后者更紧凑，因此使供体和受体彼此更靠近。

MMP-9蛋白质裂解活性导致双重Venus蛋白质从细胞膜上释放，且Venus对mTFP1的荧光比率降低。所述生物传感器主要存在于细胞膜上。细胞质中存在小部分生物传感器可能表示传感器有一定程度的降解。在体外测定中，所述生物传感器被MMP-9裂解。所述裂解并非由于蛋白质的自发降解，并可通过加入广谱MMP抑制剂而被阻断。在未处理的裂解物中可观察到生物传感器的基线裂解。由于细胞裂解是在不含任何类型的蛋白酶抑制剂的的情况下进行的，所观察到的裂解可能由HEK293细胞裂解物中存在的内源MMP-9引起。该基线裂解可至少部分地被广谱的(GM6001阻断MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8和MMP-9)和特异性的(抑制剂I选择性地阻断MMP-9和MMP-13)基质金属蛋白酶抑制剂所阻断。

从表达所述生物传感器并用自激活MMP-9处理的固定的HEK293细胞的细胞膜收集的荧光发射光谱与未处理细胞中记录的结果不同。mTFP1对荧光信号的贡献增加，暗示生物传感器受到裂解。MMP-9对生物传感器结构的影响随后通过活细胞显微成像观察。

这表明本发明的生物传感器在活细胞中进行体外以及体内研究MMP-9的蛋白裂解活性中的用途。

实施例

实施例中使用材料

所述遗传编码的基于FRET的MMP-9活性生物传感器在pDisplay质粒(Clontech)中组装。mTFP1基因扩增自pmTFP1-N1质粒(AlleleBiotech)。编码Venus基因的质粒由JacekJaworski(TheInternationalInstituteofCellBiology，Warsaw)提供。

PhusionHotStartII聚合酶购自ThermoScientific(之前的Finnzymes)。XmaI、SacII、Nhel、AflII、AgeI、XbaI、ApaI和BglII限制性内切酶获自NewEnglandBiolabs和ThermoScientific(之前的Fermentas)。SLIC克隆中所需的T4DNA聚合酶获自ThermoScientific(之前的Fermentas)。DMEM+GlutaMAX(高葡萄糖4.5g/L)、胎牛血清和青/链霉素混合物购自Sigma-Aldrich。用于HEK293细胞系转染的聚乙烯亚胺获自Fluka。ProteoextractSubcellularProteomeKit获自Calbiochem并且EndoFreePlasmidDNAMaxiKit来自Qiagen。α-GFP抗体购自MBL(#498)，α-myc抗体来自SantaCruzBiotechnologies(#sc-40)，α-N-钙粘蛋白抗体来自BDBiosciences(#610920)，α-hsp90抗体来自Stressgen(#SPS-771)，α-组蛋白H3抗体来自Abcam(#ab10799)。

用于包被玻璃盖玻片的聚-L-赖氨酸购自Sigma-Aldrich。自激活的MMP-9根据先前描述的方法进行设计和纯化[Michaluk等人，2007]。寡核苷酸订购于SigmaAldrich或Genomed。

实施例1构建MMP-9活性生物传感器(环状连接子)

使用[Li和Elledge，2007]中描述的SLIC克隆方法克隆生物传感器。用PhusionHotStartIIHighFidelityPolymerase(ThermoScientific)和以下引物扩增荧光蛋白基因：

Venus1

正向引物:CTGGGGCCCAGCCGGCCAGATCTCCCGGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

(SEQIDNO:1)

反向引物:TCCTCGCCCTTGCTCACCATCTTGTACAGCTCGTCCATGC.

(SEQIDNO:2)

Venus2

正向引物:GCATGGACGAGCTGTACAAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA.

(SEQIDNO:3)

反向引物:TCCTCGCCCTTGCTCACCATCTTGTACAGCTCGTCCATGC；

(SEQIDNO:4)

mTFP1

正向引物:GCATGGACGAGCTGTACAAGCTTAAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGA.

