KR101981199B1 - 리포터 모이어티, 기질 모이어티 및 탈안정화 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주세포, 및 그의 용도 - Google Patents

리포터 모이어티, 기질 모이어티 및 탈안정화 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주세포, 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

리포터 모이어티, 기질 모이어티 및 탈안정화 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주세포, 및 그를 이용하여 프로테아제의 수준을 측정하는 방법을 제공한다.

Description

리포터 모이어티, 기질 모이어티 및 탈안정화 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주세포, 및 그의 용도{Recombinant polynucleotide encoding polypeptide including reporter moiety, substrate moiety and destabilization moiety, host cell including the same and use thereof}
리포터 모이어티, 기질 모이어티 및 탈안정화 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주세포, 및 그를 이용하여 프로테아제의 수준을 측정하는 방법에 관한 것이다.
프로테아제는 단백질 분해(proteolysis)를 수행하는 효소이다. 프로테아제는 폴리펩티드 사슬 중에 아미노산을 서로 연결하는 펩티드 결합을 가수분해에 의하여 분해한다. 프로테아제에는 신경독소가 포함될 수 있다. Clostridium botulinum 및 Clostridium tetani는 아주 강력한 신경독소, 즉 보툴리눔 독소(BoNT)와 테타누스 독소(TeNT)를 생산한다. 이들 클로스트리디아성 신경독소는 신경세포(neuronal cell)에 특이적으로 결합하고 신경전달물질(neurotransmitter)의 방출을 저해한다. 신경독소와 같은 일부 프로테아제는 아주 강력한 독성을 가지고 있을 뿐만 아니라 극소량으로 존재하기 때문에 그 활성을 안전하고, 정확하게 측정할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
일 양상은 리포터 모이어티; 탈안정화 모이어티 및 상기 리포터 모이어티와 상기 탈안정화 모이어티를 작동적으로 연결하는 기질 모이어티로서, 상기 기질 모이어티는 프로테아제 활성의 절단 부위(cleavage site)를 포함하는 것인 기질 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
다른 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드, 및 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터 또는 그의 산물에 의하여 방출되는 신호를 측정하기 위한 검출제(detection agent)를 포함하는, 프로테아제 폴리펩티드의 단백질 분해 활성(proteolytic activity)을 결정하기 위한 키트를 제공한다.
다른 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포, 및 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터 또는 그 산물에 의하여 방출되는 신호를 측정하기 위한 검출제(detection agent)를 포함하는, 프로테아제 폴리펩티드의 단백질 분해 활성(proteolytic activity)을 결정하기 위한 키트를 제공한다.
다른 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드를 프로테아제 폴리펩티드를 포함할 것으로 의심되는 시료와 접촉시키는 단계; 및 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 결정하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기한 숙주세포를 프로테아제 폴리펩티드를 포함할 것으로 의심되는 시료와 접촉시키는 단계; 및 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 상기 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 결정하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드를 프로테아제 폴리펩티드에 접촉시키는 단계; 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상을 결정하는 단계를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 폴리펩티드의 특성을 결정하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기한 숙주세포를 프로테아제 폴리펩티드에 접촉시키는 단계; 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티, 상기 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상을 결정하는 단계를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 폴리펩티드의 특성을 결정하는 방법을 제공한다.
제1 양상은 리포터 모이어티; 탈안정화 모이어티 및 상기 리포터 모이어티와 상기 탈안정화 모이어티를 작동적으로 연결하는 기질 모이어티로서, 상기 기질 모이어티는 프로테아제 활성의 절단 부위(cleavage site)를 포함하는 것인 기질 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 리포터 모이어티는 검출가능한 신호를 방출하거나, 그에 의하여 촉매되는 반응에서 검출가능한 신호를 방출하는 물질(이하 "산물(product)이라고도 한다)을 방출하는 물질인 것일 수 있다. 상기 리포터 모이어티는 형광 단백질, β-lactamase, β-galactosidase, alkaline phosphatase, chloramphenicol acetyaltransferase, β-glucuronidase, peroxidase 및 luciferase로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 형광 단백질은 GFP, YFP, Citrine, CFP, RFP, Kaede, PA-GFP, Emerald, Venus, DsRed, mHoneydew, mBanana, mOrange, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mRasberry, mPlum, ZsGreen, 및 ZsYellow 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 탈안정화 모이어티는 그의 부재시에 비하여 세포 내에서 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시키는 특성을 갖는 것일 수 있다. 상기 발현은 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서의 발현인 것일 수 있다. 상기 탈안정화 모이어티는 세포 내에서 제1 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 mRNA 또는 단백질의 분해를 촉진하는 것일 수 있다. 상기 탈안정화 모이어티는 PEST, CL1 또는 PEST과 CL1의 융합 단백질인 것일 수 있다.
상기 프로테아제는 박테리아 유래의 것일 수 있다. 상기 박테리아는 클로스트리움 속의 것일 수 있다. 상기 프로테아제는 신경독소(neurotoxin) 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 프로테아제는 엔도프로테아제인 것일 수 있다. 상기 신경독소 폴리펩티드는 보툴리눔 독소 혈청 타입 A(botulinum toxin serotype A: BoNT/A), BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/CD, BoNT/DC, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/FA, BoNT/G, 테타누스 신경독소(TeNT), 또는 이들의 변이체인 것일 수 있다. 상기 프로테아제는 상기 기질 모이어티 중의 절단 부위를 절단하는 것일 수 있다. 상기 절단 부위는 상기 프로테아제에 의하여 인식되고 절단되는 부위인 것일 수 있다. 각 보툴리눔 독소 혈청 타입의 아미노산 서열 및 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 알려져 있다. 보툴리눔 독소 혈청 타입의 아미노산 서열 및 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, WO2004-031355의 서열번호 1 내지 14에 개시된 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 절단 부위는 프로테아제에 의하여 특정 절단 부위에서 절단되어 질 수 있는 펩티드 기질일 수 있다. 상기 절단 부위는 예를 들면, 신경독소의 내생성 프로테아제에 의하여 인식되고 절단되는 절단 부위일 수 있다. 신경독소의 절단 부위는 자연적으로 발생하거나 인위적으로 만들어진 것일 수 있다. 신경독소 절단부위는 예를 들면, BoNT/A, BoNT/E 프로테아제, 또는 이들의 변이체에 의해서 인식되고 절단되는 단백질에서 유래된 것일 수 있다. 상기 단백질은 SNAP-25, 그의 이소폼, 파랄로그, 또는 오소로그일 수 있다. SNAP-25는 사람, rat, mouse, bovine, danio, carassius, xenopus, torpedo, strongylocentrotus, loligo, lymnaea 또는 aplysia 유래의 것일 수 있다. SNAP-25는 SNAP-25A 또는 SNAP-25B일 수 있다.
또한, 신경독소 절단부위는 예를 들면, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G 프로테아제, 또는 이들의 변이체에 의해서 인식되고 절단되는 단백질에서 유래된 것일 수 있다. 상기 단백질은 VAMP, 그의 이소폼, 파랄로그, 또는 오소로그일 수 있다. 상기 단백질은 VAMP, 그의 이소폼, 파랄로그, 또는 오소로그는 예를 들면, 인간 혹은 마우스의 VAMP-1, VAMP-2, VAMP-3/cellubravin, bovine VAMP-2, rat VAMP-2 또는 VAMP-3, chicken VAMP-1, VAMP-2 또는 VAMP-3, Torpedo VAMP-1, Strongylocentrotus VAMP, Drosophila sybA, synB, synC, synD, 또는 syn, Hirudo VAMP, Xenopus VAMP-2 또는 VAMP-3, Danio VAMP-1 또는 VAMP-2, Loligo VAMP, Lymnaea VAMP, Aplysia VAMP 또는 Caenorhabditis SNB1-like일 수 있다.
