JP2014518376A - 非ｆｒｅｔボツリヌスアッセイ - Google Patents

Abstract

組成物は、（ｂ）切断部位に化学的に結合した（ａ）レポーター含有部分を含む人工構造物を有する。前記切断部位は治験物質と相互作用し前記レポーター含有部分を前記構造物の残り部分から切断する。切断された部分は局所環境によって、破壊あるいは分解され、治験物質の存在は、レポーターからのシグナルの減少によって示される。前記治験物質は、好ましくは、ボツリヌストキシン（BoTN）であり、前記切断配列は、SNAREタンパク質の全部又は一部である。前記切断可能レポーター含有部分は、好ましくは、黄色蛍光タンパク質（YFP）、シトリン、ビーナス、又はYPetタンパク質である。

Description

本出願は、2011年6月1日出願の米国仮特許出願第61/492237号の優先権を主張するものである。この優先権出願とその中で参照されているその他の刊行物とを、そのそれぞれが個別、独立的に参考文献として合体された場合と同様にここに参考文献として合体される。合体される参考文献中におれる用語の定義又は使用法がここに提供されるその用語の定義と一貫しない、又は矛盾する場合には、ここに提供される定義が適用され、参考文献中のその用語の定義は適用されない。

本発明の分野は、プロテアーゼアッセイ、特に、ボツリヌストキシンに関連するプロテアーゼアッセイに関する。

ボツリヌス神経毒（BoNT）は、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）によって産生され、知られているもののなかで最も強力な毒素に含まれる。これらの毒素は、食物中毒のよく知られた原因であり、多くの場合、犠牲者に対して深刻な害あるいはその死さえももたらす。7種類の構造的に関連するボツリヌス神経毒又は血清型（BoNT/A-G）があり、これらのそれぞれは重鎖（〜100KD）と軽鎖（〜50KD）とから構成されている。前記重鎖は受容体媒介エンドサイトーシスによって毒素の標的細胞への侵入を媒介する。一旦、内部に取り込まれると、前記軽鎖はエンドソーム小胞内腔から細胞質ゾルへと転位置し、亜鉛依存プロテアーゼとして作用して小胞標的膜融合を媒介するタンパク質（「基質タンパク質」）を切断する。

これらのBoNT基質タンパク質は、細胞膜タンパク質シンタキシン、表在性膜タンパク質SNAP-25、小胞膜タンパク質シナプトブレビン（Syb）を含む。これらのタンパク質はSNARE（可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体）タンパク質と総称される。SNAREタンパク質の切断は、細胞膜との小胞融合を阻害し、神経筋接合部における神経伝達物質放出を消失させる。SNAREタンパク質中で、シンタキシンとSNAP-25とは通常、標的膜上に位置することから、t-SNAREと呼ばれ、これに対して、シナプトブレビンは専らシナプス内のシナプス小胞で見つかることからv-SNAREと呼ばれている。総合で、これら三つのタンパク質が、小胞膜と細胞膜との間の融合を媒介する最小の機構と考えられている複合体を形成する。BoNT/A、E、及びC¹はSNAP-25を、BoNT/B、D、F、Gはシナプトブレビン（Syb）を単一の、ただし異なる部位において切断する。BoNT/Cも、SNAP-25に加えて、シンタキシンを切断する。

特に明記されない限り、ここに記載されるすべての範囲はそれらのエンドポイントを含むものと解釈され、オープンエンド範囲は、商業的に実用的な値を含むものと解釈される。同様に、値のすべてのリストは特に明記されない限り中間値を含むものと解釈される。

食中毒源として、又、バイオテロリズム武器としてのその脅威により、BoNTを感度良く、かつ迅速に検出することが必要である。現在、毒素を検出するための最も高感度な方法は、マウスで毒性アッセイを行うことである。この方法は、多数のマウスを必要とし、時間がかかり、毒素触媒反応動態を研究するためには使用できない。毒素に対する抗体の使用に基づく多くの増幅免疫アッセイシステムが開発されているが、これらのシステムの大半は複雑で高価な増幅処理を必要とするものであり、これらも毒素触媒活性の研究に使用することはできない。切断された基質分子を検出し、これらの毒素の酵素活性を測定するためにHPLCと免疫アッセイを使用することが可能ではあるが、これらの方法は一般に時間がかかり、複雑であり、これらのうちのいくつかは特殊な抗体を必要とするものであり、その理由により大規模なスクリーニング用としては利用できない。従って、BoNTを検出するための新規で改善された方法と組成物とが求められている。

ここ数年間において、研究者はBoNTを検出するためにFRETを使用することを研究し始めている。FRETアッセイにおいては、毒素切断部位を含む短い合成ペプチド（12〜35のアミノ酸）中で二つの天然アミノ酸に置き換えるために二つの蛍光発光アミノ酸誘導体が使用されている。それらが前記ペプチド中において互いに近接する時、一つのアミノ酸誘導体の蛍光シグナルが別のアミノ酸誘導体によって消光される。このメカニズムが、「フェルスター共鳴エネルギー移動（Forster resonance energy transfer）」（FRET）と呼ばれている。前記ペプチドの切断によって二つのアミノ酸誘導体が互いに分離され、それによりFRET中における減少を検出することができる。

FRETアッセイは、これまでBoNTの検出するために成功して使用されている（例えば、特許文献１（2003年10月28日出願のChapmanの米国特許出願第2004/0191887号）、特許文献２（2004年12月20日出願のChapmanの米国特許出願第2006/0134722号）、特許文献３（Stewardの米国特許第7208285号 （2007年4月））、特許文献４（Fernandez-Salasの米国特許第7183066号（2007年2月））、そして特許文献５（米国特許出願第2011/0033866号（2010年2月公開））を参照）。

FRETアッセイをBoNTの検出に利用することにおいていくらかの成功が示されてはいるが、その感度と特異性とは多くの目的のためにはまだ望ましいものではない。

例えば、BoNT基質タンパク質の局在化確認のためのFRETアッセイにおいて、ペプチドの切断時のFRET発光の損失に関する測定が重度の干渉を受ける可能性があり、その結果、場合によってはBoNT無しで処理された細胞と飽和濃度のBoNTで処理された細胞との間に差がないことがある。従って、FRETの損失に基づく方法はBoNTによって引き起こされた変化の報告が非常に不良であり、従って、その低い統計的性能と再現性とによってそれは信頼性の低い方法となっているということができる。特許文献６（Ester Fernandez-Salasの米国特許出願第 2009/0191583号）は単一の蛍光体のみを用いた非-FRET BoNTアッセイに言及している。この文献に開示のアッセイは、効率的なクロストリジウム毒素取り込みが可能で、蛍光マーカーを含む膜局在化コクストリジウム毒素基質を含む細胞を使用している。

