JP6510747B2 - プロテアーゼ活性測定法 - Google Patents
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Description
(1)プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質が固定された担体を用意する工程、担体にプロテアーゼを接触させる工程、プロテアーゼの作用により、プロテアーゼ認識配列が切断されて、担体から遊離したレポータータンパク質を回収する工程、回収したレポータータンパク質由来の発光、発色又は蛍光を測定する工程を含む、プロテアーゼ活性の測定方法。
(2)担体がアビジンをコーティングしたビーズであり、プロテアーゼ認識配列にビオチンが結合しており、レポータータンパク質がプロテアーゼ認識配列を介してビオチン・アビジン結合により担体に固定されている(1)記載の方法。
(3)担体が金属を固定化したカラム充填剤であり、プロテアーゼ認識配列にHis tagが結合しており、レポータータンパク質がプロテアーゼ認識配列を介してHis tag・金属結合により担体に固定されている(1)記載の方法。
(4)金属が、ニッケル、銅、亜鉛及びコバルトから成る群より選択される(3)記載の方法。
(5)担体がアビジンをコーティングしたプレート底面であり、プロテアーゼ認識配列にビオチンが結合しており、レポータータンパク質がプロテアーゼ認識配列を介してビオチン・アビジン結合により担体に固定されている(1)記載の方法。
(6)プロテアーゼ認識配列が、HIV-1のプロテアーゼ認識配列である(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)HIV-1のプロテアーゼ認識配列が、MA/CA、CA/p2、p2/NC、NC/p1、p1/p6gag、NC/TFP、TFP/p6pol、p6pol/PR、PR/RTp51、RT/RTp66、RTp66/INT及びNefから成る群より選択される配列である(6)記載の方法。
(8)レポータータンパク質がルシフェラーゼであり、レポータータンパク質由来の発光がルシフェラーゼとルシフェリンとの反応により生じる発光である(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9)種類の異なるレポータータンパク質のそれぞれが種類の異なるプロテアーゼ認識配列のそれぞれを介して固定された担体を用意して、種類の異なるプロテアーゼのそれぞれの活性を測定する(1)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10)プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質が固定された担体を含む、プロテアーゼ活性の測定キット。
(11)プロテアーゼ認識配列を介してレポータータンパク質が固定された担体。
(12)プロテアーゼ認識配列が結合したリポータータンパク質からなるプロテアーゼ活性測定用レポータータンパク質。
MA/CA
Ser-Gln-Asn-Tyr / Pro-Ile-Val-Gln(配列番号11)
NC/p1
Arg-Gln-Ala-Asn / Phe-Leu-Gly-Lys(配列番号12)
p2/NC
Thr-Ala-Ile-Met / Met-Gln-Lys-Gly(配列番号13)
または
Ser-Ala-Ile-Met / Met-Gln-Lys-Gly(配列番号14)
p1/p6gag
Pro-Gly-Asn-Phe / Leu-Gln-Ser-Arg(配列番号15)
NC/TFP
Arg-Gln-Ala-Asn / Phe-Leu-Arg-Glu(配列番号16)
TFP/p6pol
Asn-Leu-Ala-Phe / Gln-Gln-Gly-Glu(配列番号17)
または
Asn-Leu-Ala-Phe / Any-Gln-Gly-Glu(配列番号18)
または
Asp-Leu-Ala-Phe / Leu-Gln-Gly-Lys(配列番号19)
p6pol/PR
Ser-Phe-Ser-Phe / Pro-Gln-Ile-Thr(配列番号20)
または
Ser-Phe-Any-Phe / Pro-Gln-Ile-Thr(配列番号21)
または
Ser-Phe-Asn-Phe / Pro-Gln-Val-Thr(配列番号22)
PR/RTp51
Thr-Leu-Asn-Phe / Pro-Ile-Ser-Pro(配列番号23)
RT/RTp66
Ala-Glu-Thr-Phe / Tyr-Val-Asp-Gly(配列番号24)
RTp66/INT
Arg-Lys-Val-Leu / Phe-Leu-Asp-Gly(配列番号25)
Nef
Asp-Cys-Ala-Trp / Leu-Glu-Ala-Gln(配列番号26)
または
Ala-Cys-Ala-Trp / Leu-Glu-Ala-Gln(配列番号27)
CA/p2
Ala-Arg-Val-Leu / Ala-Glu-Ala-Met(配列番号28)
ただし、記号は以下の意味を表す。
