JP2010539477A - 切断配列とスペーサーを用いた共鳴エネルギー転移アッセイ - Google Patents

Abstract

分子構築物は、ドナー標識、アクセプター標識、ドナーとアクセプターの間に配置されたリンカーペプチド（リンカーは、切断部位配列を有する。）及び（ａ）ドナーと切断部位配列及び（ｂ）アクセプターと切断部位配列の少なくとも１つの間のスペーサーを含む。好ましくは、構築物は、ＣＦＰ−（ＳＧＬＲＳＲＡ）−ＳＮＡＰ−２５−（ＳＮＳ）−ＹＦＰ及びＣＦＰ−（ＳＧＬＲＳＲＡ）−シナプトブレビン−（ＳＮＳ）−ＹＦＰからなる群から選択される。好ましい実施形態において、リンカーペプチドは、シナプトブレビン（ＶＡＭＰ）、シンタキシン及びＳＮＡＰ−２５又はボツリヌス神経毒素によって認識及び切断され得るこれらの断片からなる群から選択されるボツリヌス神経毒素の基質である。有利には、スペーサーは、スペーサーを持たない対応する構築物と比較して、ドナー標識とアクセプター標識間の電気的カップリングを増加させる。

Description

本願は、２００７年９月１４日に出願された仮出願６０／９７２６７３（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）の優先権を主張する。

（発明の分野）
本発明の分野は、ボツリヌス毒素及び破傷風毒素に関連するプロテアーゼアッセイのための蛍光共鳴エネルギー転移である。

ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ）は、クロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）によって産生され、公知の毒素の中で最も強力な毒素である。これらの毒素は、食中毒の有名な原因であり、しばしば、深刻な損害又は犠牲者の死をもたらす。構造的に関連した７つのボツリヌス神経毒素又は血清型が存在し（ＢｏＮＴ／ＡからＧ）、それらの各々が重鎖（約１００ＫＤ）及び軽鎖（約５０ＫＤ）から構成される。重鎖は、受容体によって媒介されるエンドサイトーシスを通じた標的細胞中への毒素の侵入を媒介する。一旦、内部に取り込まれると、軽鎖は、エンドソーム小胞の管腔からサイトゾル中へ転位され、小胞−標的膜融合を媒介するタンパク質（「基質タンパク質」）を切断するための亜鉛依存性プロテアーゼとして作用する。

これらのＢｏＮＴ基質タンパク質には、形質膜タンパク質であるシンタキシン、表在性膜タンパク質であるＳＮＡＰ−２５及び小胞膜タンパク質であるシナプトブレビン（Ｓｙｂ）が含まれる。これらのタンパク質は、ＳＮＡＲＥ（可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体）タンパク質と総称される。ＳＮＡＲＥタンパク質の切断は、形質膜との小胞融合を遮断し、神経筋接合部での神経伝達物質の放出を停止する。ＳＮＡＲＥタンパク質のうち、シンタキシン及びＳＮＡＰ−２５は、通常、標的膜上に存在し、従って、ｔ−ＳＮＡＲＥと称されるのに対して、シナプトブレビンは、シナプス内のシナプス小胞とともに専ら見出され、ｖ−ＳＮＡＲＥと称される。総合すると、これら３つのタンパク質は、小胞膜と形質膜間での融合を媒介する最小の機構と考えられている複合体を共同して形成する。ＢｏＮＴ／Ａ、Ｅ及びＣ^１は、単一の、但し異なる部位において、ＳＮＡＰ−２５を切断し、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｇは、シナプトブレビン（Ｓｙｂ）を切断する。ＢｏＮＴ／Ｃは、ＳＮＡＰ−２５の他に、シンタキシンも切断する。

食中毒の原因として、及び生物テロの武器としての脅威のため、ＢｏＮＴを感度よく、迅速に検出する必要が存在する。現在、毒素を検出するための最も感度が高い方法は、マウス中で毒素アッセイを行うことである。この方法は、大量のマウスを必要とし、時間がかかり、毒素の触媒速度論を研究するために使用することはできない。毒素に対する抗体の使用を基礎とする多数の増幅されたイムノアッセイ系も開発されているが、これらの系の多くは、複雑で高価な増幅プロセスを必要とし、毒素の触媒活性を研究するために使用することもできない。ＨＰＬＣ及びイムノアッセイは、切断された基質分子を検出し、これらの毒素の酵素活性を測定するために使用することができるが、これらの方法は、一般に、時間がかかり、複雑であり、そのうち幾つかは特殊な抗体を必要とするので、大規模なスクリーニングに適用することはできない。従って、ＢｏＮＴを検出するための改善された新しい方法及び組成物に対する要望が存在する。

ＦＲＥＴアッセイでは、毒素切断部位を含有する極めて短い合成ペプチド（２０から３５アミノ酸）中の２つの固有アミノ酸を置換するために、２つの蛍光発生性アミノ酸誘導体が使用される。ペプチド中において、あるアミノ酸誘導体と別のアミノ酸誘導体が近接したときに、あるアミノ酸誘導体の蛍光シグナルは別のアミノ酸誘導体によって消光され、この機序は、「フォスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ；Ｆｏｒｓｔｅｒ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）」と呼ばれる。ペプチドの切断は２つのアミノ酸誘導体を分離し、ＦＲＥＴの減少を検出することができる。

ＦＲＥＴアッセイは、ＢｏＮＴを検出するために首尾よく使用されてきた（例えば、２００３年１０月２８日に出願されたＣｈａｐｍａｎに対する米国特許出願２００４／０１９１８８７号、２００４年１２月２０日に出願されたＣｈａｐｍａｎに対する米国特許出願２００６／０１３４７２２号、Ｓｔｅｗａｒｄに対する米国特許第７，２０８，２８５号（２００７年４月）及びＦｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓに対する米国特許第７，１８３，０６６号（２００７年２月）（これらの各々は、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。組み込まれた参考文献中の用語の定義又は使用が本明細書中に挙げられているその用語の定義と一致せず、又は反対である場合には、本明細書中に挙げられているその用語の定義が適用され、参考文献中のその用語の定義は適用されない。）。

米国特許出願２００４／０１９１８８７号明細書 米国特許出願２００６／０１３４７２２号明細書 米国特許第７，２０８，２８５号明細書 米国特許第７，１８３，０６６号明細書

ＢｏＮＴの検出に対してＦＲＥＴアッセイを応用する上で幾らかの成功が示されてきたが、感度及び特異性が十分ではない。従って、改善された装置、システム及び方法が必要とされている。

本発明は、分子構築物がドナー標識、アクセプター標識、ドナーとアクセプターの間に配置されたリンカーペプチド（リンカーは、切断部位配列を有する。）及び（ａ）ドナーと切断部位配列及び（ｂ）アクセプターと切断部位配列の少なくとも１つの間のスペーサーを含む、装置、システム及び方法を提供する。

好ましい実施形態において、ドナー標識が、双極子−双極子カップリング機構によって、アクセプター標識へエネルギーを転移させることができるように、ドナー及びアクセプター標識は電気的カップリングを与えるように配置される。特に好ましい実施形態において、双極子−双極子カップリング機構は、フォスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）である。

ドナー及びアクセプター標識は、発色団又は蛍光団部分の何れかであり得、ドナー標識の発光スペクトルはアクセプター標識の励起スペクトルと重複する。好ましくは、ドナーは、緑色蛍光タンパク質又はその変形物であり、アクセプターは、緑色蛍光タンパク質の対応する変形物である。本発明のために特に好ましいドナー及びアクセプター標識（蛍光団の対）は、ＣＦＰ−ＹＦＰである。

好ましい実施形態において、リンカーペプチドは、シナプトブレビン（ＶＡＭＰ）、シンタキシン及びＳＮＡＰ−２５又はボツリヌス神経毒素によって認識及び切断され得るこれらの断片（「切断可能断片」）からなる群から選択されるボツリヌス神経毒素の基質である。これらのタンパク質は、ＳＮＡＲＥ（可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体）タンパク質と総称される。リンカーは、例えば、５ｎｍ、８ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１４ｎｍ及び２０ｎｍに等しい又はそれ以上など、あらゆる適切な長さの一次構造長を有し得る。

特に好ましい実施形態において、完全な構築物は、ＣＦＰ−（ＳＧＬＲＳＲＡ）−ＳＮＡＰ−２５−（ＳＮＳ）−ＹＦＰ又はＣＦＰ−（ＳＧＬＲＳＲＡ）−シナプトブレビン−（ＳＮＳ）−ＹＦＰを含む。

一実施形態において、リンカーペプチドは、少なくとも約１４のアミノ酸残基及び配列番号１から６（以下に論述されている。）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態において、リンカーペプチドは、少なくとも約１５又は少なくとも約１６又は少なくとも約１７又は少なくとも約１８又は少なくとも約１９又は少なくとも約２０又は少なくとも約２１又は少なくとも約２２又は少なくとも約２３又は少なくとも約２４又は少なくとも約２５又は少なくとも約２６又は少なくとも約２７又は少なくとも約２８又は少なくとも約２９のアミノ酸残基を含み、配列は、配列番号１から６（以下に論述されている。）からなる群から選択される。

好ましい実施形態において、リンカーペプチドは、少なくとも約３０のアミノ酸残基及び配列番号１から６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、リンカーペプチドは、少なくとも約３５のアミノ酸残基、又は少なくとも約４０のアミノ酸残基、又は少なくとも約４５のアミノ酸残基、又は少なくとも約５０のアミノ酸残基を含む。特に好ましい実施形態において、本発明の構築物は、少なくとも約５５のアミノ酸残基又は少なくとも約６５のアミノ酸残基を含むリンカーペプチドを含む。

本発明の切断部位配列は、（ａ）ＳＮＡＲＥタンパク質、モチーフ、変異タンパク質及び（ｂ）少なくとも５つのアミノ酸を有するスペーサー（スペーサーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ及び（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎは、１から３である。）からなる群から選択される配列を含む。）を有利に含み得る。

本明細書において、タンパク質の「変異タンパク質」は、例えば、原型タンパク質と少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％の同一性を有する組成物など、対応する原型タンパク質と少なくとも３０％の同一性を有するものと解釈されなければならない。同一性からの変動は、付加、欠失及び置換の何れか又はそれ以上を含み得る。想定される変異タンパク質には、断片、末端切断物及び融合タンパク質が含まれる。

本発明のスペーサーは、アミノ酸のあらゆる適切な数を有し得るが、好ましくは、少なくとも３、５、７、１０、１２又は１５のアミノ酸を有し得る。スペーサーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ及び（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎは、１から３である。）からなる群から選択される配列を含み得る。あるいは、スペーサーは、ＳＮＡＲＥモチーフを含み得る。有利には、スペーサーのこのような構成は、スペーサーを持たない対応する構築物と比較して、ドナー標識とアクセプター標識間の電気的カップリングを増加させる。

さらに、本発明は、上記構築物をコードする単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。構築物は、好ましくは、プロモーターに作用可能に連結されたポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターである。本発明の好ましいプロモーターは、誘導性プロモーターである。

本発明は、上記単離されたポリヌクレオチド分子を含む細胞も提供する。一実施形態において、細胞は、初代培養された神経細胞、ＰＣ１２細胞又はその誘導物、初代培養されたクロマフィン（ｃｈｒｏｍａｐｈｉｎ）細胞、神経芽細胞腫細胞、ヒトアドレナリン作動性ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞及びＮＳ−２６細胞株からなる群から選択される。好ましくは、細胞は、皮質神経細胞、海馬神経細胞、脊髄運動神経細胞又はマウスコリン作動性Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞である。

さらなる実施形態において、本発明は、適切な容器中に本発明の構築物を含むキットを提供する。

ドナー標識とアクセプター標識間のエネルギー転移の感度を向上させる、想定される方法は、（ａ）リンカーを通じて物理的に結合されたドナー標識とアクセプター標識を含む構築物を準備すること（（ａ）リンカー中に切断部位配列を含み、及び（ｂ）ドナーと切断部位配列及びアクセプターと切断部位配列の少なくとも１つの間に、リンカー中にスペーサーを含むことにより、ドナーとアクセプター間の電気的カップリングが増加される。）を含む。本明細書において想定される構築物は、完全な細胞、可溶化液又は活性なペプチダーゼを含むあらゆる物質に対して適用することができる。

何らかの特定の理論又は作用機序に拘泥することを望むものではないが、スペーサーは、ドナーとアクセプター間の電気的カップリングを増加させることによって感度及び特異性を向上させ、次いで、電気的カップリングの増加は、（ａ）ドナーとアクセプター間の三次構造の距離を減少させ、及び（ｂ）ドナーとアクセプター間の電気的跳躍（ｈｏｐ）を与えることによって引き起こされる。

好ましい実施形態において、構築物はタンパク質を基礎とする構築物であり、リンカーはペプチド配列であり、切断部位配列はＳＮＡＲＥタンパク質又はその断片若しくは変異タンパク質を含み、及びスペーサーは少なくとも３、５、７、１０、１２及び１５アミノ酸を含む。スペーサーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ及び（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎは、１から３である。）からなる群から選択される配列を含み得る。

（ａ）本明細書に上記されている構築物を準備すること（リンカーは、基質タンパク質であり、又は検出されるべきボツリヌス神経毒素に対応する切断可能なその断片である。）、（ｂ）ボツリヌス神経毒素はタンパク質基質又はその断片を切断する条件下で、ボツリヌス神経毒素を含有すると疑われる試料に前記構築物を曝露すること、並びに（ｃ）構築物が試料に曝露される前及び後に、ＦＲＥＴシグナルを検出及び比較することを含み、ＦＲＥＴの減少が試料中のボツリヌス神経毒素の存在を示唆する、ボツリヌス神経毒素を検出する方法も本明細書に開示される。好ましい実施形態において、さらなるＺｎ^２＋が検出されるべき試料に添加される。本発明の方法は、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｅ及びＣからなる群から選択されるボツリヌス神経毒素の検出に適しており、対応する基質タンパク質はＳＮＡＰ−２５又は切断可能なその断片である。本発明の方法は、対応する基質タンパク質として、シナプトブレビン（Ｓｙｂ）又は切断可能なその断片を用いて、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、Ｆ又はＧを検出するのにも適している。同様に、本発明の方法は、対応する基質タンパク質として、ＳＮＡＰ−２５又は切断可能なその断片を用いてＢｏＮＴ／Ｃを検出するのに適している。

好ましい実施形態において、本発明の方法に関して、ＦＲＥＴは、１）アクセプター（Ａ）発光波長及びドナー（Ｄ）発光波長で発光された蛍光を測定し、それぞれの発光の大きさの比によってエネルギー転移を測定すること；２）Ｄの蛍光寿命を測定すること；３）Ｄの光退色速度を測定すること；４）Ｄ又はＡの異方性を測定すること；及び５）Ｓｔｏｋｅｓシフト単量体／励起二量体蛍光を測定することからなる群から選択される方法によって検出される。

本発明は、上記構築物を発現するように遺伝子操作された細胞を準備すること（構築物中のリンカーは、ボツリヌス毒素に対応する基質ペプチドである。）；候補阻害剤化合物の存在下で、ボツリヌス神経毒素に前記細胞を曝露すること；並びにボツリヌス毒素への前記曝露前及び後に、細胞のＦＲＥＴシグナルを検出することを含み、候補阻害剤の不存在下でのボツリヌス神経毒素に曝露された細胞と比べて、ＦＲＥＴの減少が実質的に観察されないことが、候補阻害剤がボツリヌス神経毒素を阻害できることを示唆する、ボツリヌス神経毒素の阻害剤をスクリーニングする方法も提供する。好ましくは、候補化合物は、化合物のライブラリーに属し、前記方法は高処理量の方法である。

