KR20130111954A - N-단부 지배 프로테아제 활성 표시 방법 및 이의 용도 - Google Patents

N-단부 지배 프로테아제 활성 표시 방법 및 이의 용도 Download PDF

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KR20130111954A
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시냅틱 리서치, 엘엘씨
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Abstract

프로테아제 활성 탐지를 위한 세포 기반 분석을 공개한다. 이 분석에서, 세포는 최소한 하나의 라벨, 바람직하게는 이의 C-말단에 라벨을 가진 프로테아제 기질을 발현하도록 조작한다. 기질을 인지하는 프로테아제에 의해 기질이 절단되면 C-말단 단편과 N-말단 단편이 생성되며, 라벨을 보유하는 단편은 유비퀴틴 프로테아좀 분해를 겪는다. 이 분석은 라벨이 부착된 단편의 분해로 인하여 라벨이 사라지는 것을 측정한다. 프로테아제 활성 탐지를 위한 무-세포 분석 또한 공개한다. 무-세포 분석에서, 프로테아제 기질은 단편의 분해를 위한 유비퀴틴 프로테아좀 경로의 요소들을 포함하는 용액에서 발현된다. 이 분석은 프로테아제에 의한 절단으로 인하여 단편에 부착된 라벨의 사라짐을 측정한다.

Description

N-단부 지배 프로테아제 활성 표시 방법 및 이의 용도{N-END RULE PROTEASE ACTIVITY INDICATION METHODS AND USES THEREOF}
본 발명은 프로테아좀 분해(proteasome degradation) 대상이 되는 보틀리누스균 독소 (BoNT) 기질의 C-말단 펩티드 단편들에 일반적으로 관한 것이다. 좀더 구체적으로, BoNTs의 활성을 측정하고, BoNT 억제물질들의 확인, 진단 테스트, 그리고 N-단부 지배 분해 대상이 되는 C-말단 표식들의 분해 후 환경 시료들에서 프로테아제의 상호 작용 또는 존재를 확인하기 위하여 BoNT 기질 C-말단 펩티드 단편들을 이용하는 방법에 관한 것이다.
보틀리누스균 신경독소 (BoNTs)는 알려진 가장 강력한 천연 독소다(1, 2). 이들 독소는 신경근 접합에서 시냅스앞 말단으로부터 아세틸콜린의 방출을 차단시키는 7가지 별개의 BoNT의 혈청형(A-G)을 포함하는데, 이는 이완성 마비(flaccid paralysis)를 일으키는 원인이 된다(2, 3). BoNTs의 7가지 혈청형의 서열들은 당업계에 공지되어 있다. BoNTs는 100 kD 중쇄에 이황화결합에 의해 연결된 50 kD 촉매성 경쇄 (LC)를 포함하는 아연 메탈로프로테아제다(4). BoNTs는 이들 경쇄가 시냅스앞 말단에서 이들의 표적 단백질중 하나를 절단할 때 시냅스 전달을 일시적으로 그리고 가역적으로 억제한다. 이들 단백질은 25kD의 시냅토좀-연합 단백질(SNAP25), 소포-연합 막 백질 (VAMP) 그리고 신탁신(syntaxin)을 포함한다(4). BoNT 기질들의 서열들은 공지되어 있다. 그러나, 근육 마비 기간은 혈청형에 따라 다양하다. BoNT/A 및 BoNT/E 둘다 SNAP25를 표적으로 한다. BoNT/A로 인한 근육 마비 기간은 몇 개월 지속될 수 있지만, BoNT/E의 효과는 상대적으로 짧다(5).
발명의 요약
본 발명의 목적은 보틀리누스균 신경독소 (BoNT)의 활성을 평가하기 위하여 세포 기반 분석(cell based assay)을 제공하는 것이다. 이 분석은 기질의 C-말단에 라벨을 보유하는 BoNT 기질을 발현시키는 재조합 세포를 제공하는 것을 포함한다. 이 BoNT 기질은 BoNT에 의해 절단될 때 N-말단 단편과 C-말단 단편을 만든다. 이 C-말단 단편은 재조합 세포의 유비퀴틴(ubiquitin) 프로테아좀 경로에 의해 분해된다. 이 분석의 최종 단계는 BoNT 존재하에서 세포내 라벨의 발현을 측정하는 단계다. 본 발명의 일부 구체예들에서, BoNT는 세포의 막을 가로질러 운반된다. 다른 구체예들에서, 세포 내부의 벡터에 의해 BoNT가 발현된다.
본 발명의 추가 목적은 두 가지 BoNT를 구별하기 위한 세포 기반 분석을 제공하는 것이다. 이 분석의 제 1 단계는 제 1 프로테아제에 의해 제 1 부위에서 절단되는 프로테아제 기질을 발현시키는 벡터를 포유한 재조합 세포를 제공하는 것으로 구성되며, 이때 이 절단에 의해 제 1 C-말단 단편과 제 1 N-말단 단편이 생성되고, 상기 C-말단 단편은 재조합 세포의 유비퀴틴 프로테아좀 경로에 의해 분해가능하다. 이 프로테아제 기질은 또한 제 2 프로테아제에 의해 제 2 부위에서 절단되어, 제 2 C-말단 단편과 제 2 N-말단 단편이 생성되지만, 상기 제 2 C-말단 단편은 유비퀴틴 프로테아좀 경로에 의해 분해되지 않는다. 그 다음 재조합 세포는 제 1 프로테아제와 접촉시키고, 라벨을 측정한다. 그 다음 이 세포는 제 2 프로테아제와 접촉시키고, 라벨을 측정한다. 제 1 프로테아제를 이용한 라벨의 존재와 제 2 프로테아제를 이용한 라벨의 존재를 비교하여 기질을 인지하는 프로테아제의 활성 또는 존재를 판단한다.
보틀리누스균 독소 (BoNT) 활성을 평가하는 방법. 이 방법의 제 1 단계는 기질의 C-말단에 라벨을 보유하는 BoNT 기질을 제공하는 것으로 구성된다. 제 2 단계에서, 이 BoNT 기질은 펩티드를 분해할 수 있는 유비퀴틴 프로테아좀의 성분들을 포함하는 무세포 용액 또는 세포 기반 용액으로 구성된 군으로부터 선택한 용액에 두고, 이때 이 펩티드는 유비퀴틴 프로테아좀의 기능을 하는 성분들을 보유하는 세포 내부에서 발현된다. 그 다음 BoNT 기질은 최소한 두 가지 단편들로 절단되는데, 이때 상기 최소한 두 단편들중 최소한 하나는 라벨을 포함하며, 그리고 유비퀴틴 프로테아좀의 성분들에 의해 분해된다. 이 방법의 최종 단계에서 라벨을 포함하는 단편의 분해로 인하여 라벨로부터 신호 손실을 측정한다.