/ 切断部位
Ala アラニン
Arg アルギニン
Asn アスパラギン
Asp アスパラギン酸
Cys システイン
Gln グルタミン
Glu グルタミン酸
Gly グリシン
Ile イソロイシン
Leu ロイシン
Lys リシン
Met メチオニン
Phe フェニルアラニン
Pro プロリン
Ser セリン
Thr スレオニン
Trp トリプトファン
Tyr チロシン
Val バリン
Any すべてのアミノ酸
レポータータンパク質としては、甲虫ルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどの発光、発色又は蛍光酵素などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
〔実施例1〕プロテアーゼ活性検出方法1
実験方法
a)プロテアーゼベクターの構築(ビオチン・アビジン結合系)(図4)
本発明による、アビジン・ビオチンの結合能力による担体への固定を利用した、プロテアーゼ活性測定用レポータータンパク質発現ベクターを構築した。プロテアーゼ認識配列は、Turbo 3C プロテアーゼ認識配列、またはHIV-1のMA-CA配列もしくはNc/p1配列を採用した。まず、Trbo3cプロテアーゼはLeu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro(配列番号30)を認識配列として6番目と7番目の間を切断する酵素であり、His-tagやGST tagを利用したタンパク質精製システムに採用されている。また、MA-CA配列はSer-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln(配列番号11)であり、Nc/p1配列はArg-Gln-Ala-Asn-Phe-Leu-Gly-Lys(配列番号12)である。これらは、HIV-1が未成熟なウイルス粒子として出芽後に、自身が有する HIV-1プロテアーゼがウイルス粒子内の前駆体タンパク質 Pr55 gag -pol をプロセシングすることにより感染性を有する成熟したウイルスとなるときの、HIV-1プロテアーゼに認識され切断される配列である[de Oliveira T et al. Variability at HIV-1 Subtype C Protease Cleavage Sites: An Indication of Viral Fitness? Journal of Virology (2003), 77(17): 9422-30]。なお、切断箇所はいずれの配列も4番目と5番目の間に存在する。
まず、a)で得られた発現ベクターが、目的とするタンパク質を発現しているかを確認した。すなわち、発現ベクターを大腸菌BL21 DE3 (pLysS)に常法により形質転換した。発現ベクターを保持する大腸菌は薬剤耐性(アンピシリン)を有する。この大腸菌をアンプ1mg・mlを含むLB培地2.5 mlに植菌し、一夜培養した。次に、培養液100ulを新たに2.5 mlの培養液に移し、5時間程培養した。氷上に30 分インキュベートし、IPTGを終濃度 0.1 mMになるように加えた。その後、16℃4時間で培養した。培養液から簡易的に可溶性タンパク質を抽出するため、-80℃に30分間で凍結および37℃で急速解凍の操作を3回繰り返し、大腸菌破砕液を得た。この液を15000rmpで15分間遠心分離してその上清を可溶性タンパク質溶液とした。一部を分取し、SDS-PAGEを行い目的の位置でのバンドを確認することによりレポータータンパク質が大腸菌で正常に生成されているとした。
プローブタンパク質と固相担体を結合させるため、以下の操作を行った。すなわち、上記で得られたプローブタンパク質溶液とストレプトアビジンが微粒子金属表面にコーティングされているマイクロビーズであるDyaabeads Myone Streptavidin T1(Invitrogen社)(以下、ストレプトアビジンコートビーズ)。ストレプトアビジンコートビーズが結合できるビオチン化タンパク質の上限は、ビーズ溶液100ul当たり20ugである。まず、ストレプトアビジンコートビーズの保存液をPBSバッファーに置換する。100ulのストレプトアビジンコートビーズ懸濁液をチューブに分取する。チューブの底面を磁気に接近させ、ビーズを沈殿させる。吸引により上清液を除去し、PBSバッファーを200ul添加して転倒混和してビーズを洗浄する。再びチューブ底面を磁気に近づけビーズを沈殿させ、バッファーを吸引除去する。この操作を3回繰り返す。次に、高濃度プローブタンパク質溶液をタンパク質量が20ugを超過しないようにストレプトアビジンコートビーズに添加する。マイクロチューブローテーターを用い、30分間室温で混合することによりビオチン化タンパク質をビーズに結合させる。その後、チューブ底面を磁気に近づけてビーズを沈殿させ、上清液を除去後、プロテアーゼ反応バッファー(50 mM Na acetate [pH 5.5], 1 M NaCl, 1 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA)100ulで再懸濁する。この懸濁液をプロテアーゼ認識プローブ溶液とした。