例えば、この文献において利用可能な細胞は、細胞膜に局在化するSNAP25₂₀₆-エンハンスト緑色蛍光タンパク質（EGFP）融合タンパク質を発現することができる。この細胞をBoNT/A処理すると、前記膜局在化SNAP25₂₀₆-EGFP基質の切断が起こり、EGFP含有フラグメントが細胞質内に放出される。処理された細胞を484nMレーザーで励起すると、前記EGFPが励起され、510nMの光が放出される。しかしながら、前記EGFPの一部分は今や細胞質であるので、切断されなかった膜局在化SNAP25₂₀₆-EGFP毒素基質と切断された局在化EGFPフラグメントとの間の分布の変化をBoNT/A処理細胞中に観察することができる。従って、前記アッセイは、定質的な分析には有効であるかもしれないが、膜と細胞質との両方にEGFP発光部分が存在することから、この方法は定量的分析には望ましいものではない。

米国特許出願第2004/0191887号 米国特許出願第2006/0134722号 米国特許第7208285号 米国特許第7183066号 米国特許出願第2011/0033866号 米国特許出願第 2009/0191583号

したがって、FRETと非-FRETアッセイとの両方に対して従来技術の欠点と限界とを克服する改良された装置、システム、及び方法が未だに必要とされている。

発明の要約
本発明は、組成物が、（ｂ）切断部位に化学的に結合した（ａ）レポーター含有部分を含む人工構造物を有し、前記レポーター含有部分を構造物の残りの部分から切断するように治験物質と相互作用することを特徴とする方法とアッセイを提供する。一つの具体的なクラスの実施例は、ボツリヌストキシンの定質的及び定量的検出のための方法に関し、これは、
（ｉ）人工構造物と酵素とを含む組成物を提供する工程、
ここで、前記構造物は、（ａ）レポーター含有部分と、（ｂ）前記レポーター含有部分の前記構造物の残り部分からの切断をもたらすようにボツリヌストキシンの一部分と相互作用する切断部位とを有し、
ここで、前記組成物はベースラインシグナルを同定する発光を示し、
ここで、前記酵素は前記切断前よりも前記切断後において前記レポーター含有部分の分解を少なくとも10倍速く促進する、
（ｉｉ）前記ベースラインシグナルから第１発光測定値を得る、
（ｉｉｉ）前記組成物を前記ボツリヌストキシンに対して暴露させる、そして次に、
（ｉｖ）以下の指標として前記ベースラインシグナルの低下について前記組成物を更にテストして別の発光測定値を得る、
前記トキシンの前記切断部位における前記構造物の切断、そして
前記レポーター含有部分の分解、
（ｖ）工程（ｉｉ）の前記第１発光測定値を工程（ｉｖ）の前記別の測定値と比較する。

ここでの使用において、特に銘記されない限りは、「に結合する」という用語は、直接結合（互いに結合された二つのエレメントが互いに接触している）と間接結合（少なくとも１つの追加のエレメントが二つのエレメント間に位置する）との両方を含むものとする。従って、用語「に結合」と「と結合」という用語は同義的に使用される。

更に、本発明の課題は、治験物質の存在をテストするためのアッセイに関し、これは、人工構造物と酵素とを含む細胞を有し、ここで、前記構造物は、被保護部分と保護部分とを含み、前記被保護部分はレポーターを含むように選択され、そして、前記治験物質はイン・ヴィトロで前記被保護部分を保護解除するように作用し、前記酵素は、前記被保護部分が保護されている時よりも保護解除された時のほうがこの被保護部分の分解が少なくとも10倍速くなるように促進し、それによって前記治験物質の定量的測定に使用される前記レポーターから得られるシグナルを減少させる。

前記切断されたレポーター含有部分は、局所環境によって破壊もしくは分解され、次に、前記治験物質の存在が、前記レポーターからのシグナルの低下によって示される。本出願の文脈において、前記被保護部分の分解は、通常、二つの経路のうちの少なくとも１つによる、タンパク質をプテアソームに標的化するユビキチン依存プロセスによる、あるいは、オートファジー（自己貪食）−リソソーム経路、による細胞内的なものであると考えられる。一つの経路において、前記プテアソームは前記酵素である。前記リソソーム経路においては、対象酵素は、特に、カテプシンと呼ばれるプロテアーゼのファミリーを含む、加水分解酵素であると考えられる。

好適実施例において、前記治験物質はボツリヌストキシン（BoTN）であり、前記切断配列は前記治験物質と適切にマッチングされる。例えば、BoNT/A、E、及びCはSNAP-25を、BoNT/B、D、F、Gはシナプトブレビン（Syn）を、単一の、ただし異なる部位において切断する。BoNT/Cも、SNAP-25に加えて、シンタキシンを切断する。

考えられる切断部位は、好ましくは、（ａ）SNAREタンパク質、モチーフ、又は変異タンパク質（mutein）を含むことができる。ここで、タンパク質の「変異タンパク質」とは、対応の天然タンパク質に対して少なくとも30%の同一性を有するもの、例えば、前記天然タンパク質に対して少なくとも35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は98%の同一性を有する組成物を含む。同一性からのバリエーションは、任意のより多くの追加、欠失、及び置換を含むことができる。考えられる変異タンパク質は、断片（fragment）、切断体（truncate）、及び融合タンパク質を含む。

好適実施例の別の態様において、前記切断可能レポーター含有タンパク質は、蛍光タンパク質、例えば、黄色蛍光タンパク質（Yellow Florescent Protein、YFP）、を含む。YFPは、オワンクラゲ（Aequorea Victoria）由来の、緑色蛍光タンパク質の遺伝的変異体であり、514 nMの励起ピークと527 nmの発光ピークを有する。

更に、密接に関連するシトリン（Citrine）、ビーナス（Venus）、又はYPetタンパク質も前記切断可能レポーター含有タンパク質に使用可能であると考えられる。改変は、塩化物感度の低下、突然変異速度の増加、輝度（減衰係数と量子収量の積）の増大をもたらす。もちろん、特定の特性を持つようにここに記載した蛍光タンパク質を改変したり、特定のサイズに切断（truncate）することも可能である。