이 방법 또는 청구항 16, 이때 BoNT 기질은 25kD의 시냅토좀 연합된 단백질(SNAP-25), SNAP-25 이소폼, 소포-연합 막 백질 (VAMP), VAMP 이소폼, 그리고 상기의 것에 최소한 80% 유사한 펩티드로 구성된 군으로부터 선택하고, 프로테아제에 의해 인지되는 절단 서열을 보유한다.
본 발명의 추가 목적은 보틀리누스균 신경독소 (BoNT) 억제물질들을 확인하는 방법이다. 이 방법의 제 1 단계는 BoNT를 발현시키는 벡터와 BoNT에 의해 절단될 때 라벨을 보유하는 분해가능한 C-말단 단편을 생성시키는 BoNT 기질을 발현시키는 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공하는 것이다. 이 방법의 제 2 단계는 BoNT 및 BoNT 기질을 발현시키는 것이다. 제 3 단계는 상기 재조합 세포에 테스트 분자를 접촉시키는 것을 포함한다. 제 4 단계는 제 1 라벨 및 제 2 라벨의 존재를 측정하는 것으로 구성되며, 이때 라벨의 존재. 라벨로부터 신호의 증가는 BoNT의 억제를 나타낸다.
본 발명의 여러 장점은 첨부된 도면들 참고하면 당업자들이 더 잘 인지할 수 있을 것이다:
도 1은 본 발명의 한 구체예에 따라 루시퍼라제로 라벨된 C-말단을 보유하고, 그리고 N-단부 지배 분해를 겪는 SNAP-25를 보여주는 실험 결과들을 나타낸다.
도 2는 CFP로 라벨된 C-말단을 보유하는 SNAP-25를 보여주는 실험결과들을 나타낸다.
도 3은 BoNT/LC A에 의해 절단된 후 SNAP-25 C-말단 단편이 분해되는 것을 보여주는 실험 결과들을 나타낸다.
다음의 설명은 당업자가 본 발명을 실행할 수 있도록 제공되는 본 발명의 특정 구체예의 설명이며, 바람직한 구체예로 한정시키고자 하는 의도는 아니며, 본 발명의 특정 실시예로 제공된다. 당업자는 본 발명의 동일한 목적을 실행하기 위한 기타 방법들 및 시스템을 기획하거나 수정시키기 위하여 여기에서 공개되는 개념 및 특정 구체예들을 근거로 하여 이용할 수 있음을 인지할 것이다. 당업자는 또한 이러한 균등한 조합들이 넓은 형태로 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않음을 인지할 것이다.
본 출원에서 이용된 것과 같이, 용어들 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 당업계에 잘 인지되는 것들이며, 상호호환적으로 이용한다. 본 발명의 일부 구체예들은 당업계에 숙련자들이 인지하는 것과 같은 펩티드들 및 이러한 펩티드들의 변이체들에 관계한다. 당업자는 본 발명의 특정 구체예들이 명세서에 공개된 특정 펩티드 서열에 관한 것들이며, 또한, 공개된 펩티드 서열의 단편들, 유사체들 및/또는 유도체들과 같은 변이체들에 관한 것들이라는 것을 인지할 것이다. 특정 펩티드 서열들의 변이체들은 바람직하게는 이 특정 단백질 서열의 최소한 하나의 생물학적 기능 또는 활성을 보유한다.
이 펩티드들의 변이체들은 다음의 것일 수 있다: (i) 아미노산 잔기들중 하나 이상의 잔기들이 보존 또는 비-보존 아미노산 잔기 (바람직하게는 보존 아미노산 잔기)로 치환되며, 그리고 이러한 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 인코드되거나 또는 인코드되지 않은 것, (ii) 하나 이상의 변형된 아미노산 잔기들, 가령, 치환기들의 부착에 의해 변형된 잔기들이 있는 것, (iii) 펩티드는 본 발명의 펩티드의 대체 접합(splice) 변이체인 것, (iv) 이 펩티드들의 단편들 및/또는 (iv) 하기에서 더 설명되는 것과 같이, 폴리펩티드가 또다른 폴리펩티드, 가령, GFP 또는 루시퍼라제와 융합된 것. 변이체들은 고유 서열의 단백질분해 절단(다중-부위 단백질 가수분해를 포함)을 통하여 생성된 펩티드들을 또한 포함한다. 변이체들은 해독-후 또는 화학적으로 변형될 수 있다. 당업자는 임의의 이러한 변이체들이 본 발명의 범위내에 있는 것으로 간주한다.
당업계에 공지되어 있는 것과 같이, Davydov et al. (특허 제7,608,682호)(이의 전문이 여기에 참고자료로 통합된다)에서 설명하는 것과 같이 두 펩티드 간에 "유사성(similarity)"은 제 1 펩티드의 서열 및 이의 보존 아미노산 치환과 제 2 펩티드의 서열을 비교하여 판단한다. 변이체들은 최초 서열과 상이한, 바람직하게는 관심 분절(segment) 하나 당 잔기의 40% 미만이 최초 서열과 상이한, 더 바람직하게는 관심 분절 하나 당 잔기의 25% 미만으로 최초 서열과 상이한, 더 바람직하게는 관심 분절 하나 당 잔기의 10% 미만으로 최초 서열과 상이한, 가장 바람직하게는 관심 분절 하나 당 단지 몇 개의 잔기가 최초 단백질 서열과 상이하고, 동시에 최초 서열의 기능을 유지하고 및/또는 N-단부 지배 경로를 통하여 유비퀴틴화(ubiquitylate)시키는 능력을 유지하는데 충분한 상동성을 가진 펩티드 서열을 포함한다고 정의한다. 본 발명은 여기에서 설명하는 아미노산 서열에 최소한 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90%, 또는 95% 유사한 또는 동일한 단백질 서열을 포함한다. 다양한 프로테아제에 의해 인지되는 펩티드 안에 바람직한 분절들도 본 발명의 범위 안에 있다. 이러한 분절들은 최소한 10, 25, 50, 100, 150 또는 200개 아미노산 잔기들의 단편들을 포함하는데, 이들은 프로테아제에 의해 인지되고, 그리고 절단된다. 본 발명은 N-단부 지배 유비퀴틴화(ubiquitylation) 경로에 의해 분해가능한 여기에서 설명된 기질들의 변이체를 포함한다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
본 발명의 기타 구체예들은 이들 펩티드 (또는 이의 변이체들)와 하나 이상의 생물학적 경로의 기타 성분들의 상호작용 산물들에 관계한다. 특정 추가 구체예들은 이들 펩티드, 이 펩티드의 변이체들, 또는 펩티드들과 상호작용하는 효소들의 활성을 조정, 억제 또는 강화시키는 생물학적으로 활성이 있는 물질을 확인하는 방법에 관한 것이다. 이 펩티드들은 약학 조성물에서 활성 물질의 용도에 또한 관계한다. 본 발명의 기타 구체예들은 이들 펩티드들, 이들의 관련 생물학적 활성, 또는 이 펩티드들과 상호작용하는 효소 또는 프로테아제의 생물학적 활성을 측정하는 것과 관련된 진단 방법들에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명의 기타 구체예들은 하기에서 설명된 방법들의 실행을 지원하는 시약들, 키트, 및 분석 조성물들에 관한 것이다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 출원인은 N-단부 지배를 겪게 되는 프로테아제의 확인된 펩티드 기질들을 보유한다. 본 출원에서 이용된 것과 같이, 분해될 조짐의 펩티드 잔기들을 N-degrons이라고 한다. 분해를 촉진시키는 잔기들은 "약체화(destabilizing)" 잔기들이라고 하고, 분해를 촉진시키지 않는 잔기들은 "안정화(stabilizing)" 잔기들이라고 한다. 따라서, N-degrons는 이 펩티드 단편에서 "약체화" 잔기들이다. 출원인들은 세포 내부 유비퀴틴 프로테아좀 경로에 의해 분해되는 확인된 다양한 프로테아제 단편들을 보유한다.