得られたプローブタンパク質が実際に特定のプロテアーゼの活性を測定可能であるかを検討した。Turbo 3C プロテアーゼ認識配列を有するプロテアーゼ認識プローブ溶液20ulへは1ユニットのTurbo 3Cプロテアーゼ、MA-CA配列またはNc/p1配列を有するプロテアーゼ認識プローブ溶液20ulへは1ユニットのHIV-1プロテアーゼ(ANASPEC社)を加え、15分間室温で反応させた。5分おきにタッピングしてプロテアーゼがよく混合するようにした。チューブ底面を磁気に近づけて磁気ビーズを沈殿させ、上清液を別チューブに回収した。回収した上清液にピッカジーンPGL-100を100ul添加し、ルミノメーターLV9800(ベルトールド社)で10秒間の発光量を測定した。また、検出された発光がプロテアーゼの切断により生じたものであるかどうかを検証するため、プロテアーゼ反応中にプロテアーゼインヒビターを同時に添加した試験区も設定した。
結果を図5〜7に示す。
実験方法
e)プロテアーゼベクターの構築(His-tag Ni結合系)(図4)
アビジン−ビオチン結合系に依存しない、His-tagのみを結合部位とするプロテアーゼ検出系を検討した。まず、HIV-1プロテアーゼ認識配列であるMA/CA配列をルシフェラーゼに付加するため、ルシフェラーゼの5'末端側にプロテアーゼ認識配列を発現する配列を含んだプライマーとルシフェラーゼのC末端を含むプライマーを合成し、PCRを行った。これによりアミノ酸配列Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln(配列番号11)とルシフェラーゼが融合したタンパク質を発現する遺伝子断片が得られる。得られたPCRにより増幅されたDNA断片を、pTriEx3 Neoベクター(メルク)に挿入した。pTriEx-3ベクターは大腸菌・酵母・昆虫細胞・哺乳動物細胞のいずれにおいても目的とするタンパク質の大量発現を可能としている。また、本ベクターは発現させるタンパク質のC末端にHis-tagを付加する。
まず、e)で得られた発現ベクターが、目的とするタンパク質を発現しているかを確認した。すなわち、発現ベクターを大腸菌BL21 DE3 (pLysS)に常法により形質転換した。発現ベクターを保持する大腸菌は薬剤耐性(アンピシリン)を有する。この大腸菌をアンプ1mg・mlを含むLB培地2.5 mlに植菌し、一夜培養した。次に、培養液100ulを新たに2.5 mlの培養液に移し、5時間程培養した。氷上に30 分インキュベートし、IPTGを終濃度 0.1 mMになるように加えた。その後、16℃4時間で培養した。培養液から簡易的に可溶性タンパク質を抽出するため、-80℃に30分間で凍結および37℃で急速解凍の操作を3回繰り返し、大腸菌破砕液を得た。この液を15000rmpで15分間遠心分離してその上清を可溶性タンパク質溶液とした。一部を分取し、SDS-PAGEを行い目的の位置でのバンドを確認することによりレポータータンパク質が大腸菌で正常に生成されているとした。
プローブタンパク質と固相担体を結合させるため、以下の操作を行った。すなわち、上記で得られたプローブタンパク質溶液とアガロース中において、イミノ二酢酸によりニッケルイオンがキレートされているマイクロビーズであるメタルキレートアガロース(和光純薬)(以下、Niビーズ)を混合することにより、プローブタンパク質中のHis-tagとNiビーズのニッケルイオンとを結合させる。His-tagが付加されたタンパク質はアガロースビーズ溶液1mll当たり20mgである。まず、Niビーズの保存液をPBSバッファーに置換するため、100ulのNiビーズ溶液をチューブに分取した。チューブを静置して、ビーズを沈殿させる。注意深く上清を除去し、PBSバッファーを200ul添加して転倒混和してビーズを洗浄する。再びチューブを静置してビーズを沈殿させ、PBSバッファーを吸引除去する。この操作を3回繰り返す。次に、高濃度プローブタンパク質溶液を、タンパク質量が2mgを超過しないようにNiビーズに添加する。マイクロチューブローテーターを用い、30分間室温で混合することによりHis-tagラベルされたプローブタンパク質をNiビーズに結合させる。その後、チューブを静置してビーズを沈殿させ、上清を除去するし、プロテアーゼ反応バッファー(50 mM Na acetate [pH 5.5], 1 M NaCl, 1 mMdithiothreitol, 1 mM EDTA)100ulで再懸濁する。この懸濁液をプロテアーゼ認識プローブ溶液とした。
得られたプローブタンパク質が実際に特定のプロテアーゼの活性を測定可能であるかを検討した。MA-CA配列を有するプロテアーゼ認識プローブ溶液20ulに1ユニットのHIV-1プロテアーゼ(ANASPEC社)を加え、15分間室温で反応させた。5分おきにタッピングしてプロテアーゼがよく混合するようにした。その後、チューブを軽く遠心することによりビーズを沈殿させ、上清液を別チューブに回収した。回収した上清液にピッカジーンPGL-100を100ul添加し、ルミノメーターLV9800(ベルトールド社)で10秒間の発光量を測定した。また、検出された発光がプロテアーゼの切断により生じたものであるかどうかを検証するため、プロテアーゼ反応中にプロテアーゼインヒビターを同時に添加した試験区も設定した。