또한, 신경독소 절단부위는 BoNT/C 프로테아제, 또는 그 변이체에 의해서 인식되고 절단되는 단백질에서 유래된 것일 수 있다. 상기 단백질은 Syntaxin 또는 그 오소로그, 파랄로그, 상동체일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면, 인간 혹은 마우스의 Syntaxin 1A, Syntaxin 1B1, Syntaxin 2-1, Syntaxin 2-2, Syntaxin 2-3, Syntaxin 3A 또는 Syntaxin 1B2, bovine 또는 rat Syntaxin 1A, Syntaxin 1B1 또는 Syntaxin 1B2, rat Syntaxin 2 또는 Rat syntaxin 3, mouse Syntaxin 1A, Syntaxin 1B1, Syntaxin 1B2, Syntaxin 2, Syntaxin 3A, Syntaxin 3B 또는 Syntaxin 3C, chicken Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 2; Xenopus Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 1B, Danio Syntaxin 1A, Syntaxin 1B 또는 Syntaxin 3, Torpedo Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 1B, Strongylocentrotus Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 1B, Drosophila Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 1B, Hirudo Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 1B, Loligo Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 1B, Lymnaea Syntaxin 1A 또는 Syntaxin 1B 또는 그 오소로그, 파랄로그, 상동체일 수 있다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 제1 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 하는 조절 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 발현가능한 재조합 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 터미네이터 서열, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 세포는 상기 프로테아제와 결합하고 내재화(internalization)할 수 있는 것일 수 있다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 프로테아제는 신경독소 폴리펩티드이고, 상기 세포는 상기 신경독소 폴리펩티드와 결합, 내재화, 세포 내부에서 방출 또는 이들의 조합이 일어나도록 되어 있는 것일 수 있다. 상기 세포는 클로스트리움 속의 신경독소(neurotoxin)에 중독될 수 있는 것일 수 있다. 상기 신경독소 폴리펩티드는 보툴리눔 독소 혈청 타입 A(botulinum toxin serotype A: BoNT/A), BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/CD, BoNT/DC, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/FA, BoNT/G, 테타누스 신경독소(TeNT), 또는 이들의 변이체인 것일 수 있다. 상기 세포는 내분비성 세포(endocrine cell) 등일 수 있다. 상기 세포는 일차 뉴론(primary neuron), neuroblastoma 세포, 또는 만능 줄기세포로부터 분화된 뉴론인 것일 수 있다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 벡터(vector)일 수 있다. 상기 벡터는 발현 벡터인 것일 수 있다. 상기 벡터는 바이러스 벡터(viral vector), 플라스미드 벡터(plasmid vector), 또는 선형 핵산 구조체(linear nucleic acid construct)일 수 있다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드의 상류 또는 하류에 연결된 비시스트론 서열(bicistronic sequence)을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 비시스트론 서열은 5'-캡(cap) 비의존적으로 번역(5'-cap independently tanslate)이 될 수 있도록 하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 비시스트론 서열은 mRNA로부터 폴리펩티드를 합성하는 번역(translation) 동안 리보솜이 하나의 5'-캡을 가진 mRNA로부터 2 이상의 폴리펩티드를 합성하도록 하는 뉴클레오티드 서열인 것일 수 있다. 상기 비시스트론 서열은 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site: IRES) 또는 리보솜이 펩티드 결합을 형성하는 것을 누락(skip)하도록 하는 것인 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 리보솜이 펩티드 결합을 형성하는 것을 누락(skip)하도록 하는 비시스트론 서열은 P2A, T2A, E2A, 또는 F2A (예, 서열번호 13, 20, 22, 또는 24)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(예, 서열번호 5, 19, 21,또는 23)일 수 있다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 또한 상기 비시스트론 서열의 상류 또는 하류에 작동가능하게 연결된 내부 표준 리포터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 내부 표준 리포터는 상기 리포터 모이어티와 다른 것일 수 있다. 상기 내부 표준 리포터는 검출가능한 신호를 방출하거나, 그에 의하여 촉매되는 반응에서 검출가능한 신호를 방출하는 물질로 전환하는 물질인 것일 수 있다. 상기 내부 표준 리포터는 형광 단백질, β-lactamase, β-galactosidase, alkaline phosphatase, chloramphenicol acetyaltransferase, β-glucuronidase, peroxidase 및 luciferase로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 형광 단백질은 GFP, YFP, Citrine, CFP, RFP, Kaede, PA-GFP, Emerald, Venus, DsRed, mHoneydew, mBanana, mOrange, tdTomato, mTangerine, mStrawberry, mCherry, mRasberry, mPlum, ZsGreen, 및 ZsYellow 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드의 구조를 나타낸 도면이다. 도 1의 A 및 B에서, R, S, 및 D는 각각 리포터 모이어티(reporter moiety), 기질 모이어티(substrate moiety), 및 탈안정화 모이어티(destabilization moiety)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 도 1의 B에서, I, 및 B는 각각 내부 표준 리포터(internal standard reporter), 및 비시스트론 서열(bicistronic sequence)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 도 1에서, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 왼쪽부터 오른쪽으로 5'->3의 순서로 기재된 것이다. 도 1의 A에 나타낸 바와 같이, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 R-S-D의 구조를 가질 수 있다. 그러나, 이 구조는 예시적인 것이며, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 추가적인 -S-의 구조가 R과 D 사이에 연결되어, 2개 이상, 예를 들면, 3, 또는 4 이상의 기질 모이어티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, -D 구조도 2개 이상, 예를 들면 3, 또는 4 이상의 탈안정화 모이어티를 포함할 수 있다. 도 1의 A에 나타낸 바와 같이, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 I-B-R-S-D의 구조를 갖고 있다. 그러나, 이 구조는 예시적인 것이며, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 추가적인 -I-B-의 구조가 5' 위치에 연결되어, 2개 이상, 예를 들면, 3, 또는 4 이상의 내부 표준 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 R-S-D-B-I의 구조를 가질 수 있다. 그러나, 이 구조는 예시적인 것이며, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 추가적인 -B-I-의 구조가 3' 위치에 연결되어, 2개 이상, 예를 들면, 3, 또는 4 이상의 내부 표준 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
도 2는 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드의 구조 및 그에 의하여 발현된 폴리펩티드와 프로테아제의 반응을 나타내는 도면이다. 도 2에서, 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 발현된 폴리펩티드는 프로테아제의 존재하에서 기질 모이어티의 절단 부위가 절단되어, 리포터 모이어티 단편과 나머지로 단편화된다.
*도 3은 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 프로테아제와 접촉하는 경우를 나타내는 도면이다. 도 3에서, 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 발현된 폴리펩티드는 프로테아제의 존재하에서 기질 모이어티의 절단 부위가 절단되어, 리포터 모이어티 단편과 나머지로 단편화된다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 세포 내에 프로테아제가 형질감염 경우(상단), R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드는 S 부위에서 절단되어 리포터 모이어티는 탈안정화 모이어티(D)로부터 분리되어, 탈안정화 모이어티(D)가 형질감염 경우에 비하여 더 안정화된다. 그에 따라서, 상기 리포터 모이어티 또는 그로부터 유래되는 물질로부터 측정되는 신호는, 탈안정화 모이어티(D)가 형질감염 경우에 비하여 더 강하다. 도 3에서 하단은 세포 내에 프로테아제가 존재하지 않는 경우, R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드는 탈안정화 모이어티(D)를 그대로 유지하고 있어서, 탈안정화 모이어티(D)에 의하여 R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드의 수준이 낮아지고, 그에 따라서 그로부터 측정되는 신호도 작아진다는 것을 나타낸다.
도 4는 일 양상에 따른 내부 표준 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 프로테아제와 접촉하는 경우를 나타내는 도면이다. 도 4에서, 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 발현된 폴리펩티드는 프로테아제의 존재하에서 기질 모이어티의 절단 부위가 절단되어, 리포터 모이어티 단편과 나머지로 단편화된다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 세포 내에 프로테아제가 형질감염 경우(A), R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드는 S 부위에서 절단되어 리포터 모이어티는 탈안정화 모이어티(D)로부터 분리되어, 탈안정화 모이어티(D)가 형질감염 경우에 비하여 더 안정화된다. 그에 따라서, 상기 리포터 모이어티 또는 그로부터 유래되는 물질로부터 측정되는 신호는, 탈안정화 모이어티(D)가 형질감염 경우에 비하여 더 강하다. 도 4에서 하단(B)은 세포 내에 프로테아제가 존재하지 않는 경우, R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드는 탈안정화 모이어티(D)를 그대로 유지하고 있어서, 탈안정화 모이어티(D)에 의하여 R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드의 수준이 낮아지고, 그에 따라서 그로부터 측정되는 신호도 작아진다는 것을 나타낸다. 도 4에 있어서, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 내부 표준 리포터 단백질은 프로테아제의 존재 유무와 관계없이 세포 내에서 발현된다. 반면, 상기 R-S-D 폴리펩티드는 상기 비시스트론 서열에 의하여 5'-캡 비의존적으로 번역되어 합성된다. 따라서, 상기 내부 표준 리포터로부터 측정되는 신호는 숙주세포에서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 조건을 표준화하는데 사용될 수 있다.
제2 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주세포는 상기 프로테아제를 세포 내, 예를 들면 세포질 내로 전치시킬 수 있는 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 신경독소 폴리펩티드를 세포 내 예를 들면 세포질 중으로 전치(translocate)시킬 수 있는 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 예를 들면, 프로테아제와 수용체를 통하여 결합하고 그 복합체를 세포 내 예를 들면, 세포질 중으로 전치시키는 것일 수 있다. 그러나, 청구된 발명이 특정한 전치 기작에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포질 내에서 발현할 수 있는 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 염색체 내에 삽입되어 있거나, 염색체 외에 형질감염 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 일시적(transient) 또는 영구적(permanently)으로 발현되는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그 자체 또는 벡터와 같은 비히클에 포함된 형태일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 외부로부터 도입된 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 재조합 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 내분비성 세포(endocrine cell)일 수 있다. 상기 세포는 일차 뉴론(primary neuron), neuroblastoma 세포, 및 만능 줄기세포로부터 분화된 뉴론으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 숙주세포는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 리포터 모이어티; 탈안정화 모이어티 및 상기 리포터 모이어티와 상기 탈안정화 모이어티를 작동적으로 연결하는 기질 모이어티로서, 상기 기질 모이어티는 프로테아제 활성의 절단 부위(cleavage site)를 포함하는 것인 기질 모이어티를 포함하는 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드와 상기 내부 표준 리포터 단백질을 발현하는 것일 수 있다.
제3 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드, 및 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터 또는 그 산물에 의하여 방출되는 신호를 측정하기 위한 검출제(detection agent)를 포함하는, 프로테아제, 예를 들면 신경독소 폴리펩티드의 단백질 분해 활성(proteolytic activity)을 결정하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트에 있어서, 상기 리포터는 루시퍼라제이고, 상기 키트는 루시퍼라제 기질을 더 포함하고, 상기 검출제는 상기 루시퍼라제 기질의 효소적 전환을 측정하기 위한 것 예를 들면, 광검출기일 수 있다. 상기 리포터는 형광 단백질이고, 상기 검출제는 상기 형광 단백질로부터 나오는 형광을 측정하기 위한 것, 예를 들면, 상기 형광 단백질을 여기 광을 이용하여 여기시키고 이에 따라 방출되는 형광을 측정하기 위한 장비일 수 있다. 상기 내부 표준 리포터는 상기 리포터 모이어티와는 다른 것일 수 있다. 상기 리포터는 상기 리포터 모이어티와는 다른 루시퍼라제 또는 형광 단백질일 수 있다.
제4 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포, 및 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터 또는 그 산물에 의하여 방출되는 신호를 측정하기 위한 검출제(detection agent)를 포함하는, 프로테아제 예를 들면, 신경독소 폴리펩티드의 단백질 분해 활성(proteolytic activity)을 결정하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트에 있어서, 상기 리포터는 루시퍼라제이고, 상기 키트는 루시퍼라제 기질을 더 포함하고, 상기 검출제는 상기 루시퍼라제 기질의 효소적 전환을 측정하기 위한 것일 수 있다. 상기 리포터는 형광 단백질이고, 상기 검출제는 상기 형광 단백질로부터 나오는 형광을 측정하기 위한 것, 예를 들면, 상기 형광 단백질을 여기 광을 이용하여 여기시키고 이에 따라 방출되는 형광을 측정하기 위한 장비일 수 있다. 상기 내부 표준 리포터는 상기 리포터 모이어티와는 다른 것일 수 있다. 상기 리포터는 상기 리포터 모이어티와는 다른 루시퍼라제 또는 형광 단백질일 수 있다.