본 발명의 특정 구체예들에서 제공되는 것과 같이, 프로테아제는 이의 펩티드 기질을 절단하여 새로운 N-말단 및 새로운 C-말단을 각각 보유하는 두 개의 단편들을 만든다. C-말단 단편은 유비퀴틴 분해 경로에 의해 N-단부 지배 분해를 겪는다. 본 출원에서 설명된 것과 같이, 펩티드 기질은 특정 프로테아제가 인지하여 두 개 이상의 단편들이 생성되도록 절단되는 펩티드이며, 이때 생성된 단편중 최소한 하나는 N-degron을 보유하며, 세포의 유비퀴틴 프로테아좀 시스템에 의해 분해된다. 프로테아제가 두 개 이상의 단편들을 만든다면, 이들 단편들중 최소한 하나는 N-degron을 함유할 것으로 본다.
본 발명의 한 구체예에서, 프로테아제의 펩티드 기질은 이의 C-말단에 테그 또는 라벨을 보유한다. 용어 "테그(tag)", "라벨(label)" 또는 "지표(indicator)" 는 본 출원에서 호환되며, 그리고 펩티드 또는 펩티드 단편의 탐지를 허용하는 리포터 분자를 말한다. 본 발명의 일부 구체예들에서 이용된 라벨들은 방사성 동위원소, 형광(형광 편광, 황색 형광 단백질 (YFP), 청색 형광 단백질 (BFP), 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (PvFP) 그리고 형광 돌연변이물질을 포함), 인광, 발광 (반딧불이, Renilla, 및 Gaussia 루시퍼라제를 포함), 화학적발광 및/또는 전기화학적발광(ECL) 화합물, 효소, 또는 바람직하게는 라벨된 결합 짝(가령, 바이오틴, 스트렙타아비딘, 에피토프 테그, 친화력 테그(가령, His6), 플루오레신, 합텐, 이뮤노겐, GST 및/또는 GFP)에 의해 인지되는 결합 종들을 포함하는 라벨 모이어티와 같은 효소 공-인자를 포함할 수 있고, 이들은 당업계에 공지되어 있다. 프로테아제 기질의 C-말단의 라벨링은 라벨된 분해가능한 단편을 만든다. 본 발명의 추가 구체예들에서, 프로테아제 기질은 이의 N-말단에 제 1 라벨을 그리고 이의 C-말단에 제 2 라벨을 보유한다. 시료내 각 단편의 존재를 판단하는데 각 말단 단부에 라벨들을 이용한다.
FRET 쌍들은 펩티드 기질의 라벨로 또한 이용할 수 있는 것으로 본다. FRET 분석들은 라벨된 펩티드의 각 단부에서 라벨 사이의 근접성(proximity)에 의존한다. 이 방법은 이 펩티드 기질의 절단과 두 라벨의 분리로 인한 신호의 변화에 의존한다. 전통적인 FRET 분석들이 항상 신뢰되는 것은 아닌데, 그 이유는 용액 또는 혼합물 안에 절단된 단편들이 남아있고, 일부의 경우, 허위 음성 결과로 이어지기 때문이다. 절단된 단편들이 용액 혼합물에 남아있고, 상호작용을 지속하면 절단이 일어나지 않은 것으로 나타나는 결과를 야기한다. 여기에서 설명하는 것과 같이, 단편들중 하나의 N-단부 지배 분해는 용액으로부터 FRET 쌍중 한 개 구성부를 완전하게 제거하여 정확한 결과를 낳고, 이 문제를 해결한다.
본 발명의 한 구체예에 따르면, 프로테아제 기질에 특이적인 프로테아제의 활성의 존재 또는 활성 수준을 측정하는 방법을 설명한다. 이 방법의 제 1 단계에서, 프로테아제에 의해 절단된 단편들중 하나를 분해할 수 있는 혼합물 안에 프로테아제 기질을 제공한다. 이 방법의 제 2 단계에서, 혼합물에 프로테아제를 추가한다. 제 3 단계에서, 라벨의 존재를 측정한다. 대안 구체예에서, 라벨의 존재는 이 프로테아제를 혼합물에 추가하기 전 측정한다. 이 방법의 추가 대안 구체예에서, 이 프로테아제 기질은 이의 N-말단과 C-말단에 각각 라벨을 보유한다. 이 대안 구체예의 제 2 단계에서 혼합물에 프로테아제를 추가하고, 제 3 단계에서 N-말단 라벨 및 C-말단의 존재 차이를 측정한다.
라벨의 존재를 측정하는 방법들은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 방사능활성 라벨을 이용할 때, 세포 용해물은 겔 상에서 이동시키고, 라벨된 표적이 위치하는 밴드를 방사능활성 라벨이 나타낼 것이다. 이러한 실시예에서, 대조군과 비교하였을 때, 밴드가 없는 경우, 라벨의 분실을 나타낸다. 다른 구체예들에서, 라벨에 특이적인 항체들을 이용하는 웨스턴 블랏을 이용한다. 다시, 대조군과 비교하였을 때, 웨스턴 블랏에서 밴드가 사라진 경우 단편의 분해를 나타낸다. 다른 한편으로 살아있는 세포 분석에서, 생물발광, 형광, 및 기타 라벨들을 이용하여 실시간으로 라벨의 존재를 평가한다. 여기에서 설명하는 것과 같이, 살아있는 세포 분석에서, 프로테아제가 기질에 작용하기 전, 형광 현미경으로 이 라벨을 측정한다. 상이한 시점에서 세포의 평가는 이 라벨이 발현되었는지 그리고 일정시간 이후에도 지속적으로 발현되는 지를 판단하기 위하여 시스템을 제공한다. 예를 들면, 프로테아제의 발현이 없는 대조군은 24시간 후에도 라벨이 계속 존재함을 보여준다. 그 반면에, 프로테아제가 발현되거나 또는 이의 기질과 상호작용이 허용되면, 이 형광 라벨은 더 이상 존재하지 않는다. 라벨의 존재를 측정하는 추가 예는 루시퍼라제의 활성을 측정하는 발광분석기(luminometer)를 포함한다. 당업자는 혼합물 안에 라벨의 존재를 평가하는 다른 도구들이 있으며, 이러한 방법들은 본 발명의 범위내에 속함을 인지할 것이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 라벨된 프로테아제 기질은 Davydov et al. (특허 제7,608,682호)에서 설명하는 것과 같이, 토끼의 망상적혈구 용해물과 RNA 중합효소 (가령 SP6 또는 T7)를 함유하는 전사-해독 반응 혼합물 안에 플라스미드 DNA로부터 생성된다. 이 펩티드 기질은 펩티드 기질 특이적인 프로테아제 부재하에 만들어진다. 한 가지 대안 구체예에서, 이 프로테아제를 혼합물에 첨가하고, 그 다음 이 라벨의 존재를 측정한다. 추가 대안 구체예에서, 라벨의 존재는 프로테아제를 추가하기 전에 측정하거나 규명하고, 그리고 프로테아제를 추가한 후 라벨의 존재 감소를 측정한다. 두 가지 라벨을 이용한 이 방법의 또다른 구체예에서, N-말단 단편의 라벨과 관련하여 분해가능한 단편에 있는 라벨의 상대적인 변화를 측정하여 프로테아제의 활성을 결정한다.
