CN111334555A - 一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法及其应用，检测方法包括如下步骤：S1.向可能含蛋白酶的样本和一阴性对照中，加入含有特定氨基酸序列连接的光信号激活分子A或含有它的溶液；S2.孵育一段时间后，检测光信号，检测步骤(1)包括检测含有特定氨基酸序列连接的光信号激活分子A后的样本和阴性对照的光信号強度,比较样本和阴性对照信号的相对信号强度。检测方法可以在制备用于临床诊断病原体感染的试剂盒中应用。当样本中含有待检测蛋白酶活性时，反应中光信号发生变化，即光信号变强、减弱乃至消失，并从光信号的变化判断待检样本中是否含有该蛋白酶活性，操作简单，仅20分钟，即可得到结果。

Description

一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体地涉及一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法及其应用。
背景技术
病原体已经适应在宿主细胞中生存和复制，并从一个个体传播到另一个个体。病原体，特别是病毒，在受感染的人类或动物宿主体内的复制通常依赖于宿主细胞的核酸和/或蛋白质合成机器。然而，由病原体，特别是病毒基因组编码的蛋白质，往往在病原体的生存、复制和传播中起着至关重要的作用。在这些病原体编码的蛋白质中有内肽酶，也称为蛋白酶。
为了有效地整合基因组，病毒通常将病毒蛋白合成为多聚蛋白，每个多聚蛋白包含一个以上的功能蛋白。因此，多聚蛋白必须在一个精确的位置被裂解。在某些情况下，多聚蛋白被宿主细胞的蛋白酶裂解。在其他情况下，病毒多聚蛋白被病毒基因组自身编码的蛋白酶裂解。后一类病毒包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类丙型肝炎病毒(HCV)、冠状病毒(CoV)、西尼罗河病毒(WNV)、寨卡病毒(Zika virus)和登革病毒(DENV)。
由于病毒编码的蛋白酶在特定的裂解位点裂解病毒多聚蛋白，因此病毒蛋白酶一直是抗病毒药物的首选靶点。事实上，许多人致力于开发这些病毒蛋白酶的抑制剂作为抗病毒药物。其中一些抑制剂已经成为抗病毒药物。例如，针对HIV和HCV蛋白酶的蛋白酶抑制剂是重要和有效的抗病毒药物。
荧光测定法被开发并用于筛选病毒蛋白酶抑制剂。通常，这些检测使用合成肽作为底物，其中包含裂解位点氨基酸序列，一端为荧光部分，另一端为猝灭部分。猝灭部分降低荧光或引起荧光部分的波长偏移。当肽底物被裂解时，光信号强度增加和/或峰值波长变化。这些变化可以用荧光计测量。虽然这类方法不灵敏，但由于大量的克隆和纯化的蛋白酶可用于药物筛选试验，因此适用于抑制剂药物筛选。然而，这些检测方法对诊断用途不够灵敏。临床样本中的病毒蛋白酶的含量极为微量，检测微量的病毒酶需要更为灵敏的检测方法。
发明内容
有鉴于此，为解决上述技术问题，本发明的目的在于提出一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法及应用，该方法实质上更灵敏，因此适用于通过检测表明病原体存在的活性蛋白酶来诊断病原体感染。
所采用的技术方案为：
一方面，本发明的一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法,包括如下步骤：
S1.向可能含蛋白酶的待检样本及一阴性对照中，加入带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A或含有它的溶液；未带有特定氨基酸序列的独立的完整的光信号激活分子B能产生光信号，且是一种蛋白质；该特定氨基酸序列具有至少一个可以被蛋白酶裂解的裂解位点，使用带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A采用以下方案中的任意一种：
方案一：带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A是光信号激活分子B被该特定氨基酸序列插入到该光信号激活分子B中间的产物；此带有特定氨基酸序列光信号激活分子A仍能产生光信号；当该特定氨基酸序列被蛋白酶切割，将光信号激活分子B切割为第一蛋白和第二蛋白两部分，此第一蛋白和第二蛋白不能产生光信号；