さらなる実施形態において、本発明は、ＢｏＮＴ標的ペプチドの層を金属表面上に堆積させること、ＢｏＮＴが金属表面上の標的ペプチドを切断できる条件下で、その表面上にＢｏＮＴ標的ペプチドを有する前記金属表面を対応するＢｏＮＴを含有すると疑われる試料に曝露すること、及び表面プラズモン共鳴画像化を介して、ＢｏＮＴ切断の結果としての金属表面に結合された標的ペプチドの分子量の何らかの減少を測定することを含む、ボツリヌス神経毒素を検出する方法を提供する。

本発明の別の実施形態は、ａ）本明細書中に記載されている構築物を準備すること（リンカーは、検出されるべきボツリヌス神経毒素に対応する基質タンパク質又は切断可能なその断片であり、及びリンカータンパク質が、ドナーとアクセプター蛍光団の間でＦＲＥＴが生じる立体配置を採るように、構築物が細胞の形質膜に繋着されている。）、ｂ）ボツリヌス神経毒素がタンパク質基質又はその断片を切断する条件下で、ボツリヌス神経毒素を含有すると疑われている試料に構築物を曝露すること、並びにｃ）構築物が試料に曝露される前及び後に、ＦＲＥＴシグナルを検出及び比較することを含み、ＦＲＥＴの減少が試料中のボツリヌス神経毒素の存在を示唆する、ボツリヌス神経毒素を検出する方法である。

さらに、本発明は、リンカーペプチド、第一の蛍光団部分及び第二の蛍光団部分を含み、前記リンカーペプチドがシナプトブレビン、シンタキシン及びＳＮＡＰ−２５又はボツリヌス神経毒素によって切断され得るこれらの断片からなる群から選択されるボツリヌス神経毒素の基質であり、並びに第一の蛍光団部分の発光スペクトルが第二の蛍光団部分の励起スペクトルと検出可能に異なる、分子構築物を提供する。好ましくは、リンカーは、基質シナプトブレビン、シンタキシン又はＳＮＡＰ−２５の完全長タンパク質である。好ましくは、構築物は、細胞内に存在してもよく、又は存在しなくてもよい小胞に繋着される。さらに、本発明は、上記ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド構築物を提供する。

さらに、本発明は、ａ）上記ペプチド構築物を準備すること、ｂ）ボツリヌス神経毒素がタンパク質基質又はその断片を切断する条件下で、ボツリヌス神経毒素を含有すると疑われる試料に構築物を曝露すること、及びｃ）第一及び第二の蛍光団の蛍光シグナルの空間的分離を検出することを含み、空間的分離の発生が試料中のボツリヌス神経毒素の存在を示唆する、ボツリヌス神経毒素を検出する方法を提供する。好ましくは、小胞は生きた細胞内部に存在し、リンカーペプチドはＳＮＡＰ−２５（１９８−２０６）−ＹＦＰに連結されたＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（１−１９７）であり、ＣＦＰ蛍光が検出されるが、ＹＦＰ蛍光が検出されないことが、試料中におけるボツリヌス神経毒素の存在の存在を示唆する。

本発明の主題の様々な目的、特徴、態様及び利点が、類似の数値が類似の要素を表す添付の図面と合わせて、好ましい実施形態の以下の詳細な記述からさらに明らかとなる。

図１は、ボツリヌス神経毒素プロテアーゼ活性をモニタリングするための、ＣＦＰ−ＹＦＰを基礎とするバイオセンサーの模式図である。図１Ａは、バイオセンサー構築物の構成である。ＣＦＰ及びＹＦＰは、それぞれ、シナプトブレビン（アミノ酸３３から９４、上図）又はＳＮＡＰ−２５（アミノ酸１４１から２０６、下図）の断片を介して接続されている。これらの断片上の各ボツリヌス神経毒素に対する切断部位が標識されている。図１Ｂは、ＣＦＰの励起がＹＦＰ蛍光発光をもたらすＦＲＥＴに対するドナー−アクセプター対としてＣＦＰ及びＹＦＰが機能することを示す（上図）。連結されたＣＦＰとＹＦＰ間でのエネルギー転移は、ボツリヌス神経毒素によるシナプトブレビン又はＳＮＡＰ−２５断片の切断後に消失する（下図）。ＣＦＰに対する最適な励起波長は４３４ｎｍであり、発光ピークは、ＣＦＰに関して４７０ｎｍ及びＹＦＰに対して５２７ｎｍである。 図２は、組換えバイオセンサータンパク質の蛍光発光スペクトルを示す。図２Ａは、組換えヒス_６タグ付加ＣＦＰ及びＹＦＰのみ（３００ｎＭ）並びにこれら２つのタンパク質の混合物（１：１）の発光スペクトルを示す。Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭＨｅｐｅｓ、２ｍＭＤＴＴ及び１０μｍＺｎＣｌ_２、ｐＨ７．１）中で、ＰＴＩＱＭ−１蛍光光度計を用いて、４５０から５５０ｎｍまで蛍光シグナルを収集した。励起波長は、ＣＦＰに対して最適な４３４ｎｍである。ＹＦＰタンパク質は、４３４ｎｍでの直接励起によって、小さな蛍光発光シグナルを生じるに過ぎない。図２Ｂは、パネル図２Ａ中に記載されているように収集された組換えｈｉｓ_６タグ付加ＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰの発光スペクトルを示す。矢印は、ＦＲＥＴから得られたＹＦＰ発光ピークを示す。 図３は、ボツリヌス神経毒素によるバイオセンサータンパク質の切断が、インビトロでのリアルタイムの発光スペクトルスキャンによってモニターされ得ることを図示している。Ａ）３７℃で３０分間、２ｍＭＤＴＴ、１０μＭＺｎＣｌ_２を用いて、ＢｏＮＴ／Ｂを予め還元した。Ｈｅｐｅｓ緩衝液（５０ｍＭＨｅｐｅｓ、２ｍＭＤＴＴ、１０μＭＺｎＣｌ_２）中に３００ｎＭＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰタンパク質を含有するキュベット中に、５０ｎＭ毒素を添加した。毒素を添加する前及び後の表記時点で、図２Ａに記載されているように発光スペクトルを記録した（上図）。各発光スキャン後に、試料３０μＬをキュベットから採取し、ＳＤＳ搭載緩衝液と混合した。これらの試料をＳＤＳ−ｐａｇｅ及び強化化学発光（ＥＣＬ）に供した。融合タンパク質Ｎ末端のｈｉｓ_６タグを認識する抗ｈｉｓ_６抗体を用いて、ＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰ融合タンパク質の切断を検出した（下図）。ＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰ融合タンパク質の切断は、減少したＹＦＰ蛍光及び増加したＣＦＰ蛍光をもたらした。発光スペクトルスキャンによって、この変化をリアルタイムに記録した。Ｂ）パネルＡに記載されているようにＢｏＮＴ／Ｆ活性を検査するために、ＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰを使用した。Ｃ）パネルＡに記載されているように、ＢｏＮＴ／Ａ活性を検査するために（１０ｎＭ毒素を使用した。）、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰを使用した。Ｄ）パネルＡに記載されているように、ＢｏＮＴ／Ｅ活性を検査するために（１０ｎＭ毒素を使用した。）、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰを使用した。 図４は、マイクロプレート分光蛍光光度計中でのバイオセンサータンパク質を用いたボツリヌス神経毒素プロテアーゼ速度論のモニタリングを示す。Ａ）ボツリヌス神経毒素によるバイオセンサータンパク質の切断中の蛍光変化は、プレートリーダーを用いてリアルタイムで記録することができた。３００ｎＭＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰと１０ｎＭＢｏＮＴ／Ａを混合し、プレートリーダーを用いて、１００μＬ／ウェルの試料をスキャンした。励起は４３４ｎｍであり、各データ点に関して、４７０ｎｍの発光値（ＣＦＰチャンネル）及び５２７ｎｍ（ＹＦＰ又はＦＲＥＴチャンネル）を集めた。データ点当り３０秒の間隔で、反応を１時間半追跡した。ＹＦＰ蛍光の減少及びＣＦＰ蛍光の増加がリアルタイムでモニターされた。Ｂ）切断の速度は、神経毒素の濃度に依存する。バイオセンサータンパク質の同じ量を切断する能力に関して、ボツリヌス神経毒素Ａ及びＥの様々な濃度を検査した。同じデータ点でのＹＦＰ発光シグナルとＣＦＰ発光シグナル間の比によって、ＦＲＥＴシグナルの変化（ＦＲＥＴ比）を測定する。Ｃ）内部対照として、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰタンパク質のみ及びＣＰＦ／ＹＦＰタンパク質混合物（１：１）を同時にスキャンした。 図５は、プレートリーダーを用いたバイオセンサーアッセイの感度を示す。Ａ）９６ウェルプレート中のＢｏＮＴ／Ａ又はＥの様々な濃度と３００ｎＭＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰを混合した。総容積は、１００μＬ／ウェルである。プレートを３７℃で４時間温置し、次いで、プレートリーダーを用いてスキャンした（上図）。毒素濃度の対数値に対して、ＦＲＥＴ比をプロットした。各曲線に対するＥＣ５０値が、下図の表中に列記されている。各データ点は、３つの独立した実験の平均を表す。Ｂ）ＢｏＮＴ／Ｂ又はＦの様々な濃度と３００ｎＭＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰを混合した。データを収集し、パネルＡ中に記載されているようにプロットした。 図６は、生きた細胞中でのボツリヌス神経毒素活性のモニタリングを図示する。Ａ）野生型ＰＣ１２細胞中で、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰを発現させた。細胞内のＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰ切断に起因するＦＲＥＴ比の変化を記録することによって、ＢｏＮＴ／Ａ（５０ｎＭ）の侵入及び触媒活性をモニターした。ＦＲＥＴ比は、合計５３の毒素処理された細胞及び５３の対照細胞から平均を求めた。ＢｏＮＴ／Ａでの７２時間の処理は、有意な程度で、細胞の全集団のＦＲＥＴ比を低下させた（Ｐ＜１．４７Ｅ−５）。Ｂ）ｓｙｔＩＩを発現するＰＣ１２細胞に、ＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰを形質移入し、ＢｏＮＴ／Ｂ（３０ｎＭ）で処理した。パネル（Ａ）におけるように、ＦＲＥＴ比の変化を記録することによって、ＢｏＮＴ／Ｂの侵入及び触媒活性をモニターした。７３の毒素処理された細胞及び７３の対照細胞を分析した。ＢｏＮＴ／Ｂでの７２時間の処理は、有意な程度で、細胞の全集団のＦＲＥＴ比を低下させた（Ｐ＜２Ｅ−１０）。 図７は、本発明を使用した生きた細胞中でのＢｏＮＴ／Ａ活性のモニタリングを示す。（ａ）生きた細胞中での毒素センサーのＦＲＥＴシグナルの測定。ＰＣ１２細胞を形質移入するために、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（１４１−２０６）−ＹＦＰを使用した。このセンサーは、細胞中で可溶性であるように見受けられた。正確に同じ設定を用いて、順次、各細胞に対して異なるフィルターの組（ＣＦＰ、ＦＲＥＴ及びＹＦＰ）を用いた３つの画像を撮影した。左側の索引表中に示されているように、任意単位での蛍光強度を反映するために、画像は色分けした。方法中に詳述されているように、ＦＲＥＴフィルターの組を用いて収集されたシグナルからＣＦＰ及びＹＦＰの両方から得られたクロストークを差し引くことによって、補正されたＦＲＥＴ値を計算した。（ｂ）ＢｏＮＴ／Ａ活性を検出するために、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（１４１−２０６）−ＹＦＰが形質移入されたＰＣ１２細胞を使用した。５０ｎＭＢｏＮＴ／Ａホロ毒素を培地に添加し、９６時間後に、８０の細胞を分析した。ＣＦＰ蛍光シグナルに対して、補正されたＦＲＥＴシグナルを標準化し、表記瓶を有するヒストグラムとしてプロットした。対照細胞には、同じセンサーを形質移入したが、毒素での処理は行わず、平行して分析した。ＢｏＮＴ／Ａとの温置は、細胞集団の間でＦＲＥＴ比（補正されたＦＲＥＴ／ＣＦＰ）をシフトさせ、細胞中のＢｏＮＴ／Ａによって、センサータンパク質を切断したことを示唆する。しかしながら、シフトは小さく、切断は細胞内において効率的でないことを示唆した。（ｃ）。左図：完全長ＳＮＡＰ−２５（アミノ酸１から２０６）を通じて、ＣＦＰとＹＦＰを連結することによって、効率的な毒素センサーを構築し、細胞中でのＢｏＮＴ／Ａ活性の検出に関して検査した。このＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（ＦＬ）−ＹＦＰ融合タンパク質は、その４つのシステインにおいて、パルミトイル化を介して、細胞中の形質膜へ主として局在している（左図、中央図の上側の枠）。中央図：ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（ＦＬ）−ＹＦＰセンサーをＰＣ１２細胞に形質移入し、ＢｏＮＴ／Ａ活性を検出するために使用した。５０ｎＭＢｏＮＴ／Ａホロ毒素を培地に添加し、パネル（ａ）中に記載されているように、４８及び９６時間後に、２００個の細胞のＦＲＥＴシグナルを分析した。対照細胞には、毒素センサーを形質移入したが、毒素での処理は行わず、平行して分析した。代表的な細胞の画像を中央図中に示した。このセンサーは、有意なＦＲＥＴを与えた（中央図の上側の「補正されたＦＲＥＴ」枠）。細胞をＢｏＮＴ／Ａで処理した後に、ＦＲＥＴシグナルは消失した（９６時間、中央図の下側の「補正されたＦＲＥＴ」枠）。注：切断産物の一つであるＹＦＰがタグ付加されたＳＮＡＰ−２５のＣ末端は、毒素切断後に分解された。従って、ＹＦＰの蛍光シグナルは、毒素処理された細胞中において著しく減少した（下側の「ＹＦＰ」枠）。右図：パネル（ｂ）において記載されているように、表記瓶を有するヒストグラムとして、ＦＲＥＴ比をプロットする。（ｄ）ＰＣ１２細胞にＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（Ｃｙｓ−Ａｌａ）−ＹＦＰを形質移入した（Ｃｙｓ８５、８８、９０、９２にＡｌａ変異を有する完全長ＳＮＡＰ−２５、左図）。このタンパク質は、サイトゾル全体に散在性に分布し、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（ＦＬ）−ＹＦＰ（右図、「補正されたＦＲＥＴ」枠）に対して観察された強いＦＲＥＴシグナルを欠如していた。（ｅ）ＰＣ１２細胞に、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（ＦＬ）−ＹＦＰ及びＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（Ｃｙｓ−Ａｌａ）−ＹＦＰを形質移入した。次いで、ＢｏＮＴ／Ａあり（＋、完全な状態の細胞）又はなし（−、完全な状態の細胞）（５０ｎＭ、７２時間）で細胞を処理し、採集した。また、ＢｏＮＴ／Ａに曝露されていない試料から得られた細胞抽出物の半分は、還元されたＢｏＮＴ／Ａあり（＋、インビトロ）又はなし（−、インビトロ）とともに、インビトロで温置され（２００ｎＭ、３０分、３７℃）、切断産物を示すための対照としての役割を果たした（２つの切断産物が、矢印によって示されている。）。各試料の同じ量（細胞可溶化液３０μｇ）を１つのＳＤＳ−ｐａｇｅゲルに搭載し、抗ＧＦＰ抗体を用いたイムノブロット分析に供した。ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（ＦＬ）−ＹＦＰは完全な状態の細胞中で有意な切断を行ったが、細胞中でのＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（Ｃｙｓ−Ａｌａ）−ＹＦＰの検出可能な切断は存在せず、生きた細胞中でのＢｏＮＴ／Ａによる効率的な切断のために、膜の繋着が重要であることを示唆している。注：毒素処理された細胞中には、１つの切断産物（ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（１−１９７））のみが検出され、他の切断産物（ＳＮＡＰ−２５（１９８−２０６）−ＹＦＰ）は細胞中で殆ど分解されたことを示唆している。 図８は、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（１４１−２０６）−ＹＦＰセンサーを形質膜に繋着することによって、細胞中のＢｏＮＴ／Ａによって効率的に切断されたセンサーが作製されることを示す。（ａ）形質膜へＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（１４１−２０６）−ＹＦＰを標的化するために構築された構築物の模式的な記載。パルミトイル化部位（残基８３から１２０）を含有するＳＮＡＰ−２５の断片をＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（１４１−２０６）−ＹＦＰセンターのＮ末端に融合し、この断片は、融合タンパク質を形質膜へ標的化した。（ｂ）ＰＣ１２細胞をＳＮＡＰ−２５（８３−１２０）−ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（１４１−２０６）−ＹＦＰで形質移入した。５０ｎＭＢｏＮＴ／Ａホロ毒素を培地に添加し、図７ａ中に記載されているように、９６時間後に、８０個の細胞のＦＲＥＴシグナルを分析した。対照細胞には、毒素センサーを形質移入したが、毒素での処理は行わず、平行して分析した。代表的な細胞の画像が左図中に示されている。このセンサーは、有意なＦＲＥＴを与えた（左図の上側の「補正されたＦＲＥＴ」枠）。細胞をＢｏＮＴ／Ａで処理した後に、ＦＲＥＴシグナルは低下した（９６時間、左図の下側の「補正されたＦＲＥＴ」枠）。右図：図７ｂにおいて記載されているように、表記瓶を有するヒストグラムとして、細胞のＦＲＥＴ比をプロットする。（ｃ）様々なＣＦＰ／ＹＦＰ構築物で、ＰＣ１２細胞を形質移入し、図７ａに記載されているように、対応するＦＲＥＴ比を測定した。細胞中でのＣＦＰ及びＹＦＰの同時発現は、本発明者らのアッセイ条件下で有意なＦＲＥＴをもたらさなかった。ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（ＦＬ）−ＹＦＰはＦＲＥＴの有意なレベルを示したのに対して、可溶性ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（Ｃｙｓ−Ａｌａ）−ＹＦＰは示さなかった。 図９は、ＢｏＮＴ／ＢによるＳｙｂの効率的な切断には、Ｓｙｂの小胞への局在化が必要とされることを示す、（ａ）シナプトタグミンＩＩを安定に発現するＰＣ１２細胞株を形質移入するために、ＣＦＰ−Ｓｙｂ（３３−９４）−ＹＦＰを使用した（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ ｍｅｄｉａｔｅ ｅｎｔｒｙ ｏｆ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ．Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６２，１２９３−１３０３（２００３））。このセンサーは、細胞内において可溶性であるように見受けられ、強いＦＲＥＴシグナルを生成する（上図）。ＢｏＮＴ／Ｂ活性を検出するために、ＣＦＰ−Ｓｙｂ（３３−９４）−ＹＦＰが形質移入されたＰＣ１２細胞を使用した。５０ｎＭＢｏＮＴ／Ｂホロ毒素を培地に添加し、図７ｂに記載されているように、９６時間後に、８０個の細胞を分析した。対照細胞には、同じセンサーを形質移入したが、毒素での処理は行わず、平行して分析した。ＢｏＮＴ／Ｂとの温置は、細胞集団の間でＦＲＥＴ比をシフトさせ、細胞中のＢｏＮＴ／Ｂによって、センサータンパク質が切断されたことを示唆した。しかしながら、シフトは小さく、切断は細胞内において効率的でないことを示唆した。（ｂ）ＹＦＰ−Ｓｙｂ（ＦＬ）−ＣＦＰセンサーの模式的な記載。完全長Ｓｙｂは１１６のアミノ酸を含有し、単一の膜貫通ドメインを通じて、小胞に局在化されている。ＢｏＮＴ／ＢによるＳｙｂの切断は、ＹＦＰがタグ付加されたＳｙｂの細胞質ドメインを小胞から放出させた。（ｃ）シナプトタグミンＩＩを安定に発現するＰＣ１２細胞にＹＦＰ−Ｓｙｂ（ＦＬ）−ＳＦＰを形質移入し、ＢｏＮＴ／Ｂ（５０ｎＭ、４８時間、下側の枠）あり又は毒素なし（対照、上側の枠）で処理した。各細胞に対して、ＣＦＰ及びＹＦＰ蛍光画像を収集し、代表的な細胞が示されている。このセンサーは、小胞に局在化されており、ＣＦＰ及びＹＦＰ蛍光シグナルの両方によって証明されたように、生きた細胞中の核から排除されていた（上側の枠）。ＢｏＮＴ／Ｂ処理は、ＹＦＰシグナルの再分配をもたらし、これにより、サイトゾル中において可溶性となり、核に入った。（ｄ）ＣＦＰ及びＹＦＰを連結するために、Ｓｙｂ残基３３から１１６の末端切断された様式を使用した。この構築物は、可溶性センサーＣＦＰ−Ｓｙｂ（３３−９６）−ＹＦＰ中のＳｙｂ断片として、同じサイトゾル領域（残基３３から９４、パネル（ｂ））を含有し、Ｓｙｂの膜貫通ドメインも含有する。シナプトタグミンＩＩを発現するＰＣ１２細胞を、ＣＦＰ−Ｓｙｂ（３３−１１６）−ＹＦＰ及びＣＦＰ−Ｓｙｂ（３３−９４）−ＹＦＰで形質移入した。次いで、ＢｏＮＴ／Ｂあり（＋、完全な状態の細胞）又はなし（−、完全な状態の細胞）（５０ｎＭ、４８時間）で細胞を処理し、採集した。ＢｏＮＴ／Ｂに曝露されなかった試料から得られた細胞抽出物の半分は、インビトロにおいて、還元されたＢｏＮＴ／Ｂあり（＋、インビトロ）又はなし（−、インビトロ）に温置した（２００ｎＭ、３０分、３７℃）。２つの切断産物は、アスタリスクによって示されている。各試料の同じ量（細胞可溶化液３０μｇ）を１つのＳＤＳ−ｐａｇｅゲルに搭載し、抗ＧＦＰ抗体を用いたイムノブロット分析に供した。ＣＦＰ−Ｓｙｂ（３３−１１６）−ＹＦＰは完全な状態の細胞中で有意な切断を行ったが、ＣＦＰ−Ｓｙｂ（３３−９４）−ＹＦＰの検出可能な切断は存在せず、生きた細胞中でのＢｏＮＴ／Ｂによる効率的な切断のために、小胞への局在化が重要であることを示唆している。 図１０は、ドナー標識とアクセプター標識の間に配置された切断部位配列を含むリンカーを有する従来の構築物を図示する模式図である。 図１１ａは、切断部位配列とスペーサーを含むリンカーを有し、スペーサーが切断部位配列とアクセプター標識の間に配置されている本発明の構築物の一実施形態を図示する模式図である。 図１１ｂは、切断部位配列とスペーサーを含むリンカーを有し、スペーサーがドナー標識と切断部位配列の間に配置されている本発明の構築物の別の実施形態を図示する模式図である。 図１１ｃは、切断部位配列とスペーサーを含むリンカーを有し、スペーサーがドナー標識と切断部位配列及び切断部位配列とアクセプター標識の間に配置されている本発明の構築物の別の実施形態を図示する模式図である。 図１２は、本発明の構築物を用いてドナー標識とアクセプター標識の間でのエネルギー転移の感度を向上させる方法の工程を示すブロック図である。 図１３は、本発明の構築物を用いてボツリヌス神経毒素を検出するための方法の工程を示すブロック図である。