切断されると、前記構造物は、二つの部分、即ち、前記サイトゾル又は他の局所的環境によって破壊又は分解されるレポーター含有部分と、第２部分、とに切断される。シグナル検出を正規化するために、その第２部分は、好ましくは、前記レポーターの反対側端部に、前記アッセイの正規化を補助可能な、第２蛍光タンパク質、を有する。前記第２蛍光タンパク質は、シアン蛍光タンパク質（Cyan Florescent Protein、CFP）、mCherry、又はmStrawberryとすることができる。前記レポーター含有部分は、フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を生み出すように前記第２蛍光体と結合されていない。

したがって、前記構造物のBoTN又はその他の切断基質に対する暴露の前に、当該構造物（細胞ベースのもの又はその他）を含有する前記組成物は、ベースラインシグナルを示し、暴露後に、低下したシグナルを示す。YFP分解の測定のために、直接的には、別箇に励起された、YFP発光（上部、Ex500、Em526）とCFP発光（中間、 Ex434、Em470）とが集められる。その後、これらの発光から、バックグラウンドが減じられ、YFP発光をCFP発光で割って、個々の細胞における細胞密度とレポーター発現に対して制御（control）する。この発光比（YFP/CFP、下部）は、アッセイが報告される方法である。

前記レポーター含有部分の破壊又は他の分解は、BoTNに対する暴露前よりも暴露後に遥かに速く起こる。好適実施例において、前記レポーター含有部分の破壊又は他の分解は、BoTNに対する暴露前に対して暴露後に少なくとも2倍の速さで起こるが、より好ましくは、その暴露後の比率は暴露前の比率の少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍の速さで起こる。

好適実施例の更に別の態様において、前記局所環境は、生きた細胞のサイトゾルである。例えば、YFPをC末端蛍光体として使用することができ、CFPをN末端蛍光体として使用することができる。実験によって、今般、BoNT/Aが不在の場合、YFPを直接励起して、発光を集めることが可能であることが示された。励起は、通常505 nMで起こり、対応の発光は527nMである。BoNT/Aの存在下では、前記レポーターは切断されてYFPを含有するフラグメントが発光される。このフラグメントは、前記細胞によって分解されて、YFPとその発光を破壊する。従って、BoNT/A活性は、YFP発光における損失に対する測定によって検出される。従って、FRETは必要でなく、これによって上述したすべての限界と問題とが回避される。

トランスフェクション細胞に形成されるハイブリッドタンパク質は、好ましくは、膜貫通ドメインを含み、これは細胞内小胞に局在する傾向であり、それによって小胞結合基質を提示する。トランスフェクション細胞内へのBoNTの重鎖媒介エンドサイトーシス後は、軽鎖の小胞の外表面上での提示があり、これによって、前記ハイブリッドタンパク質（単数又は複数）の切断配列を切断するという軽鎖のプロテアーゼ活性が可能となり、それによって前記レポーター含有部分を切断し、これが、その後、破壊又は分解されてテストされるシグナルを減少させる。例えば、全長Sybは、116のアミノ酸を含み、単一の膜貫通ドメインを介して小胞に局在化されている。いくつかの考えられるアッセイにおいて、前記膜固定ドメインは、パルミトイル化部位を含むフラグメントを有する。適当な膜固定ドメインは、例えば、ChapmanのUS20060134722に記載されている。

前記膜貫通ドメインがシナプトブレビンの膜貫通ドメインであることが特に好適ではあるが、その変異体（例えば、塩基転移（transition）、塩基転換（transversion）、挿入、欠失、逆位（inversion））、そしてシナプトブレビン以外の膜貫通ドメイン、であってもここでの使用に適したものと考えられる。同様に、前記膜貫通ドメインは前記ハイブリッドタンパク質を膜に対して、当該ハイブリッドタンパク質の残り部分がサイトゾルに暴露された状態で少なくとも一時的に固定されることを可能にする別のポリペプチド部分によって置き換えることも可能であることが銘記される。

前記ハイブリッドタンパク質を発現するトランスフェクション細胞に関して、一般に、その細胞が安定的にトランスフェクションされることが好適である。しかしながら、過渡的なトランスフェクションも考えられる。更に、通常は、前記トランスフェクション細胞が神経細胞であることが好ましい。しかし、他の非神経細胞（哺乳動物、げっ歯類、昆虫類細胞、酵母や細菌細胞）もここでは考えられる。最も典型的には、前記細胞は前記ハイブリッドタンパク質（単数又は複数）を構造的に発現し、したがって、適切な調節エレメントの制御下にある。別の態様に於いて、前記発現は誘導することも可能である。

一好適実施例に依れば、組換え核酸分子、好ましくは、BoTN基質ポリペプチドと適当なレポーターとをコードする発現ベクターが、適当な宿主細胞に導入される。当業者は、適当な発現ベクター、好ましくは、哺乳動物発現ベクターを選択することができ、そして、非常に多数の選択肢があることを理解するであろう。例えば、pcDNAシリーズのベクター、pCIとpSi（Promega, Madison, Wis.）等、CDM8、pCeo4がある。これらのベクターの多くは、ウィルスプロモーターを使用する。好ましくは、Clonetech（Mountain View, CA）のtet-off及びtet-onベクター等の誘導可能なプロモーターが使用される。

前記宿主細胞として多くの選択肢の細胞系が適切である。好ましくは、前記細胞は、その内部で各BoTNがその毒活性を示すタイプのものである。換言すると、前記細胞は、好ましくは、適当な細胞表面受容体を示すか、もしくは、毒素がその細胞内に十分効率的に移動することを許容し、その毒素が適当な基質ポリペプチドを切断することを許容する。具体例としては、初代培養ニューロン（皮膚ニューロン、海馬ニューロン、脊髄運動ニューロン）、PC12細胞又は派生PC12細胞系、初代培養クロマフィン細胞、いくつかの培養神経芽細胞腫細胞系、例えば、マウスコリン性Neuro2a細胞系、ヒトアドレナリン性SK-N-SH細胞系、及びNS-26細胞系があげられる。例えば、Foster and Stringer（1999）、「神経幹と始原細胞集団に導入される遺伝子調節エレメント（Genetic Regulatory Elements Introduced Into Neural Stem and Progenitor Cell Populations）」、Brain Pathology 9: 547-567を参照。