方案二：带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A是光信号激活分子B带有特定氨基酸序列连接到失活实体上的产物，此失活实体可以抑制该光信号激活分子B的活性，此带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A不能产生光信号；当特定氨基酸序列被蛋白酶裂解，释放该光信号激活分子B，该光信号激活分子B导致光信号增加；
方案三：带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A是光信号激活分子B带有特定氨基酸序列连接到可移除实体上的产物，此可移除实体不会导致光信号激活分子B的失活，此带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A仍能产生光信号；当特定氨基酸序列未被蛋白酶裂解，带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A含有的光信号激活分子B与可移除实体的一起从反应中被物理移除；当特定氨基酸序列被蛋白酶裂解，只有可移除实体从反应中被物理移除，而保留了光信号激活分子B；
S2.孵育一段时间后，进行光信号检测，检测步骤(1)包括检测带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A的样本光信号强度，并同时检测阴性对照，该阴性对照同样孵育一段时间后，测量光信号强度，通过比较阴性对照的光信号强度，判断样本光信号强度变化。
进一步地，在S1的方案一中，还加入抑制剂，该抑制剂可特异性地抑制蛋白酶的活性，使该特定氨基酸序列不会被蛋白酶切割。
进一步地，所述光信号激活分子B包括但不限于为荧光素酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶，也包括其他能导致发光反应的蛋白。
进一步地，所述荧光素酶是萤火虫荧光素酶，叩头虫荧光素酶或细菌荧光素酶。
进一步地，所述待检蛋白酶为病原体编码的蛋白质中含有的蛋白酶。
进一步地，所述病原体为人类免疫缺陷病毒、人类丙型肝炎病毒、冠状病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒或登革热病毒，该病原体编码的病毒蛋白酶可裂解所述特定氨基酸序列。
进一步地，当病原体为冠状病毒时，所述蛋白酶为PL蛋白酶和/或3CL蛋白酶；当病原体为人类免疫缺陷病毒时，所述蛋白酶为艾滋病毒逆转录病毒天门冬氨酰蛋白酶，当病原体为人类丙型肝炎病毒时，所述蛋白酶是NS3/NS4丝氨酸蛋白酶；当病原体为登革病毒时，所述蛋白酶是NS2/NS3蛋白酶,当病原体为西尼罗河病毒时，所述蛋白酶是NS2/NB3蛋白酶；当病原体为寨卡病毒时，病毒蛋白酶是NS2B/NS3蛋白酶。
进一步地，所述冠状病毒为新型冠状病毒COVID-19或SARS-COV或其他受体为ACE2的冠状病毒；所述待测样本为尿样、血样、或粪便。
进一步地，所述特定氨基酸序列包括但不限于是由至少三个氨基酸组成的氨基酸序列组成。
另一方面，本发明的基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法可以在制备用于病毒临床诊断包括冠状病毒在内的病原体感染的试剂盒中应用。
例如，冠状病毒临床诊断测试时使用样本为尿液、血样或粪便样，从而诊断受体为ACE2的冠状病毒感染包括新型冠状病毒或SARS-COV感染。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明利用化学发光或生物化学发光检测样本中的蛋白酶活性，只要被检测到的病原体中含有蛋白酶，该蛋白酶针对具有至少一个裂解位点的特定氨基酸序列具有特异性，并且这种特异性表明了该病原体，本发明基于光信号检测的强度变化，就能灵敏地检测出蛋白酶活性。
附图说明
图1-图2为实施例1和实施例4涉及的检测原理图。
图3-图4为实施例2涉及的检测原理图。
图5-图6为实施例3涉及的检测原理图。
图7为实施例4涉及的检测原理图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