本発明は、ＢＯＮＴの基質であり、並びに、好ましくはリアルタイムで、ボツリヌス神経毒素を検出し、及びボツリヌス神経毒素の基質切断活性をモニターするために、毒素によって切断され得るペプチドリンカーによって連結された蛍光団間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を基礎とする新規組成物及び方法を提供する。本発明の方法及び組成物は、数時間以内にｐＭレベルのＢｏＮＴの検出を可能とし、毒素の酵素的速度論をリアルタイムに追跡することができる。さらに、前記方法及び組成物は、培養された細胞を用いた毒素細胞侵入及び小胞膜を通じた転位の阻害剤などの毒素阻害剤の大規模なスクリーニングのための高処理量アッセイ系において使用することができる。本発明は、生きた細胞及び神経細胞中でボツリヌス神経毒素活性をモニタリングするのにも適している。

別の実施形態において、本発明は、リンカーとして完全長ＳＮＡＰ−２５及びＳｙｂタンパク質を含む構築物及び生きた細胞内の毒素活性を検出することができる蛍光性バイオセンサーとして、該構築物を使用する方法を提供する。ＳＮＡＰ−２５の切断はＣＦＰ／ＹＦＰＦＲＥＴシグナルを消失させ、Ｓｙｂの切断は細胞中のＹＦＰ蛍光の空間的再分布をもたらした。本発明は、毒素阻害剤の細胞を基礎としたスクリーニングを実施し、細胞内の毒素活性を性質決定するための手段を提供する。本発明は、ＳＮＡＰ−２５及びＳｙｂの細胞内局在化が、それぞれ、細胞中でのＢｏＮＴ／Ａ及びＢによる効率的な切断に影響を及ぼすことも開示する。

蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）は、１つの分子と別の分子（例えば、タンパク質又は核酸）間又は同じ分子上の２つの位置間の距離の評価を可能にするツールである。ＦＲＥＴは、現在、本分野において、周知である（概説として、Ｍａｔｙｕｓ， （１９９２） Ｊ． ＰｈｏｔｏＣｈｅｍ．ＰｈｏｔｏＢｉｏｌ．Ｂ：Ｂｉｏｌ．， １２：３２３を参照）。ＦＲＥＴは、励起されたドナー分子からアクセプター分子へエネルギーが転移される無放射性の過程である。無放射性のエネルギー転移は、ある蛍光団の励起状態のエネルギーが、実際の光子発光なしに、別の蛍光団へ転移される量子力学的工程である。量子物理学的な原理は、「Ｊｏｖｉｎ ａｎｄ Ｊｏｖｉｎ， １９８９， Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ， ｅｄｓ．Ｅ． Ｋｏｈｅｎ ａｎｄ Ｊ． Ｇ． Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ」に概説されている。要約すれば、蛍光団は、特徴的な波長において光エネルギーを吸収する。この波長は、励起波長としても知られている。蛍光色素によって吸収されたエネルギーは、続いて、様々な経路を通じて放出され、１つの経路は蛍光を生じる光子の放出である。放出される光の波長は、発光波長として知られ、ある蛍光団に固有の特徴である。ＦＲＥＴでは、そのエネルギーは、第二の蛍光団の発光波長において放出される。第一の蛍光団は、一般に、ドナー（Ｄ）と称され、アクセプター（Ａ）と称される第二の蛍光団より高いエネルギーの励起状態を有する。

この過程の本質的な特徴は、ドナーの発光スペクトルがアクセプターの励起スペクトルと重なり合うこと、及びドナーとアクセプターが十分に近接していることである。

さらに、ＤとＡ間の距離は、蛍光団間のエネルギーの無放射性転移を可能とするのに十分に小さくなければならない。エネルギー転移の速度は、ドナーとアクセプターの間の距離の六乗に反比例し、エネルギー転移効率は距離の変化に対して極めて敏感である。エネルギー転移は、１から１０ｎｍの距離範囲において検出可能な効率で起こると言われているが、典型的には、最適な結果のためには４から６ｎｍである。無放射性エネルギー転移が効果的である距離の範囲は、ドナーの蛍光量子効率、アクセプターの吸光係数、それぞれのスペクトルの重複の程度、培地の屈折率及び２つの蛍光団の遷移モーメントの相対的配向性など、他の多くの因子にも依存する。

本発明は、対応するＢｏＮＴによって切断可能なリンカーペプチド（「基質ペプチド」）によって連結された蛍光団ＦＲＥＴドナー及びアクセプターを含む構築物（「ＦＲＥＴ構築物」）を提供する。ＢｏＮＴの存在下で、リンカーペプチドは切断され、これにより、ドナー蛍光団によるエネルギー転移の減少及び光の増加した発光がもたらされる。このようにして、毒素のタンパク分解活性をリアルタイムにモニターし、定量することができる。

ドナー及び対応するアクセプター蛍光部分に関して本明細書において使用される「対応する」とは、ドナー蛍光部分の励起スペクトルと重複する発光スペクトルを有するアクセプター蛍光部分を表す。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの最大波長は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの最大波長より少なくとも１００ｎｍ大きくすべきである。従って、効率的な無放射性エネルギー転移が生成され得る。

基質ペプチド及びＢｏＮＴに関して本明細書において使用される「対応する」とは、リンカーペプチドに対して作用することができ及び特異的な切断部位で切断するＢｏＮＴ毒素を表す。

蛍光性ドナー及び対応するアクセプター部分は、（ａ）高効率フォスターエネルギー転移、（ｂ）大きな最終ストークスシフト（＞１００ｎｍ）、（ｃ）可視スペクトルの赤色部分への可能な限り遠い発光のシフト（＞６００ｎｍ）、及び（ｄ）ドナー励起波長での励起によって生成されたラマン水蛍光性発光より高い波長への発光のシフトに関して一般的に選択される。例えば、レーザー線付近のその最大励起（例えば、ヘリウム−カドミウム４４２ｎｍ又はアルゴン４８８ｎｍ）、高い吸光係数、高い量子収率及び対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとのその蛍光発光の優れた重複を有するドナー蛍光性部分を選択することができる。高い吸光係数、高い量子収率、ドナー蛍光性部分の発光とのその励起の優れた重複及び可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）中の発光を有する対応するアクセプター蛍光部分を選択することができる。

当業者は、多くの蛍光団分子がＦＲＥＴに適していることを認知している。好ましい実施形態において、蛍光タンパク質が蛍光団として使用される。ＦＲＥＴ技術において様々なアクセプター蛍光性部分とともに使用することができる代表的なドナー蛍光性部分には、フルオレセイン、ルシフェールイエロー、Ｂ−フィコエリトリン、９−アクリジンイソチオシアナート、ルシフェールイエローＶＳ、４−アセトアミド−４’−イソチオ−シアナートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナートフェニル）−４−メチルクマリン、スクシンイミジル１−ピレンブチラート及び４−アセトアミド−４’−イソチオシアナートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸誘導体が含まれる。使用されるドナー蛍光性部分に応じて、代表的なアクセプター蛍光性部分には、ＬＣ−レッド６４０、ＬＣ−レッド７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアナート、ローダミンｘイソチオシアナート、エリスロシンイソチオシアナート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセタート又はランタニドイオン（例えば、ユーロピウム又はテルビウム）の他のキレート物質が含まれる。ドナー及びアクセプター蛍光性部分は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｃｉｔｙ， Ｏｒｅｇ．）又はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ．）から得ることができる。