前記レポーター/切断部位構造物のコード領域は適当なプロモーターの制御下にある。使用される宿主細胞のタイプに応じて、多くの適当なプロモーターが知られており、当該技術において容易に入手可能である。そのようなプロモーターは、誘導型又は構成型とすることができる。所望のポリペプチドの発現を指令するためには構成型プロモーターを選択することができる。そのような発現構造体は、それによって、発現宿主を誘導基質を含有する培地上で培養する必要性が回避されるという追加の利点を提供することができる。適当なプロモーターの具体例は、哺乳動物系のLTR、SV40、及びCMV、細菌系のE.coli lac又はtrp、昆虫系のバキュロウィルス多面体プロモーター（polh）、及び、真核細胞又は原核細胞又はそれらのウイルスにおける発現を調節することが知られているその他のプロモーターがある。真菌類発現宿主での使用に好適な強力な構成型及び／又は誘導型プロモーターは、キシラナーゼ（xlnA）、フィターゼ、ATP-合成酵素、サブユニット9（oliC）、トリオースリン酸イソメラーゼ（tpi）、アルコールデヒドロゲナーゼ（AdhA）、アルファ−アミラーゼ（amy）、アミログルコシダーゼ（AG-glaA遺伝子由来）、アセタミダーゼ（amdS）、及びグリセルアルデヒド3-リン酸ヒドロゲナーゼ（gpd）プロモーターがある。強力な酵母プロモーターの具体例は、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクターゼ、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼがある。強力な細菌類プロモーターの具体例は、SPO₂プロモーター、更に、細胞外プロテアーゼ遺伝子由来のプロモーターを含む。

前記発現構造物の誘導可能調節を改善するためにハイブリッドプロモーターも使用可能である。前記プロモーターは、更に、適当な宿主における発現を確保するため、又は、増大するための特徴を備えることができる。例えば、それらの特徴は、プリブナウ（Pribnow）-ボックスやTATAボックス等の保存領域とすることができる。前記プロモーターは、更に、前記ヌクレオチド配列の発現のレベルに影響を与える（それを維持、増加、又は減少させる）ための他の配列を含むことさえも可能である。例えば、適当な他の配列としては、Shl-イントロン、ADHイントロンがある。その他の配列は、温度、化学物質、光、又はストレス誘導型エレメント等の誘導型エレメントを含む。更に、転写又は翻訳を促進する適当なエレメントを存在させてもよい。後者のエレメントの一例は、TMV5’シグナル配列である（Sleat, 1987, Gene 217: 217-225、及びDawson, 1993, Plant Mol. Biol 23:97を参照）。

前記発現ベクターは、更に、前記プロモーターに作用して発現を増幅する配列を含むことができる。例えば、前記SV40、CMV、及びポリオーマーcis−作用エレメント（エンハンサー）、及び選択可能マーカーは選択のための表現型特徴（例えば、哺乳動物細胞に対するジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性、又は、E.coliに対するアンプリシリン（amplicillin）／テトラサイクリン耐性）を提供することができる。前記適当なプロモーター、及び選択マーカーを含む適当なベクターの選択は当業者の水準の範囲内である。

好ましくは、前記構造物の前記コード領域は誘導型プロモーターの制御下にある。構成型プロモーターと比較して、誘導型プロモーターは、細胞中のレポーターの濃度の適切な制御を可能にし、従って、シグナルの変化の測定が大幅に容易化されることから好ましい。

例えば、Tet-on及びTet-offシステムClonetech（Mountain View CA）を使用して発現を制御することができる。このプロモーター制御下で、遺伝子発現は正確で可逆的かつ定量的に調節することができる。簡単に説明すると、Tet-onシステムの場合、下流側遺伝子の転写は、培地中にデオキシサイクリンが存在する時にのみ起こる。ある時間の転写後は、培地を交換してデオキシサイクリンを無くし、それによって新たなレポータータンパク質の合成を停止することができる。従って、新たに合成されたレポータータンパク質からのバックグラウンドは無く、毒素処理後のより早い変化を観察することができる。

光子計数落写蛍光顕微鏡システム（適当なダイクロイックミラーと特定範囲の蛍光発光をモニターするためのフィルターとを備える）、光子計数光電子増倍管、又は蛍光光度計を使用して蛍光分析を行うことができる。エネルギー放射を開始させるための励起を、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Hg）アークランプ、光ファイバー光源、その他の、所望の範囲での励起用に適切にフィルタリングされた高強度光源を使用して行うことができる。なお、当業者には、検出感度を高めるために光電子増倍管手段を組み込むことによって励起／検出手段を強化することが可能であることが明らかであろう。例えば、単一分子スケールでの検出を達成するために、二光子相互相関（two photon cross correlation）法を使用することが可能である（例えば、Kohl等、Proc. Nat’l Acad. Sci., 99: 12161, 2002を参照）。

例えば、溶解した細胞のサイトゾルや、レポーター分子から切断された時に切断可能フラグメントを分解可能であるが、レポーター分子からの切断前は、切断可能フラグメントを分解不能か、可能であるとしても遥かに少なくしか分解できない単数又は複数の酵素を含む合成培地等の、生細胞以外の構造物のため局所環境も考えられる。

更に、上述した構造物をコードする単離ポリヌクレオチド分子を提供することも考えられる。前記構造物は、好ましくは、プロモーターに操作可能に連結された前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。好適なプロモーターは誘導型プロモーターである。

更に別の実施例において、キットは、ここに記載の構造体を適当な容器内に含む。

本発明の課題は、更に、ボツリヌス神経毒のインヒビターをスクリーニングする方法を提供し、これは、上述した構造物を発現するように遺伝的に設計された細胞を提供する工程、前記細胞を候補インヒビターの存在下で前記ボツリヌス神経毒に対して暴露させる工程、そして前記ボツリヌストキシンに対する暴露の前と後で前記細胞の蛍光又はその他のシグナルを検出する工程、前記シグナルを、前記候補インヒビターの不在下で前記ボツリヌス神経毒に対して暴露した時の細胞のシグナルと比較する工程を有する。前記シグナルの減少が回避された程度において、前記候補インヒビターは、ボツリヌス神経毒を阻害することが可能であるとみなされる。いくつかの考えられる実施例において、前記候補化合物は、化合物のライブラリーのメンバーとすることができ、前記方法は高スループットな方法である。