본 발명의 추가 구체예에서, 상기에서 설명한 방법을 이용하여 시료 안에 표적 프로테아제의 존재를 결정한다. 이를테면, 이 방법을 이용하여 독성 프로테아제에 노출 의심 장소에서 환경 시료를 테스트한다. 이러한 구체예에서, 상기에서 설명한 펩티드 기질 혼합물을 라벨 신호를 측정하였던 다중 웰 어레이에 위치시킨다. 그 다음 시료를 각 웰에 추가하고, 분해가능한 단편의 사라짐을 측정한다. 대안 방법에서, 이 프로테아제 기질의 N-말단과 C-말단에 있는 라벨의 차이를 측정한다. C-말단 라벨에 대하여 N-말단 라벨의 차이의 증가는 이 프로테아제의 활성을 나타낸다.
상기에서 설명한 방법의 또다른 구체예를 이용하여 프로테아제 억제물질들을 확인한다. 이 방법은 N-단부 지배 분해가능한 단편들을 분해할 수 있는 혼합물내 라벨된 프로테아제 기질의 제 1 단계를 포함한다. 제 2 단계에서, 이 혼합물에 제안된 억제물질 분자 또는 라이브러리를 추가한다. 제 3 단계에서, 단일 라벨된 또는 이중 라벨된 기질들에 대해 상기에서 설명한 것과 같이, 단편들의 분해를 평가한다. 제 4 단계에서, 당업계에 공지되어 있는 방법들을 이용하여 프로테아좀 억제 활성에 대해 양성 결과들을 스크리닝한다. 프로테아좀을 억제하지 않는 결과들은 BoNT 억제물질들이다. 예를 들면, 특정 라벨을 가진 프로테아좀 기질을 분해하는 세포계를 이용하여 표적 억제물질을 스크리닝할 수 있는데, 이러한 특정 라벨의 예들중 하나는 GFP-CL-1을 포함하는데, 억제물질이 프로테아좀 경로에 작용한다면, GFP-CL-1 신호는 유지될 것이다.
대안 구체예에서, 이 방법을 이용하여 프로테아좀 성분 억제물질들을 확인한다. 유비퀴틴 프로테아좀 경로 억제물질들로부터 프로테아제 억제물질들을 구별하기 위하여, 프로테아제와 프로테아제 기질 그리고 또한 프로테아제에 의한 절단을 겪지 않는 유비퀴틴 프로테아좀 민감 기질의 존재하에 후보 억제물질을 테스트한다. 비-제한적인 예로써, 이 억제물질은 하기에서 설명하는 BoNT/LC A 및 SNAP-25 구성체(construct)의 존재와 그리고 유비퀴틴 프로테아좀 펩티드 표지 GFP-CL-1 존재하에 테스트한다. 이 억제물질이 BoNT/LC A에 특이적이라면, SNAP-25 구성체는 절단되지 않을 것이고, 라벨은 일정하게 남아있을 것이며; 이에 반하여, 이 프로테아좀에 의해 분해되면, GFP-CL-1 구성체에 대한 라벨 신호는 사라질 것이다. 기타 유비퀴틴 프로테아좀 표지들은 GFP-CL1, UbG76v-GFP, Ub-R-GFP를 포함한다. 당업자는 라벨은 GFP, β-갈락토시다제, 및 루시퍼라제로 구성된 군으로부터 선택할 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 추가 구체예는 표적 프로테아제를 세포의 세포질 안으로 운반할 수 있는 조작된(engineered) 세포계를 제공한다. 이 세포계는 C-말단에 라벨을 가진 프로테아제의 펩티드 기질을 발현시킨다. 다음의 세포 유형들이 이 펩티드 기질의 발현에 적합하다: HEK293, CHO, BHK, HeLa, COS, 및 신경아종 세포들, 예컨대, Neuro2A, M17, PC12, 및 N18. 당업자는 여기에서 설명된 다양한 펩티드들을 위한 플라스미드 발현을 허용하는 기타 세포 유형들도 본 발명의 범위내에 있음을 인지할 것이다. 유사하게, 프로테아제를 인지하고, 이를 세포 막을 통하여 이동시켜, 세포 안에서 발현되는 이 프로테아제 기질의 절단을 허용하는 세포 유형들 또한 본 발명의 범위내에 있다.
추가 구체예에서, 이 펩티드 기질은 이의 C-말단 및 이의 N-말단 모두에 라벨을 포함한다. 이 펩티드 기질은 생물발광, 화학발광, 형광, 또는 상기에서 설명한 것과 같이 당업자들이 인지하는 임의의 다른 방법들을 이용하여 라벨의 측정을 허용한다.
본 발명의 한 구체예에서, 프로테아제 부재하에서 라벨이 측정가능하도록 펩티드 기질의 구성적 발현을 위하여 세포계를 작제한다. 대안 구체예에서, 펩티드 기질 발현은 당업자가 인지하는 바와 같이 조절된다. 한 가지 비-제한적인 실시예에서, 이 펩티드는 유도성 벡터를 통하여 세포 안으로 도입시킨다. 유도성 벡터는 유도물질이 존재하는 경우에만 이 펩티드를 발현시킨다. 이러한 유도성 벡터들은 당업계에 공지되어 있다. 일단 이 펩티드 기질이 발현되면, 이 세포는 이 펩티드 라벨의 측정을 허용하는 정상 상태(steady state)의 발현에 도달하게 되고, 그리고 이 재조합 세포를 이용하여 기질을 특이적으로 절단하는 프로테아제의 활성을 테스트한다.
