CN101932936A - 利用切割序列和间隔子的共振能量转移测定 - Google Patents
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Abstract
分子构造物包含供体标记、受体标记、位于供体与受体之间的连接体肽、具有切割位点序列和(a)供体与切割位点序列和(b)受体与切割位点序列的至少一个之间的间隔子的连接体。优选，构造物选自CFP-(SGLRSRA)-SNAP-25-(SNS)-YFP和CFP-(SGLRSRA)-小突触泡蛋白-(SNS)-YFP。在优选实施方案中，连接体肽是肉毒杆菌神经毒素的底物，其选自小突触泡蛋白(VAMP)、突触融合蛋白和SNAP-25或其可被肉毒杆菌神经毒素识别和切割的片段。有利地，相对于无间隔子的构造物，间隔子增加了供体标记与受体标记之间的电子耦合。
Description
本申请要求2007年9月14日提交的临时申请60/972673的优先权，所述临时申请以其全文通过引用合并入本文。
发明领域
本发明的领域是关于与肉毒杆菌(Botulinum)毒素和破伤风毒素相关的蛋白酶测定的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer)领域。
背景
肉毒杆菌神经毒素(BoNT)由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生，其是已知的最强的毒素。此类毒素是食物中毒的公认来源，通常导致受害者的严重损害或甚至死亡。存在7种结构相关的肉毒杆菌神经毒素或血清型(BoNT/A-G)，其各自由重链(大约100KD)和轻链(大约50KD)组成。重链通过受体介导的内吞作用介导毒素进入靶细胞。一旦内化，轻链便从内体小泡腔转移入细胞溶质，并且充当锌依赖蛋白酶(zinc-dependent protease)来切割介导小泡-靶膜融合的蛋白(“底物蛋白(substrate proteins)”)。
此类BoNT底物蛋白包括质膜蛋白突触融合蛋白(syntaxin)、外在膜蛋白SNAP-25和小泡膜蛋白小突触囊泡蛋白(Synaptobrevin)(Syb)。此类蛋白统称为SNARE(可溶性N-乙基马来亚胺敏感因子附着蛋白受体)蛋白。SNARE蛋白的切割阻止了小泡与质膜的融合，从而消除了神经递质在神经肌肉接头的释放。在SNARE蛋白当中，突触融合蛋白和SNAP-25通常存在于靶膜上，从而称为t-SNARE，然而发现小突触囊泡蛋白只与突触内的突触小泡在一起，从而被称为v-SNARE。这三类蛋白一起形成了据认为是介导小泡膜与质膜之间的融合的最小机器的复合物。BoNT/A、E和C1在单个但不同的位点上切割SNAP-25，BoNT/B、D、F、G切割小突触泡蛋白(Syb)。除了SNAP-25外，BoNT/C还切割突触融合蛋白。
由于它们作为食物中毒源以及生物恐怖主义带来的威胁，存在对灵敏且快速地检测BoNT的需要。目前，大多数检测毒素的灵敏方法是在小鼠中进行毒性测定。该方法需要大量小鼠，非常费时并且不能用于研究毒素催化动力学。已发展了许多基于使用抗毒素抗体的放大免疫测定系统(amplified immunoassay system)，但大部分此类系统需要复杂且昂贵的放大处理，从而也不能用于研究毒素催化动力学。虽然HPLC和免疫测定可用于检测已切割的底物分子和测量此类毒素的酶促活性，但此类方法通常非常费时且复杂，它们中的一些方法需要特殊的抗体，从而使它们不适用于大规模筛查。因此，存在对用于检测BoNT的新型和改进的方法以及组合物的需要。
在FRET测定中，使用两种荧光生成氨基酸衍生物在含有毒素切割位点的非常短的合成肽(20-35个氨基酸)中取代两个天然氨基酸。当它们在肽中彼此靠近时，一个氨基酸衍生物的荧光信号被另一个氨基酸衍生物猝灭，该机制称为“
共振能量转移(resonance energytransfer)”(FRET)。肽的切割将两个氨基酸衍生物分开，并且可检测FRET的减少。
FRET测定已被成功地用于检测BoNT。(参见例如，属于Chapman的2003年10月28日提交的美国专利申请2004/0191887，2004年12月20日提交的属于Chapman的美国专利申请2006/0134722，属于Steward的美国专利7208285(2007年4月)和属于Fernandez-Salas的美国专利7183066(2007年2月)，其各自以它们的全文通过引用合并入本文。在合并的参考文献中的术语的定义或用途与本文中提供的该术语的定义不一致或相反的情况下，使用本文中提供的术语的定义而不使用参考文献中该术语的定义)。
虽然已在应用FRET测定来检测BoNT中显示了一些成功，但灵敏性和特异性不足。因此需要改进的装置、系统和方法。
发明概述
本发明提供了装置、系统和方法，其中分子构造物(construct)包括供体标记、受体标记、位于供体与受体之间的连接体肽、具有切割位点序列的连接体(linker)以及(a)供体与切割位点序列和(b)受体与切割位点序列的至少一个之间的间隔子。
在优选实施方案中，将供体和受体标记定位成提供电子耦合(electronic coupling)，这样供体标记可通过偶极-偶极耦合(dipole-dipole coupling)机制将能量转移至受体标记。在特别优选实施方案中，偶极-偶极耦合机制是
共振能量转移(FRET)。
供体和受体标记可以是生色团或荧光基团部分，其中供体标记的发射光谱与受体标记的激发光谱重叠。优选，供体是绿色荧光蛋白或其变体，受体是相应的绿色荧光蛋白的变体。用于本发明的特别优选供体和受体标记(荧光基团对)是CFP-YFP。
在优选实施方案中，连接体肽是选自小突触泡蛋白(VAMP)、突触融合蛋白和SNAP-25或其可被肉毒杆菌神经毒素识别和切割的片段(“可切割片段”)的肉毒杆菌神经毒素的底物。这些蛋白统称为SNARE(可溶性n-乙基马来亚胺敏感因子附着蛋白受体)蛋白。连接体可具有任何合适长度的一级结构长度，包括例如，大于或等于5nm、8nm、10nm、12nm、14nm和20nm的长度。
在特别优选实施方案中，完整构造物包含CFP-(SGLRSRA)-SNAP-25-(SNS)-YFP或CFP-(SGLRSRA)-小突触泡蛋白-(SNS)-YFP。
在一个实施方案中，连接体肽包含至少大约14个氨基酸和选自SEQID NOs：1至6(下文中论述的)的氨基酸序列。在优选实施方案中，连接体肽包含至少大约15个，或至少大约16个，或至少大约17个，或至少大约18个，或至少大约19个，或至少大约20个，或至少大约21个，或至少大约22个，或至少大约23个，或至少大约24个，或至少大约25个，或至少大约26个，或至少大约27个，或至少大约28个，或至少大约29个氨基酸残基，以及序列选自SEQ ID NOs：1-6(下文中论述的)。
在优选实施方案中，连接体肽包含至少大约30个氨基酸残基和选自SEQ ID NOs：1至6的氨基酸序列。更优选，连接体肽包含至少大约35个氨基酸残基，或至少大约40个氨基酸残基，或至少大约45个氨基酸残基，或至少大约50个氨基酸残基。在特别优选实施方案中，本发明的构造物包含含有大约55个氨基酸残基，或至少大约65个氨基酸残基的连接体多肽。
本发明的切割位点序列可有利地包含(a)SNARE蛋白、基序、突变蛋白和(b)具有至少5个氨基酸的间隔子，其中间隔子包括选自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中n是1至3。
蛋白质的“突变蛋白”在本文中应当被解释为具有与相应的天然蛋白质至少30％的同一性，包括例如具有与天然蛋白质至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的同一性的组成。同一性的变化可包括任何或许多添加、缺失和置换。涉及的突变蛋白包括片段、截断和融合蛋白。
本发明的间隔子可具有任何合适的氨基酸数目，但优选至少3，5，7，10，12或15个氨基酸。间隔子可包括选自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中n是1至3。备选地，间隔子可包含SNARE基序。有利地，相对于相应的无间隔子的构造物，这样的间隔子构型增加了供体标记与受体标记之间的电子耦合。
本发明还提供了编码上述构造物的分离的多核苷酸分子。构造物优选是包含与启动子有效(operably)连接的多核苷酸分子的表达载体。用于本发明的优选启动子是诱导型启动子。
本发明还提供了包含上述分离的多核苷酸分子的细胞。在一个实施方案中，细胞选自原代培养的神经元细胞、PC12细胞或其衍生物、原代培养的chromaphin细胞、成神经细胞瘤细胞(neuroblastoma cell)、人肾上腺素能(human adrenergic)SK-N-SH细胞和NS-26细胞系。优选，细胞是皮质神经元细胞、海马神经元细胞、脊髓运动神经元细胞(spinalcord motor neuron cell)或鼠胆碱能Neuro 2a细胞。
在另外的实施方案中，本发明提供了在合适的容器中装有本发明的构造物的试剂盒。
涉及的提高供体标记与受体标记之间的能量转移的灵敏性的方法包括：(a)提供包含在物理上通过连接体偶联的供体标记和受体标记的构造物，(a)在连接体内包含切割位点序列；和(b)在连接体内在供体与切割位点序列和受体与切割位点序列的至少一个之间包含间隔子，由此增加供体与受体之间的电子耦合。本文中涉及的构造物可用于完整细胞、裂解物或包含活性肽酶的任何材料。
然而不希望受任何特定理论或作用机制的束缚，预期间隔子通过增加供体与受体之间的电子耦合来提高灵敏性和特异性，这相应地通过(a)减少供体与受体之间的三级结构距离，和(b)提供供体与受体之间的电子跃迁(electronic hop)引起。
在优选实施方案中，构造物是基于蛋白质的构造物，连接体是肽序列，切割位点序列包括SNARE蛋白或其片段或突变蛋白，间隔子包含至少3、5、7、10、12和15个氨基酸。间隔子可包括选自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中n是1至3。
本文中还公开的是用于检测肉毒杆菌神经毒素的方法，方法包括(a)提供上文中描述的构造物，其中连接体是相应于待检测的肉毒杆菌神经毒素的底物蛋白或其可切割片段，(b)在肉毒杆菌神经毒素在其下可切割蛋白底物或其片段的条件下将构造物暴露于怀疑含有肉毒杆菌神经毒素的样品，和(c)在将构造物暴露于样品之前和之后检测和比较FRET信号，其中FRET的减小表明样品中存在肉毒杆菌神经毒素。在优选实施方案中，向待检测的样品中加入额外的Zn2+。本发明的方法适合于选自BoNT/A、E和C的肉毒杆菌神经毒素的检测，相应的底物蛋白是SNAP-25或其可切割片段。本发明的方法还适用于BoNT/B、D、F或G的检测，使用小突触泡蛋白(Syb)或其可切割片段作为相应的底物蛋白。类似地，本发明的方法适用于使用SNAP-25或其可切割片段作为相应的底物蛋白来检测BoNT/C。
在优选实施方案中，对于本发明的方法，通过选自下列的方法来检测FRET：1)测量在受体(A)发射波长和供体(D)发射波长上发射的荧光，并且通过各自发射振幅的比率测定能量转移；2)测量D的荧光寿命；3)测量D的光漂白速率；4)测量D或A的各向异性；和5)测量斯托克斯位移激发单体/激基缔合物荧光(monomer/excimer fluorescence)。
本发明还提供了用于筛选肉毒杆菌神经毒素的抑制剂的方法，包括提供经遗传工程改造以表达上述构造物的细胞，其中构造物中的连接体是相应于肉毒杆菌神经毒素的底物肽；将所述细胞在候选抑制剂化合物存在的情况下暴露于肉毒杆菌神经毒素；然后在暴露于所述肉毒毒素之前和之后检测细胞的FRET信号，其中与在候选抑制剂不存在的情况下暴露于肉毒杆菌神经毒素的细胞相比较，FRET无明显减少的观察表明候选抑制剂能够抑制肉毒杆菌神经毒素。优选，候选化合物在化合物的文库当中，方法是高通量方法。
在另外的实施方案中，本发明提供了检测肉毒杆菌神经毒素的方法，方法包括将一层BoNT靶肽置于金属表面上，在允许BoNT切割金属表面上的靶肽的条件下将在其表面上具有BoNT靶肽的所述金属表面暴露于怀疑含有相应的BoNT的样品，和通过等离子体共振成像测量作为BoNT切割的结果而产生的结合至金属表面的靶肽的分子量的任何减少。