図1は、BoTN/A細胞ベースのレポーターが、YFP蛍光の損失によってBoTN/Aを検出するために使用されるアッセイの一例を図示している。（Ａ）BioSentinelのBoCell（商標）A BoNT/A構造物。前記レポーター蛍光体、YFP、及び正規化蛍光体、CFPは、切断配列SNAP-25（green）、によって結合されている。SNAP-25パルミトイル化は当該レポーターを細胞膜に局在化させる。（Ｂ）YFP蛍光の損失によるBoNT/Aの検出。BoNT/A不在時は、前記YFP部分は直接励起されて蛍光発光を起こす。BoNT/Aによる前記レポーターの切断によって、前記YFP部分を含むC末端レポーターフラグメントがサイトゾル中に放出される。前記フラグメントは急速に分解され、従って、YFP発光が無くなる。前記CFPシグナルは、更に、細胞間レポーター発現レベルと細胞密度とを制御するために使用される。 図２Ａは、蛍光反応におけるBoTN/A誘導変化を図示している。倍率20のNikon（商標） TE2000-U蛍光顕微鏡と、Nikon NIS Elements 3.4ソフトウエアを使用して、半自動化YFP及びCFP蛍光測定を行った。図示されているのは、前記C末端/N末端蛍光タンパク質（FP）蛍光比率について擬似着色されたランダムに選択されたフィールドである。比率は、各蛍光体の直接励起時に集められた発光から計算された。 図２Ｂは、細胞ベースのレポーターの蛍光比率とBoNT/A感受性を示している。各条件についてランダムに選択された30の細胞の、10nM BoTN/Aの存在下又は不在下における蛍光比率を分析した。3つの異なるウェルの5つの顕微鏡フィールドからの前記30の細胞の平均シグナルが図示されている。飽和以上の蛍光を示した細胞は除外された。 図２Ｃは、BoTN/Aが前記レポーターにかかわらず細胞内で活性であったことを示すブロットである。すべてのレポーターが、BoNT/Aの存在下においていくらかの切断を示し、すべてのネイティブSNAP25が切断される。細胞を上述したように、BoTN/Aでトランスフェクションし処理したが、ただしここでは6ウェルプレートにスケールアップした。BoTN/Aとの72時間のインキュベーションの後、細胞を無血清MEMで3回洗浄し、掻爬によって集め、M-Per Lysis Buffer（Pierce（商標））を使用して溶解した。40μgの細胞溶解物を、ニトロセルロース紙に移す前にSDS-PAGEに供し、SNAP-25に対する抗体（クローン71.2、Synaptic Systems）を使用した免疫ブロットに供した。矢印は、前記レポーターの全長（閉鎖）形態と切断（解放）形態の位置を示している。全長（*）と切断（**）されたネイティブSNAP-25が示されている。 図３は、本実施例において、全く同じ細胞プレートから当該技術の慣例に従って、YFP分解とFRET損失との両方に関してデータを集めた。YFP分解については、直接かつ一つの方法で励起されたYFP発光（上部、Ex500、Em526）とCFP発光（中間、Ex434、Em470）が集められる。次にこれらの発光バックグラウンドを減じて、YFP発光をCFP発光で割って個々のウェル中の細胞密度とレポーター発現を制御する。次にこの発光比率（YFP/CFP、下部）をアッセイリポートに用いる。

本発明の様々な課題、特徴、態様、及び利点は、類似の成分が類似の参照番号によって示された添付の図面を参照して、好適実施例の以下の詳細説明からより明らかになるであろう。

図1は、BoTN/A細胞ベースのレポーターが、YFP蛍光の損失によってBoTN/Aを検出するために使用されるアッセイの一例を図示している。

（Ａ）BioSentinelのBoCell（商標）A BoNT/A構造物。前記レポーター蛍光体、YFP、及び正規化蛍光体、CFPは、切断配列SNAP-25（green）、によって結合されている。SNAP-25パルミトイル化は当該レポーターを細胞膜に局在化させる。

（Ｂ）YFP蛍光の損失によるBoNT/Aの検出。BoNT/A不在時は、前記YFP部分は直接励起されて蛍光発光を起こす。BoNT/Aによる前記レポーターの切断によって、前記YFP部分を含むC末端レポーターフラグメントがサイトゾル中に放出される。前記フラグメントは急速に分解され、従って、YFP発光が無くなる。前記CFPシグナルは、更に、細胞間レポーター発現レベルと細胞密度とを制御するために使用される。

驚くべきことに、YFPに関連するすべての蛍光タンパク質がレポーター蛍光体として有効であるわけではない。例えば、図２は、YFP又は、密接に関連する誘導体ビーナスを含むレポーターは細胞中のBoNT/A活性を検出することができるが、mCherry又はmStrawberryはそれができないという証明を提供している。ここで、Neuro2A細胞を、70%の培養密度まで96ウェルプレートで培養し、上述したN末端及びC末端（N-term/C-term）蛍光体ペアによって、Lipofectamine 2000（Invitrogen（商標））を使用して過渡的にトランスフェクションした。24時間後、細胞を10nM BoTN/Aの存在下又は不在下で、100μlのフェノールレッド-フリーMEM培地中で37℃にて72時間インキュベートした。

図２Ａは、蛍光反応におけるBoTN/A誘導変化を図示している。倍率20のNikon（商標）TE2000-U蛍光顕微鏡と、Nikon NIS Elements 3.4ソフトウエアを使用して、半自動化YFP及びCFP蛍光測定を行った。図示されているのは、前記C末端/N末端蛍光タンパク質（FP）蛍光比率について擬似着色されたランダムに選択されたフィールドである。比率は、各蛍光体の直接励起時に集められた発光から計算された。

図２Ｂは、細胞ベースのレポーターの蛍光比率とBoNT/A感受性を示している。各条件についてランダムに選択された30の細胞の、10nM BoTN/Aの存在下又は不在下における蛍光比率を分析した。3つの異なるウェルの5つの顕微鏡フィールドからの前記30の細胞の平均シグナルが図示されている。飽和以上の蛍光を示した細胞は除外された。

図２Ｃは、BoTN/Aが前記レポーターにかかわらず細胞内で活性であったことを示すブロットである。すべてのレポーターが、BoNT/Aの存在下においていくらかの切断を示し、すべてのネイティブSNAP25が切断される。細胞を上述したように、BoTN/Aでトランスフェクションし処理したが、ただしここでは6ウェルプレートにスケールアップした。BoTN/Aとの72時間のインキュベーションの後、細胞を無血清MEMで3回洗浄し、掻爬によって集め、M-Per Lysis Buffer（Pierce（商標））を使用して溶解した。40μgの細胞溶解物を、ニトロセルロース紙に移す前にSDS-PAGEに供し、SNAP-25に対する抗体（クローン71.2、Synaptic Systems）を使用した免疫ブロットに供した。矢印は、前記レポーターの全長（閉鎖）形態と切断（解放）形態の位置を示している。全長（*）と切断（**）されたネイティブSNAP-25が示されている。