제5 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드를 프로테아제 폴리펩티드를 포함할 것으로 의심되는 시료와 접촉시키는 단계; 및 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 활성을 결정하는 방법을 제공한다.
제6 양상은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드를 프로테아제 폴리펩티드에 접촉시키는 단계; 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상을 결정하는 단계를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 폴리펩티드의 특성을 결정하는 방법을 제공한다.
제5 및 제6 양상의 상기 방법은 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드에 의하여 코딩되는 폴리펩티드를 프로테아제 폴리펩티드를 포함할 것으로 의심되는 시료 또는 프로테아제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉은 상기 폴리펩티드 중의 프로테아제 활성의 절단 부위가 분해되도록 하는 조건하에서 수행될 수 있다. 상기 프로테아제는 신경독소 폴리펩티드일 수 있다.
상기 접촉은 액체 매질 중에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 액체 매질은 상기 프로테아제의 단백질 분해 활성이 작동하도록 하는 조건을 갖는 것일 수 있다. 상기 조건은 pH, 온도, 보조인자, 염 농도, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 액체 매질은 인산 완충 염수(PBS)와 같은 완충용액일 수 있다.
제5 및 제6 양상의 상기 방법은 또한 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 상기 리포터 모이어티가 검출가능한 신호를 방출하는 폴리펩티드인 경우, 상기 단계는 상기 신호를 직접적으로 측정하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 리포터 모이어티가 GFP와 같은 형광 단백질인 경우, 그 형광을 측정하는 것일 수 있다. 형광을 측정하는 것은 상기 접촉된 산물에 여기광을 조사하고, 상기 접촉된 산물로부터 나오는 방사광을 측정하는 것일 수 있다. 여기광 및 방사광의 파장은 선택되는 형광 단백질에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 리포터 모이어티가 그에 의하여 촉매되는 반응에서 검출가능한 신호를 방출하는 물질로 전환하는 폴리펩티드인 경우, 상기 단계는 접촉된 산물 중에 상기 리포터 모이어티의 촉매 활성에 필요한 기질을 첨가하여, 기질을 검출가능한 신호를 방출하는 물질로 전환시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 다음으로, 검출가능한 신호를 방출하는 물질로부터 상기 신호를 측정하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 리포터 모이어티는 루시퍼라제이고, 상기 접촉시키는 단계 또는 신호를 측정하는 단계는, 반응액 중에 루시퍼라제 기질을 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 검출은 상기 루시퍼라제 기질의 효소적 전환을 측정하기 위한 것일 수 있다. 상기 루시퍼라제 기질은 루시페린일 수 있다.
제5 및 제6 양상의 상기 방법에 있어서, 상기 측정된 신호를 대조군으로부터 측정된 신호와 비교하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 대조군은 프로테아제 예를 들면, 신경독소 폴리펩티드가 없거나 알려진 농도의 프로테아제 예를 들면, 신경독소 폴리펩티드를 포함하는 시료를 사용한 것을 제외하고는 동일한 과정에 의하여 측정된 것일 수 있다. 상기 방법은 상기 비교하는 단계에 의하여 얻어진 신호 대 시료 중 프로테아제의 수준과의 상관관계에 의하여 시료 중의 프로테아제의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
제6 양상의 상기 방법은 상기 측정된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상을 결정하는 단계를 포함한다. 상기 신호의 방출 개시점, 및 지속시간 중 하나 이상은 통상의 기술자에 의하여 상기 측정된 신호로부터 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들면, 통상의 기술자는 시간에 따른 프로테아제 활성을 나타내는 신호 값, 예를 들면, 방출된 신호로부터 방출 개시 시점, 및 지속시간을 결정할 수 있다. 상기 시간에 따른 프로테아제 활성을 나타내는 신호 값은 시간에 따른 방출된 신호의 측정값으로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간을 결정할 수 있다. 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상은 프로테아제의 타입과 같은 특성에 따라 달라지는 것일 수 있다. 상기 리포터 모이어티가 검출 가능한 신호를 방출하는 폴리펩티드인 경우, 프로테아제 활성에 의해 절단 부위가 분해될 경우 방출된 신호가 증가하기 시작하여 프로테아제 활성이 사라질 경우 방출된 신호가 감소하는 것일 수 있다. 예를 들면, 동일한 조건에서 측정된 경우 프로테아제의 특성에 따라, 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상이 달라질 수 있다. 또한, 상기 프로테아제는 이러한 상대적 비교뿐만 아니라, 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상의 절대값 또는 그 범위로부터 다른 프로테아제와 구별될 수 있다. 따라서, 상기 결정하는 단계는 알려진 프로테아제에 대한 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상과 비교하는 것 또는 알려진 프로테아제의 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상의 절대값 또는 그 범위로부터 프로테아제 특성을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상에 따라 그 프로테아제에 의하여 치료되어질 적응증(indication)이 달라질 수 있다. 따라서, 상기 방법은 결정된 프로테아제 특성에 근거하여, 프로테아제에 의하여 개체에서 치료되어질 적응증을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
제7 양상은 상기한 숙주세포를 프로테아제 폴리펩티드를 포함할 것으로 의심되는 시료와 접촉시키는 단계; 및 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 상기 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 활성을 결정하는 방법을 제공한다.
제8 양상은 상기한 숙주세포를 프로테아제 폴리펩티드에 접촉시키는 단계; 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티, 상기 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상을 결정하는 단계를 포함하는, 시료 중의 프로테아제 폴리펩티드의 특성을 결정하는 방법을 제공한다.
제7 및 제8 양상의 상기 방법은 상기한 숙주세포를 프로테아제 폴리펩티드를 포함할 것으로 의심되는 시료와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉은 프로테아제 활성의 절단 부위가 분해되도록 하는 조건하에서 수행될 수 있다. 상기 프로테아제는 신경독소 폴리펩티드일 수 있다. 상기 접촉은 액체 매질 중에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 액체 매질은 상기 프로테아제의 단백질 분해 활성이 작동하도록 하는 조건을 갖는 것일 수 있다. 상기 조건은 pH, 온도, 보조인자, 염 농도, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 액체 매질은 인산 완충 염수(PBS)와 같은 완충용액, 또는 숙주세포가 배양되는 배지일 수 있다.
제7 및 제8 양상의 상기 방법에 있어서, 상기 숙주세포는 상기 프로테아제를 세포 내, 예를 들면 세포질 내로 전치시킬 수 있는 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 신경독소 폴리펩티드를 세포 내 예를 들면 세포질 중으로 전치(translocate)시킬 수 있는 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 예를 들면, 프로테아제와 수용체를 통하여 결합하고 그 복합체를 세포 내 예를 들면, 세포질 중으로 전치시키는 것일 수 있다. 그러나, 청구된 발명이 특정한 전치 기작에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포질 내에서 발현할 수 있는 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 염색체 내에 삽입되어 있거나, 염색체 외에 존재하는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 일시적(transient) 또는 안정적으로(stably) 발현되는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그 자체 또는 벡터와 같은 비히클에 포함된 형태일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 외부로부터 도입된 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 재조합 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 내분비성 세포(endocrine cell)일 수 있다. 상기 숙주세포는 일차 뉴론(primary neuron), neuroblastoma 세포, 및 만능 줄기세포로부터 분화된 뉴론으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 리포터 모이어티; 탈안정화 모이어티 및 상기 리포터 모이어티와 상기 탈안정화 모이어티를 작동적으로 연결하는 기질 모이어티로서, 상기 기질 모이어티는 프로테아제 활성의 절단 부위(cleavage site)를 포함하는 것인 기질 모이어티를 포함하는 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드와 상기 내부 표준 리포터 단백질을 발현하는 것일 수 있다.
제7 및 제8 양상의 상기 방법은 또한 접촉된 산물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 상기 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터가 검출가능한 신호를 방출하는 폴리펩티드인 경우, 상기 단계는 상기 신호를 직접적으로 측정하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 리포터 모이어티가 GFP와 같은 형광 단백질인 경우, 그 형광을 측정하는 것일 수 있다. 형광을 측정하는 것은 상기 접촉된 산물에 여기광을 조사하고, 상기 접촉된 산물로부터 나오는 방사광을 측정하는 것일 수 있다. 여기광 및 방사광의 파장은 선택되는 형광 단백질에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터가 그에 의하여 촉매되는 반응에서 검출가능한 신호를 방출하는 물질로 전환하는 폴리펩티드인 경우, 상기 단계는 접촉된 산물 중에 상기 리포터 모이어티의 촉매 활성에 필요한 기질을 첨가하여, 기질을 검출가능한 신호를 방출하는 물질로 전환시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 다음으로, 검출가능한 신호를 방출하는 물질로부터 상기 신호를 측정하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터는 루시퍼라제이고, 상기 접촉시키는 단계 또는 신호를 측정하는 단계는, 반응액 중에 루시퍼라제 기질을 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 검출은 상기 루시퍼라제 기질의 효소적 전환을 측정하기 위한 것일 수 있다. 상기 루시퍼라제 기질은 루시페린일 수 있다. 예를 들면, 상기 리포터 모이어티는 루시퍼라제이고, 상기 접촉시키는 단계 또는 신호를 측정하는 단계는, 반응액 중에 루시퍼라제 기질을 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 검출은 상기 루시퍼라제 기질의 효소적 전환을 측정하기 위한 것일 수 있다. 상기 루시퍼라제 기질은 루시페린일 수 있다.