本发明的另一个实施方案是用于检测肉毒杆菌神经毒素的方法，所述方法包括a)提供本文中所述的构造物，其中连接体是相应于待检测的肉毒杆菌神经毒素的底物蛋白或其可切割片段，其中将构造物锚着至细胞的质膜，这样连接体蛋白可采用构象，通过该构象在供体与受体荧光基团之间可发生FRET，b)将构造物在肉毒杆菌神经毒素在其下可切割蛋白质底物或其片段的条件下暴露于怀疑含有肉毒杆菌神经毒素的样品，和c)在将构造物暴露于样品之前和之后检测和比较FRET信号，其中FRET的减小表明样品中存在肉毒杆菌神经毒素。
本发明还提供了包含连接肽、第一荧光基团部分和第二荧光基团部分的分子构造物，其中连接体肽是选自小突触泡蛋白、突触融合蛋白和SNAP-25或其能够被肉毒杆菌神经毒素切割的片段的肉毒杆菌神经毒素的底物，其中第一荧光基团部分的发射光谱可检测地与第二荧光基团部分的激发光谱不同。优选，连接体是底物小突触泡蛋白、突触融合蛋白或SNAP-25的全长蛋白。优选，构造物被锚着至小泡，其可以在或可以不在细胞内。本发明还提供了编码上述多肽构造物的多核苷酸构造物。
本发明还提供了用于检测肉毒杆菌神经毒素的方法，方法包括a)提供上述肽构造物，b)在肉毒杆菌神经毒素在其下可切割蛋白质构造物或其片段的条件下将构造物暴露于怀疑含有肉毒杆菌神经毒素的样品，和c)检测第一和第二荧光基团的荧光信号的空间分离，其中空间分离的发生表明样品中存在肉毒杆菌神经毒素。优选，小泡存在于活细胞内，连接体肽是连接至SNAP-25(198-206)-YFP的CFP-SNAP-25(1-197)，其中检测到CFT荧光但非YFP荧光，表明肉毒杆菌神经毒素在样品中的存在。
根据下列优选实施方案的详细描述和其中相同的数字代表相同的组成部分的附图，本发明主题的不同目的、特征、方面和有利方面将变得更显然。
附图概述
图1是用于监控肉毒杆菌神经毒素的蛋白酶活性的基于CFP-YFP的生物传感器的示意图。图1A是生物传感器构造物的设计。CFP和YFP分别通过小突触泡蛋白(氨基酸33-94，上图)或SNAP-25(氨基酸141-206，下图)的片段连接。对这些片段上的各肉毒杆菌神经毒素的切割位点进行标记。图1B显示CFP和YFP用作FRET的供体-受体对，其中CFP的激发导致YFP荧光的发射(上图)。在用肉毒杆菌神经毒素切割小突触泡蛋白或SNAP-25片段后(下图)，连接的CFP与YFP之间的能量转移被消除。CFP的最佳激发波长是434nM，发射峰是470nM(对于CFP)，和527nM(对于YFP)。
图2显示重组生物传感器蛋白的荧光发射光谱。图2A显示单独的重组his6-标记的CFP和YFP(300nM)以及这两种蛋白质的混合物(1∶1)的发射光谱。使用PTIQM-1荧光计在Hepes缓冲液(50mM Hepes，2mM DTT和10μM ZnCl2，pH7.1)中收集从450至550nM的荧光信号。激发波长是434nM，CFP的最佳波长。YFP蛋白通过在434nM处直接激发只引起少量的荧光发射信号。图2B显示重组his6-标记的CFP-SybII-YFP的发射光谱，如图框图2A中所述收集的。箭头标示通过FRET产生的YFP发射峰。
图3描述了肉毒杆菌神经毒素对生物传感器蛋白的切割可通过体外实时发射光谱扫描来监控。A)：在37℃下用2mM DTT，10μM ZnCl2预还原(pre-reduced)BoNT/B，进行30分钟。向装有300nM Hepes缓冲液(50mM Hepes，2mM DTT，10μM ZnCl2)中的CFP-SybII-YFP蛋白的小杯中加入50nM毒素。如图2A中所述在加入毒素之前和之后的指定的时间点上记录发射光谱(上图)。在各发射扫描后从小杯中取出30μl样品，将其与SDS上样缓冲液混合。将这些样品经历SDS-page和增强化学发光(ECL)。使用在融合蛋白N末端上识别his6标签的抗his6抗体检测CFP-SybII-YFP融合蛋白的切割(下图)。CFP-SybII-YFP融合蛋白的切割导致减少的YFP荧光和增加的CFP荧光。通过发射光谱扫描实时记录该变化。B)：将CFP-SybII-YFP用于检测BoNT/F活性，如图A中所描述的。C)：将CFP-SNAP-25-YFP用于检测BoNT/A的活性(使用10nM毒素)，如图A中所描述的。D)：将CFP-SNAP-25-YFP用于检测BoNT/E的活性(使用10nM毒素)，如图A中所描述的。
图4显示在微量滴定板荧光分光光度计中使用生物传感器蛋白进行的肉毒杆菌神经毒素的蛋白酶动力学的监控。A)：可使用平板读取器(plate-reader)实时记录肉毒杆菌神经毒素切割生物传感器蛋白的过程中荧光的变化。将10nM BoNT/A与300nM CFP-SNAP-25-YFP混合，使用平板读取器扫描100μl/孔样品。激发为434nm，对于各数据点，收集470nm(CFP通道)和527nm(YFP或FRET通道)处的发射值。以每数据点30秒的间隔跟踪反应1个半小时。实时监控YFP荧光的减少和CFP荧光的增加。B)：切割的速率取决于神经毒素的浓度。就它们切割相同量的生物传感器蛋白的能力检测不同浓度的肉毒杆菌神经毒素A和E。通过相同数据点上YFP发射信号与CFP发射信号之间的比率来测量FRET信号变化(FRET比率)。C)：在相同时间上扫描单独的CFP-SNAP-25-YFP蛋白和CFP/YFP蛋白混合物(1∶1)作为内部对照。
图5显示使用平板读取器进行的生物传感器测定的灵敏性。A)：将300nM CFP-SNAP-25-YFP与不同浓度BoNT/A或E在96孔板中混合，总体积为100μl/孔。将板在37℃下温育4小时，然后用平板读取器进行扫描(上图)。将FRET比率对毒素浓度的对数值作图。将各曲线的EC50值列于下图上的表中。各数据点代表3个独立实验的平均值。B)：将300nMCFP-SybII-YFP与不同浓度的BoNT/B或F混合。收集数据，并且如图A中所述作图。
图6描述了活细胞中肉毒杆菌神经毒素的活性的监控。A)：将CFP-SNAP-25-YFP在野生型PC12细胞中表达。通过记录FRET比率的变化监控BoNT/A(50nM)的进入和催化活性，所述FRET比率的变化由细胞内CFP-SNAP-25-YFP的切割引起。从总共53个毒素处理的细胞和53个对照细胞计算FRET比率的平均值。使用BoNT/A处理72小时减少整个细胞群体的FRET比率达到显著的程度(P＜1.47E-5)。B)：用CFP-SybII-YFP转染表达syt II的PC12细胞，并且用BoNT/B(30nM)处理其。如图(A)中一样通过记录FRET比率的变化来监控BoNT/B的进入和催化活性；分析73个毒素处理的细胞和73个对照细胞。使用BoNT/B处理72小时减少整个细胞群体的FRET比率达到显著的程度(P＜2E-10)。
图7显示根据本发明监控活细胞中BoNT/A的活性。(a).测量活细胞中毒素传感器的FRET信号。将CFP-SNAP-25(141-206)-YFP用于转染PC12细胞。该传感器在细胞中显示是可溶的。对于各细胞，使用完全相同的设置，利用不同的滤光片(filter)组(CFP、FRET和YFP)相继拍摄3个图象。对图象进行彩色编码以反映以左边上的查找表中指定的任意单位表示的荧光强度。如方法中所详述，通过从使用FRET滤光片组收集的信号减去来自CFP和YFP的交叉串扰(cross-talk)计算矫正的FRET值。(b).将用CFP-SNAP-25(141-206)-YFP转染的PC12细胞用于检测BoNT/A的活性。向培养基中加入50nM BoNT/A的全毒素，在96小时后分析80个细胞。将矫正的FRET信号根据CFP荧光信号进行标准化，并使用指定的帧长(bins)以直方图的形式进行作图。用相同的传感器转染对照，但不用毒素处理其，平行地分析它们。与BoNT/A一起的温育使FRET比率(矫正的FRET/CFP)在细胞群体中产生偏移，表明传感器蛋白在细胞中被BoNT/A切割。然而，偏移较小，表明切割在细胞中无效。(c).左图：通过将CFP与YFP经全长SNAP-25(氨基酸1-206)连接构建有效的毒素传感器，然后检测其，以检测细胞中BoNT/A的活性。该CFP-SNAP-25(FL)-YFP融合蛋白主要在其4个半胱氨酸上通过棕榈酰化定位至细胞的质膜上(左图，中图的上图框)。中图：用CFP-SNAP-25(FL)-YFP传感器转染PC12细胞，将所述细胞用于检测BoNT/A的活性。向培养基中加入50nM BoNT/A全毒素，在48和96小时后，如图(a)中所述分析200个细胞的FRET信号。用毒素传感器转染对照细胞，但不用毒素处理其，然后平行地分析它们。代表性细胞的图象示于中图。该传感器产生显著的FRET(中图的上方“矫正的FRET”框)。在用BoNT/A(96小时，中图的下“矫正的FRET”图框)处理细胞后，FRET信号消除。注意：在毒素切割后，切割产物中的一种，用YFP标记的SNAP-25的C端，被降解。从而，YFP的荧光信号在毒素处理的细胞中显著减少(下方“YFP”图框)。右图：如图(b)中所述，利用指定的帧长以直方图的形式将FRET比率进行作图。(d).用CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP(具有Cys85、88、90、92Ala突变的全长SNAP-25，左图)转染PC12细胞。该蛋白已扩散地分布在整个细胞溶质中，并且缺乏对于CFP-SNAP-25(FL)-YFP(右图，“矫正的FRET”框)观察到的强FRET信号。(e).用CFP-SNAP-25(FL)-YFP和CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP转染PC 12细胞。然后用(+，完整细胞)或不用(-，完整细胞)BoNT/A(50nM，72小时)处理细胞，收获细胞。还将一半来自未暴露于BoNT/A的样品的细胞提取物与(+，体外)或不与(-，体外)还原的BoNT/A一起体外温育(200nM，30分钟，37℃)，用作对照以显示切割产物(用箭头标示两个切割产物)。将相同量的各样品(30μg细胞裂解物)装载在SDS-page凝胶上，然后使用抗GFP抗体使之经历免疫印迹分析。虽然CFP-SNAP-25(FL)-YFP在完整细胞中遭到明显的切割，但在细胞中不存在可检测的CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP的切割，这表明膜锚着对于活细胞中BoNT/A产生的有效切割是非常重要的。注意：在毒素处理的细胞中只检测到一种切割产物(CFP-SNAP-25(1-197))，表明其他切割产物(SNAP-25(198-206)-YFP)在细胞中大部分被降解。
图8显示将CFP-SNAP-25(141-206)-YFP传感器锚着至质膜产生了在细胞中被BoNT/A有效切割的传感器。(a).经构建将CFP-SNAP-25(141-206)-YFP靶向质膜的构造物的示意图。将包含棕榈酰化位点(残基83-120)的SNAP-25的片段融合至CFP-SNAP-25(141-206)-YFP传感器的N末端，并且该片段将融合蛋白靶向质膜。(b).用SNAP-25(83-120)-CFP-SNAP-25(141-206)-YFP转染PC12细胞。向培养基中加入50nM BoNT/A全毒素，在96小时后如图7a中所述分析80个细胞的FRET信号。平行地分析用毒素传感器转染但不用毒素处理的对照细胞。代表性细胞的图象示于左图中。该传感器产生显著的FRET(左图的上方“矫正的FRET”图框)。在用BoNT/A处理细胞后(96小时，左图的下方“矫正的FRET”图框)，FRET信号减小。右图：如图7b中所述，利用指定的帧长以直方图的形式将细胞的FRET比率作图。(c).用不同的CFP/YFP构造物转染PC12细胞，如图7a中所述测定相应的FRET比率。CFP和YFP在细胞中的共表达在我们的测定条件下不导致显著的FRET。CFP-SNAP-25(FL)-YFP展示显著的FRET水平，然而可溶性CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP未展示显著的FRET水平。