別の観点から見ると、本発明は、切断可能基質を超えて、保護解除し、その後、サイトゾル又はその他の局所環境によってなんらかのかたちで分解が可能なレポーターを含む構造物を有する任意のアッセイにまで拡張することが可能である。例えば、その「ベイトドメイン（bait domain）」と結合する可能性のある組換えタンパク質のライブラリーに対するスクリーニングに使用される「ベイトドメイン」を含むように、感度性レポーターを改変することが可能であろう。結合タンパク質によって保護された前記「ベイトドメイン」無しでは、前記感受性レポーターは分解されるであろう。そのようなアッセイにおいて、結合タンパク質を発現する細胞は、前記感受性レポーターを分解から保護する複合体を形成し、一方、ベイトに対する結合パートナーを発現する細胞はより明るくなるであろう。前記ベイトドメインは小さなペプチドとすると有利であり、前記結合パートナーは、タンパク質（又はタンパク質変異体）のライブラリーのメンバーとすることができる。前記システムは、又、単一のテストタンパク質（又はテストタンパク質変異体）に対してテストされたベイトドメインのライブラリーが存在するように逆の構成にすることも可能である。

これらの場合のそれぞれにおいて、サイトゾル又はその他の局所環境によって暴露後に分解されない、あるいは、前記第１レポーターよりも遥かにゆっくりと暴露後に分解される第２レポーターを備えると有利であると考えられる。

更に、前記レポーターは適当な蛍光体から適宜選択可能であるが、このレポーターを、（ａ）保護無しで細胞内において比較的早い代謝回転を有することが知られており、そして（ｂ）結合パートナーとの相互作用によって保護することが可能であることが知られた所定の機能を有する、他の任意のタンパク質又は他の成分によって置換、又は補うことが可能であると考えられる。所定の機能には、レポーター遺伝子のための転写アクチベーター、致死遺伝子のためのリプレッサー等（容易に同定可能又は選択可能なものであれば何でもよい）が含まれる。

図３は、本実施例において、全く同じ細胞プレートから当該技術の慣例に従って、YFP分解とFRET損失との両方に関してデータを集めた。YFP分解については、直接かつ一つの方法で励起されたYFP発光（上部、Ex500、Em526）とCFP発光（中間、Ex434、Em470）が集められる。次にこれらの発光バックグラウンドを減じて、YFP発光をCFP発光で割って個々のウェル中の細胞密度とレポーター発現を制御する。次にこの発光比率（YFP/CFP、下部）をアッセイリポートに用いる。

FRETの損失に関しては、FRET発光（上部、Ex434、Em526）とCFP発光（中間、Ex434、Em470）とが集められる。次にこれらの発光のバックグラウンドを減じて、FRET発光をCFP発光で割って個々のウェル中の細胞密度とレポーター発現を制御する。この発光比率（FRET/CFP、下部）は、ここでは通常の方法との比較で示されている。

重要な比較は、FRET発光の損失に対する、直接に励起されたYFPの損失である。測定値と対応の曲線との比較から、YFP分解に関する全体的なダイナミックレンジがFRET発光のダイナミックレンジよりも遥かに大きいことが容易に明らかである。いくつかのケースにおいては、そのままのFRET発光のみを見た場合、飽和濃度のBoNTで処理した細胞とBoNT無しで処理した細胞との間に統計的な差は存在しない。FRET損失法の場合、BoNT投与反応は、FRET発光をCFP（供与体）発光で割った後に初めて明白になる。CFP（供与体）発光は、レポーター切断による消光損失による小さな増加発光を示している。

要約すると、FRET損失法は、レポーターにおけるBoNT誘導変化を非常に不良にしか報告しないか、あるいは、まったく報告せず、従って、正確な定質的及び定量的測定のためには使用することができない。これに対して、ここに記載された好適方法は高度の特異性と再現性とを有し、これによって、定質的分析と定量的分析との両方に関してデータに依存することを可能にする。

代替レポーターの遺伝子構造
４つのプラスミドバックグラウンドで20種類の代替蛍光体構造物を構築した。各構造物の内部名と、バックグラウンドとクローニングされたフラグメントの短い記載を以下に示す。構築方法のより詳細な要旨は以下の通りである。

pMD0076a、pMD0076b、pMD0097、及びpMD0098
mRasberry、 mCherry、mKate2、及びTagFRP蛍光体を、操作されたKpnI及びXhoI制限部位をもって増幅することによって構造物を作成した。次に、増幅されたフラグメントと前に使用した生成されたpcDNA4/TO BoCellベクターをKpnI/XhoIで消化した。その後、切除したCFPを除去した前記ベクターDNAを、mRasberry、mCherry、mKate2、及びTagFRPフラグメントと結合させて最終ベクターを作った。

pMD0079及びpMD0091
pMD0079に関しては、SNAP YFPを、操作されたNheI及びXhoI制限部位をもって増幅した。次に、増幅されたフラグメントとpcDNA4/TOベクターDNAとをBamHI/ XhoIで消化しその後互いに結合させた。次に、pMD0091を、ビーナス蛍光体を操作されたEcoRI及びXbaI制限部位をもって増幅することによって生成した。その後、増幅されたビーナスフラグメントとpMD0079とをEcoRI/ XbaIで消化した。その後、切除YFPを除いたpMD0079ベクターDNAを前記ビーナスフラグメントと結合させてpMD0091を作った。

pMD0077及びpMD0090
pMD0077に関しては、SNAP YFPを、操作されたNheI及びXhoI制限部位をもって増幅した。次に、増幅されたフラグメントとpIRESベクターDNAとをNheI/XhoIで消化しその後互いに結合させた。次に、CFP蛍光体を、操作されたXbaI/NotI制限部位をもって増幅することによって生成した。次に、増幅されたフラグメントと前に生成したSNAP YFP含有pIRESベクターをXbaI/NotIで消化し、互いに結合させてpMD007を作った。その後、pMD0090を、操作されたEcoRI及びMluI制限部位をもってビーナス蛍光体と増幅することによって生成した。その後、増幅されたビーナスフラグメントとpMD0077とをEcoRI/MIuIで消化した。その後、切除YFPを除いたpMD0077ベクターDNAを前記ビーナスフラグメントと結合させてpMD0090を作った。