제7 및 제8 양상의 방법에 있어서, 상기 리포터는 형광 단백질이고, 상기 측정하는 단계는 상기 형광 단백질로부터 나오는 형광을 측정하는 것을 포함하는 것일 수 있다.
제7 및 제8 양상의 방법에 있어서, 상기 측정된 신호를 대조군으로부터 측정된 신호와 비교하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 대조군은 신경독소 폴리펩티드가 없거나 알려진 농도의 신경독소 폴리펩티드를 포함하는 시료를 사용한 것을 제외하고는 동일한 과정에 의하여 측정된 것일 수 있다. 상기 방법은 상기 비교하는 단계에 의하여 얻어진 신호 대 시료 중 신경독소 폴리펩티드의 수준과의 상관관계에 의하여 시료 중의 신경독소 폴리펩티드의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
제7 및 제8 양상의 방법에 있어서, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드의 상류 또는 하류에 연결된 비시스트론 서열(bicistronic sequence) 및 상기 비시스트론 서열의 상류 또는 하류에 작동가능하게 연결된 내부 표준 리포터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 방법은 내부 표준 리포터로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 방법은 또한 내부 표준 리포터로부터 방출되는 신호 대비 상기 리포터로부터 방출되는 신호의 수준을 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
제8 양상의 상기 방법은 상기 측정된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상을 결정하는 단계를 포함한다. 상기 신호의 방출 개시점, 및 지속시간 중 하나 이상은 통상의 기술자에 의하여 상기 측정된 신호로부터 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들면, 통상의 기술자는 시간에 따른 프로테아제 활성을 나타내는 신호 값, 예를 들면, 방출된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간을 결정할 수 있다. 상기 시간에 따른 프로테아제 활성을 나타내는 신호 값은 시간에 따른 방출된 신호의 측정값으로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간을 결정할 수 있다. 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상은 프로테아제의 타입과 같은 특성에 따라 달라지는 것일 수 있다. 상기 리포터 모이어티가 검출 가능한 신호를 방출하는 폴리펩티드인 경우, 프로테아제 활성에 의해 절단 부위가 분해될 경우 방출된 신호가 증가하기 시작하여 프로테아제 활성이 사라질 경우 방출된 신호가 감소하는 것일 수 있다. 예를 들면, 동일한 조건에서 측정된 경우 프로테아제의 특성에 따라, 상기 신호의 방출 개시 시점과 그 지속시간 중 하나 이상이 달라질 수 있다. 또한, 상기 프로테아제는 이러한 상대적 비교뿐만 아니라, 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상의 절대값 또는 그 범위로부터 다른 프로테아제와 구별될 수 있다. 따라서, 상기 결정하는 단계는 알려진 프로테아제에 대한 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상과 비교하는 것 또는 알려진 프로테아제의 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상의 절대값 또는 그 범위로부터 프로테아제 특성을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상에 따라 그 프로테아제에 의하여 치료되어질 적응증(indication)이 달라질 수 있다. 따라서, 상기 방법은 결정된 프로테아제 특성에 근거하여, 프로테아제에 의하여 개체에서 치료되어질 적응증을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
제8 양상의 상기 방법은 세포의 손상 없이 예를 들면, 세포 분쇄(lysis) 없이 상기 측정된 신호로부터 상기 신호의 방출 개시 시점, 및 지속시간 중 하나 이상을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
제9 양상은 상기 숙주세포에 프로테아제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 도입시키는 단계; 및 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 숙주세포를 배양하고 배양물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 상기 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 숙주세포가 프로테아제를 발현 또는 저해할 수 있는 능력을 측정하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기 숙주세포에 프로테아제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 도입시키는 단계를 포함한다. 숙주세포 및 프로테아제에 대하여는 상기한 바와 같다. 도입시키는 단계는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 또는 형질도입(transduction)과 같은 임의의 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하는 방법에 의할 수 있다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포질 내에서 발현할 수 있는 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 염색체 내에 삽입되어 있거나, 염색체 외에 존재하는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 일시적(transient) 또는 안정적(stably)으로 발현되는 것일 수 있다. 프로테아제 예를 들면, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그 자체 또는 벡터와 같은 비히클에 포함된 형태일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 외부로부터 도입된 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 재조합 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 내분비 세포일 수 있다. 상기 숙주세포는 일차 뉴론(primary neuron), neuroblastoma 세포, 및 만능 줄기세포로부터 분화된 뉴론으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 숙주세포를 배양하고 배양물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 상기 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 상기 배양은 시험 물질의 존재하에서 수행될 수 있다. 상기 시험 물질은 단백질, 다당과 같은 중합체이거나 작은 분자 화합물(small molecule compound)일 수 있다. 상기 시험 물질은 프로테아제를 저해하거나, 촉진할 것으로 여겨지는 물질일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 후보물질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 것일 수 있다. 따라서, 상기 방법은 프로테아제 활성을 조절하는 물질을 스크리닝하는 방법일 수 있다. 상기 스크리닝하는 방법에서, 시험 물질을 사용하여 얻어진 신호인 실험군 신호와 대조군 실험으로부터 얻어진 신호인 대조군 신호를 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 대조군은 프로테아제 활성을 조절하는 것으로 알려진 물질을 사용한 양성 대조군 또는 상기 후보 물질을 제외하고 동일하게 수행하여 얻어진 음성 대조군일 수 있다. 상기 방법은 상기 비교하는 단계로부터 얻어진 비교 결과로부터 후보 물질이 프로테아제 활성을 조절하는 물질인지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 실험군 신호가 음성 대조군 신호 보다 큰 경우, 상기 물질은 프로테아제 활성을 촉진하는 활성을 갖는 것으로 결정할 수 있다. 또한, 상기 실험군 신호가 음성 대조군 신호 보다 작은 경우, 상기 물질은 프로테아제 활성을 저해하는 활성을 갖는 것으로 결정할 수 있다.
제1 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드에 따르면, 그를 포함한 숙주세포 및 시료 중의 신경독소 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 결정하는 방법에 사용될 수 있다.
제2 양상에 따른 상기한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포에 의하면, 시료 중의 신경독소 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 결정하는 방법에 효율적으로 사용될 수 있다.
제3 및 제4 양상에 따른 신경독소 폴리펩티드의 단백질 분해 활성(proteolytic activity)을 결정하기 위한 키트에 의하면, 신경독소 폴리펩티드의 단백질 분해 활성(proteolytic activity)을 결정하는데 사용될 수 있다.
제5 및 제7 양상에 따른 시료 중의 신경독소 폴리펩티드의 특성을 결정하는 방법에 따르면, 신경독소 폴리펩티드의 특성을 효율적으로 결정할 수 있다.
제6 및 제8 양상에 따른 시료 중의 신경독소 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 결정하는 방법에 의하면, 시료 중의 신경독소 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 효율적으로 결정할 수 있다.
제9 양상에 따른 숙주세포가 프로테아제를 발현 또는 저해할 수 있는 능력을 측정하는 방법에 의하면, 숙주세포가 프로테아제를 발현 또는 저해할 수 있는 능력을 효율적으로 측정하거나, 시험 물질이 프로테아제 활성을 조절할 수 있는지를 결정할 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드의 구조 및 그에 의하여 발현된 폴리펩티드와 프로테아제의 반응을 나타내는 도면이다.
도 3은 일 양상에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 프로테아제와 접촉하는 경우를 나타내는 도면이다.
도 4은 일 양상에 따른 내부 표준 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 프로테아제와 접촉하는 경우를 나타내는 도면이다.
도 5는 pFB 벡터1로 형질감염된 NG108-15 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 리포터 모이어티의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 pFB 벡터2로 형질감염된 NG108-15 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포를 형광 현미경으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 pFB 벡터3으로 형질감염된 NG108-15 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포의 리포터 모이어티의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 8은 pFB 벡터3으로 형질감염된 SiMa 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포의 리포터 모이어티의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는 pFB 벡터3으로 형질감염된 NT2 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포의 리포터 모이어티의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 pFB 벡터6으로 형질감염된 NG108-15 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 B의 경쇄를 발현하는 pCDNA4_BLC 벡터를 일시적 형질감염(transient transfection)한 NG108-15 세포로부터 발현된 리포터 모이어티 및 내부 표준 리포터 단백질로부터 나오는 신호를 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 pFB 벡터2로 형질감염된 NT2 세포를 안정화된 단일클론 유래 세포주로 확립하고 신경세포로 분화시킨 후 다른 농도의 BoNT/A로 중독화하고 발현된 리포터 모이어티 단백질로부터 나오는 신호를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12 내지 14는 pFB 벡터2로 형질감염된 NT2 세포를 안정화된 단일클론 유래 세포주로 확립하고 신경세포로 분화시킨 후 다른 농도의 BoNT/A 함유 완제품으로 중독화하고 발현된 리포터 모이어티 및 내부 표준 리포터 단백질로부터 나오는 신호를 확인한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1 : 리포터 모이어티 -기질 모이어티 - 탈안정화 모이어티 (이하 'R-S-D'라고도 함) 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 그를 포함하는 세포의 제작
(1) 리포터 모이어티 -기질 모이어티 - 탈안정화 모이어티 (이하 'R-S-D'라고도 함) 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 제작
상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 두 가지 구조를 제작하였다. 하나는 R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것이고, 다른 하나는 I-B-R-S-D 구조를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것이다. 여기서, I 및 B는 각각 내부 표준 리포터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 비시스트론 서열이다. 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 벡터의 형태이다.
상기 내부 표준 리포터 또는 리포터 모이어티는 발광 혹은 형광 단백질을 코딩하고 있는 뉴클레오티드 서열을 사용하였다. 구체적으로, 발광 단백질을 코딩하는 서열은 반딧불-루시퍼라제 단백질(Firefly luciferase: FLuc)(예, 서열번호 9)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(예, 서열번호 1)과 나노-루시퍼라제 단백질(Nano-luciferase: NLuc)(서열번호 10)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)을 사용하고, 형광단백질을 코딩하는 서열은 강화된 녹색형광단백질(enhanced Green Fluorescence Protein: eGFP)(서열번호 11)을 코딩하고 있는 뉴클레오티드 서열(서열번호 3) 또는 엠체리 단백질(mCherry)(서열번호 12)을 코딩하고 있는 뉴클레오티드 서열(서열번호 4)을 사용하였다.