表１は、それらの励起及び発光波長とともに、本発明において使用するのに適した化学的蛍光団の他の例を列記している。

トリプトファンなどのある種の天然に存在するアミノ酸は、蛍光性である。アミノ酸は、例えば、ＦＲＥＴ用の蛍光団の対を作製するために、アミノ酸上に蛍光性の基を連結することによって（ＡＥＤＡＮＳをＣｙｓに連結するなど）も誘導化させ得る。ＡＥＤＡＮＳ−Ｃｙｓ対は、タンパク質の立体構造の変化及び相互作用を検出するために一般的に使用される。アミノ酸を修飾し、タンパク質断片内でＦＲＥＴを生成させるために、幾つかの他の形態の蛍光基も使用されている（例えば、Ｓ−（Ｎ−［４−メチル−７−ジメチルアミノ−クマリン−３−イル］−カルボキサミドメチル）−システイン−とともに２，４−ジニトロフェニル−リジン）。

生きた細胞中で使用するのに特に適している別の実施形態において、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びその様々な変異体が蛍光団として使用される。最大励起及び発光が異なる蛍光性タンパク質の例が、ＷＯ９７／２８２６１（Ｔｓｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）（参照により、本明細書に組み込まれている。）の表１に列記されている。これら（それぞれ、ｎｍで表された［最大励起／最大発光］波長が続く。）には、野生型緑色蛍光性タンパク質［３９５（４７５）／５０８］及び緑色蛍光性タンパク質のクローニングされた変異体である変形物Ｐ４［３８３／４４７］、Ｐ４−３［３８１／４４５］、Ｗ７［４３３（４５３）／４７５（５０１）］、Ｗ２［４３２（４５３）／４０８］、Ｓ６５Ｔ［４８９／５１１］、Ｐ４−１［５０４（３９６）／４８０］、Ｓ６５Ａ［４７１／５０４］、Ｓ６５Ｃ［４７９／５０７］、Ｓ６５Ｌ［４８４／５１０］、Ｙ６６Ｆ［３６０／４４２］、Ｙ６６Ｗ［４５８／４８０］、ＩＯｃ［５１３／５２７］、ＷＩＢ［４３２（４５３）／４７６（５０３）］、エメラルド［４８７／５０８］及びサファイア［３９５／５１１］が含まれる。５５８ｎｍの最大励起及び５８３の最大発光を有するＤｓＲｅｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの赤色蛍光性タンパク質も使用することができる。このリストは、本分野において公知の蛍光性タンパク質を網羅したものではない。さらなる例が、Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳｗｉｓｓＰｒｏ公開データベース中に見出される。

ＧＦＰは２７から３０ＫＤタンパク質であり、別のタンパク質（例えば、標的タンパク質）と融合させることが可能であり、融合タンパク質は、宿主細胞（イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞など）中で発現されるように改変され得る。ＧＦＰ及びその様々な変異体は、生きた細胞及び組織中で蛍光を生成することができる。ＧＦＰの変異形態は、蛍光領域内に僅かなアミノ酸の差を有しており、これがシフトしたスペクトルをもたらす。異なるスペクトルを有するように、将来、ＧＦＰのさらなる変異が作製されると予想される。これらのＧＦＰ変形物のうち、ＢＦＰ−ＹＦＰ、ＢＦＰ−ＣＦＰ、ＣＦＰ−ＹＦＰ、ＧＦＰ−ＤｓＲｅｄが、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために、ＦＲＥＴドナー−アクセプター対として一般に使用される。これらの対は、対を連結するリンカー領域のプロテアーゼ切断を検出するのにも適している。

約６０アミノ酸残基のリンカー断片の使用を可能とするので、蛍光性タンパク質の使用が好ましい。より長い断片は、通常、毒素の認識及び切断に対してより感受性が高く、従って、毒素の検出に関してより高い感度をもたらす。以下の実施例に示されているように、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−ＹＦＰとの４時間の温置後のＢｏＮＴ／Ａ及びＥに対するＥＣ５０は、幅広く使用されるマイクロプレート分光蛍光光度計（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて測定した場合に、僅か１５から２０ｐＭ（１から２ｎｇ／ｍＬ）の低さである。ＢｏＮＴ／Ｂ及びＦのＥＣ５０は、約２００から２５０ｐＭであり、温置時間を増加させることによって、感度を増強させることができる。

本発明の一実施形態によれば、２つの蛍光団は、ＦＲＥＴが起こるように、適切な長さのリンカーによって一緒に連結される。リンカーは、ＢｏＮＴ基質タンパク質の断片である。リンカー断片を切断することができるＢｏＮＴに曝露されると、２つの蛍光団は分断され、ＦＲＥＴは消失される。従って、本発明は、ＦＲＥＴの変化を検出することによってＢｏＮＴを検出するための方法を提供する。多くの種からのＳＮＡＲＥタンパク質がアミノ酸レベルで保存されていることが知られているので、これらのタンパク質は、ＢｏＮＴ毒素に対する基質タンパク質として適している。これらのＢｏＮＴ基質タンパク質の多くは公知であり、本発明のための適切なリンカーペプチドとして使用し、又は使用のために修飾するのに利用可能である。基質タンパク質の幾つか及びそれらのＧｅｎＢａｎｋ受付番号は、表２に列記されている。

各ＢｏＮＴ毒素は、毒素切断部位内の２つの特異的アミノ酸間の特異的ペプチド結合を切断することが知られている。下表３は、各ＢｏＮＴ毒素に対するアミノ酸対を列記している。しかしながら、アミノ酸配列のこれらの対は、毒素の認識及び切断のために十分でない。例えば、ＢｏＮＴ／Ａは、ラットＳＮＡＰ−２５配列のＱ（１９７）−Ｒ（１９８）においてＳＮＡＰ−２５（ＧｅｎＢａｎｋ受付番号：ＮＰ１１２２５３）を切断するが、Ｑ（１５）−Ｒ（１６）において切断しない。一般に、認識部位として保存されたアミノ酸配列は存在せず、むしろ、毒素は、その標的タンパク質の一次構造ではなく三次構造を認識するものと思われる。それにも関わらず、下表３中に上掲されている毒素切断部位に２つのアミノ酸残基を有する限り、その種の起源に関わらず、基質タンパク質の極めて短い断片が毒素の認識及び切断のために十分である。

リンカータンパク質又はペプチドは、最長ＢｏＮＴ基質タンパク質の完全長とすることができる。好ましくは、リンカーは、基質タンパク質のより短い断片である。完全長基質リンカーは、効率的なＦＲＥＴに対して長すぎる場合があり得、より短い断片がより効果的であり、完全長タンパク質より製造がより容易である。他方、上述のように、このような最小の長さを下回ると、各ＢｏＮＴによるリンカーペプチドの切断が非効率的となるので、リンカーペプチドはある種の最小長さを上回るべきである。

一例としてｓｙｂＩＩ及びＢｏＮＴ／Ｂを用いて、下表４は、リンカーペプチド長さと毒素切断率との間の関係を例示する。完全長ラットｓｙｂＩＩタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ０３６７９５）は、１１６のアミノ酸を有し、アミノ末端のアミノ酸１から９４は、細胞質ドメインであり、残りは膜貫通ドメインである。表１から明らかなように、ある限界内で、より短い断片がより遅い速度で毒素によって切断される（Ｆｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１５３６５， １９９４から得られたデータ）。

表４から明らかなように、破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）は、ＢｏＮＴ／Ｂ（５５−９４）より最適な切断のために、より長い断片（３３−９４）を必要とする。６０から９４からなる断片が、ペプチドを基礎とする幾つかの毒素アッセイ法などの幾つかの研究において使用されてきた（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．， ２００３、上記、及びＳｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２９６：１３０−１３７）。

ＢｏＮＴ／Ａに関して、毒素感受性の多くを保持するために、ＳＮＡＰ−２５の１４１−２０６断片が必要とされる（Ｗａｓｈｂｏｕｒｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ４１８：１）。より短いペプチド（ＳＮＡＰ２５のアミノ酸１８７から２０３）がＢｏＮＴ／Ａによって切断されるのに十分であるという他の報告も存在する（，２００１）。ＢｏＮＴ／Ａに対する最小の部位は、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号１）である。ＢｏＮＴ／Ａは、Ｇｌｎ−Ａｒｇを切断する。

ＰＣ１２細胞内でＣＦＰとＹＦＰの間のリンカー配列として完全長ＳＮＡＰ−２５を用いて、準備的な結果は、得られたＦＲＥＴシグナルがより短い断片を用いて得られたＦＲＥＴシグナルより強く、慣用の実験室顕微鏡を用いて検出するのに十分であることを示す。おそらく、ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖もその上に標的化及び繋着され得る形質膜上に完全長ＳＮＡＰ−２５が標的化されるという事実のために、ＰＣ１２細胞中において、ＢｏＮＴ／Ａによる完全長ＳＮＡＰ−２５の切断の速度は、短い断片より速く、細胞間でより一貫していると考えられる。

ＢｏＮＴ／Ｂに関しては、最短残基６０から９４の間の断片が、残基３３から９４の間の断片と同程度に有効であることが見出された。好ましくは、３３から９４の間の断片が、ＢｏＮＴ／Ｂ及びＴｅＮＴに対して使用される。何れの毒素もＧｌｎ及びＰｈｅの間を切断し、切断に対する最小配列は、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号２）であると思われる。ＢｏＮＴ／Ｂ軽鎖はシナプス小胞の上に標的化され、及び繋着され得るという示唆が存在し、細胞内で効率的な増加した切断を達成するために、シグナル配列を介して、本発明のＦＲＥＴ構築物をシナプス小胞に標的化することも望ましい場合があり得る。

ＢｏＮＴ／Ｃは、ＳＮＡＰ２５とシンタキシンの両方を切断し、基質が溶液中に存在する場合には、極めて遅い速度で切断すると考えられる。細胞膜上に存在する原型のＳＮＡＰ２５及びシンタキシンは、ＢｏＮＴ／Ｃによって最も効率的に切断される。ＳＮＡＰ２５に対する最小切断配列は、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ（配列番号３）であり、切断は、Ａｒｇ−Ａｌａの間で起こり、シンタキシンに関して、最小切断配列は、Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ（配列番号４）であり、切断はＬｙｓ−Ａｌａにおいて起こる。

ＢｏＮＴ／Ｅは、Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（配列番号５）の最小配列を必要とし、Ａｒｇ−Ｉｌｅの間で切断する。

ＢｏＮＴ／Ｆは、Ｇｌｎ−Ｌｙｓを切断する。Ｓｃｈｍｉｄｔ他（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２９６：１３０−１３７ （２００１））は、ｓｙｂＩＩの３７から７５の断片が毒素感受性の多くを保持し、最小配列はＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（配列番号６）であることを報告した。

最小切断部位及びＦＲＥＴシグナル強度とリンカー長の間及び切断効率とリンカー長の間の関係に関する上記論述から、当業者は、ＦＲＥＴシグナル強度と切断効率の間の最適なバランスを達成するための適切なリンカー長を容易に選択することができる。

好ましくは、リンカー長は、具体的な基質と毒素の組み合わせに応じて、約８アミノ酸から約１００アミノ酸、好ましくは１０から９０の間、より好ましくは２０から８０の間、３０から７０の間、４０から６０アミノ酸長の間の何れでもよい。

一実施形態において、リンカータンパク質又はその断片がまず精製され得、又はペプチドがまず合成され、次いで、化学反応を通じて、あるアミノ酸の上に蛍光基が付加された。蛍光標識は、リンカーポリペプチドに付着され、あるいは、蛍光性タンパク質は、以下に記載されているように、リンカーポリペプチドとインフレームに融合される。上記論述は、毒素検出特異性のために短い基質断片が望ましいのに対して、改善されたシグナル強度又は切断効率のためにはより長い断片が望ましい場合があり得ることを明確にする。基質タンパク質が１つのＢｏＮＴに対して２以上の認識部位を含有する場合、位置の結果のみでは、何れの特異的毒素が試料中に存在するかを同定するのに十分ではない。本発明の一実施形態において、より長い基質断片、特に完全長の基質タンパク質が使用される場合、基質が唯一の毒素／プロテアーゼ認識部位を含有するように、例えば、部位指定突然変異導入又は当業者に周知の他の分子改変法を介して、基質を改変し得る。例えば、（ＢｏＮＴ／Ｅ切断部位に変異（Ａｓｐ１７９−＞Ｌｙｓ）を有するＳＮＡＰ−２５は、ＢｏＮＴ／Ｅ切断に対して抵抗性であるが、ＳＮＡＲＥ複合体形成に関して検査すると、正常に挙動することを示す）「Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ， ２００２， Ｎｅｕｒｏｎ ３４：５９９−６１１“Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＳＮＡＰ−２５ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｃａ２＋ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ”」を参照されたい。好ましい実施形態において、本発明の方法は、最適なシグナル強度、切断効率及び毒素／血清型特異性を達成するために、特異性の改変と長さの最適化の組み合わせを使用する。

好ましい実施形態において、蛍光団は適切な基質ペプチドによって連結された適切な蛍光タンパク質である。次いで、このようなポリペプチド及び蛍光性タンパク質標識をコードする配列のインフレーム融合を含む組換え核酸分子のインビトロでの発現を介して（例えば、無細胞転写／翻訳系を用いて、又は代わりに、本分野で周知の方法を用いて形質転換若しくは形質移入された培養細胞を用いて）、ＦＲＥＴ構築物を作製し得る。ＦＲＥＴ構築物を作製するための適切な細胞は、細菌、真菌、植物又は動物細胞であり得る。ＦＲＥＴ構築物は、インビボ、例えば、トランスジェニック植物中又はトランスジェニック動物（昆虫、両生類及び哺乳類など（但し、これらに限定されない。））中においても産生され得る。本発明において使用する組換え核酸分子は、本分野において周知の分子的方法によって構築及び発現され得、簡易な精製を可能にするためのタグ（例えば、ヒスチジンタグ）、リンカー、分泌シグナル、核局在化シグナル又は特定の細胞位置に構築物を標的化することができる他の一次配列シグナル（これが所望される場合）をコードするものなどの（但し、これに限定されない。）配列をさらに含み得る。

マイクロプレート分光蛍光光度計を用いて検出することができる十分な蛍光シグナルを生成するのに、最低３００ｎＭタンパク質で十分である。蛍光シグナルの変化は、毒素プロテアーゼ酵素活性を反映するためにリアルタイムで追跡することができる。リアルタイムモニタリングは、反応が進行するにつれてシグナルの変化を測定し、迅速なデータ収集可能にし、且つ様々な条件下で反応速度論に関する情報を与える。ＦＲＥＴ比から得られた速度論定数の単位を基質濃度に相関させるために、ＨＰＬＣアッセイなどの方法を用いて、例えば、ある種の分光蛍光光度計に対してＦＲＥＴ比の変化及び切断の程度を相関付け得る。

図１０は、ドナー標識１１０とアクセプター標識１２０の間に配置された切断部位配列１４０及び切断部位１４２を含むリンカー１３０を有する従来の構築物１００の模式図である。この種の従来技術の構築物は、ＢｏＮＴを検出するためにかなり良好に機能する。しかしながら、図１１ａの典型的な構築物１００ａは、驚くべきことに、リンカー１３０ａ内にスペーサー１５０ａを含めているために、ＢｏＮＴを検出するための増強された感度を有する。

図１１ａは、切断部位配列１４０、切断部位１４２及びスペーサー１５０ａを含むリンカー１３０ａを有する本発明の構築物１００ａの一実施形態を図示する模式図である。スペーサー１５０ａは、切断部位配列１４０とアクセプター標識１２０の間に配置される。好ましくは、構築物１００ａは、ＣＦＰ−（ＳＧＬＲＳＲＡ）−ＳＮＡＰ−２５−（ＳＮＳ）−ＹＦＰ及びＣＦＰ−（ＳＧＬＲＳＲＡ）−シナプトブレビン−（ＳＮＳ）−ＹＦＰからなる群から選択される。

フォスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）などの（但し、これに限定されない。）双極子−双極子カップリング機序によって、ドナー標識がアクセプター標識にエネルギーを転移させることができるように、ドナー標識１１０及びアクセプター標識１２０は、電気的カップリングを与えるように配置される。

リンカーペプチド１３０ａは、シナプトブレビン（ＶＡＭＰ）、シンタキシン及びＳＮＡＰ−２５又はボツリヌス神経毒素によって認識及び切断され得るこれらの断片からなる群から選択されるボツリヌス神経毒素の基質である。これらのタンパク質は、ＳＮＡＲＥタンパク質と総称される。リンカー１３０ａは、例えば、５ｎｍ、８ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１４ｎｍ及び２０ｎｍに等しい又はそれ以上など、あらゆる適切な長さの一次構造長を有し得る。

スペーサー１５０ａは、アミノ酸のあらゆる適切な数を有し得るが、好ましくは、少なくとも３、５、７、１０、１２又は１５のアミノ酸を有し得る。スペーサー１５０ａは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ及び（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎは、１から３である。）からなる群から選択される配列を含み得る。あるいは、スペーサー１５０ａは、ＳＮＡＲＥタンパク質、モチーフ又は変異タンパク質を含むことができる。スペーサー１５０ａはドナー標識１１０とアクセプター標識１２０間の一次構造距離を増加させるが、スペーサー１５０ａは、スペーサーなしの対応する構築物と比べて、ドナー標識１１０とアクセプター標識１２０間の電気的カップリング（ＦＲＥＴ効果）を有利に増加させる。スペーサー１５０ａはドナー標識１１０とアクセプター標識１２０間の三次構造距離を低下させ、従って、電気的カップリングを増加させるので、増強された電気的カップリングが生じる。

切断部位配列１４０は、（ａ）ＳＮＡＲＥタンパク質、モチーフ、変異タンパク質及び（ｂ）少なくとも５つのアミノ酸を有するスペーサー（スペーサーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ及び（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎは、１から３である。）からなる群から選択される配列を含む。）を含み得る。

図１１ｂの構築物１００ｂは、リンカー１３０ｂがドナー標識１１０と切断部位配列１４０の間に配置されたスペーサー１５０ｂを有することを除き、図１の構築物１００ａと同様である。

図１１ｃの構築物１００ｃは、リンカー１３０ｂが（ａ）ドナー標識１１０と切断部位配列１４０の間に配置されたスペーサー１５０ｂ及び（ｂ）切断部位配列１４０とアクセプター標識１２０の間に配置されたスペーサー１５０ｄを有することを除き、図１１ａの構築物１００ａと同様である。

図１２は、図１１ａから１１ｃの構築物を用いて、ドナー標識とアクセプター標識の間でのエネルギー転移の感度を向上させるための方法２００の工程を図解する。工程２１０は、リンカーを通じて物理的に結合されているドナー標識とアクセプター標識を含む図１１ａから１１ｃに係る構築物を準備することから構成される。構築物はタンパク質を基礎とする構築物であり、リンカーはペプチド配列２１２である。工程２２０は、リンカー中に切断部位配列を含めることから構成される。任意選択で、切断部位配列は、ＳＮＡＲＥタンパク質又はその断片若しくは変異タンパク質を含み、スペーサーは少なくとも５つのアミノ酸２２２を含む。工程２３０は、ドナーと切断部位配列及びアクセプターと切断部位配列の少なくとも１つの間のリンカー中にスペーサーを含めることから構成され、ドナーとアクセプター間の電気的カップリングは、（ａ）ドナーとアクセプター２３４の間の三次構造距離を短縮させること、及び（ｂ）ドナーとアクセプター２３６間の電気的跳躍を与えることによって増加される。任意選択で、スペーサーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ及び（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎは、１から３である。）２３２からなる群から選択される配列を含む。

図１３は、図１１ａから１１ｃの構築物を用いてボツリヌス神経毒素を検出するための方法３００の工程を図解する。工程３１０は、請求項１の構築物を準備することから構成され、リンカーは、検出されるべきボツリヌス神経毒素の基質タンパク質又はその切断可能断片である。工程３２０は、ボツリヌス神経毒素が基質タンパク質又はその断片を切断する条件下で、ボツリヌス神経毒素を含有すると疑われる試料に構築物を曝露することから構成される。工程３３０は、構築物が試料に曝露される前及び後に、ＦＲＥＴシグナルを検出及び比較することから構成され、ＦＲＥＴの減少は試料中のボツリヌス神経毒素の存在を示唆する。

本発明の方法は、感度が極めて高く、従って、ボツリヌス細菌細胞内部のプロトキシンなど、環境試料中のＢｏＮＴの微量を直接検出するために使用することができる。従って、本発明は、環境試料を用いて、毒素を直接検出及び同定するための方法をさらに提供する。

本発明は、上述のインビトロ系を用いてＢｏＮＴの阻害剤をスクリーニングするための方法をさらに提供する。その高い感度、迅速な読み出し及び使用の容易さのために、本発明を基礎とするインビトロ系は、毒素阻害剤のスクリーニングにも適している。具体的には、適切なＢｏＮＴ基質−ＦＲＥＴ構築物は、候補阻害剤物質の存在下で、対応するＢｏＮＴに曝露され、候補がＢｏＮＴの活性を阻害するかどうかを測定するために、ＦＲＥＴシグナルの変化がモニターされる。

本発明は、ＢｏＮＴを検出するための、及びさらにＢＯＮＴの阻害剤をスクリーニングするための細胞を基礎とする系を用いてＢｏＮＴを検出する方法をさらに提供する。上述されている適切なＢｏＮＴ基質−ＦＲＥＴ構築物は細胞内で発現され、次いで、細胞は、ＢｏＮＴを含有すると疑われる試料に曝露され、次いで、ＢｏＮＴの存在／不存在又は濃度の指標として、ＦＲＥＴシグナルの変化がモニターされる。具体的には、ＦＲＥＴシグナルの減少は、試料が対応するＢｏＮＴを含有することを示唆する。

細胞を基礎とする高処理量スクリーニングアッセイは、毒素のタンパク質分解活性を遮断することができる因子を明らかにするのみならず、その細胞受容体への結合、エンドソームの膜を横切る軽鎖転位及び転位後におけるサイトゾル中での軽鎖の再折り畳みなど毒素の作用中の他の工程を遮断できる因子も明らかにする可能性を秘めている。

本発明は、上述の細胞を基礎とする系を用いてＢｏＮＴの阻害剤をスクリーニングするための方法をさらに提供する。具体的には、適切なＢｏＮＴ基質−ＦＲＥＴ構築物を発現する細胞が、候補阻害剤物質の存在下で、対応するＢｏＮＴに曝露され、候補がＢｏＮＴの活性を阻害するかどうかを測定するために、ＦＲＥＴシグナルの変化がモニターされる。毒素−基質相互作用の直接的阻害剤を同定することができるに留まるインビトロを基礎とする他のスクリーニング法と比べて、本発明の細胞を基礎とするスクリーニング法は、毒素−膜受容体結合、膜転位及び細胞内毒素移動など（但し、これらに限定されない。）、他の毒素関連活性の阻害剤をスクリーニングすることをさらに可能とする。

好ましい実施形態によれば、ＢｏＮＴ基質ポリペプチド及び２つの適切なＦＲＥＴ実行蛍光性ペプチドをコードする組換え核酸分子、好ましくは発現ベクターが、適切な宿主細胞中に導入される。当業者は、本発明のための適切な発現ベクター、好ましくは、哺乳動物発現ベクターを選択することが可能であり、極めて多数の選択肢が存在することを認める。例えば、ｐＣＩ及びｐＳｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．から得られる。）、ＣＤＭ８、ｐＣｅｏ４などのベクターのｐｃＤＮＡ系列。これらのベクターの多くは、ウイルスのプロモーターを使用する。好ましくは、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ）から得られるｔｅｔ−ｏｆｆ及びｔｅｔ−ｏｎベクターなどの誘導性プロモーターが使用される。

細胞株の多くの選択肢が、本発明のための宿主細胞として適している。好ましくは、細胞は、それぞれのＢｏＮＴがその毒性活性をその中で呈する種類の細胞である。換言すれば、細胞は、好ましくは、適切な細胞表面受容体を提示し、あるいは、十分効率的に、毒素を細胞内に転位させ、毒素に適切な基質ポリペプチドを切断させる。具体例には、初代培養された神経細胞（皮質神経細胞、海馬神経細胞、脊髄運動神経細胞など）、ＰＣ１２細胞又は誘導されたＰＣ１２細胞株、初代培養されたクロマフィン細胞、マウスコリン作動性Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞株、ヒトアドレナリン作動性ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞株及びＮＳ−２６細胞株など、幾つかの培養された神経芽細胞腫細胞株が含まれる。例えば、「Ｆｏｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓｔｒｉｎｇｅｒ （１９９９）， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ Ｉｎｔｏ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ ａｎｄ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ， Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ９：５４７−５６７」を参照されたい。

基質−ＦＲＥＴポリペプチドに対するコード領域は、適切なプロモーターの制御下にある。使用される宿主細胞の種類に応じて、多くの適切なプロモーターが本分野において公知であり、容易に入手できる。このようなプロモーターは、誘導性又は恒常性であり得る。恒常性プロモーターは、本発明の所望のポリペプチドの発現を誘導するように選択され得る。誘導する基質を含有する培地上で発現宿主を培養する必要性が回避されるので、このような発現構築物はさらなる利点を与え得る。適切なプロモーターの例は、哺乳類系におけるＬＴＲ、ＳＶ４０及びＣＭＶ、細菌系におけるイー・コリｌａｃ又はｔｒｐ、昆虫系におけるバキュロウイルス多角体プロモーター（ｐｏｌｈ）並びに真核及び原核細胞又はそれらのウイルス中で発現を調節することが知られている他のプロモーターである。真菌発現宿主中での使用が好ましい強い恒常性及び／又は誘導性プロモーターの例は、キシラナーゼ（ｘｌｎＡ）、フィターゼ、ＡＴＰ合成酵素、サブユニット９（ｏｌｉＣ）、トリオース三リン酸イソメラーゼ（ｔｐｉ）、アルコール脱水素酵素（ＡｄｈＡ）、α−アミラーゼ（ａｍｙ）、アミログルコシダーゼ（ｇｌａＡ遺伝子由来のＡＧ）、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）及びグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇｐｄ）プロモーターに対する真菌遺伝子から取得可能なプロモーターである。強力な酵母プロモーターの例は、アルコール脱水素酵素、ラクターゼ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びトリオースリン酸イソメラーゼに対する遺伝子から取得可能なプロモーターである。強力な細菌プロモーターの例には、ＳＰＯ_２プロモーター及び細胞外プロテアーゼ遺伝子から得られるプロモーターが含まれる。

ハイブリッドプロモーターは、発現構築物の誘導性制御を改善するためにも使用され得る。プロモーターは、適切な宿主中での発現を確保するための、又は増加させるための特徴をさらに含むことができる。例えば、特徴は、Ｐｒｉｂｎｏｗボックス又はＴＡＴＡボックスなどの保存された領域であり得る。プロモーターは、本発明のヌクレオチド配列の発現のレベルに影響を及ぼすための（例えば、維持し、強化し、又は減少させるための）他の配列さえ含有し得る。例えば、適切な他の配列には、Ｓｈｌ−イントロン又はＡＤＨイントロンが含まれる。他の配列には、温度、化学、光又はストレス誘導性要素などの誘導性要素が含まれる。また、転写又は翻訳を増強するための適切な要素が存在し得る。後者の要素の例は、ＴＭＶ５’シグナル配列である（Ｓｌｅａｔ， １９８７， Ｇｅｎｅ ２１７：２１７−２２５； ａｎｄ Ｄａｗｓｏｎ， １９９３， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：９７参照）。

発現ベクターは、発現を増幅するためにプロモーターに対して作用する配列も含有し得る。例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ及びポリオーマシス作用性要素（エンハンサー）及び選択可能なマーカーは、選択のための表現型形質（例えば、哺乳動物細胞に対するジヒドロ葉酸還元酵素若しくはネオマイシン耐性又はイー・コリに対するアンピシリン／テトラサイクリン耐性）を与えることができる。適切なプロモーター及び選択マーカーを含有する適切なベクターの選択は、当業者の水準の範疇に十分属する。

好ましくは、基質−ＦＲＥＴポリペプチドに対するコード領域は、誘導性プロモーターの制御下にある。誘導性プロモーターは、細胞中のレポーターの濃度の適切な調節を可能とし、従って、ＦＲＥＴシグナルの変化の測定が大幅に容易化されるので、恒常性プロモーターと比べて、誘導性プロモーターは好ましい。

例えば、ＦＲＥＴレポーターは、Ｔｅｔ−ｏｎ及びＴｅｔ−ｏｆｆ系（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， Ｃａｌｉｆ．）を用いて調節することができる。このプロモーターの調節下において、遺伝子発現は、正確な、可逆的及び定量的様式で制御され得る。簡潔に述べると、Ｔｅｔ−ｏｎ系に関して、ドキシサイクリンが培地中に存在する場合にのみ、下流遺伝子の転写が起こる。ある期間の転写後、ドキシサイクリンを枯渇させ、従って、新たなＦＲＥＴレポータータンパク質の合成を停止させるために培地を変更することができる。従って、新たに合成されたＦＲＥＴタンパク質からのバックグラウンドは存在せず、毒素処理後のより迅速な変化を観察し得る可能性がある。

蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡系（ある範囲で蛍光発光をモニターするための適切な二色性鏡及びフィルターを含有する。）、光子計数光増倍系又は蛍光光度計を用いて実施することができる。エネルギー転移を開始するための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、光ファイバー光源又は所望の範囲内で励起させるための適切にフィルターがかけられた他の高強度光源を用いて実施することができる。検出感度を増強するための光増倍手段を取り込むことによって、励起／検出手段を増強できることが当業者に自明である。例えば、単一分子規模での検出を達成するために、二光子交差相関法を使用し得る（例えば、Ｋｏｈｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９９：１２１６１， ２００２参照）。

蛍光出力の多数のパラメータを測定し得る。それらには、１）アクセプター（Ａ）とドナー（Ｄ）の発光波長で放出された蛍光を測定し、それらの発光規模の比によってエネルギー転移の程度を決定すること、２）Ｄの蛍光寿命を測定すること、３）Ｄの光退色の速度を測定すること、４）Ｄ及び／若しくはＡの異方性を測定すること、又は５）ストークスシフト単量体／励起二量体蛍光を測定することが含まれる。例えば、「Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．， （２００１）“Ｓｐａｔｉｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ ｉｍａｇｅｓ ｏｆ ｇｒｏｗ−ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｓ ａｎｄ Ｒａｐｌ．”Ｎａｔｕｒｅ ４１１：１０６５−１０６８， Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００２） “Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．”Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：２８７−２９４」を参照されたい。

