JP5815852B2 - 非fretボツリヌスアッセイ - Google Patents
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Description
本発明は、組成物が、(b)切断部位に化学的に結合した(a)レポーター含有部分を含む人工構造物を有し、前記レポーター含有部分を構造物の残りの部分から切断するように治験物質と相互作用することを特徴とする方法とアッセイを提供する。一つの具体的なクラスの実施例は、ボツリヌストキシンの定質的及び定量的検出のための方法に関し、これは、
(i)人工構造物と酵素とを含む組成物を提供する工程、
ここで、前記構造物は、(a)レポーター含有部分と、(b)前記レポーター含有部分の前記構造物の残り部分からの切断をもたらすようにボツリヌストキシンの一部分と相互作用する切断部位とを有し、
ここで、前記組成物はベースラインシグナルを同定する発光を示し、
ここで、前記酵素は前記切断前よりも前記切断後において前記レポーター含有部分の分解を少なくとも10倍速く促進する、
(ii)前記ベースラインシグナルから第1発光測定値を得る、
(iii)前記組成物を前記ボツリヌストキシンに対して暴露させる、そして次に、
(iv)以下の指標として前記ベースラインシグナルの低下について前記組成物を更にテストして別の発光測定値を得る、
前記トキシンの前記切断部位における前記構造物の切断、そして
前記レポーター含有部分の分解、
(v)工程(ii)の前記第1発光測定値を工程(iv)の前記別の測定値と比較する。
4つのプラスミドバックグラウンドで20種類の代替蛍光体構造物を構築した。各構造物の内部名と、バックグラウンドとクローニングされたフラグメントの短い記載を以下に示す。構築方法のより詳細な要旨は以下の通りである。
mRasberry、 mCherry、mKate2、及びTagFRP蛍光体を、操作されたKpnI及びXhoI制限部位をもって増幅することによって構造物を作成した。次に、増幅されたフラグメントと前に使用した生成されたpcDNA4/TO BoCellベクターをKpnI/XhoIで消化した。その後、切除したCFPを除去した前記ベクターDNAを、mRasberry、mCherry、mKate2、及びTagFRPフラグメントと結合させて最終ベクターを作った。
pMD0079に関しては、SNAP YFPを、操作されたNheI及びXhoI制限部位をもって増幅した。次に、増幅されたフラグメントとpcDNA4/TOベクターDNAとをBamHI/ XhoIで消化しその後互いに結合させた。次に、pMD0091を、ビーナス蛍光体を操作されたEcoRI及びXbaI制限部位をもって増幅することによって生成した。その後、増幅されたビーナスフラグメントとpMD0079とをEcoRI/ XbaIで消化した。その後、切除YFPを除いたpMD0079ベクターDNAを前記ビーナスフラグメントと結合させてpMD0091を作った。
pMD0077に関しては、SNAP YFPを、操作されたNheI及びXhoI制限部位をもって増幅した。次に、増幅されたフラグメントとpIRESベクターDNAとをNheI/XhoIで消化しその後互いに結合させた。次に、CFP蛍光体を、操作されたXbaI/NotI制限部位をもって増幅することによって生成した。次に、増幅されたフラグメントと前に生成したSNAP YFP含有pIRESベクターをXbaI/NotIで消化し、互いに結合させてpMD007を作った。その後、pMD0090を、操作されたEcoRI及びMluI制限部位をもってビーナス蛍光体と増幅することによって生成した。その後、増幅されたビーナスフラグメントとpMD0077とをEcoRI/MIuIで消化した。その後、切除YFPを除いたpMD0077ベクターDNAを前記ビーナスフラグメントと結合させてpMD0090を作った。
pMD0080に関しては、SNAP YFPを、操作されたNheI及びXhoI制限部位をもって増幅した。次に、増幅されたフラグメントとpECFP-C1とをNheI/XhoIで消化した。その後、切除CFPを除いたベクターDNAをSNAP YFPと結合させてpMD0080を作った。次に、シナプシンプロモーターを、操作されたAseI及びNheI制限部位をもって増幅することによってpMD0078を生成した。その後、増幅されたフラグメントとpMD0080とをAseI/NheIで消化した。その後、切除CMVプロモーターを除いたpMD0080ベクターDNAを前記シナプシンプロモーターと結合させてpMD0078を作った。