图9显示BoNT/B对Syb的有效切割需要Syb定位至小泡。(a).将CFP-Syb(33-94)-YFP用于转染稳定地表达突触结合蛋白II的PC12细胞系(Dong等人Synaptotagmins I and II mediate entry of botulinum neurotoxinB into cells.J.Cell Biol.162，1293-1303(2003))。该传感器在细胞中表现为可溶的，并且产生强FRET信号(上图)。将用CFP-Syb(33-94)-YFP转染的PC12细胞用于检测BoNT/B的活性。向培养基中加入50nM BoNT/B全毒素，在96小时后如图7b中所述分析80个细胞。用相同的传感器转染对照细胞，但不用毒素处理对照细胞，平行地分析它们。与BoNT/B一起温育使FRET比率在细胞群体当中发生偏移，这表明传感器蛋白在细胞中被BoNT/B切割。然而，偏移很小，表明切割在细胞中无效。(b).YFP-Syb(FL)-CFP传感器的示意图。全长Syb包含116个氨基酸，并且通过单个跨膜结构域定位至小泡。BoNT/B对Syb的切割从小泡释放用YFP标记的Syb的细胞质结构域。(c).用YFP-Syb(FL)-CFP转染稳定表达突触结合蛋白II的PC12细胞，然后用BoNT/B(50nM，48小时，下方的图框)或不用毒素(对照，上方图框)处理所述细胞。对于每一个细胞收集CFP和YFP荧光图象，显示代表性细胞。该传感器被定位至小泡，并且不存在于活细胞的细胞核中，如由CFP和YFP荧光信号(上方图框)所证明的。BoNT/B处理导致YFP信号的再分布，所述YFP信号在细胞溶质中变成可溶性的并且进入细胞核。(d).将Syb的截断形式(残基33-116)用于连接CFP和YFP。该构造物包含与可溶性传感器CFP-Syb(33-96)-YFP中的Syb片段相同的细胞溶质区域(残基33-94，图(b))，并且其还可包含Syb的跨膜结构域。用CFP-Syb(33-116)-YFP和CFP-Syb(33-94)-YFP转染表达突触结合蛋白II的PC 12细胞。然后用(+，完整细胞)或不用(-，完整细胞)BoNT/B(50nM，48小时)处理细胞，收获细胞。还将一半来自未暴露于BoNT/B的样品的细胞提取物与(+，体外)或不与(-，体外)还原的BoNT/B(200nM，30分钟，37℃)在体外一起温育。用星号标示2个切割产物。将相同量的各样品(30μg/细胞裂解物)装载至一个SDS-page凝胶上并且使用抗GFP抗体使之经历免疫印迹分析。虽然CFP-Syb(33-116)-YFP在完整细胞中经历显著的切割，但不存在可检测的CFP-Syb(33-94)-YFP的切割，这表明至小泡的定位对于BoNT/B在活细胞中产生有效切割是非常重要的。
图10是描述具有包括位于供体标记和受体标记之间的切割位点序列的连接体的现有技术构造物的示意图。
图11a是描述本发明的构造物的一个实施方案的示意图，所述构造物具有包括切割位点序列和间隔子(所述间隔子位于切割位点序列与受体标记之间)的连接体。
图11b是描述本发明的构造物的备选实施方案的示意图，所述构造物具有包括切割位点序列和间隔子(所述间隔子位于供体标记和切割位点序列之间)。
图11c是描述本发明的构造物的另一个备选实施方案的示意图，所述构造物具有包括切割位点序列和间隔子(所述间隔子位于供体与切割位点序列和切割位点序列与受体标记之间)的连接体。
图12是举例说明使用本发明的构造物提高供体标记与受体标记之间的能量转移的灵敏性的方法的步骤的方框图(block diagram)。
图13是举例说明使用本发明的构造物检测肉毒杆菌神经毒素的方法的步骤的方框图。
详细描述
本发明提供了基于通过肽连接体(所述肽连接体是BoNT的底物，并且可被毒素切割)连接的荧光基团之间的荧光共振能量转移(FRET)的新型组合物和方法来检测肉毒杆菌神经毒素和监控(优选实时)它们的底物切割活性。本发明的方法和组合物允许在数小时内检测皮摩尔水平的BoNT，并且可实时跟踪毒素的酶促动力学。通过使用培养细胞，还可将所述方法和组合物用于大规模筛选细胞毒素的抑制剂，包括毒素的细胞进入和通过小泡膜的转位的抑制剂。本发明还适合用于在活细胞和神经元中监控肉毒杆菌神经毒素的活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了构造物和使用构造物的方法，所述构造物包含全长SNAP-25和Syb蛋白作为连接体，作为可检测活细胞中的毒素活性的荧光生物传感器。SNAP-25的切割消除了CFP/YFP FRET信号，Syb的切割导致YFP在细胞中的空间重新分布。本发明提供了进行基于细胞的毒素抑制剂的筛选和用于表征细胞中毒素的活性的方法。本发明还公开了SNAP-25和Syb的亚细胞定位分别影响细胞中BoNT/A和B产生的有效切割。
荧光共振能量转移(FRET)是允许估量一个分子与另一个分子(例如，蛋白质或核酸)之间或相同分子上两个位点之间的距离的工具。FRET在本领域内现是众所周知的(关于综述，参见Matyus，(1992)J.Photochem.Photobiol.B：Biol.，12：323)。FRET是其中能量从激发供体分子转移至受体分子的非辐射过程。非辐射能量转移是一个荧光基团的激发态的能量在无实际光子发射的情况下被转移至第二荧光基团的量子力学过程。量子物理学原理综述于Jovin和Jovin，1989，Cell Structure andFunction by Microspectrofluorometry，eds.E.Kohen和J.G.Hirschberg，Academic Press中。简而言之，荧光基团吸收特征波长上的光能。该波长也称为激发波长。荧光染料吸收的能量随后通过不同途径释放，一个途径是光子的发射(从而产生荧光)。被发射的光的波长称为发射波长，其是特定荧光基团的固有特征。在FRET中，该能量在第二荧光基团的发射波长上释放。第一荧光基团通常称为供体(D)，并且具有比第二荧光基团(称为受体(A))的激发态能量更高的激发态。
所述过程的本质特征是供体的发射光谱与受体的激发光谱重叠，并且供体与受体足够接近。
此外，D与A之间的距离必须足够小以允许荧光基团之间的能量的非辐射转移。因为能量转移的比率与供体与受体之的距离的6次方成反比，因此能量转移效率对距离变化极其敏感。据认为能量转移在1至10nm的距离范围内以可检测的效率发生，但要获得最佳结果通常为4-6nm。在其中非辐射能量转移有效的距离范围也取决于许多其他因素，包括供体的荧光量子效率、受体的消光系数、它们各自的光谱的重叠的程度、介质的折射率以及两个荧光基团的跃迁矩(transition moment)的相对定向。
本发明提供了包含通过连接体肽(“底物肽”)连接的荧光基团FRET供体和受体的构造物(“FRET构造物”)，所述连接体肽可被相应的BoNT切割。在BoNT存在的情况下，切割连接体肽，从而导致能量转移的减少和增加的由供体荧光基团产生的光的发射。这样，可实时监控和定量毒素的蛋白水解活性。
如本文中关于供体和相应的受体荧光部分所使用的，“相应”是指具有与供体荧光部分的激发光谱重叠的发射光谱的受体荧光部分。受体荧光部分的发射光谱的波长最大值应当比供体荧光部分的激发光谱的波长最大值大至少100nm。因此，可产生有效的非放射能量转移。
如本文中关于底物肽和BoNT所使用的，“相应的”是指能够作用于连接体肽并且在特定切割位点进行切割的BoNT毒素。
通常就(a)高效荧光Forster能量转移；(b)极大的终斯托克斯位移(＞100nm)；(c)发射尽可能进入可见光谱的红光部分(＞600nm)的偏移；和(d)发射至比由供体激发波长上的激发产生的拉曼水体荧光发射(Raman water fluorescent emission)更长的波长的偏移选择荧光供体和相应的受体部分。例如，可选择其激发最大值接近激光线(例如，氦-镉442nm或氩488nm)、具有高消光系数、高量子产量以及其荧光发射与相应的受体荧光部分的激发光谱良好重叠的供体荧光部分。可选择具有高消光系数、高量子产量、其激发与供体荧光部分的发射良好重叠以及发射在可见光谱的红光部分(＞600nm)中的相应的受体荧光部分。
本领域技术人员将认识到许多荧光基团分子适合用于FRET。在优选实施方案中，荧光蛋白用作荧光基团。可与FRET技术中不同受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、萤光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸(acridine isothiocyanate)、萤光黄VS、4-乙酰胺基-4′-异硫代-氰芪(cyanatostilbene)-2，2′-二磺酸、7-二乙氨基-3-(4′-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺基1-pyrenebutyrate和4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸芪-2，2′-二磺酸衍生物。代表性受体荧光部分，取决于所使用的供体荧光部分，包括LC-Red 640、LC-Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺碱性蕊香红B磺酰氯(Lissamine rhodamine B sulfonyl chloride)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocyanate)、异硫氰酸罗丹明x(rhodamine x isothiocyanate)、赤藓红异硫氰酸酯(erythrosineisothiocyanate)、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸酯或稀土离子(Lanthanideions)(例如，铕或铽)的其他螯合物。可以例如从Molecular Probes(Junction City，Oreg.)或Sigma Chemical Co.(St.Louis，Mo.)获得供体和受体荧光部分。
表1列出了适合用于本发明的化学荧光基团的其他实例以及它们的激发和发射波长。
某些天然发生的氨基酸例如色氨酸是发荧光的。还可以例如通过将荧光基团连接至氨基酸(例如将AEDANS连接至Cys)衍生氨基酸来产生用于FRET的荧光基团对。通常将AEDANS-Cys对用于检测蛋白质构象变化和相互作用。也已将一些其他形式荧光基团用于修饰氨基酸和在蛋白质片段中产生FRET(例如，2.4-二硝基苯基-赖氨酸与S-(N-[4-甲基-7-二甲基氨基-香豆素-3-基]-碳酰胺甲基(carboxamidomethyl))-半胱氨酸-)。
在另一个特别适合用于活细胞的实施方案中，将绿色荧光蛋白(GFP)和其不同的突变体用作荧光基团。在它们本身当中在激发和发射最大波长上可变化的荧光蛋白的实例列于WO 97/28261(Tsien等人，1997)的表1中，所述申请通过引用合并入本文。此类实例(各自后跟以纳米表示[激发最大/发射最大]波长)包括野生型绿色荧光蛋白[395(475)/508]和绿色荧光蛋白变体的克隆的突变体P4[383/447]，P4-3[381/445]、W7[433(453)/475(501)]、W2[432(453)/408]、S65T[489/511]、P4-1[504(396)/480]、S65A[471/504]、S65C[479/507]、S65L[484/510]、Y66F[360/442]、Y66W[458/480]、IOc[513/527]、WIB[432(453)/476(503)]、Emerald[487/508]和Sapphire[395/511]。还可使用红色荧光蛋白例如具有558nm的激发最大波长和583的发射最大波长的DsRed(Clontech)。该列表未穷举本领域内已知的荧光蛋白；另外的实例见于Genbank和SwissPro公共数据库。
表1
GFP是27-30KD的蛋白质，可将其与另一种蛋白质例如靶蛋白融合，并且可对融合蛋白进行基因工程以在宿主细胞例如大肠杆菌(E.coli)的宿主细胞中表达。GFP和其不同的突变体能够在活细胞和组织中产生荧光。GFP的突变形式在它们的荧光区域具有少许氨基酸差异，这导致偏移的光谱。预期将来产生更多的具有不同光谱的GFP的突变。在此类GFP变体当中，BFP-YFP、BFP-CFP、CFP-YFP、GFP-DsRed通常用作检测蛋白质-蛋白质相互作用的FRET供体-受体对。此类对也适合用于检测连接所述对的连接体区域的蛋白酶切割。
