TW201508065A - 蛋白酶活性測定法 - Google Patents

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Akihiro Kurita
Yutaka Yamagishi
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Toyo B Net Co Ltd
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Abstract

本發明提供一種與先前之使用抗體之方法相比，步驟較少且以較短之作業時間對活體樣品中之蛋白酶進行檢測、測定之方法。本發明提供一種無需精確之分子設計，另外，成為背景之原因之螢光或發光較少且亦不存在於利用蛋白酶之切斷及螢光素酶之再構成時容易產生時滯等問題的蛋白酶檢測、測定法。 本發明蛋白酶活性之測定方法包括：準備經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白之載體之步驟；使蛋白酶與載體接觸之步驟；回收藉由蛋白酶之作用而切斷蛋白酶識別序列從而自載體游離之報導蛋白之步驟；及對來自所回收之報導蛋白之發光、發色或螢光進行測定之步驟。本發明之蛋白酶活性之測定套組包含經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白之載體。本發明之載體係經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白。

Description

蛋白酶活性測定法
本發明係關於一種蛋白酶活性測定法。
蛋白酶(protease)係將胺基酸經肽鍵而鏈狀地連結之肽(通常未達100個殘基，相對分子量較小)或蛋白質(通常為100個殘基以上，相對分子量較大)之肽鍵水解之酵素。各式種類者於作為生理作用之營養吸收、蛋白質之廢棄與再利用、活體防禦、活性之調節等廣泛之領域中發揮作用。蛋白酶係根據觸媒機制而分類為絲胺酸蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶(酸性蛋白酶)、金屬蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶等。
一般認為特定之蛋白酶之活性變化之測定對於某些特定症狀之管理治療有意義。例如，絲胺酸蛋白酶之活性變化與癌症轉移或血栓症、關節炎等症狀相關。又，關於HIV(Human Immunodeficiency Virus，人類免疫缺乏病毒)或C型肝炎病毒等之病毒傳染病，於其成熟過程中必需蛋白酶之表現。因此，簡便地檢測該等之表現對傳染病對策發揮重要之作用，具有公共衛生上之價值。
目前為止，為了識別某些樣品中所含之特定之蛋白酶，已知有使用抗體之免疫分析法、免疫墨點法(西方墨點法)、ELISA法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，酵素結合免疫吸附法)等。該等方法由於使用抗體，故而材料之採備變得昂貴。又，源自病毒疾病之蛋白酶、尤其是HIV，有以高頻度發生變異，導致抗體變得不識別之危險性。因此，業界開發有不使用抗體之蛋白酶檢測系統。例如有 應用螢光共振能量轉移(FRET，Fluorescence resonance energy transfer)之蛋白酶檢測探針(日本專利第4966469號(專利文獻1)、Protease Substrate Set,JPT Peptide Technologies GmbH)。其係於鄰近之兩個色素分子(或發色團)之間，不使激發能成為電磁波而藉由電子之共振使其直接轉移之現象。實際上，將成為基質之肽之N末端以螢光供體物質進行標記，將C末端以受體物質進行標記。受體物質係被稱為淬滅劑(quencher)之吸收光之物質。螢光供體物質被激發所產生之螢光藉由能量轉移而被受體物質吸收。若添加蛋白酶，則螢光供體物質與受體物質分離而不產生FRET，因而可檢測出來自螢光供體之螢光。本方法可任意地設計蛋白酶之識別序列，亦可容易地進行檢測。但是，有因識別序列之立體組態之影響而即便於蛋白酶未處理之狀態下亦產生成為背景(background)之原因之螢光的情形。即，需要精確地計算出蛋白酶識別序列與螢光供體、受體之部位關係之分子設計，故而檢測探針之開發、製造並不容易。又，藉由報導蛋白之結構變化而非螢光物質之方法亦利用於蛋白酶活性之檢測(日本專利特表2007-508014(非專利文獻2))。本方法係預先將蛋白酶識別序列組入至作為報導蛋白之螢光素酶之內部。該狀態之螢光素酶喪失發光能力。於對其添加蛋白酶而產生切斷之情形時螢光素酶之結構復原，因而具有發光能力。即，該發光之有無成為確認蛋白酶活性存在之指標。該方法亦與上述FRET相同，可任意地設計蛋白酶識別序列，但亦有因螢光素酶之立體結構與識別序列而具有穩定發光之可能性或未如預期般恢復螢光素酶之形狀之可能性。因此，與FRET法相同，蛋白酶識別探針之設計上亦需要高程度之計算技術。又，由於蛋白質之分子巨大，故而亦有於再構成時耗費時間，於利用蛋白酶之切斷及螢光素酶之再構成時容易產生時滯(time lag)之問題，而不適合於動力學分析。
[先前技術文獻] [專利文獻]
專利文獻1：日本專利第4966469號
非專利文獻1：日本專利特表2007-508014號公報
本發明之目的在於提供一種與先前之使用抗體之方法相比，步驟較少且以較短之作業時間對活體樣品中之蛋白酶進行檢測、測定之方法。
又，本發明之目的在於提供一種無需精確之分子設計，另外，成為背景之原因之螢光或發光較少且亦不存在於利用蛋白酶之切斷及螢光素酶之再構成時容易產生時滯等問題的蛋白酶檢測、測定法。
發明者等人為了解決該等問題而努力研究，結果發現，由來自報導蛋白之發光、發色、螢光而對活體樣品中之蛋白酶活性進行測定之新穎之方法，從而完成本發明。
本發明之主旨係如下所述。
(1)一種蛋白酶活性之測定方法，其包括：準備經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白之載體之步驟；使蛋白酶與載體接觸之步驟；回收藉由蛋白酶之作用而切斷蛋白酶識別序列從而自載體游離之報導蛋白之步驟；及對來自所回收之報導蛋白之發光、發色或螢光進行測定之步驟。
(2)如(1)記載之方法，其中載體為塗覆有抗生物素蛋白之珠粒，且於蛋白酶識別序列上結合有生物素，報導蛋白經由蛋白酶識別序列並藉由生物素-抗生物素蛋白結合而固定於載體。
(3)如(1)記載之方法，其中載體為固定化有金屬之管柱填充劑，且於蛋白酶識別序列上結合有His標籤(Histidine tag，組胺酸標籤)， 報導蛋白經由蛋白酶識別序列並藉由His標籤-金屬結合而固定於載體。
(4)如(3)記載之方法，其中金屬為選自由鎳、銅、鋅及鈷所組成之群。
(5)如(1)記載之方法，其中載體為塗覆有抗生物素蛋白之培養盤底面，且於蛋白酶識別序列上結合有生物素，報導蛋白經由蛋白酶識別序列並藉由生物素-抗生物素蛋白結合而固定於載體。
(6)如(1)至(5)中任一項記載之方法，其中蛋白酶識別序列為HIV-1之蛋白酶識別序列。