mRasberry、mCherry、mKate2、及びTagFRP蛍光体を、操作されたNheI及びXhoI制限部位をもって増幅することによって構造物を作った。次に、増幅されたフラグメントとMin(pECFP-C1バックグラウンド)由来のオリジナルのBoCell構造物とをNheI/XhoIで消化した。その後、切除したCFPを除去した前記BiCell構造物を、mRasberry、mCherry、mKate2、及びTagFRPフラグメントと結合させてpMD0081、 pMD0082、pMD0099、及びpMD0100を作った。
pMD0092については、前記ビーナス蛍光体を、操作されたEcoRI及びXbaI制限部位をもって増幅した。その後、増幅されたフラグメントとpMD0080とをEcoRI/XbaIで消化した。その後、切除YFPフラグメントを除いたpMD0080を前記ビーナスフラグメントと結合させてpMD0092を作った。
前記SNAP YFP構造物を、操作されたXbaI及びBamHI制限部位をもって増幅した。次に、増幅されたフラグメントとpBudCE4.1ベクターとを、XbaI/BamHIで消化し、互いに結合させた。その後、CFP、 mRapsberry、及びmCherry蛍光体を、操作されたKpnI及びBglII制限部位をもって増幅した。増幅されたフラグメントと、前に生成したSNAP YFP含有pBudCE4.1ベクターをKpnI/BglIIで消化し互いに結合させてpMD0103、pMD0104、及びpMD0105を生成した。
前記SNAPビーナス構造体を、操作されたXbaI及びBamHI制限部位をもって増幅させた。次に、増幅されたフラグメントとpBudCE4.1ベクターとを、XbaI/BamHIで消化し、互いに結合させた。その後、前記CFP、mRaspberry、及びmCherry蛍光体を、操作されたKpnI及びBg1II制限部位をもって増幅した。増幅されたフラグメントと前に生成したSNAPビーナス含有pBudCE4.1ベクターをKpnI/BglIIで消化し互いに結合させてpMD0106、pMD0107、及びpMD0108を生成した。
Neuro2A細胞を96ウェルプレートに播種し、これらの細胞を、上述した遺伝子構造物と、製造業者の指示に従ってLipofectamine 2000(商標)を使用して過渡的にトランスフェクションする前に、24〜48時間増やした。トランスフェクション細胞を、0又は30nMのBoNT/Aホロトキシンを適用して前記細胞を更に24時間37℃、5%CO2でインキュベーションする前に、24時間回復させた。その後、Nikon TE2000U蛍光顕微鏡を使用して、細胞を、各条件において最低三枚の画像で、撮像した。蛍光発光を、リストした蛍光体用に適したフィルターを使用して集めた。適当な励起及び発光波長設定を使用したVarioskan(商標)蛍光マイクロプレートリーダーを使用して総蛍光発光も集めた。
一次スクリーニングを通過した遺伝子構造物を、様々なDNA濃度を使用して、上述したように細胞に過渡的にトランスフェクションした。DNA濃度を変化させることによって、様々なレベルのレポーター発現を有する細胞が生成された。トランスフェクションと24時間の回復時間後、トランスフェクション細胞を、10pM〜30nM BoNT/Aで滴定して更にインキュベートさせた。インキュベーション後、適当な励起及び発光波長設定を使用したVarioskan(商標)蛍光マイクロプレートリーダーを使用して蛍光発光を集めた。すべての実験において、テストレポーター反応を、平行して過渡的にトランスフェクションされた現在のBoCellレポーターCFP-SNAP25-YFPと直接比較した。
レポーター遺伝子構造物を、その製造業者のプロトコルに従ってLipofectamineを使用してガラスカバースリップ上にプレーティングされた細胞にトランスフェクションした。各構造物に関して、単一蛍光体対照もトランスフェクションされた。24時間の回復期間の後、細胞を30nM BoNTと、又は30nM BoNT無しで、処理した。各レポーターに対する前記対照を使用して、蛍光顕微鏡によって画像を撮った。これらの画像は三フィルターセット法によってFRET測定値を校正するのに使用された。次に、レポーターのBoNT/Aの存在及び不在下でのFRT効率について評価した。すべての実験に関して、テストレポーター反応を、平行して過渡的にトランスフェクションされた現在のBoCellレポーターCFP-SNAP25-YFPと直接比較した。各テストレポーターを、FRETの存在に関して、FRET発光がBoTN/Aに対して反応性であるか否かについて評価した。その結論は、FRET発光は、例3において既に観察した条件と一致して、信頼できるスクリーニング法ではない、というものであった。
Claims (19)
- ボツリヌストキシンの定質的及び定量的検出のための方法であって、
(i)人工構造物と酵素とを含む組成物を提供する工程、
ここで、前記構造物は、