본 발명의 방법의 한 구체예에서, 표적 프로테아제는 작제된 세포계에 존재하고, 펩티드 기질 신호에 대한 프로테아제의 효과를 측정한다. 프로테아제 기질이 단일 라벨을 보유하는 본 발명의 한 구체예에서, 정상 상태(steady state)에 도달하면 신호의 감소가 측정된다. 라벨의 감소된 수준은 활성 프로테아제를 나타낸다. 대안으로, 펩티드 기질이 두 개의 라벨을 포함하는 경우, C-말단 라벨에 대한 N-말단 라벨의 비율 차이를 측정한다. N-말단 라벨에 대한 C-말단 라벨 비율의 감소는 이 프로테아제의 활성을 나타낸다. 추가 구체예에서, 이 세포계를 이용하여 특정 프로테아제의 존재에 대하여 환경 시료들을 테스트한다.
대안 구체예에서, 세포질 내부로 프로테아제를 운반할 수 있는 세포를 제공한다. 이 세포는 이 프로테아제에 대한 펩티드 기질을 포함하는 벡터로 트랜스펙션시킨다. 이 벡터는 펩티드 기질을 발현시키고, 이 기질은 프로테아제에 의해 절단되어 N-말단 단편과 C-말단 단편이 생성된다. 상기에서 설명한 것과 같이 이 펩티드 기질은 N-말단 단편과 C-말단 단편에 라벨을 보유한다. 프로테아제가 펩티드 기질을 절단할 때, 단편들중 하나는 분해된다. N-말단 라벨에 대한 C-말단 라벨의 비율은 프로테아제의 활성을 나타낸다.
본 발명의 한 가지 추가 구체예에서, 동일한 기질의 상이한 영역들을 절단하는 두 가지 프로테아제의 활성은 이 분절들중 하나가 N-단부 지배 분해를 겪을 때 측정한다. 이러한 구체예에서, 신호의 손실은 분해가능한 단편을 만드는 프로테아제가 존재함을 나타낸다. 이 펩티드 기질이 절단 부위에 의해 분리되는 FRET 쌍으로 라벨되는 경우, 두 프로테아제 간의 차이 결과를 또한 비교할 수 있다. 전통적인 FRET 분석은 두 프로테아제를 구별할 수 없지만, 본 출원에서 설명하는 N-단부 지배 방법은 구별한다. 분해가능한 단편의 분해로 인한 신호의 손실은 FRET 쌍의 각 성분을 분리시키는 펩티드 단편의 단순 절단으로 인한 것보다 신호에서 더 큰 변화를 초래한다. 추가 구체예에서, 프로테아제의 특이성(speficity)은 N-말단 라벨에 대한 C-말단 라벨의 공지된 대조군 비율과 비교하였을 때, N-말단 라벨에 대한 C-말단 라벨 비율의 감소를 비교함으로써 확인한다.
본 발명의 구체예들의 한 가지 중요한 장점은 세포계 시스템에서 프로테아제에 의한 특이적 절단으로 인한 신호의 손실을 세포 사멸과 같은 기타 인자들로 인한 신호의 손실과 구별하는 능력이다.
본 발명의 추가 구체예에서, 프로테아제 억제물질들을 확인하는 방법을 제시한다. 이 방법의 제 1 단계에서 이 분석을 실행하기 위한 세포계를 제공한다. 이 세포는 펩티드의 C-말단에 최소한 한 개의 라벨을 보유하고, 그리고 유비퀴틴 프로테아좀 경로를 통하여 분해를 겪게될 펩티드 기질을 발현시키도록 작제한다. 이 세포는 라벨되고, 그리고 프로테아제의 기질은 아니지만, 유비퀴틴 프로테아좀 경로에 의해 분해되는 제 2 펩티드를 발현시키도록 더 작제한다. 이 방법의 제 2 단계에서, 프로테아제 억제물질 후보물질은 이 세포와 접촉되도록 둔다. 이 억제물질의 크기에 따라, 세포 안으로 수동적으로 또는 능동적으로 통합될 수 있다. 이 방법의 제 3 단계에서, 제 1 펩티드와 제 2 펩티드로부터 라벨의 발현을 측정한다. 프로테아제 기질 라벨의 존재는 오로지 이 억제물질이 프로테아제를 특이적으로 억제함을 나타낸다.
출원인들은 BoNT/LC A가 분해가능한 단편을 생성시키는 SNAP-25을 절단한다는 것을 보여준다(6). 소포 연합 막 단백질 (VAMP, 또한 Synaptobrevin이라고도 부름, 이의 서열은 GebBank:CAA88760에서 볼 수 있다; NCBI 참고 서열: NP 055047)은 BoNT/LC B, BoNT/LC F, 및 파상풍 독소에 의해 절단되어(6), 분해가능한 단편을 생성한다. 제 3 BoNT 기질은 신탁신(Syntaxin) 1이며, 이는 BoNT C1에 의해 절단되지만, 이러한 절단으로 분해가능한 기질이 생성되지는 않는다. 출원인들은 BoNT/LC E가 SNAP-25를 절단하지만 분해가능한 단편을 생성시키지는 않는다는 것을 알았다.
SNAP-25 또는 VAMP의 전장 서열을 포함하는 펩티드들은 본 발명의 한 구체예에 따라 분해가능한 단편들을 생성시킬 것이다. 다양한 BoNT/LCs에 의해 인지되는 SNAP-25 또는 VAMP의 절단 서열이 그대로 남아있다면, SNAP-25 또는 VAMP의 단편들과 SNAP-25 또는 VAMP의 변이체들은 또한 분해가능한 단편들을 생성시킬 것이다. 이러한 변이체들은 SNAP-25 또는 VAMP 이소폼들, 그리고 다양한 프로테아제에 의해 인지되는 절단 서열들을 보유한 공지의 SNAP-25 또는 VAMP 펩티드에 80% 유사성을 보유한 기타 펩티드들을 포함한다.
출원인들은 세포에서 SNAP-25 P9 C-말단 단편의 완전한 분해 후 뒤따라 BoNT/A에 의해 SNAP-25가 절단된다는 것을 설명한다. 출원인들은 BoNT/A 절단에 의해 생성된 C-말단 단편은 신속하게 분해된다는 것을 보여주었다. BoNT/A의 존재 또는 부재하에서 해당 C-말단 단편의 면역형광에 대해 N-말단 단편의 면역형광의 변화는 이 프로테아제의 활성을 나타낸다. BoNT/A 절단으로부터 P9 단편은 신속하게 분해되었고, 그리고 세포 안에 임의의 유의미적인 수준으로 축적되지 않을 것이다.
출원인들은 BoNT/LC A의 절단 후 SNAP-25의 C-말단은 다른 구성체들에서 완전하게 분해된다는 것을 또한 설명하였다. 도 3에 나타낸 것과 같이, 이를테면, SBP-CFP-SNAP25-Venus-BD-NFkB 및 BoNT/LC A 플라스미드로 공동-트랜스펙션된 293FT 세포들의 형광현미경 사진은 Venus 형광 단백질을 함유하는 C-말단 단편이 절단 후 분해된다는 것을 보여준다. CFP를 함유하는 N-말단 단편이 24시간 후 존재한다는 것을 도 3(a)에서 보여준다. Venus YFP를 함유하는 C-말단 단편은 신호 분해에 존재하지 않음을 도 3(b)에서 보여준다. 도 3(c)에서 CFP-SNAP-25-VENUS-BD-NFkB (Oyler et al, 미국 특허 출원 번호 12/962,610, 이의 전문이 여기에 참고자료로 통합된다) 펩티드가 절단됨을 더 보여준다. 라인 3은 125kDa 밴드의 구성체를 보여주는 반면, 라인 4는 절단 후 단지 57kDa 단편을 보여주는데, 이는 SNAP-25의 N-말단 단편에 상응한다.