(SEQIDNO:5)

反向引物:

AGATGAGTTTTTGTTCGTCGACCTGCAGCCGCACTTGTACAGCTCGTCCATGC

(SEQIDNO:6)。

用Xmal和Sacll酶裂解pDisplay质粒生成单链末端。使用限制性内切酶分析和测序确定了Venus-Venus-mTFP1串联构建体的恰当组装。

将2个限制性内切酶位点引入所述串联构建体：Nhel位点将Venus1和Venus2荧光蛋白分隔开，而AflII克隆至Venus2和mTFP1基因之间(在引物序列中这些位点以黑体标出)。将两段寡核苷酸克隆至这些位点中，每段都编码了设计为可变的且提供荧光蛋白之间空间分隔的肽连接子。寡核苷酸由通过限制性内切酶裂解位点(Agel和Xbal)隔开的重复片段组成，以使得可以迅速而简单地调整它们的长度。具有以下序列的寡核苷酸(编码连接子LN1)被克隆至AflII位点:

CTTAAGGGATCCCCCCGCTCTCTCTCTAAGCTTAAA-(GGAGGAGGAACT)₈-CTTAAG

(SEQIDNO:7)。

AgeI限制性位点以黑体表示，编码MMP-9裂解位点的序列以下划线标出。以下寡核苷酸序列(编码连接子LN2)被克隆至NheI位点:

GCTAGCGGTGGTAGCGGTGGTAGCGGTGCTAGT-(GGTGGTTCTGGT)₈-GCTAGC

(SEQIDNO:8)。

XbaI限制性位点以黑体表示。以上方式构建的生物传感器在物结构的环中携带MMP-9裂解位点，因此得名：具有环状连接子的生物传感器。

实施例2构建MMP-9活性生物传感器(α-螺旋连接子)

为构建具有位于α-螺旋结构内的MMP-9裂解位点的变体MMP-9活性生物传感器，将具有环状连接子的生物传感器中Venus和mTFP1之间的连接子用AflII酶切去，用以下寡核苷酸代替(SEQNOID:9)：

CTTAAGGAGGAGGAGATCAGAGAGGCCTTCAGAGTGTTCCCCAGAAGCCTGAGCCTGAGACACGTGATGACCAACCTGCTTAAG

其编码下面的肽(+1开放阅读框)：

PRSLS

(SEQIDNO:10)，其中黑体标出的序列代表α-螺旋。

实施例3构建FLIM所需的膜锚定的mTFP1

在pDisplay质粒中构建膜锚定的mTFP1。使用以下引物扩增所述mTFP1基因——

正向引物:AAGAACATGGTGAGCAAGGGCGAGG(SEQIDNO:11)

反向引物:AAGAACCTTGTACAGCTCGTCCATGC.(SEQIDNO:12)。

黑体为限制性位点——分别是正向引物中的ApaI和反向引物中的BglII。将PCR产物克隆至pDisplay质粒中这些位点之间。

实施例4构建具有不同连接子长度的MMP-9活性生物传感器

生成一系列具有改变的连接子长度的变体生物传感器以进行针对生物传感器的FRET效率优化。用Agel或Xbal酶部分裂解编码具有全长连接子的生物传感器的质粒，重新连接并转化如大肠杆菌(E.coli.)。使用逐渐增加量的酶进行限制内切酶裂解反应。用足以切割1-4个其限制性位点的量的AgeI裂解LN1连接子2h——使用了0.85U、1U、1.5U、2U、2.5U、3U、3.5U的Agel。类似地，用6U、8U、10U、12U、14U、16U、18U或20U裂解LN2连接子2h，以裂解质粒1-4个Xbal位点。使用PCR对克隆进行分析以确定生物传感器内的连接子长度并进行测序。

得到以下的生物传感器：1-1、2-1、3-1、4-1、5-1、6-1、7-1、8-1、1-2、2-2、8-2、1-3、2-3、3-3、4-3、5-3、6-3、7-3、8-3、1-4、2-4、8-4、1-5、2-5、8-5、1-6、2-6、8-6、1-7、8-7、1-8、2-8、3-8、4-8、5-8、6-8、7-8、8-8，其中标记生物传感器的数字对中第一位数表示LN2连接子中GGSGGR六肽重复片段的数量，而数字对中第二位数表示LN1连接子中GGTGGT六肽重复片段的数量。