(7)如(6)記載之方法，其中HIV-1之蛋白酶識別序列為選自由MA/CA、CA/p2、p2/NC、NC/p1、p1/p6gag、NC/TFP、TFP/p6pol、p6pol/PR、PR/RTp51、RT/RTp66、RTp66/INT及Nef所組成之群中之序列。
(8)如(1)至(7)中任一項記載之方法，其中報導蛋白為螢光素酶，且來自報導蛋白之發光為藉由螢光素酶與螢光素之反應而產生之發光。
(9)如(1)至(8)中任一項記載之方法，其係準備經由種類不同之各蛋白酶識別序列分別固定有種類不同之各報導蛋白之載體，對種類不同之各蛋白酶之活性進行測定。
(10)一種蛋白酶活性之測定套組，其包含經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白之載體。
(11)一種載體，其係經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白。
(12)一種蛋白酶活性測定用報導蛋白，其包含結合有蛋白酶識別序列之報導蛋白。
根據本發明，與使用先前之抗體之方法相比，可步驟較少且以 較短之作業時間對活體樣品中之蛋白酶進行檢測、測定。
又，根據本發明，可實現無需精確之分子設計，另外，成為背景之原因之螢光或發光較少且於利用蛋白酶之切斷及螢光素酶之再構成時不產生時滯的蛋白酶之檢測、測定。
本說明書包含作為本申請案之優先權之基礎之日本專利申請、日本專利特願2013-161480之說明書及/或圖示中記載之內容。
圖1係本發明之實施態樣之概略圖。
圖2係本發明之實施態樣的一概略圖。於該態樣中，經由蛋白酶識別序列並藉由抗生物素蛋白-生物素結合而將報導蛋白(發光、發色酵素)固定於珠粒(載體)。
圖3係本發明之實施態樣的一概略圖。於該態樣中，經由蛋白酶識別序列並藉由His標籤 Ni結合而將報導蛋白(發光、發色酵素)固定於固相載體。
圖4係表示實施例1(生物素-抗生物素蛋白結合系統)及實施例2(His標籤 Ni結合系統)中製作之載體之構成。Bio：生物素結合序列，3C：Turbo 3C蛋白酶識別序列，MA/CA：HIV之MA/CA序列，Nc/p1：HIV之Nc/p1序列，Luc：螢光素酶，TsLuc：耐熱性螢光素酶，His：His標籤。
圖5係表示藉由螢光素酶之發光獲得之Turbo 3C蛋白酶之檢測結果(生物素-抗生物素蛋白結合系統)。
圖6係表示藉由螢光素酶之發光獲得之HIV-1蛋白酶之檢測結果(MA/CA序列)(生物素-抗生物素蛋白結合系統)。
圖7係表示藉由螢光素酶之發光獲得之HIV-1蛋白酶之檢測結果(Nc/p1序列)(生物素-抗生物素蛋白結合系統)。
圖8係表示藉由螢光素酶之發光獲得之HIV-1蛋白酶之檢測結果 (MA/CA序列)(His標籤 Ni結合系統)。
圖9係表示藉由耐熱性螢光素酶之發光獲得之HIV-1蛋白酶之檢測結果(MA/CA序列)(生物素-抗生物素蛋白結合系統)。
圖10係使用經由兩種蛋白酶識別序列分別固定有兩種報導蛋白之載體，對檢體中之複數種病毒同時進行檢測之方法的模式圖。FLuc：螢火蟲螢光素酶，RLuc：海腎(海紫羅蘭科)螢光素酶，GrLuc：綠光螢光素酶，RdLuc：紅光螢光素酶。
以下，對於本發明之實施形態更詳細地說明。
本發明提供一種蛋白酶活性之測定方法，其包括：準備經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白之載體之步驟；使蛋白酶與載體接觸之步驟；回收藉由蛋白酶之作用而切斷蛋白酶識別序列從而自載體游離之報導蛋白之步驟；及對來自所回收之報導蛋白之發光、發色或螢光進行測定之步驟。
作為蛋白酶識別序列，可例示：HIV-1之蛋白酶識別序列、疱疹病毒之蛋白酶識別序列、脊髓灰白質炎病毒之蛋白酶識別序列、C型肝炎病毒之蛋白酶識別序列等，但並非限定於該等。
作為HIV-1之蛋白酶識別序列，可例示：MA/CA、CA/p2、p2/NC、NC/p1、p1/p6gag、NC/TFP、TFP/p6pol、p6pol/PR、PR/RTp51、RT/RTp66、RTp66/INT、Nef等，但並非限定於該等。
MA/CA、CA/p2、p2/NC、NC/p1、p1/p6gag、NC/TFP、TFP/p6pol、p6pol/PR、PR/RTp51、RT/RTp66、RTp66/INT、Nef之序列及切斷部位係如下所述。
MA/CA Ser-Gln-Asn-Tyr/Pro-Ile-Val-Gln(序列編號11)NC/p1 Arg-Gln-Ala-Asn/Phe-Leu-Gly-Lys(序列編號12)p2/NC Thr-Ala-Ile-Met/Met-Gln-Lys-Gly(序列編號13)或Ser-Ala-Ile-Met/Met-Gln-Lys-Gly(序列編號14)p1/p6gag Pro-Gly-Asn-Phe/Leu-Gln-Ser-Arg(序列編號15)NC/TFP Arg-Gln-Ala-Asn/Phe-Leu-Arg-Glu(序列編號16)TFP/p6pol Asn-Leu-Ala-Phe/Gln-Gln-Gly-Glu(序列編號17)或Asn-Leu-Ala-Phe/Any-Gln-Gly-Glu(序列編號18)或Asp-Leu-Ala-Phe/Leu-Gln-Gly-Lys(序列編號19)p6pol/PR Ser-Phe-Ser-Phe/Pro-Gln-Ile-Thr(序列編號20)或Ser-Phe-Any-Phe/Pro-Gln-Ile-Thr(序列編號21)或Ser-Phe-Asn-Phe/Pro-Gln-Val-Thr(序列編號22)PR/RTp51 Thr-Leu-Asn-Phe/Pro-Ile-Ser-Pro(序列編號23)RT/RTp66 Ala-Glu-Thr-Phe/Tyr-Val-Asp-Gly(序列編號24)RTp66/INT Arg-Lys-Val-Leu/Phe-Leu-Asp-Gly(序列編號25)Nef Asp-Cys-Ala-Trp/Leu-Glu-Ala-Gln(序列編號26)或Ala-Cys-Ala-Trp/Leu-Glu-Ala-Gln(序列編號27)CA/p2 Ala-Arg-Val-Leu/Ala-Glu-Ala-Met(序列編號28)
其中，符號表示以下含義。
作為報導蛋白，可例示：甲蟲螢光素酶、海紫羅蘭科螢光素酶、長腹水蚤(Gaussia)螢光素酶、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)、綠色螢光蛋白(GFP)、過氧化酶、鹼性磷酸酶等發光、發色或螢光酵素等，但並非限定於該等。
作為螢光素酶，只要為與螢光素酶基質發生反應而產生發光之螢光素酶即可，並非特別限定，較佳為包含所有之如下酵素：以來自甲蟲之螢火蟲-螢光素(即，多雜環有機酸D-(-)-2-(6'-羥基-2'-苯并噻唑基)-△2-噻唑啉-4-羧酸)作為發光基質，將其氧化催化而釋出光子之酵素；來自螢火蟲科、叩頭蟲(Elateridae)科、稚螢(Drilidae)科、大場雌光螢(Rhagophthalmus ohbai)科等發光甲蟲並參與發光反應之酵素。該等中，亦包含藉由重組DNA技術或突變技術等，而人為地改變了酵素蛋白本身之穩定性(亦包含耐熱性)或發光特性等之酵素。作為耐熱性得到提高之螢光素酶，已知有日本專利特表平09-510610、日本專利特表2008-244507、日本專利特開2000-197487等中揭示之螢光素酶等，亦可使用該等。