(a)第1蛍光体を含むレポーター含有部分と第2蛍光体を含む第2部分と、ここで、前記レポーター含有部分は、フェルスター共鳴エネルギー移動を生み出すように前記第2蛍光体と結合されていない、
(b)前記レポーター含有部分の前記構造物の残り部分からの切断をもたらすようにボツリヌストキシンの一部分と相互作用する切断部位、とを有し、
前記組成物はベースラインシグナルを同定する発光を示し、
前記酵素は前記切断前よりも前記切断後において前記レポーター含有部分の分解を少なくとも10倍速く促進する、
(ii)前記ベースラインシグナルから第1発光測定値を得る工程、
(iii) 前記組成物を前記ボツリヌストキシンに対して暴露させる工程、そして次に、
(iv)以下を指標として前記ベースラインシグナルの低下について前記組成物をテストして別の発光測定値を得る工程、
前記ボツリヌストキシンの前記切断部位における前記構造物の切断、そして
前記レポーター含有部分の分解、
(v)工程(ii)の前記第1発光測定値を工程(iv)の前記別の発光測定値と比較する工程、を有する方法。 - 前記第1蛍光体は、黄色蛍光タンパク質 (YFP)を含む請求項1に記載の方法。
- 前記第1蛍光体は、黄色蛍光タンパク質 (YFP)、シトリン(Citrine)、ビーナス(Venus)、及びYPetタンパク質から成るグループから選択される請求項1に記載の方法。
- 前記第1蛍光体は、黄色蛍光タンパク質 (YFP)、シトリン、ビーナス、及びYPetタンパク質の少なくとも1つの誘導体である請求項1に記載の方法。
- 前記第2蛍光体を前記レポーター含有部分の反対側端部に含む請求項1に記載の方法。
- 前記第1蛍光体は黄色蛍光タンパク質(YFP)を含み、第2蛍光体はシアン蛍光タンパク質(CFP)を含む請求項1に記載の方法。
- 前記第1蛍光体は、黄色蛍光タンパク質(YFP)、シトリン、ビーナス、及びYPetタンパク質の少なくとも1つを含み、前記第2蛍光体は、CFP、mStrawberry、及びmCherryの少なくとも1つを含む請求項6に記載の方法。
- 前記レポーター含有部分は、発色団を含む請求項1に記載の方法。
- 前記構造物は、トランスフェクション生細胞によって内因的に作られる請求項1に記載の方法。
- 前記組成物はトランスフェクション生細胞に含まれ、前記切断部位は、SNAREタンパク質、モチーフ、及び突然変異タンパク質の少なくとも1つを含み、前記第1蛍光体は、黄色蛍光タンパク質(YFP)、シトリン、ビーナス、及びYPetタンパク質の少なくとも1つを含む請求項1に記載の方法。
- 工程(ii)の前記第1発光測定値は、前記レポーター含有タンパク質を直接励起することによって得られる請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(ii)の前記第1発光測定値は、前記黄色蛍光タンパク質(YFP)を励起することによって得られる請求項2〜4、6、及び7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記YFP分解の測定値は、直接、別々に励起されたYFPとCFPの発光を集めることによって得られる請求項6に記載の方法。
- 前記発光はバックグラウンドが減じられ、前記YFP発光はCFP発光で割られて個々の細胞における細胞密度とレポーター発現を制御する請求項13に記載の方法。
- 治験物質の存在をテストするためのアッセイであって、人工構造物と酵素とを含む細胞を有し、ここで、前記構造物は、被保護部分、第2部分、及び保護部分とを含み、前記被保護部分はレポーターを含むように選択され、そして、前記第2部分は第2蛍光体を含み、ここで、前記レポーターは、フェルスター共鳴エネルギー移動を生み出すように前記第2蛍光体と結合されていない、そして、前記治験物質はイン ヴィトロで前記被保護部分を保護解除するように作用し、前記酵素は、前記被保護部分が保護されている時よりも保護解除された時の方が前記被保護部分の分解が少なくとも10倍速くなるように促進し、それによって前記治験物質の定量的測定に使用される前記レポーターから得られるシグナルを減少させる、アッセイ。
- 前記レポーターは蛍光体を含み、そして前記構造物はSNAREタンパク質、モチーフ、及び突然変異タンパク質の少なくとも1つを含む請求項15に記載のアッセイ。
- 前記蛍光体は黄色蛍光タンパク質(YFP)、シトリン、ビーナス、及びYPetタンパク質の少なくとも1つである請求項16に記載のアッセイ。
- 前記第2蛍光体はCFP、mStrawberry、及びmCherryの少なくとも1つである請求項16に記載のアッセイ。
- 前記構造物は膜局在化ドメインであって、前記酵素は前記細胞のサイトゾルに存在する請求項16に記載のアッセイ。
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