상기 비시스트론 서열은 돼지 테스코비루스-1(teschovirus-1)에서 유래된 자가-절단 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(P2A)(서열번호 5)을 사용하였다.
단백질 분해효소의 기질 모이어티는 보툴리눔 독소 타입 A형의 경우 인간 SNAP25의 C-말단부위로써 전체 207개 아미노산 서열 중 145번부터 207번까지의 아미노산 서열(서열번호 14)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 6) 또는 보툴리눔 독소 타입 B형의 경우 인간 VAMP2(서열번호 18)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 17)을 사용하였다.
탈안정화 모이어티는 PEST 서열(서열번호 16)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 8) 및 CL1 서열(서열번호 15)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호7)을 사용하였다.
상기 재조합 폴리뉴클레오티드의 제작 과정은 다음과 같았다:
먼저, pGL4.31 벡터(Promega)에서, 반딧불-루시퍼라제 단백질(Firefly luciferase: FLuc)(서열번호 9)을 코딩하는 뉴클레오티드(서열번호 1)(이하 'FLuc 서열'이라고 함)를, pNL1.1 벡터(Promega)에서 나노-루시퍼라제 단백질(Nano-luciferase: NLuc)(서열번호 10)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)(이하 'NLuc 서열'이라고 함)를, pEGFP-C1 벡터(clontech)에서 강화된 녹색형광단백질(enhanced Green Fluorescence Protein: eGFP)(서열번호 11)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 3)(이하 'eGFP 서열'이라고 함)을, pmCherry-C1 벡터에서 엠체리 단백질(mCherry)(서열번호 12)을 코딩하고 있는 뉴클레오티드 서열(서열번호 4)(이하 'mCherry 서열'이라고 함)을 얻었다. 인간 SNAP25의 C-말단부위로써 전체 207개 아미노산 서열 중 145번부터 207번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열서열번호 6)(이하 'SNAP25 서열'이라고 함)과 인간 VAMP2를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(이하 'VAMP2 서열'이라고 함)은 인간 유래 세포주의 mRNA에서 RT-PCR을 통해 뉴클레오티드 서열을 합성하였다. CL1과 PEST이 융합된 CL1-PEST 폴리펩티드를 코딩하는 서열(이하 'CL1-PEST 서열'이라고 함), 및 돼지 테스코비루스-1(teschovirus-1)에서 유래된 자가-절단 펩티드 P2A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(이하 'P2A 서열'이라고 함)은 유전자 합성을 통해 얻었다.
다음으로, 상기의 서열들의 조합으로 R-S-D 혹은 I-B-R-S-D의 재조합된 폴리뉴클레오티드를 제한효소를 이용한 유전자 클로닝 법을 이용하여 제작하였으며 pCDNA4 벡터(invitrogen) 또는 pFB 벡터(Agilent)의 BamHI/XhoI 제한효소 부위에 연결하여 재조합 벡터를 제작하였다. 예로서 NLuc 서열-SNAP25 서열-CL1-PEST 서열로 구성된 재조합 폴리뉴클레오티드가 pCDNA4 벡터의 BamHI/XhoI 효소 부위에 도입된 벡터(이하 "pCDNA4 벡터1"이라고도 함) 또는 pFB 벡터의 BamHI/XhoI 효소 부위에 도입된 pFB 벡터(이하 "pFB 벡터1"이라고도 함)를 제작하였다. 또한, 상기 mCherry 서열, SNAP25 서열, 및 CL1-PEST 서열로 구성된 재조합 폴리뉴클레오티드가 pCDNA4 벡터의 BamHI/XhoI 효소 부위에 도입된 벡터(이하 pCDNA4 벡터2) 또는 pFB 벡터의 BamHI/XhoI 효소 부위에 도입된 pFB 벡터(이하 "pFB 벡터2"이라고도 함)를 제작하였다. 또한, 상기 FLuc 서열, 및 P2a 서열, NLuc 서열, SNAP25 서열, 및 CL1-PEST 서열로 구성된 재조합 폴리뉴클레오티드가 pCDNA4 벡터의 BamHI/XhoI 효소 부위에 도입된 벡터(이하 pCDNA4 벡터3) 또는 pFB 벡터의 BamHI/XhoI 효소 부위에 도입된 pFB 벡터(이하 "pFB 벡터3"이라고도 함)를 제작하였다. 또한, 상기 FLuc 서열, P2a 서열, NLuc 서열, VAMP2 서열, 및 CL1-PEST 서열로 구성된 재조합 폴리뉴클레오티드가 pFB 벡터의 BamHI/XhoI 효소 부위에 도입된 pFB 벡터(이하 "pFB 벡터4"이라고도 함)를 제작하였다.
여기서 pCDNA4 벡터는 플라스미드 유래의 벡터이며 세포에서 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 일시적(transient) 발현을 시키기 위하여 사용하였다. 반면, pFB 벡터는 몰로니 생쥐 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia virus: MMLV) 유래의 벡터로서 형질감염을 통한 조작된 세포주, 즉 상기 재조합 폴리뉴클레오티드가 염색체 내에 도입된 세포주를 제작하는데 사용되었다.
제작된 플라스미드 벡터 및 바이러스 벡터는 시퀀싱을 통해 작제물의 구성을 확인하였으며 세포 배양용 수준으로 플라스미드 벡터 DNA를 정제 및 분리하였다.
(2) R-S-D 또는 I-B-R-S-D 폴리펩티드를 발현하는 세포의 제작
상기 (1)에서 제작된 벡터를 안정하고 일정하게 발현하는 세포주를 구축하기 위해 MMLV 유래 바이러스 벡터, 즉 pFB 벡터를 이용한 형질도입법을 수행하였다. MMLV 유래 바이러스 벡터를 이용한 형질감염법은 당업계에서 널리 수행되는 방법이며 해당 참고 문헌을 참조하였다(Felts Ka et al., Mol Biotechnol. 2002 Sep;22(1):25-32.). 간략히 설명하면 패키징을 위한 세포인 HEK-293T(ATCC-CRL-3216) 세포를 10% fetal bovine serum(FBS)이 포함된 DMEM 배지 10ml에 1X107의 세포 개수를 55 cm2 컬쳐 디시에 씨딩하고 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 후, (1)에서 제작된 본 발명의 재조합 폴리뉴클레오티드 pFB 벡터 즉 pFB 벡터 1,2,3, 또는 4와 pCMV-gagpol (Cell Biolabs,inc.)및 pCMV-VSV-G (Cell Biolabs,inc.)를 3:2:1의 비율로 혼합하였다. 이때 pFB 벡터는 7.5ug를 사용하였다. 이 벡터의 혼합물은 형질감염(transfection)을 하기 위해 LipofectamineTM 3000 (invitrogen)를 이용하였으며 형질도입방법은 제조자의 지침에 따라 수행하였다. 형질 도입 이후 48시간 동안 세포를 동일한 조건에서 배양하였다. 그에 따라, 상기 HEK 293T 세포로부터 감염성 있는 패키징된 pFB 벡터 1,2,3 또는 4 함유 비루스를 생산하였다.
다음으로, 생산된 상기 감염성 있는 패키징된 pFB 벡터 1,2,3 또는 4 함유 비루스를 목적 세포에 형질 감염시켜 안정화되고 일정하게 발현하는 세포주를 확립하였다. 목적 세포는 NG108-15 세포(ATCC-HB-12317), SiMa 세포(DSMZ: ACC-164), 및 NT2 세포(ATCC-CRL-1973)를 사용하였다. NG108-15 세포는 쥐의 신경아세포종과 랫트의 신경교종의 잡종 세포로써 신경세포로 분화를 통해 보툴리눔 독소 A형에 대한 감수성이 확인된 세포주이며(Whitemarsh RC et al., Biochem Biophys Res Commun. 2012 Oct 19;427(2):426-30), SiMa 세포는 인간 유래 신경아세포종 유래의 세포주로서 신경세포로 분화를 통해 보툴리눔 독소 A형에 대한 감수성이 확인된 세포주이며(Fernandez-Salas E et al., PLoS One. 2012;7(11):e49516), NT2 세포는 인간의 고환에서 유래한 태생기암 (embryonal carcinoma)세포주로서 다분화능을 가지고 있으며 특정 조건하에서 신경세포로 분화가 진행될 수 있으며 신경세포로 분화된 NT2 세포는 보툴리눔 독소 A형에 대한 감수성이 확인되었다 (Tegenge et al., Cell Mol Neurobiol. 2012 Aug;32(6):1021-9).
목적 폴리펩티드의 발현이 안정화된 세포주 제작의 구체적 과정은 다음과 같다.
먼저, 목적세포는 감염 하루 전에 10% FBS가 함유된 DMEM 배지 0.5ml를 함유하는 24-well 플레이트의 각 웰당 약 1x105 세포로 씨딩하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1일 동안 배양하였다. 또한, 상기에서 수집된 HEK-293T 세포의 배양 상등액을 0.45um 시린지 필터를 이용하여 여과하여, 세포와 세포 잔해가 제거된 비루스 용액을 얻었다. 이렇게 얻어진 비루스 용액을 1ml/웰(24-웰)의 농도로 배지가 제거된 상기 목적 세포가 배양된 웰에 첨가하고, 동일한 조건에서 6시간 동안 배양하여 감염이 일어나게 했다. 감염 시 목적세포로의 감염효율을 높이기 위해 polybrene을 8mg/ml 수준으로 첨가하였다. 6시간 이후, 상기 배지를 일반 세포 배양용 배지인 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 교체하고 2일 동안 동일한 조건에서 배양하였다.