於報導蛋白為螢光素酶之情形時，作為來自報導蛋白之發光，可對藉由螢光素酶與螢光素之反應而產生之發光進行測定。藉由螢光素酶與螢光素之反應所產生之發光可藉由使用市售之螢光素/螢光素酶發光試劑(LL發光試劑)進行發光，並利用照度計測定該發光而實施。
作為載體，可例示：珠粒、管柱填充劑、培養盤等，但並非限定於該等。
珠粒較佳為平均粒徑為50-150um、且經1~10%高度交聯之瓊脂 糖。
用作載體之珠粒亦可為磁珠。磁珠可藉由磁氣而分離，故而較為便利。
珠粒亦可用作管柱填充劑。
作為培養盤，可利用微量滴定盤。微量滴定盤可使用通常所銷售者。孔數有6、24、96、384等，任一孔數均可應對。作為材質，可使用丙烯酸系樹脂、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、玻璃製等中之任一種。
載體較佳為具有經由蛋白酶識別序列而可將報導蛋白固定之表面。於經由蛋白酶識別序列而將報導蛋白固定於載體時，較佳為利用生物素-抗生物素蛋白結合、His標籤 Ni結合等。
例如，若於載體(例如珠粒、培養盤)表面塗覆抗生物素蛋白，而使生物素結合於蛋白酶識別序列，則可藉由生物素-抗生物素蛋白結合，經由蛋白酶識別序列而將報導蛋白固定於載體。
於使生物素結合於蛋白酶識別序列時，較佳為於蛋白酶識別序列上附加生物素結合序列(序列之例示為Leu-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Thr-Glu-Ile(序列編號29)(由表現蛋白質之宿主而將生物素附加於第5位之離胺酸之部位))。
又，若於載體(例如管柱填充劑)表面使金屬固定化，並於蛋白酶識別序列上附加His標籤，則可藉由His標籤-金屬結合，經由蛋白酶識別序列而將報導蛋白固定於載體。作為金屬，可列舉：鎳、銅、鋅、鈷等。
進而，亦可對報導蛋白附加His標籤。藉此，可利用Ni結合配體填充管柱對報導蛋白進行純化。
於經由蛋白酶識別序列而將報導蛋白固定於載體時，較佳為如上所述般於蛋白酶識別序列上附加生物素結合序列或His標籤序列， 且較佳為利用基因工程方法製作結合有附加該等序列後之蛋白酶識別序列的報導蛋白(於下述實施例中，記作「蛋白酶識別探針蛋白」)，並將該蛋白酶識別探針蛋白固定於載體。於蛋白酶識別探針蛋白中，於將生物素結合序列或His標籤序列附加於蛋白酶識別序列之N末端側之情形時，較佳為使報導蛋白結合於蛋白酶識別序列之C末端側，反之，於將生物素結合序列或His標籤序列附加於蛋白酶識別序列之C末端側之情形時，較佳為使報導蛋白結合於蛋白酶識別序列之N末端側。由於在利用基因工程方法製作蛋白酶識別探針蛋白時使用載體，故而亦可使源自該載體之序列包含於蛋白酶識別探針蛋白中。
於本發明之方法中，若使蛋白酶與經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白之載體接觸，則藉由蛋白酶之作用而切斷蛋白酶識別序列，報導蛋白自載體游離。回收所游離之報導蛋白，並對來自所回收之報導蛋白之發光、發色或螢光進行測定，藉此可對蛋白酶活性進行測定。
於載體為珠粒之情形時，較佳為使載體與蛋白酶於溶液中接觸。關於藉由蛋白酶之作用而切斷蛋白酶識別序列從而自載體游離之報導蛋白，可藉由離心分離使載體沈澱，並自其上清液進行回收。若載體為磁珠，則可藉由磁氣而非離心分離使載體沈澱，可自其上清液回收游離報導蛋白。
於載體為管柱填充劑之情形時，若使含有蛋白酶之溶液於管柱中流動，則藉由蛋白酶之作用而切斷蛋白酶識別序列從而自載體游離之報導蛋白會不斷流出，故而只要採集流出液即可回收游離報導蛋白。
於使蛋白酶與載體接觸時之條件較佳為於20~40℃之溫度、較佳為25~30℃之溫度、pH值2~8之條件下進行反應。HIV-1蛋白酶之最佳pH值為2~5。
來自所回收之報導蛋白之發光、發色或螢光可藉由常法進行測定。例如，若報導蛋白為螢光素酶，則只要使用市售之螢光素/螢光素酶發光試劑(LL發光試劑)使其發光，並利用照度計測定該發光即可。
又，若發光蛋白質為海紫羅蘭科螢光素酶，則將其添加至回收含1mg/ml之腔腸素之溶液後之溶液中，使其發光，並利用照度計測定該發光。
於使用過氧化酶作為報導蛋白之情形時，可使用發光、發色兩種測定方法。即，過氧化酶係使過氧化氫之氧原子活化而將基質氧化之酵素，故而若利用該酵素反應之原理使基質氧化，則可使用發光或發色之色素進行該酵素量之定量。於發光之情形時，利用照度計進行色素濃度之定量，於發色之情形時，利用吸收特定波長之色素之性質，使用吸光度分析儀進行色素濃度之定量。
於將螢光蛋白質作為報導蛋白之情形時，藉由蛋白酶反應之切斷反應所游離之蛋白質之螢光之測定係使用同時進行激發光之照射與螢光之測定的機器。具體而言為螢光分光光度計或微盤讀取器(Microplate Reader)等。
為了對所檢測出之發光、發色或螢光是否為藉由蛋白酶之切斷所產生者進行驗證，較佳為設定於蛋白酶反應中添加有蛋白酶抑制劑之試驗區。即便自血液等活體樣品中檢測出發光、發色或螢光，只要於在相同之活體樣品中添加有蛋白酶抑制劑之試驗區未檢測出發光、發色或螢光，便可認為所檢測出之發光、發色或螢光為藉由蛋白酶之切斷所產生者，但若於在相同之活體樣品中添加有蛋白酶抑制劑之試驗區亦檢測出發光、發色或螢光，則不可認為所檢測出之發光、發色或螢光為藉由蛋白酶之切斷所產生者。
於本發明中，固定於載體之報導蛋白及蛋白酶識別序列並不分 別限定為一種，亦可為複數種。即，亦可準備經由種類不同之各蛋白酶識別序列分別固定有種類不同之各報導蛋白的載體，並對種類不同之各蛋白酶之活性進行測定。例如，如圖10之(例1)所示，於一測定系統中準備經由HIV蛋白酶識別序列而固定有螢火蟲螢光素酶之載體、及經由C型肝炎病毒識別序列而固定有海腎螢光素酶之載體，並同時測定複數種病毒。或者如圖10之(例2)所示，於一測定系統中準備經由HIV蛋白酶識別序列而固定有綠光螢光素酶之載體、及經由C型肝炎病毒識別序列而固定有紅光螢光素酶之載體，並同時測定複數種病毒。
又，本發明提供一種包含經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白之載體的蛋白酶活性之測定套組。上文已對經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白之載體進行了說明。
於本發明之測定套組中，亦可進而包含：蛋白酶標準試劑、蛋白酶抑制劑、用以使報導蛋白發光之試劑(例如螢光素/螢光素酶發光試劑)、試劑溶解液(例如發光試劑溶解液)、使發光、發色或螢光量同蛋白酶量對應之校準曲線、操作說明書、及根據數值結果判斷陰性、陽性之軟體等。
本發明之蛋白酶活性之測定方法及測定套組可利用於產生蛋白酶之微生物(亦包含病毒)之檢測、定量等。
進而，本發明提供一種經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白之載體。上文已對經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白之載體進行了說明。經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白之載體可利用於產生蛋白酶之微生物(亦包含病毒)之檢測、定量等。