荧光蛋白的使用是优选的，因为它们使得能够使用大约60个氨基酸残基的连接体片段。更长的片段通常对毒素的识别和切割更敏感，从而导致对检测毒素的更高的灵敏性。如下面实例中所显示的，在与CFP-SNAP-YFP一起温育4小时后，当用广泛使用的微量滴定板荧光分光光度计(microplate spectrofluorometer)(Spectra Max Gemini，MolecularDevice)测量时，BoNT/A和E的EC50低至15-20pM(1-2ng/ml)。BoNT/B和F的EC50是大约200-250pM，可通过增加温育时间来增强灵敏性。
根据本发明的一个实施方案，通过合适长度的连接体将两个荧光基团连接在一起，这样可使FRET发生。连接体是BoNT底物蛋白的片段。当暴露于能够切割连接体片段的BoNT时，两个荧光基团被分开，从而消除FRET。本发明因此提供了用于通过检测FRET的变化来检测BoNT的方法。来自许多物种的SNARE蛋白适合用作BoNT毒素的底物蛋白，因为已知此类蛋白质在氨基酸水平上是保守的。许多此类BoNT底物蛋白是已知的并且可获得用于或经修饰用作本发明的合适的连接体肽。一些底物蛋白和它们的GenBank登录号列于表2中。
表2
已知各BoNT毒素切割毒素切割位点内的两个特定氨基酸之间的特定肽键。下面的表3列出了针对各BoNT毒素的所述氨基酸对。然而，这些氨基酸序列对不足以被毒素识别和切割。例如，BoNT/A在大鼠SNAP-25序列(GenBank登录号：NP__112253)的Q(197)-R(198)而非Q(15)-R(16)上切割SNAP-25。通常，不存在作为识别位点的保守氨基酸序列；相反，毒素据信识别它们的靶蛋白的三级结构而非一级结构。然而，无论其物种来源，底物蛋白的非常短的片段足以被毒素识别和切割，只要它们在上文所列的毒素切割位点上具有下面的表3中的2个氨基酸残基。
连接体蛋白或肽可以长至BoNT底物蛋白的全长。优选，连接体是更短的底物蛋白的片段。全长底物连接体对于有效FRET可能太长，更短的片段比全长蛋白更有效并且更容易产生。在另一方面，如上文所指出的，连接体肽应当长于某个最小长度，因为短于这样的最小长度，各自BoNT对连接体肽的切割会变得无效。
表3
以syb II和BoNT/B为例，下面的表4举例说明了连接体-肽长度与毒素的切割率之间的关系。全长大鼠syb II蛋白(GenBank号：NP__036795)具有116个氨基酸，其中氨基端上的氨基酸1-94是细胞质结构域，其余的是跨膜结构域。如表1清楚地显示，在某个限度内，毒素以更慢的速率(来自Foran等人，Biochemistry 33：15365，1994的数据)切割更短的片段。
如可从表4看到的，为了获得最佳切割，破伤风神经毒素(TeNT)需要比BoNT/B(55-94)更长的片段(33-94)。已在几个研究(包括几种基于肽的毒素测定法)(Schmidt等人，2003，同上，和Schmidt等人，2001，Analytical Biochemistry，296：130-137)中使用了由60-94组成的片段。
对于BoNT/A，需要SNAP-25的141-206片段来保持大部分毒素敏感性(Washbourne等人，1997，FEBS Letters，418：1)。也存在其他报导：更短的肽，SNAP25的氨基酸187-203，足以被BoNT/A切割(，2001)。对于BoNT/A最小的位点是：Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys(SEQ ID NO：1)。BoNT/A切割Gln-Arg。
表4
通过在PC12细胞内使用全长SNAP-25作为CFP与YFP之间的连接体序列，初步结果显示获得的FRET信号比使用更短的片段获得的FRET信号强，足以使用常规实验室显微镜来检测。据信，可能地由于全长SNAP-25被靶向质膜(BoNT/A轻链也可被靶向和锚着在其上)上的事实，在PC12细胞中，BoNT/A对全长SNAP-25的切割率比短片段更快，并且在细胞之间更一致。
对于BoNT/B，发现短至残基60至94的片段与残基33至94之间的片段一样有效。优选，将33至94之间的片段用于BoNT/B和TeNT。两种毒素在Gln与Phe之间进行切割，切割的最小序列据信为：Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser(SEQ ID NO：2)。有迹象显示BoNT/B轻链可被靶向并且锚着在突触小泡上，可期望通过信号序列将本发明的FRET构造物靶向突触小泡以在细胞内获得增加的切割效率。
BoNT/C切割SNAP25和突触融合蛋白，并且据信如果底物存在于溶液中，则以非常低的速率进行切割。存在于细胞膜上的天然SNAP25和突触融合蛋白被BoNT/C最有效地切割。对于SNAP25最小的切割序列是：Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met(SEQ ID NO：3)，其中切割在Arg-Ala之间发生；对于突触融合蛋白，最小切割序列是Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Phe(SEQ ID NO：4)，并且切割在Lys-Ala上发生。
BoNT/E需要最小序列：Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Glu-Lys(SEQ ID NO：5)，并且在Arg-Ile之间进行切割。
BoNT/F切割Gln-Lys。Schmidt等人(Analytical Biochemistry，296：130-137(2001))报导：syb II的37-75片段保持大部分毒素敏感度，并且最小序列是：Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu(SEQ ID NO：6)。
根据上文关于最小切割位点和FRET信号强度与连接体长度之间以及切割效率与连接体长度之间的关系的论述，本领域技术人员可容易地选择合适的连接体长度来获得FRET信号强度与切割效率之间的最佳平衡。
优选，取决于特定的底物和毒素组合，连接体长度是大约8个氨基酸至大约100个氨基酸之间，优选10至90个氨基酸之间，更优选20至80个氨基酸之间，30至70个氨基酸之间，40至60个氨基酸之间的任何长度。
在一个实施方案中，可首先纯化连接体蛋白或其片段，或首先合成肽，然后将荧光基团通过化学反应加至某个氨基酸。将荧光标记附着至连接体多肽或备选地，将荧光蛋白按读框与连接体多肽融合，如下面所描述的。上文的论述清楚地表明，虽然短底物片段对于毒素检测特异性是期望的，但更长的片段可能对于提高的信号强度或切割效率是期望的。很容易地认识到，当蛋白质包含1个以上的一种BoNT的识别位点时，单独的位点结果将不足以鉴定哪种特定的毒素存在于样品中。在本发明的一个实施方案中，如果使用更长的底物片段，特别地全长底物蛋白，则可以例如通过定向诱变或本领域技术人员熟知的其他分子工程方法对底物进行工程改造，这样使其只包含一个毒素/蛋白酶识别位点。参见例如Zhang等人，2002，Neuron 34：599-611″Ca2+-dependent synaptotagminbinding to SNAP-25 is essential for Ca2+triggered exocytosis″(显示在BoNT/E切割位点具有突变(Asp 179至Lys)的SNAP-25抗BoNT/E切割，但当就SNARE复合物形成进行检测时表现正常)。在优选实施方案中，本发明的方法使用特异性工程和长度最优化的组合来获得最佳信号强度、切割效率和毒素/血清型特异性。
在优选实施方案中，荧光基团是通过合适的底物肽连接的合适的荧光蛋白。然后可通过任一体外(例如，使用无细胞转录/翻译系统，或取而代之使用利用本领域内熟知的方法转化或转染的培养细胞)表达重组核酸分子来产生FRET构造物，所述核酸分子包含编码这样的多肽和荧光蛋白标记的序列的符合读框的融合序列。用于产生FRET构造物的合适的细胞可以是细菌、真菌、植物或动物细胞。还可在体内例如在转基因植物中或在转基因动物包括但不限于昆虫、两栖动物和哺乳动物中产生FRET构造物。如果需要，可通过本领域内熟知的分子方法构建和表达用于本发明的重组核酸分子，所述重组核酸分子可额外地包含序列，包括但不限于编码使得能够容易纯化的标记(例如，组氨酸标记)、连接体、分泌信号、核定位信号或能够将构造物靶向特定细胞位置的其他基本序列信号的序列。
低至300nM的蛋白质足以产生可使用微量滴定板荧光分光光度计检测的充足的荧光信号。可实时跟踪荧光信号的变化以反映毒素的蛋白酶酶促活性。实时监控将信号变化测量为反应进程，并且允许快速的数据收集和产生关于在不同条件下的反应动力学的信息。可以例如就某些荧光分光光度计，使用方法例如HPLC测定使FRET速率的变化与切割的程度进行关联，以使来自FRET比率的动力学常数的单位与底物浓度进行关联。
图10是具有连接体130的现有技术构造物100的示意图，所述连接体130包含位于供体标记110与受体标记120之间的切割位点序列140和切割位点142。该类型的现有技术构造物特别适合用于检测BoNT。然而，图11a的示例性构造物100a令人惊讶地由于在连接体130a内包含间隔子130a而具有增强的对于检测BoNT的灵敏性。
图11a是描述本发明的构造物100a的一个实施方案的示意图，所述构造物具有包括切割位点序列140、切割位点142和间隔子150a的连接体130a。间隔子150a位于切割位点序列140与受体标记120之间。优选，构造物100a选自CFP-(SGLRSRA)-SNAP-25-(SNS)-YFP和CFP-(SGLRSRA)-小突触泡蛋白-(SNS)-YFP。
供体标记110和受体标记120被定位成提供电子耦合，从而使供体标记可通过偶极-偶极耦合机制(包括但不限于共振能量转移(FRET))将能量转移至受体标记。
连接体肽130a是选自小突触泡蛋白(VAMP)、突触融合蛋白和SNAP-25或其可被肉毒杆菌神经毒素识别和切割的片段的肉毒杆菌神经毒素的底物。此类蛋白统称为SNARE蛋白。连接体130a可具有任何合适长度的一级结构长度，包括例如，大于或等于5nm、8nm、10nm、12nm、14nm和20nm。
间隔子150a可具有任何合适数目的氨基酸，但优选至少3、5、7、10、12或15个氨基酸。间隔子150a可包括选自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中n是1-3。备选地，间隔子150a可包括SNARE蛋白、基序或突变蛋白。虽然间隔子150a增加供体标记110与受体标记120之间的一级结构的距离，但相对于无间隔子的相应构造物，间隔子150a有利地增加供体标记110与受体标记120之间的电子耦合(FRET效应)。增强的电子耦合发生，因为间隔子150a减少了供体标记110与受体标记120之间的三级结构距离，从而允许增加电子耦合。
切割位点序列140可包括(a)SNARE蛋白、基序、突变蛋白，和(b)具有至少5个氨基酸的间隔子，其中间隔子包含选自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中n为1至3。
除连接体130b具有位于供体标记110与切割位点序列140之间的间隔子150b外，图11b的构造物100b与图11a的构造物100a相似。
除了连接体130b具有(a)位于供体标记110与切割位点序列140之间的间隔子150c和(b)位于切割位点序列140与受体标记120之间的间隔子150d外，图11c的构造物100c与图11a的构造物100a相似。
图12举例说明了使用图11a至11c的构造物提高供体标记与受体标记之间的能量转移的灵敏性的方法200的步骤。步骤210由提供根据图11a至11c的构造物组成，所述构造物包含通过连接体物理连接的供体标记和受体标记。构造物是基于蛋白质的构造物，连接体是肽序列212。步骤220由在连接体中包括切割位点序列组成。任选地，切割序列包括SNARE蛋白或其片段或突变蛋白，间隔子包含至少5个氨基酸222。步骤230由在供体与切割位点序列和受体与切割位点序列的至少一个之间的连接体中包括间隔子组成，由此供体与受体之间的电子耦合通过(a)减少供体与受体234之间的三级结构距离和(b)在供体与受体236之间提供电子跃迁(electronic hop)而得到增强。任选地，间隔子包括选自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中n是1-3232。