結果を図8に示す。
図8は、ルシフェラーゼの発光によるHIV-1プロテアーゼの検出結果(MA/CA配列)の検出結果を示す。Protease(+):HIV-1プロテアーゼを1ユニット添加後、発光測定した結果。Protease(-):HIV-1プロテアーゼを添加せず。Protease+Inhibitor:HIV-1プロテアーゼ 1ユニットおよびProtease Inhibitor Coktail(シグマ・アルドリッジ)5ulを同時に添加後、発光測定した結果。
レポータータンパク質として耐熱性ルシフェラーゼ(特表平09-510610、いわゆるE354K)を使用し、HIV-1プロテアーゼとMA-CA配列を有するプロテアーゼ認識プローブとの反応を30℃で行った以外は、実施例1と同様の操作で実験を行った。結果を図9に示す。
ヌクレオチド番号1-252:PinPoint Xa Vector(プロメガ)由来の配列
ヌクレオチド番号253-282:Bio(ビオチン結合配列)コード領域
ヌクレオチド番号283-384: PinPoint Xa Vector(プロメガ)由来の配列
ヌクレオチド番号385-408:3C(Turbo 3Cプロテアーゼ認識配列)コード領域
ヌクレオチド番号409-426:制限酵素サイトを含む配列
ヌクレオチド番号427-2064:Luc(ルシフェラーゼ)コード領域
ヌクレオチド番号2064-2142:pTriEx3 Neoベクター(メルク)由来の配列
ヌクレオチド番号2143-2166:His(His tag) コード領域
ヌクレオチド番号2167-2169:終始コドン
<配列番号2>実施例1a)でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片(Bio-Turbo3C-Luc-His)がコードするアミノ酸配列を示す。
<配列番号3>実施例1a)でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片(Bio-MA/CA-Luc-His)のDNA配列と、コードされるアミノ酸配列(三文字表記)を示す。
ヌクレオチド番号1-252:PinPoint Xa Vector(プロメガ)由来の配列
ヌクレオチド番号253-282:Bio(ビオチン結合配列)コード領域
ヌクレオチド番号283-384: PinPoint Xa Vector(プロメガ)由来の配列
ヌクレオチド番号385-408:MA/CA(HIV-1のプロテアーゼ認識配列MA/CA)コード領域
ヌクレオチド番号409-426:制限酵素サイトを含む配列
ヌクレオチド番号427-2064:Luc(ルシフェラーゼ)コード領域
ヌクレオチド番号2064-2142:pTriEx3 Neoベクター(メルク)由来の配列
ヌクレオチド番号2143-2166:His(His tag) コード領域
ヌクレオチド番号2167-2169:終始コドン
<配列番号4>実施例1a)でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片(Bio-MA/CA-Luc-His)がコードするアミノ酸配列を示す。
<配列番号5>実施例1a)でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片(Bio-Nc/p1-Luc-His)のDNA配列と、コードされるアミノ酸配列(三文字表記)を示す。
ヌクレオチド番号1-252:PinPoint Xa Vector(プロメガ)由来の配列
ヌクレオチド番号253-282:Bio(ビオチン結合配列)コード領域
ヌクレオチド番号283-384: PinPoint Xa Vector(プロメガ)由来の配列
ヌクレオチド番号385-408: Nc/p1(HIV-1のプロテアーゼ認識配列Nc/p1)コード領域
ヌクレオチド番号409-426:制限酵素サイトを含む配列
ヌクレオチド番号427-2064:Luc(ルシフェラーゼ)コード領域
ヌクレオチド番号2064-2142:pTriEx3 Neoベクター(メルク)由来の配列
ヌクレオチド番号2143-2166:His(His tag) コード領域
ヌクレオチド番号2167-2169:終始コドン
<配列番号6>実施例1a)でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片(Bio-Nc/p1-Luc-His)がコードするアミノ酸配列を示す。
<配列番号7>実施例2e)でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片(Luc-MA/CA- His)のDNA配列と、コードされるアミノ酸配列(三文字表記)を示す。
ヌクレオチド番号1-33:pTriEx3 Neoベクター(メルク)由来の配列