pMD0078及びpMD0080
pMD0080に関しては、SNAP YFPを、操作されたNheI及びXhoI制限部位をもって増幅した。次に、増幅されたフラグメントとpECFP-C1とをNheI/XhoIで消化した。その後、切除CFPを除いたベクターDNAをSNAP YFPと結合させてpMD0080を作った。次に、シナプシンプロモーターを、操作されたAseI及びNheI制限部位をもって増幅することによってpMD0078を生成した。その後、増幅されたフラグメントとpMD0080とをAseI/NheIで消化した。その後、切除CMVプロモーターを除いたpMD0080ベクターDNAを前記シナプシンプロモーターと結合させてpMD0078を作った。

pMD0081、pMD0082、pMD0099、及びpMD0100
mRasberry、mCherry、mKate2、及びTagFRP蛍光体を、操作されたNheI及びXhoI制限部位をもって増幅することによって構造物を作った。次に、増幅されたフラグメントとMin（pECFP-C1バックグラウンド）由来のオリジナルのBoCell構造物とをNheI/XhoIで消化した。その後、切除したCFPを除去した前記BiCell構造物を、mRasberry、mCherry、mKate2、及びTagFRPフラグメントと結合させてpMD0081、 pMD0082、pMD0099、及びpMD0100を作った。

pMD0092
pMD0092については、前記ビーナス蛍光体を、操作されたEcoRI及びXbaI制限部位をもって増幅した。その後、増幅されたフラグメントとpMD0080とをEcoRI/XbaIで消化した。その後、切除YFPフラグメントを除いたpMD0080を前記ビーナスフラグメントと結合させてpMD0092を作った。

pMD0103、pMD0104、及びpMD0105
前記SNAP YFP構造物を、操作されたXbaI及びBamHI制限部位をもって増幅した。次に、増幅されたフラグメントとpBudCE4.1ベクターとを、XbaI/BamHIで消化し、互いに結合させた。その後、CFP、 mRapsberry、及びmCherry蛍光体を、操作されたKpnI及びBglII制限部位をもって増幅した。増幅されたフラグメントと、前に生成したSNAP YFP含有pBudCE4.1ベクターをKpnI/BglIIで消化し互いに結合させてpMD0103、pMD0104、及びpMD0105を生成した。

pMD0106、pMD0107、及びpMD0108
前記SNAPビーナス構造体を、操作されたXbaI及びBamHI制限部位をもって増幅させた。次に、増幅されたフラグメントとpBudCE4.1ベクターとを、XbaI/BamHIで消化し、互いに結合させた。その後、前記CFP、mRaspberry、及びmCherry蛍光体を、操作されたKpnI及びBg1II制限部位をもって増幅した。増幅されたフラグメントと前に生成したSNAPビーナス含有pBudCE4.1ベクターをKpnI/BglIIで消化し互いに結合させてpMD0106、pMD0107、及びpMD0108を生成した。

代替レポーターの一次スクリーニング
Neuro2A細胞を96ウェルプレートに播種し、これらの細胞を、上述した遺伝子構造物と、製造業者の指示に従ってLipofectamine 2000（商標）を使用して過渡的にトランスフェクションする前に、24〜48時間増やした。トランスフェクション細胞を、0又は30nMのBoNT/Aホロトキシンを適用して前記細胞を更に24時間37℃、5%CO₂でインキュベーションする前に、24時間回復させた。その後、Nikon TE2000U蛍光顕微鏡を使用して、細胞を、各条件において最低三枚の画像で、撮像した。蛍光発光を、リストした蛍光体用に適したフィルターを使用して集めた。適当な励起及び発光波長設定を使用したVarioskan（商標）蛍光マイクロプレートリーダーを使用して総蛍光発光も集めた。

蛍光顕微鏡データを処理して、所与のチャンネルの画素強度に基づき過剰発現（飽和）細胞を排除した。その後、各チャンネルからの全発光を集め、指示されている場合には、BoNT/A応答YFP又はビーナス発光は、前記BoNT/A-無反応CFP、RFP（mKate2、mRaspberry、又はmCherry）、あるいは、外因的に追加された膜色素（代替レポーター２）発光によって割られた。

上述したように集められたデータを使用して、各レポーター構造物を、以下について分析した。各レポーターの細胞標的化を細胞膜上の均一な蛍光発現の存在によって判断した。不良な細胞膜標的化は、細胞内の明るい穴の開いたスポットの存在と関連付けられた。細胞膜標的化の欠如したレポーターはそれ以上の考慮から除外された。総蛍光発光、従って、総レポーター発現は、バックグラウンド発光に対する所与の蛍光プローブの発光によって判断された。バックグラウンドに対して＞２倍のシグナルを提供しないプローブは、それ以上の考慮から除外された。

前記代替レポーターの二次スクリーニング: BoNT/A-投与反応
一次スクリーニングを通過した遺伝子構造物を、様々なDNA濃度を使用して、上述したように細胞に過渡的にトランスフェクションした。DNA濃度を変化させることによって、様々なレベルのレポーター発現を有する細胞が生成された。トランスフェクションと24時間の回復時間後、トランスフェクション細胞を、10pM〜30nM BoNT/Aで滴定して更にインキュベートさせた。インキュベーション後、適当な励起及び発光波長設定を使用したVarioskan（商標）蛍光マイクロプレートリーダーを使用して蛍光発光を集めた。すべての実験において、テストレポーター反応を、平行して過渡的にトランスフェクションされた現在のBoCellレポーターCFP-SNAP25-YFPと直接比較した。

BoNT/A-反応YFPの蛍光発光を、前記BoNT/A-無反応CFP、RFP（mKate, mRaspberry、又はmCherry）あるいは、外因的に追加された膜色素（代替レポーター２）発光によって割って発光比率を得た。次に、この発光比率を、BoNT/A濃度の関数としてプロットした。データをBoCellレポーターと比較した。テストレポーター適合性をBoCellレポーターとの比較によって定質的に評価した。BoNT/Aは、現在のBoCellレポーターと比較される前記テストレポーターと同様の反応を引き起こすであろうか。