图13举例说明用于使用图11a至11c的构造物检测肉毒杆菌神经毒素的方法300的步骤。步骤310由提供权利要求1的构造物组成，其中连接体是待检测的肉毒杆菌神经毒素的底物蛋白或其可切割片段。步骤320由在肉毒杆菌神经毒素在其下可切割底物蛋白或其片段的条件下将构造物暴露于怀疑含有肉毒杆菌神经毒素的样品组成。以及步骤330由在将构造物暴露于样品之前和之后检测和比较FRET信号组成，其中FRET的减少表明样品中存在肉毒杆菌神经毒素。
本发明的方法是高度灵敏的，并且作为结果，可用于直接检测环境样品中痕量的BoNT，包括肉毒杆菌细胞中的原毒素。因此，本发明还提供了用于直接使用环境样品进行毒素检测和鉴定的方法。
本发明还提供了使用上述体外系统筛选BoNT的抑制剂的方法。由于其高度灵敏性、快速读出和易使用性，基于本发明的体外系统也适合用于筛选毒素的抑制剂。具体地，在候选抑制物质存在的情况下将合适的BoNT底物-FRET构造物暴露于相应的BoNT，监控FRET信号的变化以确定候选物是否抑制BoNT的活性。
本发明还提供了用于使用基于细胞的系统检测BoNT的方法以检测BoNT和进一步用于筛选BoNT的抑制剂。将如上所述的合适的BoNT底物-FRET构造物在细胞中表达，然后将细胞暴露于怀疑含有BoNT的样品，然后监控FRET信号的变化，作为BoNT的存在/不存在或浓度的指示。特别地，FRET信号的减少标示着样品含有相应的BoNT。
基于细胞的高通量筛选测定具有不仅显示出可阻断毒素的蛋白水解活性的试剂而且还可显示出可阻断毒素作用中的其他步骤(例如与其细胞受体的结合、轻链穿过内体膜的转位以及转位后轻链在细胞溶质中的折叠)的试剂的潜力。
本发明还提供了用于使用上述基于细胞的系统筛选BoNT的抑制剂的方法。具体地，将表达合适的BoNT底物-FRET构造物的细胞在候选抑制剂物质存在的情况下暴露于相应的BoNT，监控FRET信号的变化以确定候选物是否抑制BoNT的活性。与只可鉴定毒素-底物相互作用的直接抑制剂的其他基于体外的筛选方法相比较，本发明的基于细胞的筛选方法还允许筛选其他毒素相关活性(例如但不限于毒素-膜受体结合、膜转位和细胞内毒素运动)的抑制剂。
根据优选实施方案，将编码BoNT底物多肽和两个合适的FRET效应荧光肽(FRET-effecting fluorescent peptide)的重组核酸分子，优选表达载体导入合适的宿主细胞。本领域技术人员可选择合适的表达载体，优选哺乳动物表达载体用于本发明，并且承认存在许多选择。例如，pcDNA系列的载体，例如pCI和pSi(来自Promega，Madison，Wis.)、CDM8、pCeo4。许多此类载体使用病毒启动子。优选，使用诱导型启动子，例如来自BDBiosciences(San Jose，Calif.)的tet-off和tet-on载体。
细胞系的许多选择适合作为用于本发明的宿主细胞。优选，细胞是其中各BoNT展示其毒性活性的类型的细胞。换句话说，细胞优选展示合适的细胞表面受体，或以其他方式允许毒素充分有效地转移入细胞，以及允许毒素切割合适的底物多肽。特定的实例包括原代培养的神经元(皮质神经元、海马神经元、脊髓运动神经元等)；PC12细胞或衍生的PC12细胞系；原代培养的chromaphin细胞；几种培养的成神经细胞瘤细胞系，例如鼠胆碱能Neuro 2a细胞系、人肾上腺素能SK-N-SH细胞系和NS-26细胞系。参见例如Foster和Stringer(1999)，Genetic Regulatory ElementsIntroduced Into Neural Stem and Progenitor Cell Populations，BrainPathology 9：547-567。
底物-FRET多肽的编码区在合适的启动子的控制之下。取决于所使用的宿主类型，许多合适的启动子是已知的并且在本领域可容易地获得。此类启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。可选择组成型启动子来指导本发明的期望的多肽的表达。这样的表达构造物可提供额外的有利方面，因为其避开了对在含有诱导底物的培养基上培养表达宿主的需要。在哺乳动物系统中合适的启动子的实例可以是LTR、SV40和CMV；在细菌系统中是大肠杆菌(E.coli)lac或trp；在昆虫系统中是杆状病毒多角体启动子(polh)和已知在真核和原核细胞或它们的病毒中控制表达的其他启动子。优选用于真菌表达宿主的强组成型和/或诱导型启动子的实例是可从木聚糖酶(xlnA)，植酸酶(phytase)，ATP-合成酶，亚基9(oliC)，磷酸丙糖异构酶(tpi)，醇脱氢酶(AdhA)，α-淀粉酶(amy)，淀粉葡糖苷酶(AG-来自glaA基因)，乙酰胺酶(amdS)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(gpd)启动子的真菌基因获得的启动子。强酵母启动子的实例是可从醇脱氢酶，乳糖酶，3-磷酸甘油酸酯激酶和磷酸丙糖异构酶的基因获得的启动子。强细菌启动子的实例包括SPO2启动子以及来自细胞外蛋白酶基因的启动子。
杂合启动子还可用于提高表达构造物的诱导型调控。启动子可额外地包括确保或增加在合适的宿主中的表达的特性。例如，特性可以是保守区域例如普里布诺框(Pribnow Box)或TATA框。启动子可以甚至包含影响(例如维持、增加或减少)本发明的核苷酸序列的表达水平的其他序列。例如，合适的其他序列包括Shl-内含子或ADH内含子。其他序列包括诱导型元件-例如温度、化学药品、光或胁迫诱导型元件。同样，增强转录或翻译的合适的元件可存在。后一种元件的实例是TMV 5′信号序列(参见Sleat，1987，Gene 217：217-225；和Dawson，1993，Plant Mol.Biol.23：97)。
表达载体还可包含作用于启动子以扩增表达的序列。例如，SV40、CMV和多瘤顺式作用元件(增强子)和选择标记可提供用于选择的表型性状(例如二氢叶酸还原酶或新霉素抗性(对于哺乳动物细胞)或氨苄青霉素/四环素抗性(对于大肠杆菌))。合适的包含合适的启动子和选择标记的载体的选择完全在本领域技术人员的水平之内。
优选，底物-FRET多肽的编码区在诱导型启动子的控制之下。与组成型启动子相比较，诱导型启动子是优选的，因为其允许适当地控制细胞中报告因子的浓度，从而极大地方便了FRET信号的变化的测量。
例如，可使用Tet-on和Tet-off系统(BD Biosciences，San Jose，Calif.)控制FRET报告分子。在该启动子的控制下，可以以精确的、可逆的和定量的方式调控基因表达。简而言之，对于Tet-on系统，只有当多西环素存在于培养基中时，下游基因的转录才发生。在转录进行某个时期后，我们可改变培养基以排除多西环素，从而终止新的FRET报告蛋白的合成。因此，不存在来自新合成的FRET蛋白的背景，我们可以能够在毒素处理后看到更快的变化。
可使用例如光子计数落射荧光显微镜系统(photon countingepifluorescent microscope system)(包含适当的二色镜和滤光片以用于监控特定范围内的荧光发射)、光子计数光电倍增系统或荧光计来进行荧光分析。可使用氩离子激光器、高强度水银(Hg)弧光灯、导光纤维光源或经适当滤过以在期望的范围内激发的其他高强度光源进行起始能量转移的激发。对于本领域技术人员来说将很显然的是可通过整合光电倍增管装置以增强检测灵敏性来增强激发/检测装置。例如，可使用两光子交叉相关法(two photon cross correlation method)在单分子尺度上实现检测(参见例如Kohl等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，99：12161，2002)。
可测量许多荧光输出的参数。它们包括：1)测量在受体(A)和供体(D)的发射波长上发射的荧光和根据它们的发射振幅的比率确定能量转移的程度；2)测量D的荧光寿命；3)测量D的光漂白速率；4)测量D和/或A的各向异性；或5)测量斯托克斯位移激发单体/激基缔合物荧光。参见例如Mochizuki等人，(2001)″Spatio-temporal images of grow-factor-inducedactivation of Ras and Rapl.″Nature 411：1065-1068，Sato等人(2002)″Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single livingcells.″Nat Biotechnol.20：287-294。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于使用表面等离子体共振成像(SPRi)技术检测BoNT的方法。表面等离子体共振(SPR)是已建立的用于检测分子结合的光学技术，其基于支持结合的化学药品的薄金属膜(通常金)中表面等离子体的产生。表面等离子体是限制在金属膜中的自由电子的集体振动。这些电子被来自高折射率棱镜的光入射场共振激发。在该共振激发发生所处的范围内入射角q相对狭窄，并且以在共振入射角qr上具有最小值的反射光的强度的减小为特征。反射光的相也几乎随该区域中的q线性变化。qr的值对存在于数纳米的金属膜内的介质的折射率是敏感的。从而，由于分子与膜的结合或由于结合的分子的分子量的变化而引起的折射率的小变化可被检测为该角度的变化。许多用于将生物分子锚着至金属表面的方法在本领域内已知，用于检测这样的锚着和测量SPRi的方法在本领域内是已知的，参见例如美国专利6,127,129、美国专利6,330,062，和Lee等人，2001，Anal.Chem.73：5527-5531，Brockman等人，1999，J.Am.Chem.Soc.121：8044-8051，和Brockman等人，2000，Annu.Rev.Phys.Chem.51：41-63，其全都以其全文通过引用合并入本文。
实际上，可将一层BoNT靶肽沉积在金属上。将怀疑含有相应的BoNT的样品用于组合表面(composite surface)，然后进行温育以允许毒素(如果存在)切割结合的靶肽。切割将导致结合至金属表面的肽的分子量减小，然后该减小可使用标准设备和方法来检测。结合层的厚度的减小表示切割已发生，从而表明样品包含相应于靶肽的毒素。
备选地，BoNT蛋白与其相应的底物肽(所述肽被锚着至金属表面)的结合也可引起折射率的变化，并且可利用已知的SPRi技术和仪器来检测。
许多方法在本领域内已知用于将蛋白质或肽分子锚着至或沉积在金属表面。例如，可向肽的末端加入额外的Cys残基，然后将该肽交联至金属表面上。间接地，可以首先将抗体锚着至金属表面，然后将毒素底物连接至该抗体。通过抗体进行的间接锚着适合用于本发明，只要抗体-底物结合不阻止毒素识别和进入底物的切割位点即可。此外，可使用镍-NTA或谷胱甘肽分别拖下(hold on)his6或GST融合蛋白。关于将肽锚着至金属表面的另外的信息可见于Wegner等人，(2002)Characterization and Optimization of Peptide Arrays for the Study ofpitope-Antibody Interactions Using Surface Plasmon Resonance Imaging″Analytical Chemistry 74：5161-5168，其以其全文通过引用合并入本文。
可通过SPR1容易地检测核酸分子中大约10至16个碱基(相应于分子量的3,000至6,400道尔顿)的变化。这暗示可检测肽分子中少至16个氨基酸残基的变化。该高灵敏性允许短肽底物至表面上的锚着，而不使用全长毒素底物蛋白。短肽片段是优选的，因为它们更稳定，可更便宜地制备并且允许更高的反应特异性。
实施例
材料和方法