本公司(申请人)开发了基于光信号检测的基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法，并可用于筛选病毒蛋白酶抑制剂，可以用于诊断病原体感染，包括检测病人或动物物种中某些病原体感染的诊断应用。另外，本发明方法也可以判断病原体感染后病人病情变化或疗效，用于监控检测感染后的病人病情变化，如经过治疗后或治疗过程中病情是否有所改善或恶化。这些检测使用合成肽(也就是含有特定氨基酸序列连接的光信号激活分子A)作为底物。
病原体感染的蛋白酶能分裂特定氨基酸序列，并且只存在于被病原体感染的病原体和/或宿主细胞中。裂解位点的氨基酸序列应当是特异性的，才能检测到蛋白酶，因此称之为特定氨基酸序列或特异性氨基酸序列。该特定氨基酸序列不一定只有一个氨基酸序列；相反，它可以是多个氨基酸序列，例如是由至少三个氨基酸组成的氨基酸序列组成。这些氨基酸序列具有相似的特征。其特征可能是氨基酸在一定位置的疏水性或大小，特异性氨基酸序列是主要或仅由待检测的蛋白酶有效裂解的任何序列，因此对于具体的序列并不做限定，任何可以主要或仅由待检测的蛋白酶有效裂解的序列都可以作为特异性氨基酸序列，宿主细胞的病原体的其他蛋白酶要么在样本中缺乏检测，要么不能有效地裂解该特定氨基酸序列。也就是，该特定氨基酸序列只能被特定的蛋白酶裂解而不是其他。
作为一个实施例，待测样本应含有病原体和/或受感染细胞或/或病原体和/或受感染细胞的成分含有待检蛋白酶。
光信号激活分子的例子包括但不限于，各种类型的荧光素酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶，以及其他可以直接或间接激活光信号的物质。
本发明描述了可用于临床诊断病原体感染的基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法。本发明公开的检测方法依赖于两个因素来实现对病原体或由病原体引起的感染的特异性和灵敏性检测:一个是只能切割特异性氨基酸序列的病原体编码的蛋白酶，一个是光信号激活分子。
许多病原体，特别是病毒，会产生特定的蛋白酶，这些蛋白酶只能切割具有特定特征的特定氨基酸序列，如氨基酸序列。例如，人类免疫缺陷病毒(HIV)的基因组编码一种反胃蛋白酶，它能裂解新合成的多聚蛋白。丙型肝炎病毒的基因组编码NS3/NS4丝氨酸蛋白酶，它在丙型肝炎病毒多蛋白中裂解4个位点。针对这些蛋白酶的特异性抑制剂已被确定，并被用作有效的抗病毒药物。
许多其他病毒也有病毒基因组编码的特定蛋白酶，例子包括但不限于冠状病毒的基因组编码papain-like(PL)蛋白酶和3-chymotrypsin-like(3CL)蛋白酶、登革热病毒的基因组编码NS2/NS3蛋白酶,西尼罗河病毒基因组编码的NS2/NB3蛋白酶,寨卡(Zika)病毒基因组编码的NS2B/NS3蛋白酶。目前正大力开发针对这些蛋白酶的抑制剂，并打算将其用作抗病毒药物。
尽管针对这些蛋白酶的抗病毒药物已经取得了高度成功，但这些病原体蛋白酶还没有被普遍用于诊断目的。利用特定的蛋白酶诊断病原体感染有几个优点。病原体蛋白酶与病原体核酸一起或在其之前合成。这意味着病原体蛋白，包括蛋白酶，可以在病原体特异性抗体被检测出来之前被检测出来。如果设计合理，检测酶活性可能比检测非酶蛋白(如使用一对抗体的抗原)更灵敏。此外，由于这些蛋白酶对于其目标裂解氨基酸序列是独特和特异性的，因此可以设计一个匀相的分析方法，这样就不需要清洗，从而简化了分析过程和所需的仪器。此外，由于蛋白酶的活性对病原体的生命周期至关重要，因此它不太容易受到遗传变化的影响，这是检测病原体，特别是病毒时经常遇到的问题。病原蛋白酶不常用于病原体感染的诊断，主要是由于常用的蛋白酶检测方法缺乏灵敏性。
因此，本发明公开的检测方法使用光信号激活分子，使化学发光或生物化学发光得以产生，这种发光可以是高度灵敏的。光信号激活分子应该是蛋白质或含有氨基酸序列，可以通过插入蛋白酶的切割位点进行修饰。
光信号激活分子的一个例子是荧光素酶。许多种类的昆虫和细菌产生荧光素酶来产生光，这被认为是在黑暗中交配的信号。昆虫荧光素酶的一个例子是萤火虫荧光素酶。萤火虫荧光素酶可分为两个互补的部分，当它们靠近时仍能产生光信号。因此，含有蛋白酶裂解位点的氨基酸序列可以插入到适当的位置，而不会造成荧光素酶活性的损失，除非修饰过的荧光素酶被裂解。