결과
도 1a에서 볼 수 있는 것과 같이, SNAP25는 BoNT/A 및 BoNT/E로부터 생성된 단백질분해성 단편들을 만든다. 도 1(b) 신경 세포들에서 BoNT/E 및 BoNT/A 경쇄들의 공동-국소화, 이는 N-단부 지배 분해가 라벨된 SNAP-25로부터 신호의 감소에 대한 이유임을 확인시키는 것을 돕는다. 도 1(c)는 본 발명의 한 구체예에 따라 BoNT 단백질분해 활성을 위한 루시퍼라제 리포터의 도안을 보여준다. 도 1(d)는 생물발광 분석에서 N-단부 지배 분해의 효과를 보여준다. 세포들은 루시퍼라제 리포터와 YFP, YFP-LCE 또는 YFP-LCA으로 트랜스펙션시켰고 그리고 트랜스펙션 후 36시간에 발광분석기로 발광을 측정하였다. 나타낸 데이터는 임의의 상대적인 발광 단위(RLU)의 평균 ± SEM (n=3; p<0.01 YFP에 비교하여 YFP-LCA)이다. 이 결과들은 SNAP-25 YFP-LCA 민감 단편들에 대한 신호의 상당한 감소가 있음을 보여준다. 도 1(e)는 루시퍼라제 리포터와 표시된 플라스미드로 트랜스펙션된 세포들에서 효과를 보여준다. 세포들은 DMSO 또는 20 μM의 MG132로 하룻밤동안 처리하였고, 그리고 용해물들은 표시된 항체들로 프로브시켰다.
클로스트리디움(Clostridium) 유전자들의 높은 A/T 함량은 포유류 세포 공격(challenging)에서 이들이 발현되도록 한다. 이를 극복하기 위하여, 그리고 독소 지속(persistence)에 대한 원리를 연구하기 위하여, 포유류 발현에 최적화된 코돈을 가진 BoNT/A LC (LCA) 및 BoNT/E LC (LCE)를 인코드하는 cDNA를 만들었다. 살아있는 세포들에서 LCs의 국소화의 시각화를 돕기 위하여, 이들을 황색 (YFP) 또는 적색 형광 단백질 (RFP)에 융합시켰다. N18 신경아종 세포에 YFP-LCE 및 RFP-LCAs를 공동-트랜스펙션시켜, LCA 및 LCE의 세포 하위 국소화를 직접적으로 비교하였다. 신경아종 세포들에서 발현될 때 LCA는 주로 혈장 막에 국소화된다(도 1b). LCA는 일부 세포내 막과 소포들에서 또한 볼 수 있을 것이다. 흥미로운 것은, LCE는 신경아종 세포들에서 유사한 분포를 가진다(도 1b). 공촛점 영상에서 YFP-LCE와 RFP-LCA는 이들 세포들에서 실제 공동-국소화된다는 것을 보여주었다(도 1b). 이 결과에서 BoNT/A LC의 지속은 BoNT/E LC에 비교하여 정상 상태 세포하위 국소화(steady state sub-cellular localization)에서의 차이로 설명할 수 없음을 시사한다.
이 지속이 SNAP25의 BoNT/LC A에 의해 생성된 더 짧은 C 말단 단편의 증가된 안전성으로 기인할지도 모른다는 가능성을 풀기 위하여, FLAG-테그된 뮤린 SNAP25의 C-말단에 융합된 루시퍼라제로 구성된 리포터를 만들었다(도 1c). BoNT/A는 이 구성체를 절단하여 P197과 루시퍼라제에 융합된 P9에 상응하는 C-말단 산물을 생성하였다. 출원인들은 BoNT/A 절단에 의해 생성된 단편을 함유하는 P9는 N-말단 Arg (SNAP-25의 R197)를 가지며, 신속하게 분해된다는 것을 보았다. 대조적으로, BoNT/E 절단은 P180 단편과 상대적으로 안정적인 C-말단 산물을 만들었다. 이러한 예측과 일관되게, 리포터 구성체와 BoNT/A LC의 공동-트랜스펙션은 루시퍼라제 활성에서 10배 이상의 감소를 초래하였지만, BoNT/E LC와의 공동-발현은 루시퍼라제 활성에서 단지 작은 변화만을 초래하였다(도 1d). 이 구성체의 N-말단에 대항하는 항체와의 면역블랏팅에서 YFP-LCA 및 YFP-LCE에 의해 전장의 SNAP-25-루시퍼라제 리포터의 단백질가수분해는 두 개 단편을 만든다는 것을 확인하였다(도 1e, 중간 패널). N-말단 단편들은 전장의 리포터와 비교하여 상대적으로 안정적인 것으로 보였다. 특히, BoNT/A 단백질가수분해에 의해 생성된 C-말단 단편은 거의 탐지할 수 없었지만 프로테아좀의 억제물질인 MG132의 존재하에서는 축적되었다(도 1e, 하위 패널). BoNT/A 단백질가수분해로부터 단편을 함유하는 P9의 신속한 손실이 단순히 루시퍼라제와의 융합에 의해 야기된 것은 아닌데, 그 이유는 다른 단백질 (CFP)과의 융합으로 유사한 결과들을 낳기 때문이다(도 2). 이들 결과는 세포들에서 우리의 재조합 BoNT/A 및 BoNT/E LCs의 활성을 확인하고, 뿐만 아니라 BoNT/A에 의해 생성된 P9 단편은 수명이 짧고 BoNT/A 활성의 양호한 지표임을 설명한다. 그 결과, 이 분석은 BoNT/LC E 활성으로부터 BoNT/LC A를 구별해내는데 유용하다.
재료 및 방법들
플라스미드
우리는 대장균(E. coli) 및 포유류용으로 바람직한 코돈을 이용하여 BoNT/A 및 E 경쇄들 (LCs)에 대한 합성 유전자들을 만들었다. 뮤린 SNAP25는 PCR를 이용하여 만들었고, 그리고 pcDNA3.1(+) FLAG 벡터에 서브클론시켰다. 루시퍼라제를 pcDNA3.1(+) SNAP25에 서브클론시켜, 리포터를 만들었다. SNAP-25-Luc 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 1로 제공하며 그리고 SNAP25-Luc 구성체의 아미노산 서열은 서열 번호: 2로 제공한다. BoNT LCs를 표적으로 하는 유비퀴틴 리가아제를 만들기 위하여, 우선 BoNT/A 및 E 단백질가수분해에 저항성인 SNAP-25 돌연변이(SNC)를 만들었고, 이의 뉴클레오티드는 서열 번호: 3으로 제공하며, 그리고 펩티드 서열은 서열 번호: 4로 제공한다.