生物传感器DNA构造物的构建：使用EcoRI和BamHI位点将YFPcDNA(Clontech)插入pECFP-C1载体(Clontech)以产生pECFP-YFP载体。使用PCR扩增编码大鼠syb II的氨基酸33至94的cDNA，然后使用位于CFP与YFP基因之间的XhoI和EcoRI位点将其克隆入pECFP-YFP载体，以产生可用于转染细胞的CFP-SybII-YFP(也称为CFP-Syb(33-94)-YFP)构造物。使用相同的方法，但使用SNAP-25的残基141至206构建构造物CFP-SNAP-25-YFP(也称为CFP-SNAP-25(141-206)-YFP)。也制备具有全长大鼠SNAP-25B作为连接体的构造物(CFP-SNAP25FL-YFP)。为了使用细菌大肠杆菌纯化重组嵌合蛋白，我们还使用NheI和BamHI位点将CFP-SybII-YFP基因和CFP-SNAP-25-YFP基因从pECFP-YFP载体移入pTrc-his(Invitrogen)载体。
使用PCR，通过定点诱变实现SNAP-25的4个Cys残基至Ala的突变，然后如上所述将片段插入CFP与YFP之间。通过首先将编码SNAP-25的残基83至120的cDNA片段插入pEYFP-N1(Clontech)的XhoI/EcoRI位点，然后使用EcoRI/BamHI将CFP-SNAP-25(141-206)cDNA亚克隆入下游位点来构建SNAP-25(83-120)-CFP-SNAP-25(141-206)-YFP。通过首先将全长Syb II cDNA在EcoRI和BamHI位点插入pECFP-C1载体，然后将全长YFP cDNA在XhoI和EcoRI位点上插入上游来构建YFP-Syb(FL)-CFP。通过经由EcoRI/BamH位点置换YFP-Syb(FL)-CFP构造物中的全长Syb来构建YFP-Syb(33-116)-CFP。通过PCR产生所有cDNA片段。
蛋白质纯化和荧光光谱的获取：如(Chapman等人，A novel functionfor the second C2 domain of synaptotagmin.Ca.2+-triggered dimerization.J.Biol.Chem.271，5844-5849(1996))所述纯化His6-标记的CFP-SybII-YFP和CFP-SNAP-25-YFP蛋白。使用HEPES缓冲液(50mM HEPES，pH7.1)透析蛋白质过夜。将300nM蛋白在小杯中置于总体积500μl HEPES缓冲液中，所述缓冲液含有2mM DTT和10μM ZnCl2。使用PTIQM-1荧光计收集从450nM至550nM的发射光谱。激发波长是434nM，其为CFP的最佳激发波长。
肉毒杆菌神经毒素的激活和监控生物传感器蛋白的切割：将BoNT/A、B、E或F与2mM DTT和10μM ZnCl2于37℃下一起温育30分钟以将毒素的轻链从重链还原。为了进行实验，使用PTIQM-1荧光计，向装有300nM相应的FRET传感器的小杯中加入10nM BoNT/A、E或50nM BoNT/B、F。在加入毒素后的某些时间间隔(例如0、2、5、10、30、60、90分钟)上如上所述收集发射光谱。在各发射扫描结束时，收集小部分样品(30μl)，将其与SDS-上样缓冲液混合，过后将其经历SDS-page凝胶。使用增强化学发光(ECL)(Pierce)，利用抗-his6抗体显现传感器蛋白和切割产物。
为了进行实验，使用荧光分光光度计，在96孔板中以每孔100μl的体积制备300nM FRET传感器蛋白。向各孔中加入不同浓度的BoNT，然后在434nM处激发样品。以30秒的间隔收集YFP通道(527nM)和CFP通道(470nM)的发射光谱，进行90分钟。对于每一个数据点，通过YFP通道与CFP通道之间的比率确定FRET比率。
在毒素处理后测量活细胞中FRET速率的变化，使用电穿孔(Bio-Rad)将DNA构造物pECFP-SNAP25-YFP用于转染PC12细胞。在转染后将细胞经历24小时，然后向培养基中加入50nM BoNT/A。在与毒素一起温育72小时后，使用Nikon TE-300显微镜收集表达FRET传感器的细胞的荧光图象。使用下列滤光片组(Chroma Inc.)：CFP通道：CFP激发滤光片(436/10nm)、JP4分光器(beamsplitter)、CFP发射滤光片：(470/30nm)；FRET通道：CFP激发滤光片(436/10nm)、JP4分光器、YFP发射滤光片(535/30nm)收集每一个孔(CFP通道和FRET通道)的两个图象。从各图象减去背景(不包含细胞的区域)，然后使用MetaMorph软件比较各细胞的CFP通道和FRET通道的荧光强度。如之前所述，通过FRET通道与CFP通道之间的强度比率来确定FRET速率。对照细胞不用毒素处理，但以相同的方式进行分析。为了在活细胞中检测BoNT/B，我们如上所述使用相同方法转染表达syt II的PC12细胞系。
活细胞成像和FRET分析：通过电穿孔(Bio-Rad，CA)用图注中指定的不同cDNA构造物转染PC12细胞。使用具有100倍油浸物镜的NikonTE-300显微镜收集荧光图象。使用已建立的方法，利用三滤光片组方法(three-filter set method)(Gordon 等人，Quantitative fluorescenceresonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy.Biophys J.74，2702-2713(1998)；Sorkin等人，Interaction of EGF receptorand grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer(FRET)microscopy.Curr.Biol.10，1395-1398(2000))定量活细胞中的CFP/YFP FRET。简而言之，对于每一个细胞，通过3个不同的滤光片组：CFP滤光片(激发，436/10nm；发射，470/30nm)、FRET滤光片(激发，436/10nm；发射，535/30nm)和YFP滤光片(激发，500/20nm，发射，535/30nm)获得3张连续的图象。使用JP4分光器(Set ID 86000，ChromaInc.VT)。使用完全相同的设置(4x4 Binning，200ms暴光时间)获得所有图象。为了排除可因荧光蛋白的高表达水平而产生的浓度依赖性FRET信号，在我们的实验中只计数具有低于最大12-比特等级(scale)(1-2097灰度)的半值的CFP和YFP强度的细胞(Miyawaki等人，Monitoringprotein conformations and interactions by fluorescence resonance energytransfer between mutants of green fluorescent protein.Methods Enzymol.327，472-500(2000)；Erickson等人，DsRed as a potential FRET partnerwith CFP and GFP.Biophys J 85，599-611(2003))。在计算FRET值之前从各原始图象中减去背景(来自不包含细胞的区域)。然后获得和比较各图象的荧光强度值。首先检测单独用CFP或YFP转染的PC12细胞以获得这些滤光片组的串扰值(crosstalk value)。FRET滤光片通道对于CFP显示大约56-64％的渗透(bleed-through)，对于YFP显示大约24％的渗透。当使用CFP滤光片时对于YFP事实上没有串扰，或使用YFP滤光片时对CFP没有串扰，这极大地简化了FRET计算。对于表达毒素传感器的细胞，使用下列公式计算“矫正的FRET”：矫正的FRET＝FRET-(CFP X0.60)-(YFP X 0.24)，其中FRET、CFP和YFP分别相应于通过FRET、CFP和YFP滤光片组获得的图象的荧光强度。来自CFP和YFP荧光的渗透的平均分数分别为0.6和0.24，当通过FRET滤光片组获得图象时。因为CFP-SNAP25FL-YFP传感器的毒素切割导致YFP片段的膜分离，所述YFP片段在细胞溶质中被降解(图7c，e)，因此将用于我们的数据分析的FRET比率计算为根据单独的CFP荧光强度标准化的“矫正的FRET”值(矫正的FRET/CFP)。我们注意到，如果FRET发生，这些计算中的CFP强度由于供体猝灭而被低估。然而，已报导，由于供体猝灭而产生的CFP荧光的减少只有大约5-10％(Gordon等人，Quantitative fluorescenceresonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy.Biophys J 74，2702-2713(1998)；Sorkina等人，Oligomerization ofdopamine transporters visualized in living cells by fluorescence resonanceenergy transfer microscopy.J.Biol.Chem.278，28274-28283(2003))。使用MetaMorph软件(UniversalImaging Corp.，PA)进行所有成像和计算。
为了进行包括毒素处理的实验，向细胞培养基中加入指定的全毒素，进行不同的时间，然后如上所述分析细胞。用毒素传感器转染对照细胞，但不用毒素处理对照细胞，然后以相同的方式分析它们。
毒素底物切割的免疫印迹分析：用如图注中指定的不同毒素传感器cDNA构造物转染野生型PC12细胞或Syt II+PC12细胞(Dong等人，2003，同上)。在转染后24小时向培养基中加入BoNT/A或B，将细胞再温育另外48小时。然后收获细胞，如之前所述将细胞裂解物经历免疫印迹分析。用相同的cDNA构造物转染对照细胞，除了不用毒素处理之外，平行地测定所述细胞。用毒素体外处理三分一的对照细胞裂解物(200nMBoNT/A或B，在37℃下进行30分钟)，然后将其经历免疫印迹分析。使用抗-SNAP-25抗体26测定内源SNAP-25和转染的CFP-SNAP-25-YFP传感器。也使用GFP多克隆抗体(Santa Cruz.，CA)测定CFP-SNAP-25-YFP和CFP-SybII-YFP传感器蛋白。将抗-his6抗体(Qigen Inc.，CA)用于测定重组传感器蛋白的切割。
实施例1：基于CFP-YFP FRET对的生物传感器和肉毒杆菌神经毒
素的蛋白酶活性
为了使用FRET法监控肉毒杆菌神经毒素蛋白酶活性，通过syb II或SNAP-25片段连接CFP和YFP蛋白(分别表示为CFP-SybII-YFP和CFP-SNAP-25-YFP)(图1A)。使用毒素底物的短片段而非全长蛋白质以最优化CFP-YFP能量转移效率，所述能量转移效率随距离增加而呈指数下降。然而，当靶蛋白片段变得太短时，BoNT产生的切割效率显著降低。因此，使用包含小突触泡蛋白序列的氨基酸33至96的区域，因为已报导其保持与全长小突触泡蛋白相同的由BoNT/B、F和TeNT产生的切割率。类似地，选择SNAP-25的残基141至206以确保构建物仍然可被BoNT/A和E识别和切割。
FRET测定描述于图1B中。当在434nM(CFP的最佳激发波长)上激发时，CFP-SybII-YFP和CFP-SNAP-25-YFP嵌合蛋白将因CFP-YFP对之间的FRET而引发YFP荧光发射。肉毒杆菌神经毒素可识别和切割CFP与YFP之间的短底物片段，在CFP与YFP分离后，FRET信号被消除。因为可在活细胞中表达此类嵌合蛋白，因此也将它们称为肉毒杆菌神经毒素的“生物传感器”。
我们首先纯化CFP-SybII-YFP和CFP-SNAP-25-YFP的his6-标记的重组嵌合蛋白，然后使用PTIQM-1荧光计表征它们的发射光谱。如所预期的，两种生物传感器蛋白，当在434nM处激发它们的CFP时，都在525nM处显示明显的YFP荧光峰(图2B，C)。相反地，当在434nM处直接激发时，单独的YFP只产生少量荧光信号(图2A)。单个的CFP和YFP的混合物在525nM处不具有峰发射(图2A)。这显示使用生物传感器蛋白观察到的YFP荧光峰由FRET引起。因为FRET比率(YFP荧光强度/CFP荧光强度)受许多因素例如缓冲液组成、Zn.2+浓度和还原剂的浓度(数据未显示)影响，因此此后的实验都在相同的缓冲条件(50mM Hepes，2mM DTT，10μM ZnCl2，pH 7.1)中进行。加入2mM DTT和10μM Zn.2+以最优化肉毒杆菌神经毒素的蛋白酶活性。