다음으로, 24-well에서 감염된 목적세포는 2일간 배양 후 55 cm2 컬쳐 디쉬(dish)로 이송되고 pFB 벡터의 선택적 항생제인 게네티신(geneticin, Gibco)을 500~1000ug/ml으로 첨가하여 5일간 배양하였다. 적절한 항생제의 용량은 목적세포와 geneticin의 적정시험(titration)에 근거하여 처리하였다. NT2 세포가 목적 세포인 경우 10ml의 세포배양용 배지를 함유한 컬쳐디쉬에서 5일간 800ug/ml의 게네티신 존재하에서 배양하였다.
다음으로, 단일 세포 클론을 형성하기 위해 목적세포를 2 세포/well의 농도로 96-well의 웰로 이송하였다. 55cm2 컬쳐 디쉬 배양에서 사용된 동일한 배지 100ul를 포함한 96-웰 플레이트의 각 웰에서 동일한 조건하에서 4주간 배양을 하면서 단일 세포의 클론이 형성된 콜로니를 세포배양용 현미경을 통해 선별하고 확장 배양을 하였다.
이 단계에서 제조된 재조합 폴리뉴클레오티드의 구성에 따라 전-선별과정을 수행할 수 있다. 즉, 내부 표준 리포터 단백질이 형광 단백질인 경우 형광 현미경을 이용하여, 또는 내부 표준 리포터 단백질이 발광 단백질인 경우 발광분석을 통해 전-선별과정을 수행하였다.
또한, 내부 표준 리포터 단백질이 존재하지 않는 재조합 폴리뉴클레오티드의 전-선별과정을 위해 또는 내부 표준 리포터 단백질이 존재하는 각 단일 클론 세포주의 감도 우수성을 먼저 선별하기 위해, 프로테오좀 저해제 MG132(Sigma)를 10uM 배지의 농도로 첨가하거나 또는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드가 SNAP25 서열을 포함하는 경우에 한정해 보툴리눔 독소 타입A형의 경쇄 DNA를, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드가 VAMP2 서열을 포함하는 경우 보툴리눔 독소 타입 B형의 경쇄 DNA를 LipofectamineTM 3000 (invitrogen)를 사용하고 제조자의 지침에 따라 형질도입 하였다. 이때 BoNT/A LC와 BoNT/B LC는 pCDA4의 BamHI/XhoI 부위에 도입되었다. 방법은 96-well에서 약 3~4주간 배양하면서 단일 클론의 콜로니가 확인된 세포에 한해 동 개수의 세포를 96-well 플레이트 2장에 독립적으로 씨딩을 하여 1장을 선별을 위한 실험에 소진하고 1장은 유지 배양용으로 이용하였다.
이러한 선별과정을 통해 단일 클론 유래의 세포주는 각각 확장 배양을 수행하고 동결보관하였다. 동결보관법은 일반적인 포유동물세포의 동결보관법으로 수행하였는데 간략히 설명하면 5x107 내지 1x107 세포를 5% 혹은 10%의 DMSO가 포함된 배양 배지 1ml에 희석하여 동결용 바이알에 담고 프로그램화된 동결 용기를 이용하여 -80℃까지 온도를 낮추고 이후 액화 질소 탱크의 가스상에 보관하였다.
그 결과, pFB 벡터 1,2,3,4, 또는 6 함유 비루스를 안정화되고 일정하게 발현하는 세포주 NG108-15 세포, SiMa 세포, 및 NT2 세포를 확립하였다.
(3) 확립된 NG108 -15 세포, SiMa 세포, 및 NT2 세포의 신경세포로의 분화 및 독도 중독법
NG108-15 세포, SiMa 세포, 및 NT2 세포는 신경아세포종(Neuroblastoma) 세포주 또는 배성암(embryonal carcinoma cell) 세포주이며, 이들은 신경 세포로 분화되는 경우, 보툴리눔 독소의 감수성이 있는 것으로 알려진 바 있다. 따라서, 이들 세포를 다음 과정에 따라 신경세포로 분화시켰다.
NG108-15 세포는 10(v/v)% FBS가 첨가된 DMEM 배지 중에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 유지 배양하였다. 신경 세포 분화를 위하여, matrigel(BD sceince)이 코팅된 세포배양용 96-well 플레이트의 각 웰에 2x104 세포/웰의 농도로 세포를 씨딩하고 약 5일간 레티노산(retinoic acid) 50uM과 푸르모파민(purmophamine) 25uM이 첨가된 neurobasal 배지(Gibco)에서 동일한 조건에서 배양하였다. 상기 neurobasal 배지는 보충제로서 B27(Gibco), Glutamax(Gibco) 및 non-essential amino acid(Gibco)를 각각 1X의 양으로 포함하였다.
SiMa 세포는 10(v/v)% FBS가 첨가된 DMEM 배지 중에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 유지 배양하였다. 신경 세포 분화를 위하여, matrigel(BD sceince)이 코팅된 세포배양용 96-well 플레이트의 각 웰에 5x104 세포/웰의 농도로 세포를 씨딩하고 약 5일간 레티노산(retinoic acid) 50uM가 첨가된 무혈청 MEM 배지(Welgene)에서 동일한 조건에서 배양하였다. 상기 MEM 배지는 보충제로서 B27(Gibco), N2(Gibco), Glutamax(Gibco), HEPES(Gibco) 및 non-essential amino acid(Gibco)를 각각 1X의 양으로 포함하였다.
NT2 세포(이하 "NTtera2 세포"라고도 함)는 10(v/v)% FBS가 첨가된 α-MEM 배지(Welgene) 중에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 유지 배양하였다. 신경 세포 분화를 위하여, 페트리 접시(petri dish)의 각 웰에 1x105 세포/ml의 농도로 세포를 씨딩하고 1주일간 레티노산(retinoic acid) 50uM가 첨가된 분화용 배지에서 동일한 조건에서 2 내지 3일마다 배지를 교환하면서 배양하였다. 분화용 배지는 10(v/v)% FBS가 첨가된 DMEM/F12(Welgene) 배지를 사용하였다.
이렇게 배양된 세포는 구상체를 형성하며 1주일간 배양 후 구상체를 수집하여 동일 면적의 일반 세포배양 플레이트에 구상체를 이송하고 부착세포로서 1주일간 동일한 조건에서 레티노산 50uM이 첨가된 상기 분화배지를 중에서 2~3일마다 배지를 교환하면서 배양하였다. 이 후 부착된 세포를 트립신을 이용하여 탈군집화, 및 탈부착화하고 세포 개수를 세었다.
1x107 세포를 175T 플라스크(Nunc)에 이송을 하고 유사분열 저해제(mitotic inhibitor)가 첨가된 상기 분화용 배지에서 동일한 조건에서 2~3일 마다 배지를 교환하면서 열흘간 배양하였다. 유사분열 저해는 AraC 1uM, 우리딘(Uridine) 10uM 및 풀록스우리딘(Floxuridine) 10uM이었다. 신경세포로 분화된 세포는 트립신을 이용하여 탈부착화하며 여기서 수득된 세포는 동결 보관하였다. 동결 보관용 배지는 동결용 배지를 이용하며 동결법은 상기 세포 동결방법을 이용하였다. 분화된 신경세포는 matrigel이 코팅된 세포배양용 96-well 플레이트에 웰당 1x105 세포수준으로 씨딩하고 상기 분화용 배지 중에서 약 열흘 이상 배양하며 배지는 2~3일간 마다 교환하였다.
(4) 분화된 신경세포에 대한 보툴리눔 독소의 중독화
분화된 신경세포에서 보툴리눔 독소 타입 A형의 중독화는 다음과 같이 수행하였다. 정제된 독소 단백질의 중독화는 상기 분화용 배지에 정제된 독소 단백질을 적절한 농도로 희석한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 유지 배양 중인 상기 신경 세포의 배양액과 교환하였다. 그 후 동일한 조건에서 24시간 동안 배양하여 독소 중독화를 유도하고, 이후 배지를 상기 분화용 배지로 교환하고 72 시간을 동일한 조건에서 배양하였다.
상기 분화용 배지를 상업적으로 판매되는 보툴리눔 독소 의약품 바이알(메디톡신주, Neuronox)에 첨가하여 동결 건조된 독소 단백질과 부형제를 현탁한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 유지 배양 중인 세포의 배양액과 교환하였다. 완제품 바이알에 대한 독소 역가 실험은 부형제의 처리 양을 동일하게 하기 위해 독소 플라시보 바이알을 이용하였다. 독소 플라시보 바이알은 완제품 독소 바이알에서 독소 단백질만을 제거하였다.
즉, 독소 완제 바이알과 독소 플라시보 바이알을 동량으로 현탁한 후 각 처리 농도에 따라 총 중독시키는 배지의 양을 동일하게 처리하였다.
(5) 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터의 정량 분석
상기 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 리포터 모이어티 또는 내부 표준 리포터 단백질의 정량 분석은 다음과 같이 수행하였다.
본 발명의 상기 재조합 폴리뉴클레오티드에서 발광 단백질을 리포터 모이어티 혹은 내부 표준 리포터 단백질로 이용한 경우 발광 분석법을 통해 상기 발광 단백질을 정량 분석하였다. 리포터 모이어티가 NLuc 경우, Nano-luciferase assay kit(promega)에 의하여 분석하였다.
리포터 모이어티가 NLuc이고 내부 표준 리포터 단백질이 FLuc인 경우, one-glo Dual nano-luciferase assay kit(promega사)를 이용하고, 시험은 공급자의 매뉴얼대로 수행하였으며, 발광은 SpectraMax(Molecular Device사)를 사용하여 측정하였다. 노말라이제이션을 위해 측정된 NLuc 값은 내부 표준 리포터 단백질인 FLuc 값으로 나눈 값을 결과 값으로 이용하였다.