別の実施形態において、本発明は、表面プラズモン共鳴画像化（ＳＰＲｉ）技術を用いてＢｏＮＴを検出するための方法を提供する。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、結合化学を支持する薄い金属フィルム（典型的には、金）中での表面プラズモンの生成を基礎とする、分子結合を検出するための確立された光学的技術である。表面プラズモンは、金属フィルム中に束縛された自由電子の集合的振動である。これらの電子は、高い屈折率のプリズムから入射する光照射野によって共鳴的に励起される。この共鳴励起が起こる入射角ｑは相対的に狭く、共鳴入射角ｑｒにおいて最小値を有する反射光の強度の低減によって特徴付けられる。反射光の位相も、この領域中のｑに関してほぼ線形的に変動する。ｑｒの値は、金属フィルムの数ナノメートル内に存在する溶媒の屈折率に対して敏感である。従って、フィルムへの結合の結合による又は結合された分子の分子量の変化による屈折率の小さな変動は、この角度の変動として検出され得る。金属表面へ生物分子を繋着し、このような繋着を検出し、及びＳＰＲｉを測定するための多くの方法が本分野において公知である。例えば、米国特許第６，１２７，１２９号、同第６，３３０，０６２号及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：５５２７−５５３１， Ｂｒｏｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：８０４４−８０５１並びにＢｒｏｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．５１：４１−６３（何れも、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。

実際には、ＢｏＮＴ標的ペプチドの層を金属上に堆積し得る。対応するＢｏＮＴを含有すると疑われる試料を複合表面に適用し、毒素が存在する場合に、結合された標的ペプチドを毒素に切断させるために温置する。切断は、金属表面に結合されたペプチドの分子量の減少をもたらし、次いで、この減少は、標準的な装置及び方法を用いて検出することができる。結合された層の厚さの減少は、切断が起こり、その結果、試料が標的ペプチドに対応する毒素を含有することを示唆する。

あるいは、その対応する基質ペプチド（金属表面に繋着されている。）へのＢｏＮＴタンパク質の結合は、屈折率の変化も引き起こし、公知のＳＰＲｉ技術及び装置によって検出することができる。

金属表面上にタンパク質又はペプチド分子を繋着又は堆積させるための多くの方法が本分野において公知である。例えば、余分なＣｙｓ残基をペプチドの末端に付加し、次いで、これを金属表面上に架橋することが可能である。間接的に、まず、金属表面に抗体を繋着させることができ、この抗体に、毒素基質を結合させることが可能である。抗体−基質結合が毒素による基質の切断部位の認識及び接近を妨げない限り、抗体を介した間接的繋着は本発明に関して適している。さらに、それぞれ、ｈｉｓ６又はＧＳＴ融合タンパク質を保持するために使用することができるニッケル−ＮＴＡ又はグルタチオン。金属表面へのペプチドの繋着に関するさらなる情報は、「Ｗｅｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ， （２００２） Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｒｒａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｉｔｏｐｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ“Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７４：５１６１−５１６８」（参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。）中に見出され得る。

核酸分子中の約１０から１６塩基の変化（３，０００から６，４００ダルトンの分子量に相当する。）が、ＳＰＲｉによって容易に検出され得る。これは、ペプチド分子中の僅か１６のアミノ酸残基の変化を検出できることを示唆する。この高い感度によって、完全長毒素基質タンパク質の使用に代えて、短いペプチド基質を表面上に繋着することが可能となる。より安定で、より調製が安価で、より高い反応特異性が可能となるので、短いペプチド断片が好ましい。

（実施例）
材料及び方法
バイオセンサーＤＮＡ構築物の構築：ｐＥＣＦＰ−ＹＦＰベクターを作製するために、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位を用いて、ＹＦＰｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃ）をｐＥＣＦＰ−Ｃ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に挿入した。ＰＣＲを使用し、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ部位（ＣＦＰとＹＦＰ遺伝子の間にある。）を用いて、ｐＥＣＦＰ−ＹＦＰベクター中に、ラットｓｙｂＩＩのアミノ酸３３から９４をコードするｃＤＮＡを増幅して、細胞を形質移入するために使用することができるＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰ（ＣＦＰ−Ｓｙｂ （３３−９４）−ＹＦＰとも称される。）構築物を得た。同じ方法を使用して（但し、ＳＮＡＰ−２５の残基１４１から２０６を使用）、構築物ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰ（ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（１４１−２０６）−ＹＦＰとも称される。）を構築した。リンカーとして完全長ラットＳＮＡＰ−２５Ｂを有する構築物（ＣＦＰ−ＳＮＡＰ２５ＦＬ−ＹＦＰ）も作製した。細菌イー・コリを用いて組換えキメラタンパク質を精製するために、本発明者らは、ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩ部位を用いて、ｐＥＣＦＰ−ＹＦＰベクターからＣＦＰ−Ｓｙｂｌｌ−ＹＦＰ遺伝子及びＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰ遺伝子をｐＴｒｃ−ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクター中にも移動した。

ＰＣＲを用いた部位指定突然変異導入によって、ＳＮＡＰ−２５の４つのＣｙｓ残基のＡｌａへの変異を達成し、次いで、上述のように、ＣＦＰとＹＦＰの間に断片を挿入した。まず、ＳＮＡＰ−２５の残基８３から１２０をコードするｃＤＮＡ断片をｐＥＹＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位中に挿入し、次いで、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩを用いて、下流の部位中にＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（１４１−２０６）ｃＤＮＡをサブクローニングすることによって、ＳＮＡＰ−２５（８３−１２０）−ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（１４１−２０６）−ＹＦＰを構築した。まず、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位において、完全長ＳｙｂＩＩｃＤＮＡをｐＥＣＦＰ−Ｃ１ベクター中に挿入し、次いで、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ部位の上流中に完全長ＹＦＰｃＤＮＡＰを挿入することによって、ＹＦＰ−Ｓｙｂ（ＦＬ）−ＣＦＰを構築した。ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位を介して、ＹＦＰ−Ｓｙｂ（ＦＬ）−ＣＦＰ構築物中の完全長Ｓｙｂを置換することによって、ＹＦＰ−Ｓｙｂ（３３−１１６）−ＣＦＰを構築した。全てのｃＤＮＡ断片は、ＰＣＲを介して作製された。

タンパク質の精製及び蛍光スペクトルの獲得：Ｈｉｓ_６タグ付加されたＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰ及びＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰタンパク質は、記載のとおり精製した（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｎｏｖｅｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ Ｃ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉ． Ｃａ^２＋−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１， ５８４４−５８４９ （１９９６））。ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．１）を用いて、タンパク質を一晩透析した。２ｍＭＤＴＴ及び１０μＭＺｎＣｌ_２を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液５００μＬの合計用量で、３００ｎＭタンパク質をキュベット中に入れた。ＰＴＩＱＭ−１蛍光光度計を用いて、４５０ｎｍから５５０ｎｍまでの発光スペクトルを集めた。励起波長は４３４ｎｍであり、これはＣＦＰに対する最適な励起波長である。

ボツリヌス神経毒素の活性化及びバイオセンサータンパク質の切断のモニタリング：重鎖から毒素軽鎖を還元するために、３７℃で３０分間、２ｍＭＤＴＴ及び１０μＭＺｎＣｌ_２とともに、ＢｏＮＴ／Ａ、Ｂ、Ｅ又はＦを温置した。ＰＴＩＱＭ−１蛍光光度計を用いた実験のために、３００ｎＭの対応するＦＲＥＴセンサーを含有するキュベット中に１０ｎＭＢｏＮＴ／Ａ、Ｅ又は５０ｎＭＢｏＮＴ／Ｂ、Ｆを添加した。毒素を添加した後、ある時間間隔で（例えば、０、２、５、１０、３０、６０、９０分）、上述のように発光スペクトルを収集した。各発光スキャンの終了時に、試料の少量（３０μＬ）を集め、ＳＤＳ搭載緩衝液と混合し、その後、ＳＤＳ−ｐａｇｅゲル上に供した。強化化学発光（ＥＣＬ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用し、抗ｈｉｓ６抗体によって、センサータンパク質及び切断産物を可視化した。

分光蛍光光度計を使用する実験のために、９６ウェルプレート中にて、１００μＬ容量／ウェルで、３００ｎＭＦＲＥＴセンサータンパク質を調製した。ＢｏＮＴの様々な濃度を各ウェル中に添加し、試料を４３４ｎｍで励起した。ＹＦＰチャネル（５２７ｎｍ）及びＣＦＰチャネル（４７０ｎｍ）の発光スペクトルを３０秒間隔で９０分間収集した。各データ点に対するＹＦＰチャネルとＣＦＰチャネル間の比によって、ＦＲＥＴ比を測定する。

毒素処理後における生きた細胞内でのＦＲＥＴ比の変化を測定し、電気穿孔（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＰＣ１２細胞を形質移入するために、ＤＮＡ構築物ｐＥＣＦＰ−ＳＮＡＰ２５−ＹＦＰを使用した。形質移入から２４時間後、細胞を継代させ、５０ｎＭＢｏＮＴ／Ａを培地中に添加した。毒素との７２時間の温置後、ＮｉｋｏｎＴＥ−３００顕微鏡を用いて、ＦＲＥＴセンサーを発現する細胞の蛍光画像を収集した。以下のフィルターの組（Ｃｈｒｏｍａ Ｉｎｃ．）を用いて、各細胞の２つの画像（ＣＦＰチャンネル及びＦＲＥＴチャンネル）を収集した。ＣＦＰチャネル：ＣＦＰ励起フィルター（４３６／１０ｎｍ）、ＪＰ４ビーム分割器、ＣＦＰ発光フィルター：（４７０／３０ｎｍ）；ＦＲＥＴチャネル：ＣＦＰ励起フィルター（４３６／１０ｎｍ）、ＪＰ４ビーム分割器、ＹＦＰ発光フィルター（５３５／３０ｎｍ）。各画像からバックグラウンド（細胞を含有しない領域）を差し引き、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを用いて、各セルのＣＦＰチャネル及びＦＲＥＴチャネルの蛍光強度を比較した。先述のように、ＦＲＥＴチャネルとＣＦＰチャネルの間の強度比によって、ＦＲＥＴ比を測定する。対照細胞は毒素で処理されなかったが、同じ様に分析した。生きた細胞中でＢｏＮＴ／Ｂを検査するために、本発明者らは、上述のものと同じ操作を用いて、ｓｙｔＩＩを発現するＰＣ１２細胞株を形質移入した。

生きた細胞の画像化及びＦＲＥＴ分析：電気穿孔（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ）を介して、図の注釈に記されている様々なｃＤＮＡ構築物でＰＣ１２細胞を形質移入した。油に浸漬された１００倍対物レンズを使用するＮｉｋｏｎＴＥ−３００顕微鏡を用いて、蛍光画像を収集した。３つ組みフィルター法を用いる確立された方法を用いて、生きた細胞中のＣＦＰ／ＹＦＰＦＲＥＴを定量した（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ． ７４， ２７０２−２７１３（１９９８）；Ｓｏｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｇｒｂ２ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ）ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０， １３９５−１３９８（２０００））。要約すれば、３つの異なるフィルターの組を通じて、３つの連続画像を各細胞に対して取得した。ＣＦＰフィルター（励起、４３６／１０ｎｍ；発光、４７０／３０ｎｍ）、ＦＲＥＴフィルター（励起、４３６／１０ｎｍ；発光、５３５／３０ｎｍ）及びＹＦＰフィルター（励起、５００／２０ｎｍ、発光、５３５／３０ｎｍ）。ＪＰ４ビーム分割器（ＳｅｔＩＤ８６０００， Ｃｈｒｏｍａ Ｉｎｃ．ＶＴ）を使用した。全ての画像は、正確に同じ設定で取得した（４×４ビニング、２００ｍ秒の露出時間）。蛍光タンパク質の高発現レベルから生じ得る濃度依存的ＦＲＥＴシグナルを排除するために、本発明者らの実験では、最大１２ビットスケール（１から２０９７のグレイスケール）の半分値を下回るＣＦＰ及びＹＦＰ強度を有する細胞のみをカウントした（Ｍｉｙａｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＥｎｚｙＭｏｌ．３２７， ４７２−５００ （２０００）； Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＤｓＲｅｄ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ＦＲＥＴ ｐａｒｔｎｅｒ ｗｉｔｈ ＣＦＰ ａｎｄ ＧＦＰ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ８５， ５９９−６１１ （２００３））。ＦＲＥＴ値を計算する前に、それぞれの生画像からバックグラウンド（細胞を含有しない領域から得られる。）を差し引いた。次いで、各画像の蛍光強度値を取得し、比較した。これらのフィルターの組に対するクロストーク値を得るために、まず、ＣＦＰ又はＹＦＰのみで形質移入されたＰＣ１２細胞を検査した。ＦＲＥＴフィルターチャネルは、ＣＦＰに関して滲み出し（ｂｌｅｅｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）の約５６から６４％及びＹＦＰに関して約２４％を示す。ＣＦＰフィルター使用する際にはＹＦＰに対して実質的にクロストークが存在せず、又はＹＦＰフィルターを使用する際にはＣＦＰに対して実質的にクロストークが存在せず、これにより、ＦＲＥＴの計算が大幅に簡略化された。毒素センサーを発現する細胞に関して、「補正されたＦＲＥＴ」値は、以下の式を用いて計算した。ＦＲＥＴ＝ＦＲＥＴ−（ＣＦＰ×０．６０）−（ＹＦＰ×０．２４）（ＦＲＥＴ、ＣＦＰ及びＹＦＰは、それぞれ、ＦＲＥＴ、ＣＦＰ及びＹＦＰフィルターの組を通じて獲得された画像の蛍光強度に対応する。）。ＦＲＥＴフィルター組を通じて画像を取得した場合における、ＣＦＰ及びＹＦＰ蛍光から生じる滲み出しの平均割合は、それぞれ、０．６及び０．２４である。ＣＦＰ−ＳＮＡＰ２５ＦＬ−ＹＦＰセンサーの毒素切断はＹＦＰ断片の膜の解離をもたらしたので（ＹＦＰ断片は、サイトゾル中で分解された。）（図７ｃ、ｅ）、本発明者らのデータ解析において使用されたＦＲＥＴ比は、ＣＦＰ蛍光強度（補正されたＦＲＥＴ／ＣＦＰ）のみに対して「補正されたＦＲＥＴ」値を標準化するとして計算される（補正されたＦＲＥＴ／ＣＦＰ）。本発明者らは、ＦＲＥＴが生じた場合のドナーの消光故に、これらの計算におけるＣＦＰ強度は過小評価であることに注目する。しかしながら、ドナー消光によるＣＦＰ蛍光の減少は、約５から１０％に過ぎないことが報告されている（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ７４， ２７０２−２７１３ （１９９８）； Ｓｏｒｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８， ２８２７４−２８２８３ （２００３））。全ての画像及び計算は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．， ＰＡ）を用いて行った。

毒素処理を伴う実験に関しては、様々な時間にわたって、表記ホロ毒素を細胞培地に添加し、次いで、上述のように細胞を分析した。対照細胞には、毒素センサーを形質移入したが、毒素での処理は行わず、同じように分析した。

毒素基質切断のイムノブロット分析：図面の注釈に記されているような様々な毒素センサーｃＤＮＡ構築物で、野生型ＰＣ１２細胞又はＳｙｔＩＩ＋ＰＣ１２細胞（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３、上記）を形質移入した。形質移入から２４時間後に、ＢｏＮＴ／Ａ又はＢを培地に添加し、細胞をさらに４８時間温置した。次いで、細胞を採集し、細胞可溶化液を先述のようなイムノブロット分析に供した。対照細胞に同じｃＤＮＡ構築物を形質移入し、毒素で処理しなかったことを除き、平行してアッセイした。対照細胞可溶化液の１／３をインビトロにて毒素で処理し（２００ｎＭＢｏＮＴ／Ａ又はＢ、３７℃で３０分）、イムノブロット分析に供した。抗ＳＮＰＡ−２５抗体２６を用いて、内在性ＳＮＡＰ−２５及び形質移入されたＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰセンサーをアッセイした。ＧＦＰポリクローナル抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ．，ＣＡ）を用いて、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰ及びＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰセンサータンパク質もアッセイした。組換えセンサータンパク質切断に対するアッセイのために、抗ｈｉｓ６抗体（Ｑｉｇｅｎ Ｉｎｃ．， ＣＡ）を使用した。