進而又，本發明提供一種包含結合有蛋白酶識別序列之報導蛋白的蛋白酶活性測定用報導蛋白。較佳為如上所述般於蛋白酶識別序列上附加生物素結合序列或His標籤序列，若利用基因工程方法製作 結合有附加該等序列後之蛋白酶識別序列的報導蛋白(蛋白酶識別探針蛋白質)，並將該蛋白酶識別探針蛋白質固定於載體(上述假設)，則可使用該載體進行產生蛋白酶之微生物(亦包含病毒)之檢測、定量等。
實施例
以下，基於實施例詳細地說明本發明，但本發明並不限定於該等實施例。
[實施例1]蛋白酶活性檢測方法1
實驗方法
a)蛋白酶載體之構築(生物素-抗生物素蛋白結合系統)(圖4)
構築本發明之蛋白酶活性測定用報導蛋白表現載體，該載體係利用藉由抗生物素蛋白-生物素之結合能力的於載體上之固定。蛋白酶識別序列係採用Turbo 3C蛋白酶識別序列、或者HIV-1之MA-CA序列或Nc/p1序列。首先，Turbo3c蛋白酶係以Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro(序列編號30)作為識別序列而將第6位與第7位之間切斷的酵素，其被採用於利用His標籤或GST(Glutathione S Transferase，麩胱甘肽S-轉移酶)標籤之蛋白質純化系統。又，MA-CA序列係Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln(序列編號11)，Nc/p1序列係Arg-Gln-Ala-Asn-Phe-Leu-Gly-Lys(序列編號12)。該等係由在HIV-1以未成熟之病毒粒子之形式出芽後因本身所具有之HIV-1蛋白酶對病毒粒子內之前驅物蛋白質Pr55 gag-pol進行加工(processing)而成為具有傳染性之成熟之病毒時之HIV-1蛋白酶識別並切斷的序列[de Oliveira T et al.Variability at HIV-1 Subtype C Protease Cleavage Sites：An Indication of Viral Fitness？ Journal of Virology(2003),77(17)：9422-30]。再者，切斷部位於任一序列中均位於第4位與第5位之間。
首先，為了將蛋白酶識別序列附加於螢光素酶，合成於螢光素 酶之5'末端側包含表現蛋白酶識別序列之序列之引子及包含螢光素酶之C末端之引子，進行PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)。藉此，獲得表現使胺基酸序列Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln(序列編號11)與螢光素酶融合而成之蛋白質之基因片段。繼而，將所獲得之片段插入至PinPoint Xa Vector(Promega公司)。該載體係為了於所插入之序列上附加生物素結合肽而設計者。於生物素結合序列為Leu-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Thr-Glu-Ile(序列編號29)中之第5位離胺酸之部位由表現蛋白質之宿主附加生物素。本原理係根據文獻而為人所知[Chapman-Smith,A.,and Cronan,J.E.Jr.(1999)J.Nutr.129：477S-484S.]。繼而，為了獲得用以將包含生物素結合肽-蛋白酶識別序列-螢光素酶之片段自所獲得之載體插入至蛋白質表現載體之片段，而合成引子，進行PCR。將所獲得之藉由PCR而擴增之DNA片段插入至pTriEx3 Neo載體(Merck公司)。pTriEx-3載體於大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞中之任一者中均可大量表現目標蛋白質。
b)蛋白酶活性測定用報導蛋白之表現與純化(生物素-抗生物素蛋白結合系統)
首先，確認a)中所獲得之表現載體是否表現目標蛋白質。即，利用常法將表現載體轉形為大腸桿菌BL21 DE3(pLysS)。保持表現載體之大腸桿菌具有抗藥性(胺苄青黴素)。將該大腸桿菌種植於包含胺苄青黴素(Amp)1mg．ml之LB培養基2.5ml中，培養一晚。繼而，將培養液100ul轉移至新的2.5ml之培養液中，培養5小時左右。於冰上培養30分鐘，以成為最終濃度0.1mM之方式添加IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)。其後，於16℃下培養4小時。為了自培養液中簡便地萃取可溶性蛋白質，反覆進行3次於-80℃下冷凍30分鐘及以37℃迅速解凍之操作，從而獲得大腸桿菌破碎 液。將該液以15000rmp離心分離15分鐘，將其上清液作為可溶性蛋白質溶液。分取一部分，進行SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)確認目標位置處之條帶，藉此於大腸桿菌中正常地產生報導蛋白。
繼而，為了獲得大量之純度較高之報導蛋白，進行規模放大及利用Ni管柱之蛋白質之純化。首先，將大腸桿菌以200ml之規模進行培養，當OD600成為0.5時將其於冰上靜置30分鐘。以成為最終濃度0.1mM之方式添加IPTG，於16℃下培養4小時。
利用離心分離回收大腸桿菌，利用10ml之冷PBS(Phosphate-Buffered Saline，磷酸鹽緩衝液)將所獲得之大腸桿菌顆粒清洗2次。繼而，添加9ml之音波處理緩衝液(sonication buffer)[20mM之Tris(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三(羥基甲基)胺基甲烷)-HCl(pH值8.0)、500mM之NaCl、1mM之EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)、1mM之PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride，苯甲基磺醯氟)]，於冰上進行超音波處理。於-80℃下以10分鐘將處理液迅速冷凍後，於室溫下對成為雪霜狀之固形物進行30秒超音波處理。反覆進行3次上述冷凍融解處理。繼而，添加1ml之10% Triton X-100，於4℃下振盪1小時。為了去除夾雜物，以12,000轉進行10分鐘離心分離，將上清液用於純化。