본 발명의 상기 재조합 폴리뉴클레오티드에서 형광 단백질을 리포터 모이어티 혹은 내부 표준 리포터 단백질로 이용한 경우, 형광 측정기를 통해 형광값을 정량 분석하였다. 리포터 모이어티가 mCherry이고 내부 표준 리포터 단백질이 eGFP인 경우 형광 측정기인 SpectraMax(Molecular Device사)를 사용하여 mCherry의 경우 610nm 파장에서 여기하고 507nm 파장에서 방출값을 측정하였다. eGFP의 경우 488 nm 파장에서 여기하고 507 nm 파장에서 방출 값을 측정하였다. 노말라이제이션을 위해 측정된 mCherry의 방출 값은 내부 표준 리포터 단백질인 eGFP의 방출 값으로 나눈 값을 결과값으로 이용하였다. 또한 incucyte 기기(Essen Bioscience사)를 이용하여 GFP와 RFP의 형광값을 측정하여 노말라이제이션을 수행해 결과 값으로 이용할 수 있다. eGFP는 GFP 계열이고 mCherry는 RFP 계열이다.
(6) 결과
도 5는 pFB 벡터1로 형질감염된 NG108-15 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 리포터 모이어티의 활성을 측정한 결과를 나타낸다. 도 5에서, pFB 벡터1로 형질감염된 NG108-15 세포의 제작, 신경세포로 분화, 보툴리눔 독소 A로 중독화, 및 리포터 모이어티의 활성 측정은 상기 (3), (4), 및 (5)에 기재된 바와 같다. 도 5에서, 나노-루시퍼라제의 활성 측정은, 중독화를 위하여 최종적으로 72 시간 배양된 세포를 상기의 Nano-luciferase kit를 이용하여 발광도를 측정하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 측정된 나노-루시퍼라제의 활성은 10nM 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 것이, 그렇지 않은 경우에 비하여 현저하게 증가된 상대적 발광 단위(relative luminescence unit)를 보였다.
도 6은 pFB 벡터2로 형질감염된 NG108-15 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포를 형광 현미경으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 6에서, pFB 벡터2로 형질감염된 NG108-15 세포의 제작, 신경세포로 분화, 및 보툴리눔 독소 A로 중독화는 상기 (3), 및 (4)에 기재된 바와 같다. 도 6에 나타낸 결과는, Olympus FSX-100 기기 형광 현미경을 사용하여 중독화를 위하여 최종적으로 72 시간 배양된 세포를 형광관찰 하였다.
도 6에서 control은 보툴리눔 독소 A 농도가 0nM인 대조군이고, BoNT/A 1nM은 보툴리눔 독소 A 농도가 1nM인 실험군을 나타낸다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 실험군에서 적색 형광을 띠는 세포가 현저하게 증가하였다.
도 5 및 도 6의 결과는 보툴리눔 독소 A에 의하여 SNAP25의 절단 부위가 절단되지 않는 경우, NLuc-SNPA25 기질 모이어티-CL1-PEST 구조의 폴리펩티드가 용이하게 분해되어 상대적 발광 단위가 낮은 반면, 보툴리눔 독소 A에 의하여 SNAP25의 절단 부위가 절단되는 경우, NLuc-SNPA25 기질 모이어티-CL1-PEST 구조의 폴리펩티드가 분해로부터 안정화되어 상대적 발광 단위가 높다는 것을 나타낸다.
도 7은 pFB 벡터3으로 형질감염된 NG108-15 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포를 형광 현미경으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 7에서, pFB 벡터3으로 형질감염된 NG108-15 세포의 제작, 신경세포로 분화, 보툴리눔 독소 A로 중독화, 및 리포터 모이어티의 활성 측정은 상기 (3), (4), 및 (5)에 기재된 바와 같다. 도 7에서, 반디불이-루시퍼라제(FLuc) 및 나노-루시퍼라제(NLuc)의 활성 측정은, 중독화를 위하여 최종적으로 72 시간 배양된 세포를 One-glo nano dual luciferase kit를 이용하여 발광도를 측정하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 측정된 반디불이-루시퍼라제(FLuc)에 대한 나노-루시퍼라제의 상대적 활성은 10nM 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 것이, 그렇지 않은 경우에 비하여 현저하게 증가된 상대적 발광 단위(relative luminescence unit)를 보였다. 도 7에서 BoNT/A 0nM은 보툴리눔 독소 A 농도가 0nM인 대조군이고, BoNT/A 1nM은 보툴리눔 독소 A 농도가 1nM인 실험군을 나타낸다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 측정된 나노-루시퍼라제의 활성은 10nM 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 것이, 그렇지 않은 경우에 비하여 현저하게 증가된 상대적 발광 (relative luminescence)을 보였다.
도 8은 pFB 벡터3으로 형질감염된 SiMa 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포를 형광 현미경으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 pFB 벡터3으로 형질감염된 NT2 세포를 신경세포로 분화시킨 후 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 후 세포를 형광 현미경으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 8 및 도 9는 세포를 NG108-15를 사용한 대신, SiMa 세포 및 NT2 세포를 각각 사용한 것을 제외하고는 도 7의 과정과 동일한 과정에 의하여 측정된 것이다. 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 측정된 나노-루시퍼라제의 활성은 10nM 보툴리눔 독소 A로 중독화시킨 것이, 그렇지 않은 경우에 비하여 현저하게 증가된 상대적 발광(relative luminescence)을 보였다.
도 10은 pFB 벡터 4를 이용하여 형질감염을 유도하여 안정하게 폴리펩티드를 발현하는 NG108-15 세포에서 BoNT/B의 경쇄를 임의 발현한 후 (pCDNA4-BLC) 발현된 리포터 모이어티 및 내부 표준 리포터 단백질로부터 나오는 신호를 확인한 결과를 나타낸다. 여기서, pCDNA4-BLC 벡터는 LipofectamineTM 3000 (invitrogen)를 사용하고 제조자의 지침에 따라 형질도입하였다. 형질도입 이후 48시간 동안 세포를 동일한 조건에서 배양하였다. 그에 따라서, pCDNA4-BLC 벡터는 NG108-15 세포에서 일시적(transiently)으로 발현된다. 도 10에서, 세로축은 NLuc 값을 Fluc 으로 노말라이제이션 값이다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 반디불이-루시퍼라제에 대하여 측정된 나노-루시퍼라제의 활성은 10ug 보툴리눔 독소 B의 경쇄를 코딩하는 pCDNA4-BLC의 DNA를 도입시킨 것이, 그렇지 않은 경우에 비하여 현저하게 증가된 상대적 발광(relative luminescence)을 보였다.
도 11은 pFB 벡터3가 형질도입된 안정화된 세포주 NT2 세포를 다른 농도의 BoNT/A로 중독화하고 발현된 리포터 모이어티 단백질로부터 나오는 신호를 확인한 결과를 나타낸다. 도 11에서, BoNT/A API는 BoNT/A로서 BoNT/A를 포함하는 제품을 제조하는데 사용되는 원료를 나타낸다. BoNT/A API는(주)메디톡스로부터 공급되었다. pFB 벡터3은 LipofectamineTM 3000(invitrogen)을 사용하고 제조자의 지침에 따라 형질도입하였다. 형질도입 이후 48시간 동안 세포를 동일한 조건에서 배양하였다. 그에 따라서, pFB 벡터3은 NT2 세포에서 일시적(transiently)으로 발현된다. 도 11에서, RLU는 상대적 루시퍼라제 단위(relative luciferase unit)를 나타낸다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 반디불이-루시퍼라제에 대하여 측정된 나노-루시퍼라제의 활성은 1pM 내지 10nM의 농도에서 보툴리눔 독소 A의 농도 의존적으로 상대적 발광 단위(relative luminescence unit)을 보였다. 이는 RLU를 측정함으로써, 시료 중의 보툴리눔 독소, 예를 들면 타입 A의 수준을 측정할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 12 내지 14는 pFB 벡터3이 형질도입된 안정화된 NT2 세포를 다른 농도의 BoNT/A 함유 완제품으로 중독화하고 발현된 리포터 모이어티 및 내부 표준 리포터 단백질로부터 나오는 신호를 확인한 결과를 나타낸다. 도 12 내지 도 14는 BoNT/A로서 BoNT/A를 포함하는 제품을 제조하는데 사용되는 원료를 사용한 대신, BoNT/A로서 BoNT/A를 포함하는 제품을 사용한 것을 제외하고는 동일한 과정에 의하여 측정하였다. BoNT/A API에 비하여 상기 제품은 부형제 등의 성분을 더 포함한다. 도 12, 도 13 및 14는 각각 FLuc, NLuc 및 NLuc/FLuc의 값으로 나타낸 것이다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 반디불이-루시퍼라제에 대하여 측정된 나노-루시퍼라제의 활성은 1U 내지 10U의 농도에서 보툴리눔 독소 A의 농도 의존적으로 상대적 발광 단위(relative luminescence unit)을 보였다. 이는 RLU를 측정함으로써, 시료 중의 보툴리눔 독소, 예를 들면 타입 A의 수준을 측정할 수 있다는 것을 나타낸다.