ＣＦＰ−ＹＦＰＦＲＥＴ対及びボツリヌス神経毒素プロテアーゼ活性を基礎とするバイオセンサー
ＦＲＥＴ法を用いてボツリヌス神経毒素プロテアーゼ活性をモニターするために、ｓｙｂＩＩ又はＳＮＡＰ−２５断片を介してＣＦＰ及びＹＦＰタンパク質を接続し、それぞれ、ＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰ及びＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰと表記される（図１Ａ）。距離が増加するにつれて指数関数的に低下するＣＦＰ−ＹＦＰエネルギー転移効率を最適化するために、完全長タンパク質の代わりに毒素基質の短い断片を使用した。しかしながら、標的タンパク質断片が短すぎるようになるにつれて、ＢｏＮＴによる切断効率は著しく減少する。従って、完全長シナプトブレビンと同じＢｏＮＴ／Ｂ、Ｆ及びＴｅＮＴによる切断速度を保持すると報告されているので、シナプトブレビン配列のアミノ酸３３から９６を含有する領域を使用した。同様に、構築物がＢｏＮＴ／Ａ及びＥによってなお確実に認識及び切断され得るようにするために、ＳＮＡＰ−２５の残基１４１から２０６を選択した。

ＦＲＥＴアッセイは、図１Ｂに図示されている。４３４ｎｍ（ＣＦＰに対する最適な励起波長）で励起された場合、ＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰ及びＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰキメラタンパク質は、ＣＦＰ−ＹＦＰ対の間でのＦＲＥＴのために、ＹＦＰ蛍光発光を呈する。ボツリヌス神経毒素は、ＣＦＰとＹＦＰの間で短い基質断片を認識及び切断することができ、ＣＦＰとＹＦＰが分離された後に、ＦＲＥＴシグナルは消失する。これらのキメラタンパク質は生きた細胞中で発現させることができるので、ボツリヌス神経毒素に対する「バイオセンター」とも表記される。

本発明者らは、ＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰ及びＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰの精製されたｈｉｓ６タグ付加組換えキメラタンパク質をまず精製し、ＰＴＩＱＭ−１蛍光光度計を用いてこれらの発光スペクトルを性質決定した。予想されたとおり、両バイオセンサータンパク質のＣＦＰが４３４ｎｍで励起されると、両バイオセンサータンパク質は５２５ｎｍに明白なＹＦＰ蛍光ピークを示す（図２Ｂ、Ｃ）。これに対して、ＹＦＰ単独では、４３４ｎｍで直接励起されたときに、小さな蛍光シグナルを与えるに過ぎなかった（図２Ａ）。各ＣＦＰとＹＦＰの混合物は、５２５ｎｍにピーク発光を有さない（図２Ａ）。これは、ＦＲＥＴから生じたバイオセンサータンパク質を用いて観察されたＹＦＰ蛍光ピークを示した。ＦＲＥＴ比（ＹＦＰ蛍光強度／ＣＦＰ蛍光強度）は、緩衝液組成、Ｚｎ^２＋濃度及び還元剤の濃度などの（図示せず）、多くの因子によって影響を受けたので、以降の実験は全て、同じ緩衝液条件（５０ｍＭＨｅｐｅｓ、２ｍＭＤＴＴ、１０ｕＭＺｎＣｌ_２、ｐＨ７．１）中で実施した。ボツリヌス神経毒素プロテアーゼ活性を最適化するために、２ｍＭＤＴＴ及び１０μＭＺｎ^２＋を添加した。

インビトロでのボツリヌス神経毒素によるバイオセンサータンパク質の切断のモニタリング
３００ｎＭキメラタンパク質ＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰを、キュベット中で５０ｎＭの予め還元されたＢｏＮＴ／Ｂホロ毒素と混合した。ＢｏＮＴ／Ｂ（０、２、５、１０、３０、６０分など）を添加した後の異なる時点で、発光スペクトルを収集した。各スキャンの終了時に、キュベットから試料の少量（３０μＬ）を取り出し、ＳＤＳ搭載緩衝液と混合した。その後、これらの試料をＳＤＳ−ｐａｇｅゲルに供し、組換えキメラタンパク質中のｈｉｓ_６タグに対する抗体を用いて、キメラタンパク質の切断を可視化した。図３Ａに示されているように、ＢｏＮＴ／Ｂとのバイオセンサータンパク質の温置は、ＹＦＰ発光の減少及びＣＦＰ発光の増加をもたらした。ＦＲＥＴ比の減少は、ＢｏＮＴ／Ｂによるキメラタンパク質の切断の程度と合致している（図３Ａ、下図）。この結果は、バイオセンサータンパク質の切断は、そのＦＲＥＴ比の変化を記録することによって、リアルタイムでモニターすることができることを示す。

ＢｏＮＴ／ＦによるＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰの切断及びＢｏＮＴ／Ａ又はＥによるＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰの切断を検出するために、同じアッセイを行った（図３Ｂ，Ｃ，Ｄ）。ＢｏＮＴ／Ｂを用いた実験によって、同様の結果が得られた。全ての事例で、本発明者らは、光学的な読み出し及びイムノブロットブロット分析の両方を用いて、基質の切断の同じ速度論を観察した。ＢｏＮＴ／Ａ及びＥは、ＢｏＮＴ／Ｂ及びＦが本発明者らのアッセイにおいてキメラ基質を切断するよりずっと早くキメラ基質を切断した。従って、最初の数分以内に生じた変化を記録するために、１０ｎＭＢｏＮＴ／Ａ又はＥのみを使用した。ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰとのＢｏＮＴ／Ｂ及びＦの混合又はＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰとのＢｏＮＴ／Ａ及びＥの混合はＦＲＥＴ比又は基質切断の変化を一切もたらさなかったので（図示せず）、キメラタンパク質の切断は特異的である。

マイクロプレート分光蛍光光度計を用いたリアルタイムでのボツリヌス神経毒素プロテアーゼ活性のモニタリング
上記実験は、それらの標的バイオセンサータンパク質の発光スペクトルの変化をモニタリングすることによって、ボツリヌス神経毒素の活性はインビトロで検出可能であることを示した。次いで、本発明者らは、マイクロプレートリーダーを用いて、リアルタイムでバイオセンサータンパク質の切断をモニターできるかどうかを決定した。これは、将来的な高処理量スクリーニングにこのアッセイを適合させるための可能性を示す。図４Ａに示されているように、９６ウェルプレート中で、３００ｎＭＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰキメラタンパク質を１０ｎＭＢｏＮＴ／Ａと混合した。ＣＦＰを４３６ｎｍで励起し、９０分にわたって、３０秒の間隔で、ＣＦＰチャネル（４７０ｎｍ）とＹＦＰチャネル（５２７ｎｍ）の蛍光を記録した。ＢｏＮＴ／Ａの添加は、ＹＦＰチャネル発光の減少及びＣＦＰチャネル発光の増加をもたらした。この結果によって、本発明者らは、複数試料中のボツリヌス神経毒素酵素活性の速度論をリアルタイムで追跡することができた。例えば、図４Ｂに示されているように、ＢｏＮＴ／Ａ又はＥの様々な濃度を３００ｎＭＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰ中に添加し、図４Ａに記載されているように、各試料のＦＲＥＴ比を同時にモニターした。ＦＲＥＴ比の変化は毒素濃度と関連していた。毒素濃度が高いほど、ＦＲＥＴ比の減少は迅速であった。ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰのみ（図４Ｃ、左図）又はＣＦＰとＹＦＰの混合物（図４Ｃ、右図）の何れかに対して、著しい変化が検出されなかったので、ＦＲＥＴ比のこの変化は特異的である。

この段階で、ＦＲＥＴ比の変化をバイオセンサータンパク質の実際の切断と相関付けることは困難であるが、この方法は、これらの試料が同時に調製及びスキャンされたときに、複数試料間で毒素切断速度論を比較するための最も簡単な方法をなお提供する。阻害剤が毒素の酵素活性に対してどのように影響を及ぼすかについての情報を与えるので、この方法は、高処理量スクリーニング毒素阻害剤に対して特に有用である。本発明者らは、これらの事例では、各速度論パラメータに対する単位は、基質濃度に代えて、ＦＲＥＴ比であることを注記する。

ある期間にわたって、毒素の様々な濃度を毒素の標的バイオセンサータンパク質の固定量とともに温置することによって、ＦＲＥＴを基礎とするこのアッセイの感度を測定する。マイクロプレート分光蛍光光度計を用いて、ＦＲＥＴ比を記録し、毒素濃度に対してプロットする。図５Ａに示されているように、この方法は、４時間の温置後に、ＢｏＮＴ／Ａ及びＥに対して同様の感度を有し（ＢｏＮＴ／Ａに対するＥＣ_５０は１５ｐＭであり、ＢｏＮＴ／Ｅに対するＥＣ_５０は２０ｐＭである。上図）、１６時間の温置は検出感度を僅かに増加させた（図５Ａ、下図）。４時間の温置を用いると、ＢｏＮＴ／Ｂ及びＦに対する感度は互いに似通っているが、ＢｏＮＴ／Ａ及びＥより約１０倍低い（図５Ｂ、上図、ＥＣ_５０はＢｏＮＴ／Ｂに対して２４２ｐＭであり、ＢｏＮＴ／Ｆに対して２０７ｐＭである。）。温置期間を１６時間まで延長することによって、ＢｏＮＴ／Ｂ及びＢｏＮＴ／Ｆ活性を検出する能力がそれぞれ８倍及び２倍増加した。

生きた細胞中のボツリヌス神経毒素活性のモニタリング
ＣＦＰ−ＹＦＰを基礎とするバイオセンサーアッセイは、インビトロでボツリヌス神経毒素を検出するために使用することができるのみならず、生きた細胞中でも使用することができる。この用途を確立するために、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ＹＦＰでＰＣ１２細胞を形質移入した。ＰＣ１２細胞は、ＢｏＮＴ／Ａ及びＥを取り込むことができる神経内分泌細胞株である。形質移入された細胞をＢｏＮＴ／Ａ（５０ｎＭ）とともに７２時間温置し、ＣＦＰ−ＹＦＰＦＲＥＴ検出に対する特殊なフィルターの組を備えた落射蛍光顕微鏡を用いて、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ２５−ＹＦＰを発現する細胞のＦＲＥＴ比を記録した。簡潔に述べれば、２つのフィルターの組（１つはＣＦＰ用（励起４３７ｎｍ／発光４７０ｎｍ）及び他方はＦＲＥＴ用（励起４３７ｎｍ／発光５３５ｎｍ））を用いて収集された同じ細胞からの画像の蛍光強度間の比として、ＦＲＥＴ比を計算する。合計５３個の細胞を収集し、同じバイオセンサータンパク質を発現するが、毒素に曝露されなかった対照細胞の同じ数と比較した。図６Ａに示されているように、７２時間のＢｏＮＴ／Ａ処理は、検査されている細胞集団に対するＦＲＥＴ比を著しく減少させた（ｐ＜１．４７Ｅ−０５）。野生型ＰＣ１２細胞は、ＢｏＮＴ／Ｂ及びＦに対して感受性でない。

シナプトタグミンＩＩ（ＢｏＮＴ／Ｂに対する受容体）及びＣＦＰ−ＳｙｂＩＩ−ＹＦＰバイオセンサーの両方を発現するＰＣ１２細胞株が最近作製された。生きた細胞中でのＢｏＮＴ／Ｂ作用を検出するために、これらの細胞を使用した。図６Ｂに示されているように、７２時間のＢｏＮＴ／Ｂ（３０ｎＭ）処理は、細胞中で発現されたバイオセンサータンパク質のＦＲＥＴ比を著しく減少させた（ｐ＜２．１Ｅ−１０）。本発明者らは、両バイオセンサータンパク質に対するＦＲＥＴ比を変化させないように見受けられる多数の細胞がなお存在したことに注目する。可能な説明が幾つか存在する。第一に、毒素／バイオセンサータンパク質比がこれらの細胞中では低すぎ得るので、バイオセンサータンパク質の著しい切断には、さらに長い温置時間を必要とし得る。第二に、これらの細胞は、タンパク質合成活性の高いレベルを有し得るので、新しいバイオセンサータンパク質は、切断産物を迅速に置き換える合成であった。それにも関わらず、これらの実験は、生きた細胞及び神経細胞中でＦＲＥＴを基礎とするアッセイを採用できる可能性を示している。

ＢｏＮＴの細胞を基礎とする検出
細胞を基礎とする研究を実施するために、本発明者らは、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（１４１−２０６）−ＹＦＰセンサーでまずＰＣ１２細胞を形質移入した（図７ａ）。材料と方法の部に上述されているように、落射蛍光顕微鏡を用いた確立された３つ組みフィルター法を用いて、図２ａに示されているように、生きた細胞中のＦＲＥＴシグナルを取得した（Ｇｏｒｄｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．ＢｉｏＰｈｙｓ．Ｊ． ７４， ２７０２−２７１３（１９９８）；及びＳｏｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｇｒｂ２ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ） ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０，１３９５−１３９８（２０００））。形質移入されたＰＣ１２細胞を５０ｎＭＢｏＮＴ／Ａで９６時間処理した。それらの蛍光画像を分析し、標準化されたＦＲＥＴ比（補正されたＦＲＥＴ／ＣＦＰ）を図７ｂにプロットした。ＳＮＡＰ−２５（４１−２０６）断片は、インビトロで完全長ＳＮＡＰ−２５と類似の毒素切断速度を有することが報告されたが（Ｗａｓｈｂｏｕｒｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｔｙｐｅｓ Ａ ａｎｄ Ｅ ｒｅｑｕｉｒｅ ｔｈｅ ＳＮＡＲＥ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ＳＮＡＰ−２５ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１８， １−５ （１９９７））、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（１４１−２０６）−ＹＦＰは生きた細胞中では優れた毒素基質でないように見受けられた。９６時間のＢｏＮＴ／Ａ（５０ｎＭ）の温置は細胞集団間でのＦＲＥＴ比の小さな（但し、有意な）シフトを示し、細胞内では切断が非効率的であり、このセンサーは細胞内での毒素検出のためには実用的でないことを示唆する。