实施例2：体外监控肉毒杆菌神经毒素对生物传感器蛋白的切割
将300nM嵌合蛋白CFP-SybII-YFP与50nM预还原的BoNT/B全毒素在小杯中混合。在加入BoNT/B后不同的时间点(0、2、5、10、30、60分钟等)上收集发射光谱。在各扫描结束时，从小杯中取出少量体积的样品(30μl)，将其与SDS-上样缓冲液混合。之后将此类样品经历SDS-page凝胶，使用抗重组嵌合蛋白中的his6标记的抗体显现嵌合蛋白的切割。如图3A中所示，生物传感器蛋白与BoNT/B的温育导致YFP发射的减少和CFP发射的增加。FRET比率的降低与BoNT/B对嵌合蛋白的切割的程度一致(图3A，下图)。该结果显示可通过记录其FRET比率的变化来实时监控生物传感器蛋白的切割。
进行相同的测定以检测BoNT/F对CFP-SybII-YFP的切割和BoNT/A或E对CFP-SNAP-25-YFP的切割(图3B、C、D)。对于使用BoNT/B的实验获得相似的结果。在所有情况下，我们使用光学读出和免疫印迹分析都观察到相同的底物切割的动力学。在我们的测定中，BoNT/A和E切割它们的嵌合底物比BoNT/B和F切割要快得多。因此，为了记录前数分钟内发生的变化，只能使用10nM BoNT/A或E。嵌合蛋白的切割是特异性的，因为将BoNT/B和F与CFP-SNAP-25-YFP混合，或将BoNT/A和E与CFP-SybII-YFP混合都未导致FRET比率或底物切割的任何变化(数据未显示)。
实施例3：使用微量滴定板荧光分光光度计实时监控肉毒杆菌神经
毒素的蛋白酶
活性
上述实验显示可通过监控肉毒杆菌神经毒素的靶生物传感器蛋白的发射光谱的变化体外检测肉毒杆菌神经毒素的活性。然后我们确定我们是否能够使用酶标仪实时监控生物传感器蛋白的切割-这将证实采用该测定进行进一步的高通量筛选的可行性。如图4A中所示，将300nMCFP-SNAP-25-YFP嵌合蛋白与10nM BoNT/A在96孔板中混合。在436nm处激发CFP，以30秒的间隔在90分钟内记录CFP通道(470nM)和YFP通道(527nM)的荧光。BoNT/A的加入导致YFP通道发射的减少和CFP通道发射的增加。该结果使得我们能够实时跟踪多个样品中肉毒杆菌神经毒素的酶促活性的动力学。例如，如图4B中所示，将不同浓度的BoNT/A或E加入至300nM CFP-SNAP-25-YFP，如图4A中所述同时监控各样品的FRET比率。FRET比率的变化与毒素的浓度相关-更高的毒素浓度导致更快的FRET比率的降低。FRET比率的该变化是特异性的，因为对于单独的CFP-SNAP-25-YFP(图4C，左图)或CFP与YFP的混合物(图4C，右图)未检测到显著的变化。
虽然在该阶段难以使FRET比率的变化与生物传感器蛋白的实际切割进行关联，但该方法仍然提供了同时比较多个样品间毒素切割动力学(当制备和扫描这些样品时)的最容易的方法-其特别适用于高通量筛选毒素的抑制剂，因为其可提供关于抑制剂影响毒素的酶促活性的机制的信息。我们注意到，在这些情况下，各动力学参数的单位可以是FRET比率而不是底物浓度。
通过将不同浓度的毒素与固定量的它们的靶生物传感器一起温育一定的时间来确定基于该FRET的测定的灵敏性。使用微量滴定板荧光分光光度计来记录FRET比率，并将其对毒素浓度作图。如图5A中所示，该方法对于BoNT/A和E(在4小时温育后)具有相似的灵敏性(对于BoNT/A的EC50是15pM，对于BoNT/E的EC50是20pM，上图)，进行16小时的温育稍微增加了检测灵敏性(图5A，下图)。对于BoNT/B和F的灵敏性彼此相近，但在4小时温育后比BoNT/A和E低大约10倍(图5B，上图，对于BoNT/B，EC50为242pM，对于BoNT/F，EC50为207pM)。温育期延长至16小时分别使检测BoNT/B和BoNT/F的活性的能力增加了8倍和2倍。
实施例4：监控活细胞中肉毒杆菌神经毒素的活性
基于CFP-YFP的生物传感器测定不仅可用于体外检测肉毒杆菌神经毒素，而且还可用于活细胞中。为了建立该应用，用CFP-SNAP-25-YFP转染PC12细胞。PC12细胞是能够吸收BoNT/A和E的神经内分泌细胞系。将转染的细胞与BoNT/A(50nM)一起温育72小时，然后使用配备有用于CFP-YFP FRET检测的专用滤光片组的落射荧光显微镜记录表达CFP-SNAP25-YFP的细胞的FRET比率。简而言之，将FRET比率计算为使用两个滤光片组(一个用于CFP(激发437nm/发射470nm)，另一个用于FRET(激发437nm/发射535nm))收集的来自相同细胞的图象的荧光强度之间的比率。收集总共53个细胞，将其与相同数目的对照细胞相比较，所述对照细胞表达相同生物传感器蛋白但不暴露于毒素。如图6A中所示，对于被检查的细胞群体，BoNT/A处理72小时显著降低FRET比率(p＜1.47E-05)。野生型PC12细胞对BoNT/B和F不敏感。
最近建立表达突触结合蛋白II(BoNT/B的受体)和CFP-SybII-YFP生物传感器的PC12细胞系。将此类细胞用于检测BoNT/B在活细胞中的作用。如图6B中所示，BoNT/B(30nM)处理72小时显著降低了细胞中表达的生物传感器蛋白的FRET比率(p＜2.1E-10)。我们注意到，仍然存在大量对于两种生物传感器蛋白未显示改变FRET比率的细胞。存在几种可能的解释。第一，毒素/生物传感器蛋白的比率在此类细胞中可能太低，从而生物传感器蛋白的显著切割可能需要更长的温育时间。第二，此类细胞可能具有高水平的蛋白质合成活性，因此新的生物传感器蛋白被快速合成来替代切割产物。然而，这些实验证实了在活细胞和神经元中采用基于该FRET的测定的可行性。
实施例5：BoNT的基于细胞的检测
为了进行基于细胞的研究，我们首先用CFP-SNAP-25(141-206)-YFP传感器转染PC12(图7a)。使用已建立的三滤光片组方法，如图2a中所示，用落射荧光显微镜获得活细胞中FRET的信号(Gordon，等人，Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements usingfluorescence microscopy.Biophys.J.74，2702-2713(1998)；和Sorkin等人，Interaction of EGF receptor and grb2 in living cells visualized byfluorescence resonance energy transfer(FRET)microscopy.Curr.Biol.10，1395-1398(2000)，如上文中在材料和方法部分所描述的。用50nMBoNT/A处理转染的PC12细胞，进行96小时。分析它们的荧光图象，将标准化的FRET比率(矫正的FRET/CFP)作图于图7b中。虽然报导SNAP-25(141-206)片段在体外具有与全长SNAP-25相似的毒素切割率(Washbourne等人，Botulinum neurotoxin types A and E require theSNARE motif in SNAP-25 for proteolysis.FEBS Lett.418，1-5(1997))，但CFP-SNAP-25(141-206)-YFP在活细胞中表现为不敏感的(poor)毒素底物。温育BoNT/A(50nM)96小时在细胞群体当中展示FRET比率的小(但显著的)偏移，这表明切割在细胞中是无效的，并且该传感器对于细胞中的毒素检测不实用。
令人惊讶地，我们发现使用全长SNAP-25作为CFP与YFP之间的连接体，尽管SNAP-25在长度上为206个氨基酸残基，当在PC12细胞中表达时产生显著水平的FRET(图7c和8c)。该FRET信号依赖于SNAP-25的膜锚着，因为导致蛋白质(称为CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP)的细胞溶质分布的SNAP-25内的棕榈酰化位点的突变(Cys 85、88、90、92Ala)(Lane&Liu，Characterization of the palmitoylation domain of SNAP-25.J.Neurochem.69，1864-1869(1997)；Gonzalo等人，SNAP-25 is targeted to the plasmamembrane through a novel membrane-binding domain.J.Biol.Chem.274，21313-21318(1999)；Koticha等人，Plasma membrane targeting ofSNAP-25increases its local concentration and is necessary for SNAREcomplex formation and regulated exocytosis.J.Cell Sci.115，3341-3351(2002)；Gonelle-Gispert等人，Membrane localization and biologicalactivity of SNAP-25 cysteine mutants in insulin-secreting cells.J.Cell Sci.113(Pt 18)，3197-3205(2000))显著地减少FRET信号(图7d)。该发现表明SNAP-25的膜锚着可导致使SNAP-25的N端和C端彼此靠近的构象变化。该传感器称为CFP-SNAP-25(FL)-YFP。表达CFP-SNAP-25(FL)-YFP的细胞与50nM BoNT/A的温育导致在一段时间内FRET比率的渐进降低(图7c，右图)。传感器的BoNT/A切割产生两个片段：保持在膜上的用CFP标记的SNAP-25的N末端片段(图2c，中图)和预期在毒素切割后重新分配入细胞溶质的用YFP标记的SNAP-25的短C末端片段。有趣地，我们注意到，C末端切割产物SNAP-25(198-206)-YFP在毒素切割后大量消失(图2c，中图的“YFP”图框)。该观察通过免疫印迹分析得到确认(图7e)，表明该可溶性片的段降解比保留在膜上的其他片段快得多。该预料之外的结果提供了通过只监控CFP与YFP荧光之间的比率来检测活细胞中毒素的活性的备选方法。
最近报导BoNT/A轻链包含膜定位信号并且在分化的PC12细胞中靶向质膜(Fernandez-Salas等人，Plasma membrane localization signals inthe light chain of botulinum neurotoxin.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101，3208-3213(2004)。因此，我们调查SNAP-25的膜锚着对于BoNT/A产生有效切割是至关重要的可能性。为了直接检测该想法，将CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP(其分布在细胞溶质中(图7d))和CFP-SNAP-25(FL)-YFP(其被锚着至质膜)用于转染PC12细胞，并且就BoNT/A在细胞中产生的切割平行地对其进行测定。如图7e中所示，细胞与BoNT/A一起温育导致大量的CFP-SNAP-25(FL)-YFP传感器被切割，然而在相同测定条件下不存在可检测的CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP的切割。
为了进一步确认该发现，我们还使用SNAP-25的短片段(残基83至120，其可将GFP靶向质膜)(Gonzalo等人，SNAP-25 is targeted to theplasma membrane through a novel membrane-binding domain.J.Biol.Chem.274，21313-21318(1999))(图8a)将含有SNAP-25(141-206)的无效传感器靶向质膜。如所预期的，CFP-SNAP-25(141-206)-YFP传感器至质膜的锚着导致由BoNT/A产生的有效切割(图8b)。这些发现显示SNAP-25的亚细胞定位确实对于BoNT/A在细胞中产生有效切割是至关重要的。