繼而，自本操作中所獲得之可溶性全部蛋白質，對以His標籤所標記之蛋白質進行特異性地純化。純化時使用HiTrap Chelating HP(GE healthcare公司)。首先，於管柱連接10ml容量之注射器並將5ml之超純水以流速1滴/秒進行送液，而將管柱保存液置換為超純水。繼而，將0.5ml之0.1M硫酸鎳溶液以流速1滴/2秒進行送液，使鎳離 子結合於配體。將5ml之超純水以流速1滴/秒進行送液，而洗除未與配體結合之鎳離子。為了使管柱平衡化，將10ml之結合緩衝液(20mM之磷酸鈉、0.5M之氯化鈉、10mM之咪唑、pH值7.4)以流速1滴/秒進行送液。繼而，將上清液以流速1滴/2秒進行送液，使包含His標籤之蛋白質結合於配體。為了去除夾雜物及除目標物以外之蛋白質，將10ml之結合緩衝液以流速1滴/秒進行送液而清洗管柱。繼而，將5ml之溶出緩衝液[20mM之磷酸鈉、500mM之NaCl、500mM之咪唑(pH值7.4)]以流速1滴/秒進行送液，回收溶出液。測定溶出液之280nm之吸光度並算出目標蛋白質之濃度，計算產量。繼而，為了將溶出緩衝液置換為適於蛋白酶反應之緩衝液，進行藉由超過濾之蛋白質濃縮及利用PBS緩衝液(2.68mM之KCl、136.89mM之NaCl、1.47mM之KH2PO4、8.10mM之Na2HPO4)將目標蛋白質再溶解。於超過濾時，使用Amicon Ultra 30K裝置(Merck公司)。將所溶出之樣品500ml放入至amicon ultar中，以14,000轉進行30分鐘離心分離，利用20ml之PBS緩衝液將存在於過濾器上之蛋白質再溶解，從而製成高濃度探針蛋白質溶液。
c)探針蛋白質之固定化(生物素-抗生物素蛋白結合系統)
為了使探針蛋白質與固相載體結合，進行以下之操作。即，係於微粒子金屬表面塗覆有上述獲得之探針蛋白質溶液與抗生蛋白鏈菌素的微球即Dyaabeads Myone Streptavidin T1(Invitrogen公司)(以下，記作抗生蛋白鏈菌素塗珠)。抗生蛋白鏈菌素塗珠可結合之生物素化蛋白質之上限係珠粒溶液每100ul為20ug。首先，將抗生蛋白鏈菌素塗珠之保存液置換為PBS緩衝液。將100ul之抗生蛋白鏈菌素塗珠懸浮液分取於管中。使管之底面靠近磁氣而使珠粒沈澱。藉由吸引而去除上清液，添加PBS緩衝液200ul進行倒置混合，從而清洗珠粒。再次使管底面靠近磁氣而使珠粒沈澱，並吸引去除緩衝液。反覆進行3 次該操作。繼而，將高濃度探針蛋白質溶液以不使蛋白質之量超過20ug之方式添加至抗生蛋白鏈菌素塗珠中。使用微管旋轉機(microtube rotator)，於室溫下混合30分鐘，藉此使生物素化蛋白質結合於珠粒。其後，使管底面靠近磁氣而使珠粒沈澱，去除上清液後，利用100ul之蛋白酶反應緩衝液(50mM之乙酸鈉(Na acetate)[pH值5.5]、1M之NaCl、1mM之二硫蘇糖醇(dithiothreitol)、1mM之EDTA)進行再懸浮。將該懸浮液作為蛋白酶識別探針溶液。
d)蛋白酶活性之測定(生物素-抗生物素蛋白結合系統)
對所獲得之探針蛋白質實際上可否測定特定之蛋白酶之活性進行研究。向具有Turbo 3C蛋白酶識別序列之蛋白酶識別探針溶液20ul中添加1單位之Turbo 3C蛋白酶，向具有MA-CA序列或Nc/p1序列之蛋白酶識別探針溶液20ul中添加1單位之HIV-1蛋白酶(ANASPEC公司)，於室溫下反應15分鐘。每隔5分鐘進行輕敲，而使蛋白酶良好地混合。使管底面靠近磁氣而使磁珠沈澱，將上清液回收於另一管中。向所回收之上清液中添加100ul之Picagene PGL-100，利用照度計LV9800(BERTHOLD公司)測定10秒期間之發光量。又，為了驗證所檢測出之發光是否為由蛋白酶之切斷所產生者，而亦設定於蛋白酶反應中同時添加有蛋白酶抑制劑之試驗區。
實驗結果
將結果示於圖5~7。
圖5係表示藉由螢光素酶之發光獲得之Turbo 3C蛋白酶之檢測結果。蛋白酶(Protease)(+)：添加1單位之Turbo 3C蛋白酶後進行發光測定所得之結果。蛋白酶(-)：未添加Turbo 3C蛋白酶。蛋白酶(+)+抑制劑(Inhibitor)：同時添加1單位之Turbo 3C蛋白酶及5ul之蛋白酶抑制劑Coktail(Sigma-Aldrich公司)後進行發光測定所得之結果。
僅於蛋白酶(+)試驗區確認出發光，於蛋白酶(+)抑制劑(+)試驗區 中，發光為背景等級。抑制劑為蛋白酶抑制劑，其特異性地抑制Turbo 3C蛋白酶之活性。因此，所檢測出之發光係來自藉由蛋白酶進行切斷而游離之螢光素酶之發光。
圖6係表示藉由螢光素酶之發光獲得之HIV-1蛋白酶之檢測結果(MA/CA序列)。蛋白酶(+)：添加1單位之HIV-1蛋白酶後進行發光測定所得之結果。蛋白酶(-)：未添加HIV-1蛋白酶。蛋白酶+抑制劑：同時添加1單位之HIV-1蛋白酶及5ul之蛋白酶抑制劑Coktail(Sigma-Aldrich公司)後進行發光測定所得之結果。
僅於蛋白酶(+)試驗區確認出發光，於蛋白酶(+)抑制劑(+)試驗區中，發光為背景等級。抑制劑為蛋白酶抑制劑，其特異性地抑制HIV-1蛋白酶之活性。因此，所檢測出之發光係來自藉由蛋白酶進行切斷而游離之螢光素酶之發光。
圖7係表示藉由螢光素酶之發光獲得之HIV-1蛋白酶之檢測結果(NC/p1序列)。蛋白酶(+)：添加1單位之HIV-1蛋白酶後進行發光測定。蛋白酶(-)：未添加HIV-1蛋白酶。蛋白酶+抑制劑：同時添加1單位之HIV-1蛋白酶及5ul之蛋白酶抑制劑Coktail(Sigma-Aldrich公司)後進行發光測定所得之結果。
僅於蛋白酶(+)試驗區確認出發光，於蛋白酶(+)抑制劑(+)試驗區中，發光為背景等級。抑制劑係蛋白酶抑制劑，其特異性地抑制HIV-1蛋白酶之活性。因此，所檢測出之發光係來自由蛋白酶所切斷而游離之螢光素酶之發光。
[實施例2]蛋白酶活性檢測方法2
實驗方法
e)蛋白酶載體之構築(His標籤 Ni結合系統)(圖4)
對不依存於抗生物素蛋白-生物素結合系統且僅將His標籤設為結合部位的蛋白酶檢測系統進行研究。首先，為了將作為HIV-1蛋白酶 識別序列之MA/CA序列附加於螢光素酶，合成於螢光素酶之5'末端側包含表現蛋白酶識別序列之序列之引子及包含螢光素酶之C末端之引子，進行PCR。藉此，獲得表現使胺基酸序列Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln(序列編號11)與螢光素酶融合而成之蛋白質之基因片段。將所獲得之藉由PCR而擴增之DNA片段插入至pTriEx3 Neo載體(Merck公司)。pTriEx-3載體於大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞之任一者中均可大量表現目標蛋白質。又，本載體係於所表現之蛋白質之C末端附加His標籤。
f)蛋白酶活性測定用報導蛋白之表現與純化(His標籤 Ni結合系統)
首先，確認e)中所獲得之表現載體是否表現目標蛋白質。即，利用常法將表現載體轉形為大腸桿菌BL21 DE3(pLysS)。保持表現載體之大腸桿菌具有抗藥性(胺苄青黴素)。將該大腸桿菌種植於包含胺苄青黴素1mg．ml之LB培養基2.5ml中，培養一晚。繼而，將培養液100ul轉移至新的2.5ml之培養液中，培養5小時左右。於冰上培養30分鐘，以成為最終濃度0.1mM之方式添加IPTG。其後，於16℃下培養4小時。為了自培養液中簡便地萃取可溶性蛋白質，反覆進行3次於-80℃下冷凍30分鐘及以37℃迅速解凍之操作，從而獲得大腸桿菌破碎液。將該液以15000rmp離心分離15分鐘，將其上清液作為可溶性蛋白質溶液。分取一部分，進行SDS-PAGE確認目標部位處之條帶，藉此於大腸桿菌中正常地產生報導蛋白。
繼而，為了獲得大量之純度較高之報導蛋白，進行規模放大及利用Ni管柱之蛋白質之純化。首先，將大腸桿菌以200ml之規模進行培養，當OD600成為0.5時將其於冰上靜置30分鐘。以成為最終濃度0.1mM之方式添加IPTG，於16℃下培養4小時。