驚くべきことに、ＳＮＡＰ−２５は２０６アミノ酸残基長であるという事実に関わらず、ＣＦＰとＹＦＰ間のリンカーとして完全長ＳＮＡＰ−２５を使用することは、ＰＣ１２細胞中で発現されたときに、ＦＲＥＴの著しいレベルを生成することを本発明者らは見出した（図７ｃ及び図８ｃ）。タンパク質（ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（Ｃｙｓ−Ａｌａ）−ＹＦＰと表記される。）のサイトゾル分布をもたらすＳＮＡＰ−２５内のパルミトイル化部位（Ｃｙｓ８５、８８、９０、９２Ａｌａ）の変異は、ＦＲＥＴシグナルを著しく低下させたので（図７ｄ）、このＦＲＥＴシグナルは、ＳＮＡＰ−２５の膜アンカーに依存している（Ｌａｎｅ ＆ Ｌｉｕ， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｌｍｉｔｏｙｌａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＳＮＡＰ−２５．Ｊ．ＮｅｕｒｏＣｈｅｍ．６９， １８６４−１８６９ （１９９７）； Ｇｏｎｚａｌｏ ｅｔ ａｌ．， ＳＮＡＰ−２５ ｉｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４， ２１３１３−２１３１８ （１９９９）； Ｋｏｔｉｃｈａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＳＮＡＰ−２５ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｔｓ ｌｏｃａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ＳＮＡＲＥ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１５， ３３４１−３３５１ （２００２）； Ｇｏｎｅｌｌｅ−Ｇｉｓｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＳＮＡＰ−２５ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１３ （Ｐｔ １８）， ３１９７−３２０５ （２０００））（ＦＩＧ．７ｄ）。この知見は、ＳＮＡＰ−２５の膜繋着がＳＮＡＰ−２５のＮ末端とＣ末端を互いに近接される立体構造的変化をもたらし得ることを示唆する。このセンサーは、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（ＦＬ）−ＹＦＰと表記される。ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（ＦＬ）−ＹＦＰを発現する細胞を５０ｎＭＢｏＮＴ／Ａとともに温置することによって、経時的なＦＲＥＴ比が徐々に減少した（図７ｃ、右図）。センサーのＢｏＮＴ／Ａ切断は、２つの断片（膜上に留まったＣＦＰタグ付加されたＳＮＡＰ−２５のＮ末端断片（図２Ｃ、中央図）及び毒素切断後に、サイトゾル中に再分布すると予測されたＹＦＰタグ付加されたＳＮＡＰ−２５の短いＣ末端断片）をもたらした。興味深いことに、本発明者らは、Ｃ末端切断産物であるＳＮＡＰ−２５（１９８−２０６）−ＹＦＰが、毒素切断後に殆ど消失したことに気づいた（図２ｃ、中央図中の「ＹＦＰ」フレーム）。この観察はイムノブロット分析（図７ｅ）によって確認され、この可溶性断片は膜上に保持された他の断片よりずっと素早く分解させることを示唆する。この予想外の結果は、ＣＦＰとＹＦＰ蛍光間の比を単にモニタリングすることによって、生きた細胞中の毒素活性を検出するための別の方法を与える。

ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖は膜局在化シグナルを含有し、分化したＰＣ１２細胞中の形質膜を標的とすることが最近報告された（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１， ３２０８−３２１３ （２００４））。従って、本発明者らは、ＳＮＡＰ−２５の膜繋着が、ＢｏＮＴ／Ａによる効率的な切断にとって不可欠であるという可能性を調べた。この考えを直接調べるために、サイトゾル中に分布したＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（Ｃｙｓ−Ａｌａ）−ＹＦＰ（図７ｄ）及び形質膜に繋着されたＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（ＦＬ）−ＹＦＰを使用して、ＰＣ１２細胞を形質移入し、細胞中でのＢｏＮＴ／Ａによる切断に関して平行してアッセイした。図７ｅに示されているように、ＢｏＮＴ／Ａとの細胞の温置はＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（ＦＬ）−ＹＦＰセンサーの著しい量の切断をもたらしたが、同じアッセイ条件下で、ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（Ｃｙｓ−Ａｌａ）−ＹＦＰの検出可能な切断は存在しなかった。

この知見をさらに確認するために、本発明者らは、ＳＮＡＰ−２５の短い断片（形質膜にＧＦＰを標的化することができる残基８３から１２０）（Ｇｏｎｚａｌｏ ｅｔ ａｌ．， ＳＮＡＰ−２５ ｉｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４， ２１３１３−２１３１８ （１９９９））（図８ａ）を用いて、形質膜に対するＳＮＡＰ−２５（１４１−２０６）を含有する非効率なセンサーも標的とした。予想通り、形質膜へのＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（１４１−２０６）−ＹＦＰセンサーの繋着はＢｏＮＴ／Ａによる効率的な切断をもたらした（図８ｂ）。これらの知見は、ＳＮＡＰ−２５の細胞内局在化が実際に細胞中でのＢｏＮＴ／Ａによる効率的な切断にとって不可欠であることを示唆する。

本発明者らは、次に、細胞中でのＢｏＮＴ／Ｂ活性をアッセイするためにＣＦＰ−Ｓｙｂ（３３−９４）−ＹＦＰセンサーを使用することができるかどうかを調べた。これらの研究のために、本発明者らは、ＢｏＮＴ／Ｂの細胞中への侵入を媒介するシナプトタグミンＩＩを発現するＰＣ１２細胞株を使用した（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ ｍｅｄｉａｔｅ ｅｎｔｒｙ ｏｆ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６２， １２９３−１３０３ （２００３））。図９ａに示されているように（上図）、形質移入されたＣＦＰ−Ｓｙｂ（３３−９４）−ＹＦＰは、細胞全体に存在する可溶性タンパク質である。ＣＦＰ−ＳＮＡＰ−２５（１４１−２０６）−ＹＦＰの場合と同様に、ＢｏＮＴ／Ｂ（５０ｎＭ、９６時間）処理は、ＦＲＥＴ比を僅かに減少したに過ぎず（図９ａ、下図）、このセンサーの切断は細胞内でも非効率であることを示唆する。

ＢｏＮＴ／Ａセンサーを用いた本発明者らの経験に基づいて、本発明者らは、Ｓｙｂの細胞内局在化がＢｏＮＴ／ＢによるＳｙｂの切断にとって重要であるかどうかを調べた。内在性Ｓｙｂは１１６アミノ酸残基の長さであり、単一の膜貫通ドメイン（残基９５から１１６、図９ｂ）を通じて分泌小胞上に存在する。適切な小胞の局在化を確保するために、本発明者らは、ＣＦＰとＹＦＰの間のリンカーとして完全長Ｓｙｂを使用した。ＣＦＰは、小胞管腔中の酸性環境に対して比較的耐性を有するので（Ｔｓｉｅｎ， Ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７， ５０９−５４４ （１９９８））、ＣＦＰはＳｙｂのＣ末端に融合され、小胞内に存在すると予測されるのに対して、ＹＦＰはＳｙｂのＮ末端に融合され、サイトゾルに向かい合う（図９ｂ）。このセンサーは、ＹＦＰ−Ｓｙｂ（ＦＬ）−ＣＦＰと表記される。ＦＲＥＴは、ここで、ＣＦＰとＹＦＰの間で起こる可能性は少ないので、ＢｏＮＴ／Ｂによる切断をモニターするために、新しいアプローチを採用した。ＹＦＰ−Ｓｙｂ（ＦＬ）−ＣＦＰセンサーの切断は、サイトゾル中に放出されるＹＦＰタグ付加されたＮ末端部分及び小胞内に限局されるＣＦＰタグ付加された短いＣ末端部分を含む２つの断片を生成する。従って、毒素活性は、細胞中のＹＦＰ蛍光の再分布をもたらす。ＹＦＰ−Ｓｙｂ（ＦＬ）−ＣＦＰは、細胞中において効率的な毒素センサーであることが明らかとなった。図９ｃに示されているように、ＢｏＮＴ／Ｂでの処理は、小胞からのＹＦＰの解離及びサイトゾル中でのその再分布をもたらした。本発明者らは、可溶性ＹＦＰ断片が核内に侵入することができ、毒素処理前に核内には蛍光シグナルが存在せず（図９ｃ）、ＹＦＰ再分布を容易に検出できる領域を与えることに注目する。ＦＲＥＴアッセイとは異なり、この検出法は、ＣＦＰとＹＦＰ間の短い距離を必要とせず、従って、生きた細胞中のプロテアーゼ活性をモニターするための新規アプローチを提供する。

Ｓｙｂ（３３−９４）を含有するセンサーの非効率的な切断はＮ末端３２アミノ酸が欠如することによるものであるという可能性を除外するために、Ｎ末端の３２残基を欠如するＳｙｂの末端切断形態を含有するセンサー（ＣＦＰ−Ｓｙｂ（３３−１１６）−ＹＦＰと表記）を構築した。このセンサーは、Ｓｙｂを小胞に繋着させる膜貫通ドメイン（残基９５から１１６）に加えて、非効率的なセンサー（残基３３から９４）を有するＳｙｂの同じサイトゾルドメインを含有する。平行してアッセイされた場合に、ＣＦＰ−Ｓｙｂ（３３−１１６）−ＹＦＰの有意な量が４８時間後にＢｏＮＴ／Ｂによって切断されるのに対して、ＣＦＰ−Ｓｙｂ（３３−９４）−ＹＦＰの検出可能な切断は存在せず（図９ｄ）、小胞の局在化が細胞内の切断効率を決定することを示唆する。この結論は、負に帯電した脂質混合物の存在がＢｏＮＴ／Ｂ、ＴｅＮＴ及びＢｏＮＴ／ＦによるＳｙｂのインビトロでの切断速度を増強するという最近の報告によってさらに支持される（Ｃａｃｃｉｎ ｅｔ ａｌ．， ＶＡＭＰ／ｓｙｎａｐｔｏｂｒｅｖｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｔｅｔａｎｕｓ ａｎｄ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ ｉｓ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｙ ａｃｉｄｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５４２， １３２−１３６ （２００３）。毒素は細胞内の小胞膜に結合しやすく、従って、小胞上に局在化されたＳｙｂに遭遇する機会が増加し得る可能性がある。あるいは、効率的な切断のために必要とされるＳｙｂの適切な立体構造状態を維持するために、膜貫通ドメインの存在が不可欠であり得るという可能性もある。

完全長のＳＮＡＰ−２５及びＳｙｂＩＩをリンカーとして使用することによって、生きた細胞中での内在性基質切断を反映し得る優れた光学的レポーターがもたらされた。これら２つのレポーターは、全ての７つのボツリヌス神経毒素及び破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）を検出できるはずである。基質リンカー配列は、長さを変化させることによって、又は他の毒素切断若しくは認識部位を変異させることによって、各ＢｏＮＴ又はＴｅＮＴに対する特異的検出を達成するように容易に修飾させることができる。これらの毒素バイオセンサーは、毒素阻害剤の細胞を基礎とするスクリーニング並びに毒素基質の認識及び細胞中での切断の研究を可能とするはずである。

先述の記載及び実施例は、本発明を例示するために記載されているに過ぎず、限定を意図するものではない。当業者は本発明の精神及び本質を取り込む開示された実施形態の改変に想到し得るので、本発明は、添付の特許請求の範囲及びその均等物に属する全ての改変を含むように広く解釈しなければならない。本明細書中に引用されている及び／又は以下に列記されている全ての参考文献は、参照により、明示的に本明細書に組み込まれる。

本明細書中の発明の概念から逸脱することなく、既に記載されているものの他に、より多くの修飾が可能であることが当業者に自明なはずである。従って、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の精神以外に限定されるものではない。さらに、本明細書及び特許請求の両方を解釈する際には、文脈と合致する限りできるだけ広義に全ての用語を解釈しなければならない。特に、「含む」及び「含んでいる」という用語は、非排他的な様式で、要素、成分又は工程を表すものと解釈しなければならず、参照されている要素、成分又は工程が、明示的に参照されていない他の要素、成分又は工程とともに存在し、又は使用され、又は組み合わされ得ることを示す。本明細書が、Ａ、Ｂ、Ｃ・・・及びＮからなる群から選択される何かの少なくとも１つを参照する場合、その文章は、非Ａ＋Ｎ又はＢ＋Ｎなど、その群からの１つの要素のみを必要とするものと解釈しなければならない。

Claims (25)

1. 構築物であって、
   ドナーが双極子−双極子カップリング機構によってアクセプターにエネルギーを転移することができるような電気的カップリングを与えるように配置されたドナー標識及びアクセプター標識、並びに
   ドナーとアクセプターの間に配置され、切断部位配列を有するリンカー、並びにドナーと切断部位配列及びアクセプターと切断部位配列の少なくとも１つの間のスペーサー、
   を有する構築物。
2. ドナー及びアクセプターの少なくとも１つが蛍光団又は発色団の少なくとも１つである、請求項１の構築物。
3. 双極子−双極子カップリング機構がフォスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）である、請求項１の構築物。
4. リンカーが５ｎｍ以上の一次構造長を有する、請求項１の構築物。
5. リンカーが８ｎｍ以上の一次構造長を有する、請求項１の構築物。
6. リンカーが１２ｎｍ以上の一次構造長を有する、請求項１の構築物。
7. リンカーは少なくとも３つのアミノ酸を有するスペーサーを含む、請求項１の構築物。
8. リンカーがＳＮＡＲＥモチーフを含む、請求項７の構築物。
9. スペーサーが少なくとも５つのアミノ酸を有する、請求項７の構築物。
10. スペーサーが（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎは、１から３である。）を含む、請求項７の構築物。
11. スペーサーが（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎは、１から３である。）を含む、請求項７の構築物。
12. スペーサーが、スペーサーなしの対応する構築物と比べて電気的カップリングを増加させる、請求項１の構築物。
13. スペーサーがＳＮＡＲＥモチーフを含む、請求項１の構築物。
14. 切断部位配列がＳＮＡＲＥタンパク質の変異タンパク質を含む、請求項１の構築物。
15. 切断部位配列が（ａ）ＳＮＡＲＥタンパク質、モチーフ、変異タンパク質の少なくとも１つ及び（ｂ）少なくとも５つのアミノ酸を有するスペーサーを含む、請求項１の構築物。
16. スペーサーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ及び（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎは、１から３である。）からなる群から選択される配列を含む、請求項１５の構築物。
17. 構築物が、ＣＦＰ−（ＳＧＬＲＳＲＡ）−ＳＮＡＰ−２５−（ＳＮＳ）−ＹＦＰ及びＣＦＰ−（ＳＧＬＲＳＲＡ）−シナプトブレビン−（ＳＮＳ）−ＹＦＰからなる群から選択される、請求項１の構築物。
18. ドナー標識とアクセプター標識の間のエネルギー転移の感度を向上させる方法であって、
    リンカーを通じて物理的に結合されたドナー標識とアクセプター標識を含む構築物を準備すること、
    リンカー中に切断部位配列を含めること、及び
    ドナーと切断部位配列並びにアクセプターと切断部位配列の少なくとも１つの間に、リンカー中にスペーサーを含めること（これによりドナーとアクセプター間の電気的カップリングが増加される。）、
    を含む、方法。
19. 構築物がタンパク質を基礎とする構築物であり、及びリンカーがペプチド配列である、請求項１８の方法。
20. 切断部位配列がＳＮＡＲＥタンパク質又はその断片若しくは変異タンパク質を含み、及びスペーサーが少なくとも５つのアミノ酸を含む、請求項１８の方法。
21. スペーサーが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ及び（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎは、１から３である。）からなる群から選択される配列を含む、請求項１８の方法。
22. スペーサーが、ドナーとアクセプターの間の三次構造距離を低下させることによって、ドナーとアクセプターの間の電気的カップリングを増加させる、請求項１８の方法。
23. スペーサーが、ドナーとアクセプター間に電気的跳躍を付与することによって、ドナーとアクセプターの間の電気的カップリングを増加させる、請求項１８の方法。
24. アッセイが完全な細胞に対して適用される、請求項１８の方法。
25. ボツリヌス神経毒素を検出する方法であって、ａ）請求項１の構築物を準備すること（リンカーは、検出されるべきボツリヌス神経毒素の基質タンパク質又は切断可能なその断片である。）、ｂ）ボツリヌス神経毒素が基質タンパク質又はその断片を切断する条件下で、ボツリヌス神経毒素を含有すると疑われる試料に前記構築物を曝露すること、並びにｃ）構築物が試料に曝露される前及び後に、ＦＲＥＴシグナルを検出及び比較することを含み、ＦＲＥＴの減少が試料中のボツリヌス神経毒素の存在を示す、方法。

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