实施例5将MMP-9活性生物传感器转染入HEK293细胞

在HEK293细胞系中进行传感器的常规FRET优化和测试。将细胞在DMEM(4.5g/L葡萄糖)+10％FBS+1％P/S中，37℃，5％CO₂下培养。用QiagenEndoFreePlasmidMaxiKit纯化编码传感器的质粒(在下述实施例中进行鉴定)。将要转染的DNA与纯DMEM及聚乙烯亚胺(PEI)(5μg/μL)混合，室温放置10分钟，然后转移至细胞培养物。将细胞与DNA-PEI复合物孵育4h，然后用新鲜培养基换液。将意欲进行共聚焦显微成像的细胞在包被聚-L-赖氨酸的玻璃盖玻片上培养。

实施例6AP/FLIM分析表达MMP-9活性生物传感器的细胞

将实施例5中所得细胞在转染2天后用溶于PBS的4％PFA，3％蔗糖进行固定，并制备显微切片。在LeicaSP5显微镜上进行受体光漂白(AP)实验，使用63xNA(1.4)油浸物镜。获得1024x1024像素点的图像。用设置为20％的氩激光以458nm激光线进行对mTFP1的成像。通过使用高功率的514nm激光进行Venus的AP并测量mTFP1荧光强度的增加，以确定传感器的FRET效率。同在LeicaSP2显微镜上进行荧光寿命成像显微术(FLIM)，对确定具有最高FRET效率的传感器作进一步分析。

由AP数据得到的变体传感器的表观FRET效率值通过下式计算:

${\mathrm{Ef}}_D=1-\left(\frac{F_{DA}}{FD}\right)---\left(1\right),$

其中f_D是参与FRET复合物的供体比率，F_DA和F_D分别为减去背景且由获得物漂白校正过的漂白前和漂白后的mTFP1荧光强度。由获得物漂白校正过的漂白后的mTFP1荧光强度如下计算：

$F_D=F_D^{B\·post}+\left(\frac{F_D^{R.per}-F_D^{R.post}}{F_D^{R.pre}}\right)F_D^{B.pre}---\left(2\right),$

其中F_D ^B和F_D ^R指漂白及目的参考区域的mTFP1强度，pre和post指漂白前和漂白后的测量。

由FLIM数据得到的FRET效率值以下式计算：

${\mathrm{Ef}}_D=(1-\frac{{\mathrm{\τ}}_D}{{\mathrm{\τ}}_{DA}})\frac{A_{DA}}{A_{DA}+A_D}---\left(3\right),$

其中τ_D是无受体(在我们的例子中即为膜锚定的mTFP1)时，供体的寿命，并且τ_DA为基于FRET的MMP-9活性生物传感器的寿命，A_DA和A_D代表个体衰退组分的振幅[Zeug等人，2012]。使用高斯噪声传播方程评估误差值。

$stdE=\sqrt{{\left(\frac{\∂E}{\∂{\mathrm{\τ}}_D}\right)}^2{{\mathrm{\Δ\τ}}_D}^2+{\left(\frac{\∂E}{\∂{\mathrm{\τ}}_{DA}}\right)}^2{{\mathrm{\Δ\τ}}_{DA}}^2}---\left(4\right).$

实施例7对于转染MMP-9活性生物传感器的细胞的荧光发射谱收集

在装配有63xNA(1.4)油浸物镜的ZeissLSM780显微镜上以1024x1024像素点进行lambda堆栈获得。用458nm激光线的氩激光进行激发，以9nm步距获得了32个lambda通道。用FijiImageJ软件通过测量各通道中质膜的平均亮度，分析所获得的lambda堆栈。通过将该光谱图线下的区域计为等于1，对回收的传感器光谱进行标准化。

实施例8HEK293细胞分级

细胞分级实验用CalbiochemProteoExtractSubcellularProteomeExtractionkit进行。在使用抗-myc抗体的Western印记上对传感器进行检测。在用以下抗体的Western印记上测试细胞分级的质量：抗-hsp90、抗-N-钙粘蛋白和抗-组蛋白H3。