利用離心分離回收大腸桿菌，利用10ml之冷PBS將所獲得之大腸桿菌顆粒清洗2次。繼而，添加9ml之音波處理緩衝液[20mM之 Tris-Cl(pH值8.0)、500mM之NaCl、1mM之EDTA、1mM之PMSF]，於冰上進行超音波處理。於-80℃下以10分鐘將處理液迅速冷凍後，於室溫下對成為雪霜狀之固形物進行30秒超音波處理。反覆進行3次上述冷凍融解處理。繼而，添加1ml之10% Triton X-100，於4℃下振盪1小時。為了去除夾雜物，以12,000轉進行10分鐘離心分離，將上清液用於純化。
繼而，自本操作中所獲得之可溶性全部蛋白質中，對以His標籤所標記之蛋白質特異性地純化。純化時使用HiTrap Chelating HP(GE healthcare公司)。首先，於管柱連接10ml容量之注射器並將5ml之超純水以流速1滴/秒進行送液，將管柱保存液置換為超純水。繼而，將0.5ml之0.1M硫酸鎳溶液以流速1滴/2秒進行送液，使鎳離子結合於配體。將5ml之超純水以流速1滴/秒進行送液，而對配體沖洗去未結合之鎳離子。為了使管柱平衡化，將10ml之結合緩衝液(20mM之磷酸鈉、0.5M之氯化鈉、10mM之咪唑、pH值7.4)以流速1滴/秒進行送液。繼而，將上清液以流速1滴/2秒進行送液，使包含His標籤之蛋白質結合於配體。為了去除夾雜物及除目標物以外之蛋白質，將10ml之結合緩衝液以流速1滴/秒進行送液而清洗管柱。繼而，將5ml之溶出緩衝液[20mM之磷酸鈉、500mM之NaCl、500mM咪唑(pH值7.4)]以流速1滴/秒進行送液，回收溶出液。測定溶出液之280nm之吸光度並算出目標蛋白質之濃度，計算產量。繼而，為了將溶出緩衝液置換為適於蛋白酶之反應之緩衝液，進行藉由超過濾之蛋白質濃縮及利用PBS緩衝液(2.68mM之KCl、136.89mM之NaCl、1.47mM之KH2PO4、8.10mM之Na2HPO4)將目標蛋白質再溶解。於超過濾時，使用Amicon Ultra 30K裝置(Merck公司)。將所溶出之樣品500ml放入至amicon ultar中，以14,000轉進行30分鐘離心分離，利用20ml之PBS緩衝液將存在於過濾器上之蛋白質再溶解，從而製成高濃度探針蛋白質溶液。
g)探針蛋白質之固定化(His標籤 Ni結合系統)
為了使探針蛋白質與固相載體結合，進行以下之操作。即，藉由於上述中所獲得之探針蛋白質溶液與瓊脂糖中，混合作為經亞胺基二乙酸而螯合有鎳離子之微球的金屬螯合瓊脂糖(和光純藥)(以下，記作Ni珠)，從而使探針蛋白質中之His標籤與Ni珠之鎳離子結合。附加有His標籤之蛋白質係瓊脂糖珠粒溶液每1ml中為20mg。首先，為了將Ni珠之保存液置換為PBS緩衝液，將100ul之Ni珠溶液分取於管中。將管靜置，使珠粒沈澱。小心地去除上清液，添加PBS緩衝液200ul進行倒置混和，從而清洗珠粒。再次將管靜置而使珠粒沈澱，並吸引去除PBS緩衝液。反覆進行3次該操作。繼而，將高濃度探針蛋白質溶液以不使蛋白質之量超過2mg之方式添加至Ni珠中。使用微管旋轉機，於室溫下混合30分鐘，藉此使經His標籤標記之探針蛋白質結合於Ni珠。其後，將管靜置而使珠粒沈澱，去除上清液，利用100ul之蛋白酶反應緩衝液(50mM之乙酸鈉[pH值5.5]、1M之NaCl、1mM之二硫蘇糖醇、1mM之EDTA)進行再懸浮。將該懸浮液作為蛋白酶識別探針溶液。
h)蛋白酶活性之測定(His標籤 Ni結合系統)
對所獲得之探針蛋白質實際上可否測定特定之蛋白酶之活性進行研究。向具有MA-CA序列之蛋白酶識別探針溶液20ul中添加1單位之HIV-1蛋白酶(ANASPEC公司)，於室溫下反應15分鐘。每隔5分鐘進行輕敲，而使蛋白酶良好地混合。其後，藉由將管輕緩地離心而使珠粒沈澱，將上清液回收於另一管中。向所回收之上清液中添加100ul之Picagene PGL-100，利用照度計LV9800(BERTHOLD公司)測定10秒期間之發光量。又，為了驗證所檢測之發光是否為由蛋白酶之切斷所產生者，而亦設定於蛋白酶反應中同時添加有蛋白酶抑制劑之試驗區。
實驗結果
將結果示於圖8。
圖8係表示藉由螢光素酶之發光獲得之HIV-1蛋白酶之檢測結果(MA/CA序列)。蛋白酶(+)：添加1單位之HIV-1蛋白酶後進行發光測定所得之結果。蛋白酶(-)：未添加HIV-1蛋白酶。蛋白酶+抑制劑：同時添加1單位之HIV-1蛋白酶及5ul之蛋白酶抑制劑Coktail(Sigma-Aldrich公司)後進行發光測定所得之結果。
僅於蛋白酶(+)試驗區確認出發光，於蛋白酶(+)抑制劑(+)試驗區中，發光為背景等級。抑制劑為蛋白酶抑制劑，其特異性地抑制HIV-1蛋白酶之活性。因此，所檢測出之發光係來自藉由蛋白酶進行切斷而游離之螢光素酶之發光。
[實施例3]蛋白酶活性檢測方法3
使用耐熱性螢光素酶(日本專利特表平09-510610，所謂E354K)作為報導蛋白，於30℃下進行HIV-1蛋白酶與具有MA-CA序列之蛋白酶識別探針之反應，除此以外，以與實施例1相同之操作進行實驗。將結果示於圖9。
圖9係表示藉由耐熱性螢光素酶之發光獲得之HIV-1蛋白酶之檢測結果(MA/CA序列)。蛋白酶(+)：添加1單位之HIV-1蛋白酶後進行發光測定所得之結果。蛋白酶(-)：未添加HIV-1蛋白酶。蛋白酶+抑制劑：同時添加1單位之HIV-1蛋白酶及5ul之蛋白酶抑制劑Coktail(Sigma-Aldrich公司)後進行發光測定所得之結果。
僅於蛋白酶(+)試驗區確認出發光，於蛋白酶(+)抑制劑(+)試驗區中，發光為背景等級。抑制劑為蛋白酶抑制劑，其特異地抑制HIV-1蛋白酶之活性。因此，所檢測出之發光係來自藉由蛋白酶進行切斷而游離之螢光素酶之發光。又，蛋白酶(+)試驗區中之發光為大約100倍之實施例1中所示之發光。認為其原因在於：若對於載體上之結合操 作或蛋白酶反應等阻礙螢光素酶之穩定之操作，使用耐熱性螢光素酶，則耐性上升。
將本說明書中所引用之所有出版物、專利及專利申請案直接以參考之形式併入至本說明書中。
[產業上之可利用性]
根據本發明，可以較少之步驟且較短之作業時間對蛋白酶進行檢測、測定。
根據本發明，可實現無需精確之分子設計，另外，成為背景之原因之螢光或發光較少且於利用蛋白酶之切斷及螢光素酶之再構成時不產生時滯的蛋白酶之檢測、測定。
本發明亦可利用於產生蛋白酶之微生物之檢測、定量等。
[序列表非關鍵文字]
<序列編號1>表示實施例1a)中插入至pTriEx3 Neo載體之DNA片段(Bio-Turbo3C-Luc-His)之DNA序列、及所編碼之胺基酸序列(三字母表述)。
核苷酸編號1-252：源自PinPoint Xa Vector(Promega公司)之序列
核苷酸編號253-282：Bio(生物素結合序列)編碼區域
核苷酸編號283-384：源自PinPoint Xa Vector(Promega公司)之序列
核苷酸編號385-408：3C(Turbo 3C蛋白酶識別序列)編碼區域
核苷酸編號409-426：包含限制酶部位之序列
核苷酸編號427-2064：Luc(螢光素酶)編碼區域
核苷酸編號2064-2142：源自pTriEx3 Neo載體(Merck公司)之序列
核苷酸編號2143-2166：His(His標籤)編碼區域
核苷酸編號2167-2169：終始密碼子