前記代替レポーターの二次スクリーニング: FRET発光
レポーター遺伝子構造物を、その製造業者のプロトコルに従ってLipofectamineを使用してガラスカバースリップ上にプレーティングされた細胞にトランスフェクションした。各構造物に関して、単一蛍光体対照もトランスフェクションされた。24時間の回復期間の後、細胞を30nM BoNTと、又は30nM BoNT無しで、処理した。各レポーターに対する前記対照を使用して、蛍光顕微鏡によって画像を撮った。これらの画像は三フィルターセット法によってFRET測定値を校正するのに使用された。次に、レポーターのBoNT/Aの存在及び不在下でのFRT効率について評価した。すべての実験に関して、テストレポーター反応を、平行して過渡的にトランスフェクションされた現在のBoCellレポーターCFP-SNAP25-YFPと直接比較した。各テストレポーターを、FRETの存在に関して、FRET発光がBoTN/Aに対して反応性であるか否かについて評価した。その結論は、FRET発光は、例3において既に観察した条件と一致して、信頼できるスクリーニング法ではない、というものであった。

尚、当業者にはここに記載の本発明の概念から逸脱することなく、すでに述べたもの以外にも多くの改変が可能であることが理解されるであろう。従って、本発明は、添付の請求項の範囲以外によって限定されるものではない。更に、明細書と特許請求の範囲との両方を解釈するにあたって、すべての用語は、その文脈と一致する最も広い解釈をされなければならない。特に、“comprises”や“comprising”という用語は、エレメント、成分又は工程を非限定的に記載するものであって、記載のエレメント、成分又は工程が、明示的は記載されていない他のエレメント、成分又は工程と共に、利用、組み合わせ可能であるということを示している。明細書、請求項がA, B,C...及びNから成るグループから選択される少なくとも１つの何かについて言及している場合、その文はそのグループからの一つのエレメントのみを要件とするものであって、AプラスNや、BプラスN等を要件とするものと解釈されてはならない。

Claims (19)

1. ボツリヌストキシンの定質的及び定量的検出のための方法であって、
   （ｉ）人工構造物と酵素とを含む組成物を提供する工程、
   ここで、前記構造物は、（ａ）レポーター含有部分と、（ｂ）前記レポーター含有部分の前記構造物の残り部分からの切断をもたらすようにボツリヌストキシンの一部分と相互作用する切断部位とを有し、
   前記組成物はベースラインシグナルを同定する発光を示し、
   前記酵素は前記切断前よりも前記切断後において前記レポーター含有部分の分解を少なくとも10倍速く促進する、
   （ｉｉ）前記ベースラインシグナルから第１発光測定値を得る工程、
   （ｉｉｉ） 前記組成物を前記ボツリヌストキシンに対して暴露させる工程、そして次に、
   （ｉｖ）以下を指標として前記ベースラインシグナルの低下について前記組成物をテストして別の発光測定値を得る工程、
   前記ボツリヌストキシンの前記切断部位における前記構造物の切断、そして
   前記レポーター含有部分の分解、
   （ｖ）工程（ｉｉ）の前記第１発光測定値を工程（ｉｖ）の前記別の発光測定値と比較する工程、を有する方法。
2. 前記レポーター含有部分は、蛍光体を含む請求項１に記載の方法。
3. 前記蛍光体は、黄色蛍光タンパク質 （YFP）を含む請求項２に記載の方法。
4. 前記蛍光体は、黄色蛍光タンパク質 （YFP）、シトリン（Citrine）、ビーナス（Venus）、及びYPetタンパク質から成るグループから選択される請求項２に記載の方法。
5. 前記蛍光体は、黄色蛍光タンパク質 （YFP）、シトリン、ビーナス、及びYPetタンパク質の少なくとも１つの誘導体である請求項２に記載の方法。
6. 前記構造体は、更に、第２蛍光タンパク質を含み、好ましくは、前記第２蛍光タンパク質を前記レポーター含有部分の反対側端部に含む請求項２に記載の方法。
7. 前記レポーター含有部分は、フェルスター共鳴エネルギー移動 （FRET）を生み出すように第２蛍光体と結合されていない請求項６に記載の方法。
8. 前記レポーターは黄色蛍光タンパク質（YFP）を含み、第２蛍光タンパク質はシアン蛍光タンパク質（CFP）を含む請求項７に記載の方法。
9. 前記レポーターは、黄色蛍光タンパク質（YFP）、シトリン、ビーナス、及びYPetタンパク質の少なくとも１つを含み、前記第２蛍光タンパク質は、CFP、mStrawberry、及びmCherryの少なくとも１つを含む請求項６に記載の方法。
10. 前記レポーター含有部分は、発色団を含む請求項１に記載の方法。
11. 前記構造物は、トランスフェクション生細胞によって内因的に作られる請求項１に記載の方法。
12. 前記組成物はトランスフェクション生細胞に含まれ、前記切断部位は、SNAREタンパク質、モチーフ、及び突然変異タンパク質の少なくとも１つを含み、前記レポーターは、黄色蛍光タンパク質（YFP）、シトリン、ビーナス、及びYPetタンパク質の少なくとも1つを含み、更に、第２蛍光タンパク質を含む請求項１に記載の方法。
13. 工程（ｉｉ）の前記第１発光測定値は、前記レポーター含有タンパク質を直接励起することによって、好ましくは、前記黄色蛍光タンパク質（YFP）を励起することによって得られる請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記YFP分解の測定値は、直接、別々に励起されたYFPとCFPの発光を集めることによって得られる請求項８に記載の方法。
15. 前記発光はバックグラウンドが減じられ、前記YFP発光はCFP発光で割られて個々の細胞における細胞密度とレポーター発現を制御する請求項１４に記載の方法。
16. 治験物質の存在をテストするためのアッセイであって、人工構造物と酵素とを含む細胞を有し、ここで、前記構造物は、被保護部分と保護部分とを含み、前記被保護部分はレポーターを含むように選択され、そして、前記治験物質はイン ヴィトロで前記被保護部分を保護解除するように作用し、前記酵素は、前記被保護部分が保護されている時よりも保護解除された時の方が前記被保護部分の分解が少なくとも10倍速くなるように促進し、それによって前記治験物質の定量的測定に使用される前記レポーターから得られるシグナルを減少させる、アッセイ。
17. 前記レポーターは蛍光体を含み、好ましくは、前記蛍光体は黄色蛍光タンパク質（YFP）、シトリン、ビーナス、及びYPetタンパク質の少なくとも1つであり、そして前記構造物はSNAREタンパク質、モチーフ、及び突然変異タンパク質の少なくとも１つを含む請求項１６に記載のアッセイ。
18. 更に、第２蛍光タンパク質を含み、好ましくは、前記第２蛍光タンパク質はCFP、mStrawberry、及びmCherryの少なくとも１つである請求項１７に記載のアッセイ。
19. 前記構造物は膜局在化ドメインであって、前記酵素は前記細胞のサイトゾルに存在する請求項１７に記載のアッセイ。

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