<110> Medy-Tox inc. <120> Recombinant polynucleotide encoding polypeptide including reporter moiety, substrate moiety and destabilization moiety, host cell including the same and use thereof <130> PN117979KR <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1653 <212> DNA <213> Firefly <400> 1 atggaagatg ccaaaaacat taagaagggc ccagcgccat tctacccact cgaagacggg 60 accgccggcg agcagctgca caaagccatg aagcgctacg ccctggtgcc cggcaccatc 120 gcctttaccg acgcacatat cgaggtggac attacctacg ccgagtactt cgagatgagc 180 gttcggctgg cagaagctat gaagcgctat gggctgaata caaaccatcg gatcgtggtg 240 tgcagcgaga atagcttgca gttcttcatg cccgtgttgg gtgccctgtt catcggtgtg 300 gctgtggccc cagctaacga catctacaac gagcgcgagc tgctgaacag catgggcatc 360 agccagccca ccgtcgtatt cgtgagcaag aaagggctgc aaaagatcct caacgtgcaa 420 aagaagctac cgatcataca aaagatcatc atcatggata gcaagaccga ctaccagggc 480 ttccaaagca tgtacacctt cgtgacttcc catttgccac ccggcttcaa cgagtacgac 540 ttcgtgcccg agagcttcga ccgggacaaa accatcgccc tgatcatgaa cagtagtggc 600 agtaccggat tgcccaaggg cgtagcccta ccgcaccgca ccgcttgtgt ccgattcagt 660 catgcccgcg accccatctt cggcaaccag atcatccccg acaccgctat cctcagcgtg 720 gtgccatttc accacggctt cggcatgttc accacgctgg gctacttgat ctgcggcttt 780 cgggtcgtgc tcatgtaccg cttcgaggag gagctattct tgcgcagctt gcaagactat 840 aagattcaat ctgccctgct ggtgcccaca ctatttagct tcttcgctaa gagcactctc 900 atcgacaagt acgacctaag caacttgcac gagatcgcca gcggcggggc gccgctcagc 960 aaggaggtag gtgaggccgt ggccaaacgc ttccacctac caggcatccg ccagggctac 1020 ggcctgacag aaacaaccag cgccattctg atcacccccg aaggggacga caagcctggc 1080 gcagtaggca aggtggtgcc cttcttcgag gctaaggtgg tggacttgga caccggtaag 1140 acactgggtg tgaaccagcg cggcgagctg tgcgtccgtg gccccatgat catgagcggc 1200 tacgttaaca accccgaggc tacaaacgct ctcatcgaca aggacggctg gctgcacagc 1260 ggcgacatcg cctactggga cgaggacgag cacttcttca tcgtggaccg gctgaagagc 1320 ctgatcaaat acaagggcta ccaggtagcc ccagccgaac tggagagcat cctgctgcaa 1380 caccccaaca tcttcgacgc cggggtcgcc ggcctgcccg acgacgatgc cggcgagctg 1440 cccgccgcag tcgtcgtgct ggaacacggt aaaaccatga ccgagaagga gatcgtggac 1500 tatgtggcca gccaggttac aaccgccaag aagctgcgcg gtggtgttgt gttcgtggac 1560 gaggtgccta aaggactgac cggcaagttg gacgcccgca agatccgcga gattctcatt 1620 aaggccaaga agggcggcaa gatcgccgtg tga 1653 <210> 2 <211> 516 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nano-luciferase <400> 2 atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60 gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120 actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180 atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240 gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300 atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360 gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420 gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480 accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgtga 516 <210> 3 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Enhanced GFP <400> 3 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtga 720 720 <210> 4 <211> 711 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCherry <400> 4 atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60 gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120 cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180 ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240 cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300 gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360 ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420 atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480 gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540 gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600 aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660 cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagtg a 711 <210> 5 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 5 ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60 ggacct 66 <210> 6 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> partial SNAP25 <400> 6 gagatggatg agaacctgga gcaggtgagc ggcatcatcg gaaacctccg ccatatggct 60 ctagacatgg gcaatgagat tgacacccag aatcgccaga tcgacaggat catggagaag 120 gctgattcca acaaaaccag aattgatgaa gccaaccaac gtgcaacaaa gatgctggga 180 agtggt 186 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL1 <400> 7 gcttgcaaga actggttcag tagcttaagc cactttgtga tccacctt 48 <210> 8 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEST <400> 8 agccacggct tccctcccga ggtggaggag caggccgccg gcaccctgcc catgagctgc 60 gcccaggaga gcggcatgga tagacaccct gctgcttgcg ccagcgccag gatcaacgtc 120 120 <210> 9 <211> 550 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Firefly luciferase <400> 9 Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro 1 5 10 15 Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg 20 25 30 Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu 35 40 45 Val Asp Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala 50 55 60 Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val 65 70 75 80 Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu 85 90 95 Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg 100 105 110 Glu Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val 115 120 125 Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro 130 135 140 Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly 145 150 155 160 Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe 165 170 175 Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile 180 185 190 Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val 195 200 205 Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp 210 215 220 Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val 225 230 235 240 Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu 245 250 255 Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu 260 265 270 Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val 275 280 285 Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr 290 295 300 Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser 305 310 315 320 Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile 325 330 335 Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr 340 345 350 Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe 355 360 365 Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val 370 375 380 Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly 385 390 395 400 Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly 405 410 415 Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe 420 425 430 Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln 435 440 445 Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile 450 455 460 Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu 465 470 475 480 Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys 485 490 495 Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu 500 505 510 Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly 515 520 525 Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys 530 535 540 Gly Gly Lys Ile Ala Val 545 550 <210> 10 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nano-luciferase <400> 10 Met Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu 20 25 30 Phe Gln Asn Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu 35 40 45 Ser Gly Glu Asn Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr 50 55 60 Glu Gly Leu Ser Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys 65 70 75 80 Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr 85 90 95 Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe 100 105 110 Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr 115 120 125 Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu 130 135 140 Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val 145 150 155 160 Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala 165 170 <210> 11 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Enhanced GFP <400> 11 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 12 <211> 236 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mCherry <400> 12 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe 1 5 10 15 Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe 20 25 30 Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr 35 40 45 Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp 50 55 60 Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His 65 70 75 80 Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe 85 90 95 Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val 100 105 110 Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys 115 120 125 Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys 130 135 140 Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly 145 150 155 160 Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly 165 170 175 His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val 180 185 190 Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser 195 200 205 His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly 210 215 220 Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 13 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 13 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 14 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial SNAP25 <400> 14 Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu 1 5 10 15 Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg 20 25 30 Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile 35 40 45 Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly 50 55 60 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CL1 <400> 15 Ala Cys Lys Asn Trp Phe Ser Ser Leu Ser His Phe Val Ile His Leu 1 5 10 15 <210> 16 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEST <400> 16 Ser His Gly Phe Pro Pro Glu Val Glu Glu Gln Ala Ala Gly Thr Leu 1 5 10 15 Pro Met Ser Cys Ala Gln Glu Ser Gly Met Asp Arg His Pro Ala Ala 20 25 30 Cys Ala Ser Ala Arg Ile Asn Val 35 40 <210> 17 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vamp <400> 17 atgtcggcta ccgctgccac cgtcctgcct gccgccccgg ccggcgaggg tggcccccct 60 gcacctcctc caaaccttac tagtaacagg agactgcagc agacgcaggc ccaggtggat 120 gaggtggtgg acatcatgag ggtgaatgtg gacaaggtcc tggagcggga ccagaagttg 180 tcggagctgg atgaccgtgc agatgccctc caggcagggg cctcccagtt tgaaacaagt 240 gcagccaagc tcaagcgcaa atactggtgg aaaaacctca agatgatgat catcttggga 300 gtgatctgcg ccatcatcct catcatcatc atcgtttact tcagc 345 <210> 18 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Vamp <400> 18 Met Ser Ala Thr Ala Ala Thr Val Leu Pro Ala Ala Pro Ala Gly Glu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu 20 25 30 Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val 35 40 45 Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp 50 55 60 Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser 65 70 75 80 Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met 85 90 95 Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val 100 105 110 Tyr Phe Ser 115 <210> 19 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A <400> 19 ggaaccggag agggcagagg aagtctgcta acatgcgctg acgtcgagga gaatcctgga 60 cct 63 <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A <400> 20 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 21 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2A <400> 21 ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60 cctggacct 69 <210> 22 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E2A <400> 22 Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 23 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2A <400> 23 ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60 tgcaaccctg gacct 75 <210> 24 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F2A <400> 24 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25

Claims (15)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 리포터 모이어티; 탈안정화 모이어티 및 N 말단에 상기 리포터 모이어티와 C 말단에 상기 탈안정화 모이어티를 작동적으로 연결하는 기질 모이어티로서, 상기 기질 모이어티는 활성 프로테아제에 의한 절단 부위(cleavage site)를 포함하는 것인 기질 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드로서, 상기 프로테아제는 신경독소(neurotoxin) 폴리펩티드이고, 상기 신경독소 폴리펩티드는 보툴리눔 독소 혈청 타입 A(botulinum toxin serotype A: BoNT/A), BoNT/B, BoNT/C, BoNT/CD, BoNT/D, BoNT/DC, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/FA, BoNT/G, 또는 테타누스 신경독소(TeNT)인 것인 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포로서, 상기 숙주세포는 신경독소 폴리펩티드를 세포질 중으로 전치(translocate)시킬 수 있는 세포인 것인 숙주세포.
  6. 삭제
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 숙주세포는 NT2, SiMa, 또는 NG108-15 세포인 것인 숙주세포.
  8. 청구항 5에 있어서, 단백질 분해 활성 신경독소 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 숙주세포.
  9. 청구항 5의 숙주세포를 단백질 분해 활성(proteolytically active) 신경독소 폴리펩티드를 포함할 것으로 의심되는 시료와 접촉시키는 단계; 및
    접촉된 산물 중의 상기 리포터로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 시료 중의 신경독소 폴리펩티드의 프로테아제 활성을 결정하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드의 상류 또는 하류에 연결된 비시스트론 서열(bicistronic sequence) 및 상기 비시스트론 서열의 상류 또는 하류에 작동가능하게 연결된 내부 표준 리포터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 접촉시키는 단계 전에 상기 숙주세포를 배지 중에서 배양하여 신경세포로 분화시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 숙주세포는 NT2, SiMa, 또는 NG108-15 세포인 것인 방법.
  13. 청구항 5의 숙주세포에 프로테아제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 단계; 및 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 숙주세포를 배양하고 배양물 중의 상기 리포터 모이어티 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계;를 포함하는, 숙주세포가 프로테아제를 발현 또는 저해할 수 있는 능력을 측정하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 배양은 시험 물질의 존재하에서 수행되는 것인 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 그의 상류 또는 하류에 연결된 비시스트론 서열(bicistronic sequence) 및 상기 비시스트론 서열의 상류 또는 하류에 작동가능하게 연결된 내부 표준 리포터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것이고, 상기 신호를 측정하는 단계는 상기 내부 표준 리포터 또는 그 산물로부터 방출되는 신호를 측정하는 단계인 것인 방법.
KR1020170064392A 2016-05-24 2017-05-24 리포터 모이어티, 기질 모이어티 및 탈안정화 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드, 그를 포함하는 숙주세포, 및 그의 용도 KR101981199B1 (ko)

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