实施例9MMP-9活性生物传感器的体外裂解

转染2天后，将HEK293细胞用PBS洗一次，从平板上刮下，在4℃裂解1h，使用以下缓冲液:50mMTris-CIpH7.5，1％TritonX-100，10mMCaCl₂，0.02％NaN₃，1μMZnCl₂。在无蛋白酶抑制剂的情况下进行裂解，因为担心这些抑制剂会阻断我们的自激活MMP-9的活性。然后将裂解物在4℃以13400rpm离心15’移除细胞碎片。用等量的移除碎片的裂解物用于后续反应。向反应物中加入400ng(终浓度10μg/mL)，1.2μg(终浓度30μg/mL)的自激活MMP-9或者400ng(终浓度10μg/mL)无活性MMP-9。GM6001抑制剂以25μM的终浓度使用。在37℃孵育30’、1h、4h或过夜后，加入SDS-PAGE样品缓冲液并加热到100℃10分钟，以中止反应。在用抗-GFP抗体的Western印记上检测传感器。

实施例10细胞培养物中对MMP-9活性生物传感器的裂解

用MMP-9活性生物传感器转染2天后，用纯DMEM替换培养基。将细胞与400ng的自激活MMP-9(终浓度-800ng/mL)孵育30min，用溶于PBS的4％PFA，3％蔗糖进行固定。如前述获得lambda堆栈。

实施例12活体成像——对转染MMP-9活性生物传感器的细胞进行比率分析

在GlassBottomMicrowellDishes(MatTekCorporation)上培养HEK293细胞系。用编码具有α-螺旋连接子的生物传感器的质粒转染细胞。转染2天后，将细胞转移至适配有培养室的ZeissLSM780显微镜，并用水浸40x物镜成像。以1024x1024像素点分辨率每30s捕获细胞的单个光学切片，同时实时对供体和受体荧光光谱进行线性离析。获取进行30min。在开始图像获取后5min，将细胞用纯DMEM进行阴性处理、用稀释于DMEM的自激活MMP-9(终浓度-460ng/mL)或类似地稀释于DMEM至相同终浓度的无活性MMP-9进行处理。在Matlab组件下用自定义写软件进行分析数据。针对各个像素点计算Venus/mTFP1比率，并相对从实验开始经过的时间进行作图。

实验结果

I.生物传感器的FRET效率(AP和FLIM研究)

引入可调节长度的连接子使得38个生物传感器变体能迅速形成。用AP技术鉴定具有最高FRET效率的本发明的生物传感器(图1B)并使用FLIM进行分析以确认基于AP的FRET效率计算。

表1呈现针对AP实验中具有最高FRET效率的传感器变体，由FLIM数据计算所得FRET效率值。使用高斯噪声传播方程估算误差值。这些变体的命名方式如下：X-Y，其中X–两个VenusFP(连接子LN2)之间的六肽重复片段的数量，Y–VenusFP和mTFP1(连接子LN1)之间的六肽重复片段的数量。

表1

变体的FRET效率

在两个VenusFP之间有长连接子的(在其DNA序列中有7个重复片段GGTGGTTCTGGTTCTAGA(SEQIDNO:13))，而在第二个Venus和mTFP1之间有短连接子(在其DNA序列中有1个GGAGGAACCGGTGGAACT重复片段(SEQIDNO:14))的生物传感器(表1中命名为7-1)，在所有获得的生物传感器的环状连接子变体中具有最高的FRET效率，其FRET效率为E＝0.20±0.03(标准偏差值)——图2A。具有α-螺旋连接子的生物传感器相比具有环状连接子的生物传感器，具有更高的获得物漂白校正的有效FRET效率，为0.26±0.02——图2B。由于具有α-螺旋连接子的生物传感器显示出更高的FRET，其被用于进一步研究。

II.细胞膜定位

本发明的MMP-9活性生物传感器定位于细胞膜。这通过在活HEK293细胞中对生物传感器的直接可视化(图1C)并通过细胞分级和随后对收集的各级分进行Western印记分析得到证实(图1D)。分级结果证实了绝大多数生物传感器(87％±6％)定位于膜中，小百分比在细胞质中。细胞核中未观察到生物传感器。对照Western印记证实了所收集级分的纯度。

III.体外生物传感器的裂解

MMP-9活性生物传感器在体外通过人自激活MMP-9进行裂解(图3)。在这些反应中使用显著更多的酶(实验中自激活MMP-9标准浓度为400ng/mL[Michaluk等人，2009])以确保整个生物传感器池都能裂解。