ヌクレオチド番号34-1671:Luc(ルシフェラーゼ)コード領域
ヌクレオチド番号1672-1689:制限酵素サイトを含む配列
ヌクレオチド番号1690-1713:MA/CA(HIV-1のプロテアーゼ認識配列MA/CA)コード領域
ヌクレオチド番号1714-1773:pTriEx3 Neoベクター(メルク)由来の配列
ヌクレオチド番号1774-1797:His(His tag) コード領域
ヌクレオチド番号1798-1800:終始コドン
<配列番号8>実施例2e)でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片(Luc-MA/CA- His)がコードするアミノ酸配列を示す。
<配列番号9>実施例3でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片(Bio-MA/CA-TsLuc-His)のDNA配列と、コードされるアミノ酸配列(三文字表記)を示す。
ヌクレオチド番号1-252:PinPoint Xa Vector(プロメガ)由来の配列
ヌクレオチド番号253-282:Bio(ビオチン結合配列)コード領域
ヌクレオチド番号283-384: PinPoint Xa Vector(プロメガ)由来の配列
ヌクレオチド番号385-408:MA/CA(HIV-1のプロテアーゼ認識配列MA/CA)コード領域
ヌクレオチド番号409-426:制限酵素サイトを含む配列
ヌクレオチド番号427-2064:TsLuc(耐熱性ルシフェラーゼ)コード領域*ヌクレオチド番号1495-1497がaaa(Lys)に置換。
ヌクレオチド番号2064-2142:pTriEx3 Neoベクター(メルク)由来の配列
ヌクレオチド番号2143-2166:His(His tag) コード領域
ヌクレオチド番号2167-2169:終始コドン
<配列番号10>実施例3でpTriEx3 Neoベクターに挿入したDNA断片(Bio-MA/CA-TsLuc-His)がコードするアミノ酸配列を示す。
<配列番号11>MA/CA配列を示す。
<配列番号12>NC/p1配列を示す。
<配列番号13>p2/NC配列を示す。
<配列番号14>p2/NC配列を示す。
<配列番号15>p1/p6gag配列を示す。
<配列番号16>NC/TFP配列を示す。
<配列番号17>TFP/p6pol配列を示す。
<配列番号18>TFP/p6pol配列を示す。
<配列番号19>TFP/p6pol配列を示す。
<配列番号20>p6pol/PR配列を示す。
<配列番号21>p6pol/PR配列を示す。
<配列番号22>p6pol/PR配列を示す。
<配列番号23>PR/RTp51配列を示す。
<配列番号24>RT/RTp66配列を示す。
<配列番号25>RTp66/INT配列を示す。
<配列番号26>Nef配列を示す。
<配列番号27>Nef配列を示す。
<配列番号28>CA/p2配列を示す。
<配列番号29>ビオチン結合配列を示す。
<配列番号30>Trbo3cプロテアーゼの認識配列(6番目と7番目の間を切断)を示す。
Claims (7)
- HIV-1のプロテアーゼ認識配列であるMA/CAを介してレポータータンパク質が固定された担体を用意する工程、担体にプロテアーゼを接触させる工程、プロテアーゼの作用により、プロテアーゼ認識配列が切断されて、担体から遊離したレポータータンパク質を回収する工程、回収したレポータータンパク質由来の発光、発色又は蛍光を測定する工程を含む、プロテアーゼ活性の測定方法であって、担体が磁気ビーズである前記方法。
- 担体がアビジンをコーティングした磁気ビーズであり、プロテアーゼ認識配列にビオチンが結合しており、レポータータンパク質がプロテアーゼ認識配列を介してビオチン・アビジン結合により担体に固定されている請求項1記載の方法。
- 担体から遊離したレポータータンパク質を回収する工程が、担体から遊離したレポータータンパク質を遠心及び/又は磁気により担体と分離して、上清液を回収することを含む請求項1又は2に記載の方法。
- レポータータンパク質がルシフェラーゼであり、レポータータンパク質由来の発光がルシフェラーゼとルシフェリンとの反応により生じる発光である請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 種類の異なるレポータータンパク質のそれぞれが種類の異なるプロテアーゼ認識配列のそれぞれを介して固定された担体を用意して、種類の異なるプロテアーゼのそれぞれの活性を測定する請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- HIV-1のプロテアーゼ認識配列であるMA/CAを介してレポータータンパク質が固定された担体を含む、プロテアーゼ活性の測定キットであって、担体が磁気ビーズである前記キット。
- HIV-1のプロテアーゼ認識配列であるMA/CAを介してレポータータンパク質が固定された担体であって、担体が磁気ビーズである前記担体。
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