<序列編號2>表示實施例1a)中插入至pTriEx3 Neo載體之DNA片段(Bio-Turbo3C-Luc-His)所編碼之胺基酸序列。
<序列編號3>表示實施例1a)中插入至pTriEx3 Neo載體之DNA片段(Bio-MA/CA-Luc-His)之DNA序列、及所編碼之胺基酸序列(三字母表述)。
核苷酸編號1-252：源自PinPoint Xa Vector(Promega公司)之序列
核苷酸編號253-282：Bio(生物素結合序列)編碼區域
核苷酸編號283-384：源自PinPoint Xa Vector(Promega公司)之序列
核苷酸編號385-408：MA/CA(HIV-1之蛋白酶識別序列MA/CA)編碼區域
核苷酸編號409-426：包含限制酶部位之序列
核苷酸編號427-2064：Luc(螢光素酶)編碼區域
核苷酸編號2064-2142：源自pTriEx3 Neo載體(Merck公司)之序列
核苷酸編號2143-2166：His(His標籤)編碼區域
核苷酸編號2167-2169：終始密碼子
<序列編號4>表示實施例1a)中插入至pTriEx3 Neo載體之DNA片段(Bio-MA/CA-Luc-His)所編碼之胺基酸序列。
<序列編號5>表示實施例1a)中插入至pTriEx3 Neo載體之DNA片段(Bio-Nc/p1-Luc-His)之DNA序列、及所編碼之胺基酸序列(三字母表述)。
核苷酸編號1-252：源自PinPoint Xa Vector(Promega公司)之序列
核苷酸編號253-282：Bio(生物素結合序列)編碼區域
核苷酸編號283-384：源自PinPoint Xa Vector(Promega公司)之序列
核苷酸編號385-408：Nc/p1(HIV-1之蛋白酶識別序列Nc/p1)編碼區域
核苷酸編號409-426：包含限制酶部位之序列
核苷酸編號427-2064：Luc(螢光素酶)編碼區域
核苷酸編號2064-2142：源自pTriEx3 Neo載體(Merck公司)之序列
核苷酸編號2143-2166：His(His標籤)編碼區域
核苷酸編號2167-2169：終始密碼子
<序列編號6>表示實施例1a)中插入至pTriEx3 Neo載體之DNA片段(Bio-Nc/p1-Luc-His)所編碼之胺基酸序列。
<序列編號7>表示實施例2e)中插入至pTriEx3 Neo載體之DNA片段(Luc-MA/CA-His)之DNA序列、及所編碼之胺基酸序列(三字母表述)。
核苷酸編號1-33：源自pTriEx3 Neo載體(Merck公司)之序列
核苷酸編號34-1671：Luc(螢光素酶)編碼區域
核苷酸編號1672-1689：包含限制酶部位之序列
核苷酸編號1690-1713：MA/CA(HIV-1之蛋白酶識別序列MA/CA)編碼區域
核苷酸編號1714-1773：源自pTriEx3 Neo載體(Merck公司)之序列
核苷酸編號1774-1797：His(His標籤)編碼區域
核苷酸編號1798-1800：終始密碼子
<序列編號8>表示實施例2e)中插入至pTriEx3 Neo載體之DNA片段(Luc-MA/CA-His)所編碼之胺基酸序列。
<序列編號9>表示實施例3中插入至pTriEx3 Neo載體之DNA片段(Bio-MA/CA-TsLuc-His)之DNA序列、及所編碼之胺基酸序列(三字母表述)。
核苷酸編號1-252：源自PinPoint Xa Vector(Promega公司)之序列
核苷酸編號253-282：Bio(生物素結合序列)編碼區域
核苷酸編號283-384：源自PinPoint Xa Vector(Promega公司)之序列
核苷酸編號385-408：MA/CA(HIV-1之蛋白酶識別序列MA/CA)編碼區域
核苷酸編號409-426：包含限制酶部位之序列
核苷酸編號427-2064：TsLuc(耐熱性螢光素酶)編碼區域*核苷酸編號1495-1497被置換為aaa(Lys)。
核苷酸編號2064-2142：源自pTriEx3 Neo載體(Merck公司)之序列
核苷酸編號2143-2166：His(His標籤)編碼區域
核苷酸編號2167-2169：終始密碼子
<序列編號10>表示實施例3中插入至pTriEx3 Neo載體之DNA片段(Bio-MA/CA-TsLuc-His)所編碼之胺基酸序列。
<序列編號11>表示MA/CA序列。
<序列編號12>表示NC/p1序列。
<序列編號13>表示p2/NC序列。
<序列編號14>表示p2/NC序列。
<序列編號15>表示p1/p6gag序列。
<序列編號16>表示NC/TFP序列。
<序列編號17>表示TFP/p6pol序列。
<序列編號18>表示TFP/p6pol序列。
<序列編號19>表示TFP/p6pol序列。
<序列編號20>表示p6pol/PR序列。
<序列編號21>表示p6pol/PR序列。
<序列編號22>表示p6pol/PR序列。
<序列編號23>表示PR/RTp51序列。
<序列編號24>表示RT/RTp66序列。
<序列編號25>表示RTp66/INT序列。
<序列編號26>表示Nef序列。
<序列編號27>表示Nef序列。
<序列編號28>表示CA/p2序列。
<序列編號29>表示生物素結合序列。
<序列編號30>表示Trbo 3c蛋白酶之識別序列(將第6位與第7位之間切斷)。
<110> 日商東洋B-NET股份有限公司日商東洋油墨SC控股股份有限公司
<120> 蛋白酶活性測定法
<130> FP-195PCT
<150> JP P2013-161480
<151> 2013-08-02
<160> 30
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 2169
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bio-Turbo3C-Luc-His DNA序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2169)
<400> 1
<210> 2
<211> 722
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成結構
<400> 2
<210> 3
<211> 2169
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bio-MA/CA-Luc-His DNA序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2169)
<400> 3
<210> 4
<211> 722
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成結構
<400> 4
<210> 5
<211> 2169
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bio-Nc/p1-Luc-His DNA序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2169)