萤火虫荧光素酶也可以在其N或C端被修饰而不引起活性损失。例如，链霉亲和素被融合到萤火虫荧光素酶的N-或C-末端。这些融合蛋白通常在融合蛋白和荧光素酶之间含有更多灵活的氨基酸序列。因此，可以在融合蛋白和荧光素酶之间插入含有蛋白酶裂解位点的氨基酸序列。在一个实施例中，链霉亲和素-蛋白酶裂解位点-荧光素酶融合蛋白用于检测样本中的蛋白酶活性。在这种分析方法中，荧光素酶活性可以被生物素化的磁性颗粒从反应中去除，除非蛋白酶的裂解位点被样本中的蛋白酶活性所裂解。至少有一个阴性对照应与样本一起测定。
在一个实施例中，样本或阴性对照与链霉亲和蛋白酶裂解位点-荧光素酶融合蛋白孵育一段时间，然后与生物素化磁颗粒孵育。除去磁性颗粒后，通过加入含有本领域适当浓度的ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)、DTT(二硫苏糖醇)、CoA(辅酶A)、镁盐和荧光素的溶液来检测荧光素酶活性。与阴性对照相比，样本中光信号的增加表明样本中存在蛋白酶活性，而蛋白酶活性的增加又表明样本来自宿主的感染。
许多有效的和特异的病原蛋白酶抑制剂已被开发为治疗药物或候选药物。由于药物或候选药物通常对病原体的蛋白酶具有高度特异性，因此可用于蛋白酶的特异性检测或提高特异性。在使用特定蛋白酶抑制剂的试验中，试验分两步进行，其中一步包含一个或多个蛋白酶抑制剂。如果蛋白酶的活性被光信号的变化所抑制，那么蛋白酶就存在于样本中。
本发明利用化学发光或生物化学发光检测样本中的蛋白酶活性，只要被检测到的病原体中含有蛋白酶，该蛋白酶针对具有至少一个裂解位点的特定氨基酸序列具有特异性，并且这种特异性表明了该病原体，本发明基于光信号检测的强度变化，就能灵敏地检测出蛋白酶活性。本发明最好通过参考图1-7来理解，图1-7描述了本发明的各种代表性实施例。
实施例1
一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法,包括如下步骤：
S1.向可能含蛋白酶的待检样本和阴性对照样本中，加入带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A(或含有带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A的溶液)；未带有特定氨基酸序列的独立的完整的光信号激活分子B能产生光信号，且光信号激活分子B是一种蛋白质。其中，为便于理解，将带有特定氨基酸序列的光信号激活分子作为一个整体区别为A，其为被特定氨基酸序列修饰的光信号激活分子；将未带有特定氨基酸序列的独立的完整的光信号激活分子作为一个整体区别为B，后简称的光信号激活分子也是B。因此，A、B并没有指示或暗示有特定的含义，只是为了区分性描述而产生的代号，使本领域技术人员在阅读时能够区分两者的区别和对应。如同“第一蛋白”和“第二蛋白”中的“第一”和“第二”是为了区别性描述，而不含有顺序之分，没有明示或暗示相对重要性，没有特定的含义。
本实施例中，带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A是光信号激活分子B被特定氨基酸序列插入到该光信号激活分子B中间的产物；此带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A仍能产生光信号；当该特定氨基酸序列被蛋白酶切割，将光信号激活分子B切割为第一蛋白和第二蛋白两部分，此第一蛋白和第二蛋白不能产生光信号。
S2.孵育一段时间后，检测步骤(1)加入带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A后的待检样本和阴性对照样本的光信号强度。比较阴性对照样本，根据光信号强度的变化来快速判断是否含有蛋白酶活性，从而判断和筛选该待检样本是否感染了含有该蛋白酶的病原体。
需要说明的是，由于A与B是区别代号，因此，用其他的数字标号或英文标号也是可以的。例如光信号激活分子1与光信号激活分子B具有相同的含义。
因此，为便于更清楚地理解，结合参见图1和图2所示，我们把一种蛋白质称之为光信号激活分子1，它能产生光信号5。然后我们将特定的可以被蛋白酶切割的特定氨基酸序列4插入到该蛋白质1中间，特定氨基酸序列4的插入不会造成光信号激活分子1的光激活活性的显著损失。蛋白酶6可以特异性的切割位点4(也就是切割特定氨基酸序列4)，将光信号激活分子1切割为蛋白2和蛋白3两部分，蛋白2和蛋白3不再能产生光信号，因此我们可以通过来光信号强度变化来检测样本中的蛋白酶6。当待测样本不含蛋白酶活性,光信号的损失或减弱意味着待测样本中该蛋白酶活性存在，进一步象征存在病原体或病原体组织的存在，这表明本例样本来自于感染了病原体的宿主。