接着我们检测CFP-Syb(33-94)-YFP传感器是否可用于测定BoNT/B在细胞中的活性。为了进行此类研究，我们使用表达突触结合蛋白II的PC12细胞，所述突触结合蛋白II介导BoNT/B进入细胞(Dong等人Synaptotagmins I and II mediate entry of botulinum neurotoxin B into cells.J.Cell Biol.162，1293-1303(2003))。如图9a(上图)中所示，转染的CFP-Syb(33-94)-YFP是遍布于细胞的可溶性蛋白。与CFP-SNAP-25(141-206)-YFP的情况相似，BoNT/B(50nM，96小时)处理只稍微降低了FRET比率(图9a，下图)，这表明该传感器的切割在细胞中也是无效的。
我们对于BoNT/A传感器的经验促使我们研究Syb的亚细胞定位对于BoNT/B产生的Syb的切割是否是至关重要的。内源Syb在长度上为116个氨基酸残基，并且通过单个跨膜结构域(残基95-116，图9b)存在于分泌小泡上。为了确保恰当的小泡定位，我们将全长Syb用作CFP与YFP之间的连接体。因为CFP相对抗小泡腔中的酸性环境(Tsien，The greenfluorescent protein.Annu.Rev Biochem 67，509-544(1998)，因此将CFP融合至Syb的C端，并且预测其存在于小泡内部，同时将YFP融合至Syb的N端，其面向细胞溶质(图9b)。该传感器称为YFP-Syb(FL)-CFP。因为FRET不可能在此处的CFP与YFP之间发生，因此采用新的方法监控BoNT/B产生的切割。YFP-Syb(FL)-CFP传感器的切割可产生两个片段，包括用YFP标记的N末端部分，其可被释放入细胞溶质中，和用CFP标记的短C末端部分，其被限制在小泡内。因此，毒素活性将导致YFP荧光在细胞内的重新分布。已证明YFP-Syb(FL)-CFP在细胞中是有效的毒素传感器。如图9c中所指出的，使用BoNT/B的处理导致YFP与小泡分离和其至细胞溶质内的重新分布。我们注意到，可溶性YFP片段能够进入在毒素处理前其中没有荧光信号的细胞核(图9c)，从而提供了其中可容易地检测到YFP重新分布的区域。与FRET测定不同，该检测方法不需要CFP与YFP之间的短距离，从而提供了在活细胞中监控蛋白酶活性的新方法。
为了排除含有Syb(33-94)片段的传感器的无效切割是由于缺乏N末端32个氨基酸而引起的可能性，构建包含缺乏N末端32个氨基酸残基的Syb的截断形式的传感器(称为CFP-Syb(33-116)-YFP)。该传感器包含与无效传感器(残基33至94)相同的Syb的细胞溶质结构域和将其锚着至小泡的跨膜结构域(残基95至116)。当平行测定时，在48小时后，BoNT/B切割显著量的CFP-Syb(33-116)-YFP，然而不存在可检测的CFP-Syb(33-94)-YFP的切割(图9d)，这表明小泡定位决定细胞中的切割效率。该结论进一步得到最近的报导：带负电荷的脂质混合物的存在增加了BoNT/B、TeNT和BoNT/F体外切割Syb的速率(Caccin等人，VAMP/synaptobrevin cleavage by tetanus and botulinum neurotoxins is stronglyenhanced by acidic liposomes.FEBS Lett.542，132-136(2003)支持。毒素在细胞中可能有利于结合液泡膜，从而增加遇到定位在小泡上的Syb的机会。备选地，跨膜结构域的存在也可能对于维持Syb的恰当构象状态(所述状态是有效切割所必需的)是至关重要的。
使用全长SNAP-25和Syb II作为连接体提供了可反映活细胞中内源底物切割的优良的光学报告分子。这两种报告分子应当能够检测所有七种肉毒杆菌神经毒素和破伤风神经毒素(TeNT)。可通过改变长度或突变其他毒素切割或识别位点来容易地修饰底物连接体序列，从而获得对单个BoNT或TeNT的特异性检测。此类毒素生物传感器应当使得能够进行毒素抑制剂的基于细胞的筛选和细胞中毒素的底物识别和切割的研究。
上述描述和实施例只是提出来举例说明本发明的而不意欲限定本发明。因为包含本发明的精神和物质的公开的实施方案的变动对于本领域技术人员来说是可以发生的，因此本发明应当概括地解释为包括落在所述权利要求和其等价物的范围内的所有变化。所有上文中引用的和/或下面列出的参考文献明确地通过引用合并入本文。
对于本领域技术人员应当很显然的是除了已描述的修饰外的许多修饰是可能的，而不背离本文中的发明概念。因此，除了在所述权利要求的精神内，本发明的主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求中，应当以与上下文一致的最广泛的可能方式解释所有术语。特别地，术语“包含”和“包括”应当解释为是指以非排他的方式存在的元素、组分或步骤，表明提及及的元素、组成或步骤可与其他未明确提及的元素、组分或步骤一起存在，或利用或组合。在本说明书的权利要求提及至少一个选自A、B、C....和N的东西的情况下，正文应当解释为只需要一个来自组的元素，而非A+N或B+N等。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种构造物，其具有：
定位成提供电子耦合的供体标记和受体标记，这样供体可通过偶极-偶极耦合机制将能量转移至受体；和
置于供体与受体之间的连接体，其具有切割位点序列以及供体与切割位点序列和受体与切割位点序列的至少一个之间的间隔子；以及
其中相对于相应的无间隔子的构造物，间隔子具有的长度和序列能有效提高基于从供体标记能量转移到受体标记的测定的灵敏性。
2.权利要求1的构造物，其中供体和受体中的至少一个是荧光基团和生色团中的至少一个。
3.权利要求1的构造物，其中偶极-偶极耦合机制是
共振能量转移(FRET)。
4.权利要求1的构造物，其中连接体具有大于等于5nm的一级结构长度。
5.权利要求1的构造物，其中连接体具有大于等于8nm的一级结构长度。
6.权利要求1的构造物，其中连接体具有大于等于12nm的一级结构长度。
7.权利要求1的构造物，其中连接体包含具有至少3个氨基酸的间隔子。
8.权利要求7的构造物，其中连接体包含SNARE基序。
9.权利要求7的构造物，其中间隔子具有至少5个氨基酸。
10.权利要求7的构造物，其中间隔子包含(GGGGS)n，其中n是1至3。
11.权利要求7的构造物，其中间隔子包含(EAAAK)n，其中n是1至3。
12.权利要求1的构造物，其中间隔子包括至少10个氨基酸，并且相对于相应的无间隔子的构造物，间隔子增加电子耦合。
13.权利要求1的构造物，其中间隔子包含SNARE基序。
14.权利要求1的构造物，其中切割位点序列包含SNARE蛋白突变蛋白。
15.权利要求1的构造物，其中切割位点序列包括：
(a)SNARE蛋白、基序、突变蛋白的至少一个，和
(b)具有至少5个氨基酸的间隔子。
16.权利要求15的构造物，其中间隔子包括选自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中n是1至3。
17.权利要求1的构造物，其中构造物选自CFP-(SGLRSRA)-SNAP-25-(SNS)-YFP和CFP-(SGLRSRA)-小突触泡蛋白-(SNS)-YFP。
18.提高供体标记与受体标记之间的能量转移的灵敏性的方法，其包括：
提供包含通过连接体物理偶联的供体标记和受体标记的构造物；
在连接体中包含切割位点序列；和
在连接体中在供体与切割位点序列和受体与切割位点序列的至少一个之间包含间隔子，由此间隔子具有的长度和序列能有效增加供体与受体之间的电子耦合。
19.权利要求18的方法，其中构造物是基于蛋白质的构造物，并且连接体是肽序列。
20.权利要求18的方法，其中切割位点序列包括SNARE蛋白或其片段或突变蛋白，以及其中间隔子包含至少5个氨基酸。
21.权利要求18的方法，其中间隔子包括选自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中n是1至3。
22.权利要求18的方法，其中间隔子包括至少3个氨基酸，并且通过减少供体与受体之间的三级结构的距离来增加供体与受体之间的电子耦合。
23.权利要求18的方法，其中间隔子包括至少3个氨基酸，并且通过提供供体与受体之间的电子跃迁来增加供体与受体之间的电子耦合。
24.权利要求18的方法，其中将测定用于完整细胞。
25.用于检测肉毒杆菌神经毒素的方法，所述方法包括，
a)提供权利要求1的构造物，其中连接体是待检测的肉毒杆菌神经毒素的底物蛋白或其可切割片段，
b)将构造物在肉毒杆菌神经毒素在其下可切割底物蛋白或其片段的条件下暴露于怀疑含有肉毒杆菌神经毒素的样品，和
c)在将构造物暴露于样品之前和之后检测和比较FRET信号，其中FRET的减少表明样品中存在肉毒杆菌神经毒素。
Claims (25)
1.一种构造物，其具有：
定位成提供电子耦合的供体标记和受体标记，这样供体可通过偶极-偶极耦合机制将能量转移至受体；和
置于供体与受体之间的连接体，其具有切割位点序列以及供体与切割位点序列和受体与切割位点序列的至少一个之间的间隔子。
2.权利要求1的构造物，其中供体和受体中的至少一个是荧光基团和生色团中的至少一个。
3.权利要求1的构造物，其中偶极-偶极耦合机制是共振能量转移(FRET)。
4.权利要求1的构造物，其中连接体具有大于等于5nm的一级结构长度。
5.权利要求1的构造物，其中连接体具有大于等于8nm的一级结构长度。
6.权利要求1的构造物，其中连接体具有大于等于12nm的一级结构长度。
7.权利要求1的构造物，其中连接体包含具有至少3个氨基酸的间隔子。
8.权利要求7的构造物，其中连接体包含SNARE基序。
9.权利要求7的构造物，其中间隔子具有至少5个氨基酸。
10.权利要求7的构造物，其中间隔子包含(GGGGS)n，其中n是1至3。
11.权利要求7的构造物，其中间隔子包含(EAAAK)n，其中n是1至3。
12.权利要求1的构造物，其中相对于相应的无间隔子的构造物，间隔子增加电子耦合。
13.权利要求1的构造物，其中间隔子包含SNARE基序。
14.权利要求1的构造物，其中切割位点序列包含SNARE蛋白突变蛋白。
15.权利要求1的构造物，其中切割位点序列包括：
(a)SNARE蛋白、基序、突变蛋白的至少一个，和
(b)具有至少5个氨基酸的间隔子。
16.权利要求15的构造物，其中间隔子包括选自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中n是1至3。
17.权利要求1的构造物，其中构造物选自CFP-(SGLRSRA)-SNAP-25-(SNS)-YFP和CFP-(SGLRSRA)-小突触泡蛋白-(SNS)-YFP。
18.提高供体标记与受体标记之间的能量转移的灵敏性的方法，其包括：
提供包含通过连接体物理偶联的供体标记和受体标记的构造物；
在连接体中包含切割位点序列；和
在连接体中在供体与切割位点序列和受体与切割位点序列的至少一个之间包含间隔子，由此供体与受体之间的电子耦合得到增加。
19.权利要求18的方法，其中构造物是基于蛋白质的构造物，并且连接体是肽序列。
20.权利要求18的方法，其中切割位点序列包括SNARE蛋白或其片段或突变蛋白，以及其中间隔子包含至少5个氨基酸。
21.权利要求18的方法，其中间隔子包括选自(GGGGS)n和(EAAAK)n的序列，其中n是1至3。
22.权利要求18的方法，其中间隔子通过减少供体与受体之间的三级结构的距离来增加供体与受体之间的电子耦合。
23.权利要求18的方法，其中间隔子通过提供供体与受体之间的电子跃迁来增加供体与受体之间的电子耦合。
24.权利要求18的方法，其中将测定用于完整细胞。
25.用于检测肉毒杆菌神经毒素的方法，所述方法包括，
a)提供权利要求1的构造物，其中连接体是待检测的肉毒杆菌神经毒素的底物蛋白或其可切割片段，
b)将构造物在肉毒杆菌神经毒素在其下可切割底物蛋白或其片段的条件下暴露于怀疑含有肉毒杆菌神经毒素的样品，和
c)在将构造物暴露于样品之前和之后检测和比较FRET信号，其中FRET的减少表明样品中存在肉毒杆菌神经毒素。
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