보틀리누스균 신경독소 혈청형 A와 E (BoNT/A 및 /E) 경쇄들 (LCs)에 대한 합성 유전자들은 대장균(E. coli) 및 포유류용으로 바람직한 코돈을 이용하여 새로(de novo) 만들었다. 간략하게 설명하자면, 50-60 nt의 올리고뉴클레오티드는 이들의 반대 단부에 12 nt의 중첩(overlapping) 영역들을 도입시키기 위하여 쌍(pair)으로 기획하였다. 이들 쌍은 PCR을 이용하여 연장하고, 증폭시켜 ~100 nt의 단편들을 만들었고, 그 다음 앞선 PCR 증폭의 단부에 12 nt 중첩을 가지는 프라이머들과 함께 연속 PCR 과정에서 빌딩 블록으로 이용한다. 이러한 유형의 "중첩 연장(overlap extension)" PCR을 이용하여 완전한 합성 유전자를 만들었다. DNA 서열화에 의해 확인한 후, BoNT/A 및 /E LCs는 유일한 XhoI 및 ApaI 부위를 이용하여 pEYFP-Cl, pEGFP-C1, mRFP-C1, pcDNA3.1+, 또는 pCMVTag2C로 서브클론시켰다. GFP-LCA 또는 -LCE를 pcDNA5/TO/Frt로 서브클론시켜 테트라사이클린 유도성 구성체들을 만들었다. 리포터 구성체를 만들기 위하여, FLAG-뮤린 시냅토좀-연합 단백질 25 (SNAP25)는 PCR을 통하여 만들고, 이를 pcDNA3.1+ 벡터의 BamHI과 XhoI 부위로 서브클론시켰다. SNAP25의 정지 코돈 앞에 KpnI 부위를 만들어 넣고, 이로써 KpnI과 XhoI 부위 사이에 루시퍼라제 또는 다른 리포터들의 삽입이 가능하도록 하였다. BoNT LCs를 표적으로 하는 유비퀴틴 리가아제를 만들기 위하여, 우선 SNAP25 절단불가능한 돌연변이(SNC)를 만들었는데, 이 돌연변이는 돌연변이(D179K, R198T)를 함유하고, 그리고 BoNT/A 및 /E 단백질가수분해에 대하여 모두 저항성이다(QuickChange Kit; Invitrogen).
세포 배양 및 트랜스펙션. 37℃, 5% C02 배양기에서 표준 배양 배지로 세포계를 배양하였다. HEK293 세포들은 10% (vol/vol) FBS, 2 mM 글루타민, 그리고 2% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DEMEM에서 성장시켰다. HEK-Flp-in/T -REX/293 세포들(Invitrogen)은 10% (vol/vol) 테트라사이클린-없는 FBS (Clontech), 2 mM 글루타민, 2% 페니실린-스트렙토마이신, 100 μg/mL 제오신, 그리고 15 μg/mL 블라스티시딘이 보충된 DMEM에서 성장시켰다. 인간 신경아종 SH-SY5Y 세포들은 10% (vol/vol) FBS, 2 mM 글루타민, 그리고 2% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM/F12 배지에서 배양하였다. N18 세포들은 하이포산틴, 아미노프테린, 티미딘 배지, 10% (vol/vol) FBS, 2 mM 글루타민, 2% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 뮤린 신경아종 Neuro2a 세포들은 10% (vol/vol) FBS를 함유하는 EMEM 배지에서 배양하였다. 세포 배양 시약들은 Invitrogen으로부터 구하였다. 트랜스펙션은 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 또는 HiPerfect (Qiagen)를 이용하여 실시하였다.
대사 라벨링. 펄스-추적 분석(Pulse-chase analysis)은 트랜스펙션후 30시간에 실시하였다. 간략하게 설명하자면, 세포들은 메티오닌/시스테인(Met/Cys)-없는 배지에서 1시간 동안 굶기고, 100 μCi/mL [35S]-Met/Cys (MP Biologicals)과 함께 45분간 라벨링시킨다. 라벨링 후, PBS를 이용하여 세포들을 3회 세척하였고, 그리고 10배 과량의 라벨안된 Met를 함유하는 추적 배지에서 배양하였다. 지정된 시간대에서, PBS를 이용하여 세포들을 3차례 세척하고, 그리고 RIPA 용해 완충액 [50 mM Tris (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% (vol/vol) Triton X-100, 0.5% (wt/wt) 데옥시콜레이트 나트륨, 0.1% (wt/wt) SDS, 50 μM MG132, 그리고 프로테아제 억제물질들 (Roche)]로 용해하였다. YFP-LCs는 GFP 항체들과 함께 면역침전시켰다. 용해 완충액으로 강하게 세척한 후, 면역침전시킨 단백질들은 2X 시료 완충액에 용리시키고, SDS PAGE에 의해 해리시키고, 그리고 STORM 인영상기(phosphoimager)에서 분석을 하기 위하여 처리하고, 그리고 ImageQuant 소프트웨어(GE Healthcare Life Sciences)로 분석하였다.
항체들과 시약들. GFP 및 RFP에 대항하는 토끼 다클론 항체는 Clontech로부터 구입하였고; HA 항체는 Roche로부터; 루시퍼라제 항체는 Promega로부터; FLAG M2 항체는 Sigma로부터 구입하고; 그리고 GFP, TRAF2, 및 유비퀴틴에 대한 단클론 항체들은 Santa Cruz로부터 구입하였다. Myc 항체는 9E10 하이브리도마의 배양 상청액으로부터 구하였다. 다른 언급이 없는 한, 모든 화학물질들은 Sigma-Aldrich로부터 구하였다.
형광 현미경. 트랜스펙션후 30 시간에, 4% 파라포름알데히드에 세포들을 10분간 고정시키고, PBS로 세척한 후 Zeiss LSM 510에서 영상화하였다. 모든 영상들은 프리젠테이션용으로 최소한으로 프로세싱하였다.
루시퍼라제 분석. 루시퍼라제 분석은 제조업자의 지시에 따라 듀얼-루시퍼라제 리포터 키트(Promega)를 이용하여 트랜스펙션후 36시간에 실시하였다.
산업상 이용가능성
본 발명은 생물학적 분석들 및 관련 방법들에 적용할 수 있다. 본 발명은 보틀리누스균 신경독소 (BoNTs)의 활성을 측정하고 BoNTs의 억제물질을 확인하는 방법을 설명한다. 이 방법은 산업에서 이루어질 수 있고, 생물학 분야에서 실행할 수 있다.
참고문헌
명세서 내에서 언급된 다음의 참고문헌들은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
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Claims (20)

  1. 다음을 포함하는 보틀리누스균 신경독소 (BoNT)의 활성을 평가하기 위한 세포 기반 분석:
    재조합 세포를 제공하며, 이 재조합 세포는 C-말단에 라벨을 포함하는 BoNT 기질을 발현시키며, 이때 상기 BoNT 기질은 BoNT에 의해 절단될 때 N-말단 단편과 C-말단 단편을 만들고, C-말단 단편은 재조합 세포의 유비퀴틴 프로테아좀 경로에 의해 분해되며;
    BoNT 존재하에서 세포내 라벨의 발현을 측정한다.