图1和图2描绘本实施例的检测原理的图。光信号激活分子的两个部分通过特定氨基酸序列连接在一起，该特定氨基酸序列可以被检测到的蛋白酶有效地裂解。该连接不会造成光信号激活分子的光信号的显著损失。与阴性对照相比，蛋白酶裂解特定氨基酸序列导致光信号的丢失或减少。光信号的丢失或减少表明蛋白酶的存在，从而判断病原体的感染。
实施例2
一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法,包括如下步骤：
S1.向可能含蛋白酶的待检样本及阴性对照样本中，加入含有特定氨基酸序列连接的光信号激活分子A(或含有它的溶液)；未带有特定氨基酸序列的独立的完整的光信号激活分子B能产生光信号，且光信号激活分子B是一种蛋白质。带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A是光信号激活分子B带有特定氨基酸序列连接到失活实体上的产物，此失活实体可以抑制该光信号激活分子B的活性，此时带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A不能产生光信号；当特定氨基酸序列被蛋白酶裂解，释放该光信号激活分子B，该光信号激活分子B导致光信号增加。
S2.孵育一段时间后，检测步骤(1)加入含有特定氨基酸序列连接的光信号激活分子A后的待检样本和阴性对照样本的光信号强度。比较阴性对照样本，根据光信号强度的变化来快速判断是否含有蛋白酶活性，从而判断和筛选该待检样本是否感染了含有该蛋白酶的病原体。
结合参见图3和图4所示，将光信号激活分子1中的特定氨基酸序列4连接到失活实体7上。此失活实体7可以抑制光信号激活分子1的活性，此时光信号激活分子1不能够产生光信号。当特定氨基酸序列4被蛋白酶6裂解，释放光信号激活分子1，存在的光信号激活分子1导致光信号5的增加；当检测不到或几乎检测不到光信号时，意味着样本中不含该蛋白酶。因此，在本例中，与阴性对照相比，被测样本中光信号的增加表明蛋白酶活性的存在，而蛋白酶活性的存在又表明了宿主被病原体感染。
图3和图4描绘本实施例的检测原理的图。光信号激活分子通过含有氨基酸序列连接一个失活实体，该氨基酸序列可被被检测的蛋白酶有效地裂解。该连接导致光信号激活分子活性的丧失。被检测到的蛋白酶对连接物的裂解导致光信号激活分子活性的恢复。因此，与阴性对照相比，光信号的增加表明蛋白酶的存在，从而表明病原体的感染。
实施例3
一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法,包括如下步骤：
S1.向可能含蛋白酶的待检样本及阴性对照样本中，加入带有特定氨基酸序列连接的光信号激活分子A(或含有它的溶液)；未带有特定氨基酸序列的独立的完整的光信号激活分子B能产生光信号，且是一种蛋白质；带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A是该光信号激活分子B带有特定氨基酸序列连接到可移除实体上的产物，此可移除实体不会导致光信号激活分子B的失活，此时带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A仍能产生光信号；当特定氨基酸序列未被蛋白酶裂解，带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A含有的光信号激活分子B与可移除实体的一起从反应中被物理移除；当特定氨基酸序列被蛋白酶裂解，只有可移除实体从反应中被物理移除，而保留了光信号激活分子B。
S2.孵育一段时间后，检测步骤(1)加入含有特定氨基酸序列连接的光信号激活分子A后的待检样本和阴性对照样本的光信号强度。比较阴性对照样本，根据光信号强度的变化来快速判断是否含有蛋白酶活性，从而判断和筛选该待检样本是否感染了含有该蛋白酶的病原体。
结合参见图5和图6所示，光信号激活分子1能够被特定氨基酸序列4连接到可移除实体8上。光信号激活分子1和可移动实体8之间的连接不会导致光信号激活分子1的失活。然而，光信号激活分子1可以与可移除实体8一起从反应中被物理移除，除非连接体4被样本中的蛋白酶6裂解。因此，在去除可去除实体8后，光信号5在反应中的存在表明蛋白酶6活性的存在，而蛋白酶6活性的存在则表明宿主受到病原体的感染。