<400> 5
<210> 6
<211> 722
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成結構
<400> 6
<210> 7
<211> 1800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Luc-MA/CA-His DNA序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1800)
<400> 7
<210> 8
<211> 599
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成結構
<400> 8
<210> 9
<211> 2169
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Bio-MA/CA-TsLuc-His DNA序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2169)
<400> 9
<210> 10
<211> 722
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成結構
<400> 10
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<400> 11
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<400> 12
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<400> 13
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<400> 14
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<400> 15
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<400> 16
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<400> 17
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<220>
<221> 未歸類之特性
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為任意天然產生之胺基酸
<400> 18
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<400> 19
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<400> 20
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<220>
<221> 未歸類之特性
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸
<400> 21
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<400> 22
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<400> 23
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<400> 24
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<400> 25
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<400> 26
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒1型
<400> 27
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類腺病毒1型
<400> 28
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 大腸桿菌
<400> 29
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人類鼻病毒
<400> 30

Claims (12)

  1. 一種蛋白酶活性之測定方法，其包括：準備經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白之載體之步驟；使蛋白酶與載體接觸之步驟；回收藉由蛋白酶之作用而切斷蛋白酶識別序列從而自載體游離之報導蛋白之步驟；及對來自所回收之報導蛋白之發光、發色或螢光進行測定之步驟。
  2. 如請求項1之方法，其中載體為塗覆有抗生物素蛋白之珠粒，且於蛋白酶識別序列上結合有生物素，報導蛋白經由蛋白酶識別序列並藉由生物素-抗生物素蛋白結合而固定於載體。
  3. 如請求項1之方法，其中載體為固定化有金屬之管柱填充劑，且於蛋白酶識別序列上結合有His標籤，報導蛋白經由蛋白酶識別序列並藉由His標籤-金屬結合而固定於載體。
  4. 如請求項3之方法，其中金屬為選自由鎳、銅、鋅及鈷所組成之群。
  5. 如請求項1之方法，其中載體為塗覆有抗生物素蛋白之培養盤底面，且於蛋白酶識別序列上結合有生物素，報導蛋白經由蛋白酶識別序列並藉由生物素-抗生物素蛋白結合而固定於載體。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中蛋白酶識別序列為HIV-1之蛋白酶識別序列。
  7. 如請求項6之方法，其中HIV-1之蛋白酶識別序列為選自由MA/CA、CA/p2、p2/NC、NC/p1、p1/p6gag、NC/TFP、TFP/p6pol、p6pol/PR、PR/RTp51、RT/RTp66、RTp66/INT及Nef所組成之群中之序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中報導蛋白為螢光素酶，且來自報導蛋白之發光為藉由螢光素酶與螢光素之反應而產生之 發光。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其係準備經由種類不同之各蛋白酶識別序列分別固定有種類不同之各報導蛋白之載體，對種類不同之各蛋白酶之活性進行測定。
  10. 一種蛋白酶活性之測定套組，其包含經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白之載體。
  11. 一種載體，其係經由蛋白酶識別序列而固定有報導蛋白。
  12. 一種蛋白酶活性測定用報導蛋白，其包含結合有蛋白酶識別序列之報導蛋白。
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