  2. 청구항 1에 있어서, N-말단 단편은 N-말단 라벨을 포함하며, 그리고 측정 단계는 N-말단 라벨에 대한 C-말단 라벨의 비율을 비교하는 것을 포함하는 세포 기반 분석.
  3. 청구항 1에 있어서, 이때 BoNT는 재조합 세포의 막을 통하여 운반되는, 세포 기반 분석.
  4. 청구항 1에 있어서, 이때 재조합 세포는 BoNT의 발현을 위한 벡터를 더 포함하는, 세포 기반 분석.
  5. 청구항 4에 있어서, 이때 BoNT의 발현은 유도성 프로모터에 의해 조절되는, 세포 기반 분석.
  6. 청구항 1에 있어서, 이때 BoNT 기질은 25kD (SNAP-25)의 시냅토좀 연합 단백질, SNAP-25 이소폼, 소포-연합 막 백질 (VAMP), VAMP 이소폼, 그리고 전술한 것들에 대해 최소한 80% 유사성을 보유하는 펩티드로 구성된 군에서 선택되며, 그리고 프로테아제에 의해 인지되는 절단 서열을 가지는, 세포 기반 분석.
  7. 청구항 1에 있어서, BoNT은 BoNT/LC A이고, BoNT 기질은 SNAP-25, SNAP-25 이소폼, 또는 SNAP-25에 최소한 80% 유사성을 보유하는 펩티드이고, BoNT/LC A에 의해 인지되는 절단 서열을 보유하며, 절단에 의해 분해가능한 단편이 되는, 세포 기반 분석.
  8. 청구항 1에 있어서, BoNT는 BoNT/LC B, BoNT/LC D, BoNT/LC F로 구성된 군으로부터 선택되며, 펩티드는 VAMP, VAMP 이소폼, 또는 VAMP에 최소한 80% 유사성을 보유하는 펩티드이고, 그리고 BoNT/LC B, BoNT/LC D, 또는 BoNT/LC F에 의해 인지되는 절단 서열을 보유하며, 이 절단에 의해 분해가능한 단편을 만드는, 세포 기반 분석.
  9. 청구항 1에 있어서, 라벨은 황색 형광 단백질 (YFP), 청색 형광 단백질 (BFP), 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP) 그리고 이의 형광 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택되는, 세포 기반 분석.
  10. 청구항 1에 있어서, 라벨은 반딧불이 루시퍼라제, Renilla 루시퍼라제, 그리고 Gaussia 루시퍼라제로 구성된 군으로부터 선택된 발광 펩티드인, 세포 기반 분석.
  11. 청구항 1에 있어서, N-말단 라벨과 C-말단 단편에서의 라벨은 FRET 쌍인, 세포 기반 분석.
  12. 다음을 포함하는 두 프로테아제를 구별하기 위한 세포 기반 분석:
    재조합 세포를 제공하고,
    이 재조합 세포는 제 1 프로테아제에 의해 제 1 부위에서 절단되어 제 1 C-말단 단편과 제 1 N-말단 단편을 만드는 프로테아제 기질을 발현시키는 벡터를 보유하고, 그리고 상기 C-말단 단편은 이 재조합 세포의 유비퀴틴 프로테아좀 경로에 의해 분해가능하며;
    이 프로테아제 기질은 또한 제 2 프로테아제에 의해 제 2 부위에서 절단되어 제 2 C-말단 단편과 제 2 N-말단 단편을 만들고, 상기 제 2 C-말단 단편은 유비퀴틴 프로테아좀 경로에 의해 분해되지 않으며;
    이 프로테아제 기질을 발현시키는 재조합 세포를 제 1 프로테아제에 접촉시키고, 라벨의 존재를 측정하고;
    이 프로테아제 기질을 발현시키는 재조합 세포를 제 2 프로테아제에 접촉시키고, 라벨의 존재를 측정하고;
    제 2 프로테아제와 접촉 후 라벨의 존재에 대해 제 1 프로테아제 접촉 후 라벨의 존재에서 차이를 비교한다.
  13. 청구항 12에 있어서, 두 가지 프로테아제는 BoNT/LC A 및 BoNT/LC E이며, 프로테아제 기질은 SNAP-25인, 세포 기반 분석.
  14. 청구항 12에 있어서, 하나 이상의 조작된(engineered) 세포들을 보유하는 시료에 미확인된 프로테아제를 함유하는 시료를 접촉시키고; 세포에서 라벨 분해를 측정함으로써 미확인된 프로테아제를 확인하는 단계를 더 포함하는, 세포 기반 분석.
  15. 청구항 12에 있어서, 접촉 단계는 이 재조합 세포를 시료안에 프로테아제에 노출시키거나 또는 벡터로부터 세포내 프로테아제 생산을 유도하는 유도하는 것을 포함하는, 세포 기반 분석.
  16. 다음을 포함하는 보틀리누스균 신경독소 (BoNT) 억제물질들을 확인하는 방법:
    재조합 세포를 제공하고; 이 재조합 세포는 BoNT를 발현시키는 벡터, BoNT에 의해 절단될 때 라벨을 보유하는 분해가능한 C-말단 단편을 만드는 BoNT 기질을 발현시키는 벡터를 포함하고;
    상기 BoNT와 BoNT 기질을 발현시키고;
    상기 재조합 세포에 테스트 분자를 접촉시키고;
    라벨의 존재를 측정하고, 이때 라벨의 신호 증가는 BoNT의 억제를 나타낸다.
  17. 청구항 16에 있어서, 유비퀴틴 프로테아좀 경로의 억제용 테스트 분자를 스크리닝하는 것을 더 포함하는, 방법.
  18. 청구항 16에 있어서, BoNT는 BoNT/LC A이고, BoNT 기질은 SNAP-25, SNAP-25 이소폼, 또는 SNAP-25에 최소한 80% 유사성을 가지는 펩티드일때, BoNT/LC A에 의해 인지되는 절단 서열을 보유하고, 절단으로 인하여 분해가능한 단편을 만드는, 방법.
  19. 청구항 16에 있어서, BoNT는 BoNT/LC B, BoNT/LC D, BoNT/LC F으로 구성된 군으로부터 선택되며, 펩티드가 VAMP, VAMP 이소폼, 또는 VAMP에 최소한 80% 유사성을 보유하는 펩티드일 때, BoNT/LC B, BoNT/LC D, 또는 BoNT/LC F에 의해 인지되는 절단 서열을 보유하고, 절단으로 인하여 분해가능한 단편을 만드는, 방법.
  20. 청구항 16에 있어서, 라벨은 반딧불이 루시퍼라제, Reneilla 루시퍼라제, 및 Gaussia 루시퍼라제로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
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