图5和图6描绘本实施例的检测原理的图。光信号激活分子通过含有特定氨基酸序列连接可移除实体，该特定氨基酸序列可被检测的蛋白酶有效地裂解。该连接不会导致光信号激活分子活性的丧失。光信号激活分子可以从反应中去除，除非被检测到的蛋白酶将连接物裂解，从而导致在含有蛋白酶的反应中光信号被保留。因此，与阴性对照相比，光信号的保留表明蛋白酶的存在，从而表明病原体的感染。
实施例4
本实施例是在实施例1的基础上，本实施例的基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法，在步骤S1中还加入抑制剂，该抑制剂可特异性地抑制蛋白酶的活性，使该特定氨基酸序列不会被蛋白酶切割。
结合参见图1、图2和图7，增加引入了一个包含抑制剂9的附加反应，该抑制剂可特异性地抑制该蛋白酶6的活性。使用特异性抑制剂检测蛋白酶6可提高检测的特异性。
图1、图2和图7描绘本实施例的检测原理的图。在本实施例中，用于被检测蛋白酶的蛋白酶抑制剂用于检测。该试验是在两个反应中进行的，除了一个含有抑制剂外，其他反应都是与实施例1相同的。如果抑制剂的存在导致光信号发生可检测到的变化，那么样本中就含有被检测到的蛋白酶。信号变化可以是信号的增加或减少。图1、图2和图7描述了一种蛋白酶被抑制剂抑制导致信号增加的设计。
实施例5
有些病原体可分为多个种属，不同种属的感染临床表现不完全一样。比如，已知人类冠状病毒可分为7类。虽然这些冠状病毒都有类似的蛋白酶，但它们感染的细胞和器官不完全一样。新型冠状病毒COVID-19和SARS-COV的受体为ACE2。除呼吸道外，ACE2受体富含于心血管内壁细胞，肾脏，和小肠。因此，可以通过检测血样、尿样或者粪便中检测冠状病毒papain-like(PL)蛋白酶或3-chymotrypsin-like(3CL)蛋白酶活性，从而检测COVID-19和SARS-COV的感染。
需要说明的是，在本发明的描述中，“切割”和“裂解”可以做同一含义理解。将含有特定氨基酸序列连接的光信号激活分子A作为选择性的底物，该特定氨基酸序列能被特定的蛋白酶切割或裂解而不是其他。
相较于PCR法，本发明提供了一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法，该基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法更加灵敏，因此适用于通过检测表明病原体存在的活性蛋白酶来诊断病原体感染，从而该基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法可以在制备用于临床诊断病原体感染包括冠状病毒感染在内的试剂盒中应用。本发明解决了PCR法对样本质量的要求的难题，并且将检测时间缩短，操作简单，在一些实施案例中可以仅20分钟左右(20±1分钟)完成检测，即可得到结果，不需要专业的人员来进行操作。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法,其特征在于，包括如下步骤：
S1.向可能含蛋白酶的待检样本及一阴性对照中，加入带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A或含有它的溶液；未带有特定氨基酸序列的独立的完整的光信号激活分子B能产生光信号，且是一种蛋白质；该特定氨基酸序列具有至少一个可以被蛋白酶裂解的裂解位点，使用带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A采用以下方案中的任意一种：
方案一：带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A是光信号激活分子B被该特定氨基酸序列插入到该光信号激活分子B中间的产物；此带有特定氨基酸序列光信号激活分子A仍能产生光信号；当该特定氨基酸序列被蛋白酶切割，将光信号激活分子B切割为第一蛋白和第二蛋白两部分，此第一蛋白和第二蛋白不能产生光信号；