在转染但未处理的HEK293细胞系中生物传感器已经部分裂解(14.2±0.4％——见图3B，对照泳道；数值相对于对照泳道中全长生物传感器强度进行标准化)，这可在Western印记中很容易看出(图3)。具有α-螺旋连接子的生物传感器的体外裂解不是由于蛋白质的自发降解，尽管随着时间推移观察到生物传感器裂解形式的量有轻微增加(图3)。无活性人MMP-9不裂解生物传感器(图3)。可通过添加终浓度25μM的广谱GM6001基质金属蛋白酶抑制剂来阻断裂解(图3)。

IV.HEK293细胞培养物中的生物传感器裂解——固定细胞的荧光发射光谱

对从与自激活MMP-9孵育30分钟的HEK293细胞收集的荧光发射光谱进行分析，证实了生物传感器正在细胞膜上受到裂解(图4)。当膜内生物传感器的发射光谱产生变化时，则观察为生物传感器的裂解。用自激活MMP-9处理引起光谱向较短波长移动，造成Venus对荧光信号的贡献(受体峰)降低及相应的mTFP1贡献(供体峰)的增加。

V.HEK293细胞培养物中生物传感器的裂解——活细胞成像

在对HEK293细胞的活体成像中，当Venus对mTFP1荧光强度比率降低(图5)，则观察为生物传感器的裂解(图5)。向培养基中添加自激活MMP-9导致该比率降低，而用纯培养基的阴性处理或用无活性MMP-9的处理导致其轻微逐步增加(图5B)。

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Claims (15)

1.遗传编码的MMP-9活性生物传感器，其包含一个FRET供体荧光蛋白和两个FRET受体荧光蛋白，都通过可变连接子隔开，其中供体和受体蛋白质之间的连接子含有MMP-9裂解位点且整个生物传感器锚定于质膜上。

2.权利要求1的生物传感器，其中FRET供体荧光蛋白为蓝绿色荧光蛋白mTFP1。

3.权利要求1或权利要求2的生物传感器，其中FRET受体荧光蛋白为Venus荧光蛋白。

4.权利要求1-3中一项的生物传感器，其中MMP-9裂解位点为合成的裂解位点。

5.权利要求4的生物传感器，其中MMP-9裂解位点对应于PRSLS序列。

6.权利要求1-5中一项的生物传感器，其中该生物传感器通过PDGFR转膜结构域锚定于质膜上。

7.权利要求1-6中一项的生物传感器，其中可变连接子选自α-螺旋连接子、包含1-8个GGTGGT六肽重复片段的连接子和包含1-8个GGSGSR六肽重复片段的连接子。

8.权利要求1-7中一项的生物传感器，其中供体蛋白质和受体蛋白质之间的连接子为α-螺旋连接子。

9.权利要求8的生物传感器，其中α-螺旋连接子包含序列EEEIREAFRVFPRSLSLRHVMTNL。

10.权利要求1-7中一项的生物传感器，其中供体蛋白质和受体蛋白质之间的连接子包含仅仅一个GGTGGT或GGSGSR六肽。

11.权利要求10的生物传感器，其中供体蛋白质和受体蛋白质之间的连接子包含仅仅一个GGTGGT六肽。

12.权利要求1-11中一项的生物传感器，其中两个受体蛋白质之间的连接子含有7个GGSGSR六肽重复片段。

13.权利要求1-12中一项的生物传感器，其中两个Venus荧光蛋白被包含7个GGSGSR六肽重复片段的可变连接子隔开，其中一个Venus荧光蛋白与蓝绿色荧光蛋白mTFP1被包含合成的MMP-9裂解位点的α-螺旋连接子隔开。

14.权利要求1-12中一项的生物传感器，其中两个Venus荧光蛋白被包含7个GGSGSR六肽重复片段的可变连接子隔开，其中一个Venus荧光蛋白与蓝绿色荧光蛋白mTFP1被包含合成的MMP-9裂解位点和仅仅一个GGTGGT六肽的连接子隔开。

15.权利要求1-8中任何一项限定的遗传编码MMP-9活性生物传感器作为系统的用途，所述系统用于在活细胞中体外和体内对MMP-9的蛋白质裂解活性的研究。