方案二：带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A是光信号激活分子B带有特定氨基酸序列连接到失活实体上的产物，此失活实体可以抑制该光信号激活分子B的活性，此带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A不能产生光信号；当特定氨基酸序列被蛋白酶裂解，释放该光信号激活分子B，该光信号激活分子B导致光信号增加；
方案三：带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A是光信号激活分子B带有特定氨基酸序列连接到可移除实体上的产物，此可移除实体不会导致光信号激活分子B的失活，此带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A仍能产生光信号；当特定氨基酸序列未被蛋白酶裂解，带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A含有的光信号激活分子B与可移除实体的一起从反应中被物理移除；当特定氨基酸序列被蛋白酶裂解，只有可移除实体从反应中被物理移除，而保留了光信号激活分子B；
S2.孵育一段时间后，进行光信号检测，检测步骤(1)包括检测带有特定氨基酸序列的光信号激活分子A的样本光信号强度，并同时检测阴性对照，该阴性对照同样孵育一段时间后，测量光信号强度，通过比较阴性对照的光信号强度，判断样本光信号强度变化。
2.根据权利要求1所述的基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法,其特征在于，在S1的方案一中，还加入抑制剂，该抑制剂可特异性地抑制蛋白酶的活性，使该特定氨基酸序列不会被蛋白酶切割。
3.根据权利要求1或2所述的基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法,其特征在于，所述光信号激活分子B为荧光素酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶。
4.根据权利要求3所述的基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法,其特征在于，所述荧光素酶是萤火虫荧光素酶、叩头虫荧光素酶或细菌荧光素酶。
5.根据权利要求1或2所述的基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法,其特征在于，所述待检蛋白酶为病原体编码的蛋白质中含有的蛋白酶。
6.根据权利要求5所述的基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法,其特征在于，所述病原体为人类免疫缺陷病毒、人类丙型肝炎病毒、冠状病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒或登革热病毒，该病原体编码的病毒蛋白酶可裂解所述特定氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法,其特征在于，当病原体为冠状病毒时，所述蛋白酶为PL蛋白酶和/或3CL蛋白酶；当病原体为人类免疫缺陷病毒时，所述蛋白酶为艾滋病毒逆转录病毒天门冬氨酰蛋白酶，当病原体为人类丙型肝炎病毒时，所述蛋白酶是NS3/NS4丝氨酸蛋白酶；当病原体为登革病毒时，所述蛋白酶是NS2/NS3蛋白酶,当病原体为西尼罗河病毒时，所述蛋白酶是NS2/NB3蛋白酶；当病原体为寨卡病毒时，病毒蛋白酶是NS2B/NS3蛋白酶。
8.根据权利要求7所述的基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法,其特征在于，所述冠状病毒为新型冠状病毒COVID-19或SARS-COV或其他受体为ACE2的冠状病毒；所述待测样本为尿样、血样、或粪便。
9.根据权利要求1-8任一所述的基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法,其特征在于，所述特定氨基酸序列是由至少三个氨基酸组成的氨基酸序列组成。
10.权利要求1至9任一所述的基于光信号检测的蛋白酶活性检测方法在制备用于临床诊断包括冠状病毒在内的病原体感染的试剂盒中的应用。
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