JP2022048030A - 標的核酸の検出方法およびキット - Google Patents

標的核酸の検出方法およびキット Download PDF

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Abstract

【課題】迅速で汎用性があり、さらに高い特異性を有する標的核酸の検出方法を提供する。【解決手段】標的核酸に、第一のガイドＲＮＡおよび第一のＣａｓタンパク質を接触させる第１の工程と、前記標的核酸に、第二のガイドＲＮＡおよび第二のＣａｓタンパク質を接触させる第２の工程と、前記標的核酸、前記第一のガイドＲＮＡ、前記第一のＣａｓタンパク質、前記第二のガイドＲＮＡおよび前記第二のＣａｓタンパク質を含む複合体を検出する第３の工程であって、前記複合体において、前記第一のガイドＲＮＡおよび前記第一のＣａｓタンパク質は前記第一の塩基配列に結合しており、前記第二のガイドＲＮＡおよび前記第二のＣａｓタンパク質は前記第二の塩基配列に結合している、第３の工程と、を有する標的核酸の検出方法。【選択図】図１

Description

本発明は、標的核酸の検出方法および標的核酸を検出するためのキットに関する。
核酸は、ウイルスを含むすべての生物の遺伝情報を担う物質であり、様々な分野で検出あるいは定量が行われている。特に、医療分野においては、ウイルスや細菌等の病原体の検出、および病変に関わる遺伝子検査に、核酸の検出や定量のための技術が使用されており、核酸を検出あるいは定量するための、より迅速かつ正確性の高い、汎用性のある技術に対する需要が高まっている。
近年、細菌および古細菌におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが発見され、特許文献１では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを利用した迅速かつ、広範な作業条件下で実施できる核酸の検出方法が提案されている。
特表２０１７－５３０６９５号公報
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいては、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質が標的核酸の一部の配列を認識して結合する。しかしガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、稀に、標的核酸の一部の配列と同じ、あるいはよく似た配列を有する別の核酸に結合することがある。つまり、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいては、いわゆるオフターゲットが稀に起こることが知られている。そのため、特許文献１に記載の技術においては、標的核酸の一部の配列と同じ、あるいはよく似た別の配列を有する核酸が存在する場合、オフターゲットにより偽陽性反応が生じる可能性があり、特異性に改善の余地があった。
そこで本発明は、迅速で汎用性があり、さらに高い特異性を有する標的核酸の検出方法および上記標的核酸の検出方法を実施するためのキットを提供することを目的とする。
本発明の一態様に係る標的核酸の検出方法は、
標的核酸に、第一のガイドＲＮＡおよび第一のＣａｓタンパク質を接触させる第１の工程であって、前記第一のガイドＲＮＡは、前記標的核酸が有する第一の塩基配列を認識する、第１の工程と、
前記標的核酸に、第二のガイドＲＮＡおよび第二のＣａｓタンパク質を接触させる第２の工程であって、前記第二のガイドＲＮＡは、前記標的核酸が有する第二の塩基配列を認識し、前記第二の塩基配列は、前記第一の塩基配列と異なる配列である、第２の工程と、
前記標的核酸、前記第一のガイドＲＮＡ、前記第一のＣａｓタンパク質、前記第二のガイドＲＮＡおよび前記第二のＣａｓタンパク質を含む複合体を検出する第３の工程であって、前記複合体において、前記第一のガイドＲＮＡおよび前記第一のＣａｓタンパク質は前記第一の塩基配列に結合しており、前記第二のガイドＲＮＡおよび前記第二のＣａｓタンパク質は前記第二の塩基配列に結合している、第３の工程と、を有する。
また、本発明の別の態様に係るキットは、
標的核酸を検出するためのキットであって、第一のガイドＲＮＡ、第一のＣａｓタンパク質、第二のガイドＲＮＡ、および第二のＣａｓタンパク質を有し、
前記第一のガイドＲＮＡは、前記標的核酸が有する第一の塩基配列を認識することが可能な配列を有し、前記第二のガイドＲＮＡは、前記標的核酸が有する第二の塩基配列を認識することが可能な配列を有し、前記第二の塩基配列は、前記第一の塩基配列とは異なる配列である。
本発明によれば、迅速で汎用性があり、さらに高い特異性を有する標的核酸の検出方法および上記標的核酸の検出方法を実施するためのキットを提供することができる。
本発明に係る標的核酸の検出方法で検出される複合体の模式図である。 Ｃａｓタンパク質を基板に固定化し、標識物質を用いることで発せられる信号により複合体を検出する例を示す模式図である。 ラテックス粒子の凝集を利用した標的核酸の検出を示す模式図である。 ラテラルフローアッセイを利用した標的核酸の検出を示す模式図である。 Ｃａｓタンパク質を基板に固定化して標的核酸を検出する方法の工程を示す模式図である。 標的核酸の濃度と、測定により得られた吸光度との関係を示す図である。
以下、本発明を実施するための形態について説明する。なお、本発明は請求項によって特定されるものであって、以下の形態および実施例に限定解釈されるものではない。たとえば、以下の形態および実施例の材料、組成条件、反応条件等は、当業者が理解可能な範囲で自由に変更して本発明を実現することができる。
本発明に係る標的核酸の検出方法は、
標的核酸に、第一のガイドＲＮＡおよび第一のＣａｓタンパク質を接触させる第１の工程であって、前記第一のガイドＲＮＡは、前記標的核酸が有する第一の塩基配列を認識する、第１の工程と、
前記標的核酸に、第二のガイドＲＮＡおよび第二のＣａｓタンパク質を接触させる第２の工程であって、前記第二のガイドＲＮＡは、前記標的核酸が有する第二の塩基配列を認識し、前記第二の塩基配列は、前記第一の塩基配列と異なる配列である、第２の工程と、
前記標的核酸、前記第一のガイドＲＮＡ、前記第一のＣａｓタンパク質、前記第二のガイドＲＮＡおよび前記第二のＣａｓタンパク質を含む複合体を検出する第３の工程であって、前記複合体において、前記第一のガイドＲＮＡおよび前記第一のＣａｓタンパク質は前記第一の塩基配列に結合しており、前記第二のガイドＲＮＡおよび前記第二のＣａｓタンパク質は前記第二の塩基配列に結合している、第３の工程と、を有する。
（標的核酸）
本発明における「標的核酸」とは、検出の対象となる核酸をいい、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等が挙げられる。また、「標的核酸配列」とは主にアデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）、から構成される標的核酸の塩基配列をいう。標的核酸は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってよい。
標的核酸は、例えば微生物由来のものであり、ある態様においては、標的核酸は病原菌を有する微生物由来のものである。ここで、微生物とは、例えば、ウイルス、細菌および真菌等がある。また、ウイルスとしては、ＤＮＡをゲノムとして有するＤＮＡウイルスおよびＲＮＡをゲノムとして有するＲＮＡウイルスが含まれる。
本発明における検体とは、標的核酸の存在の有無、量（濃度）、量（濃度）の基準値に対する検出された量（濃度）の割合等を検査する対象であり、標的核酸のみから構成されていても良いし、複数の核酸の混合物であっても良い。また、標的核酸の検体中における濃度によっては、等温増幅法または変温増幅法、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＲＴ－ＬＡＭＰ法およびＮＡＳＢＡ法等の公知の核酸増幅技術を予め適用して標的核酸を増幅した後、本発明に係る検出方法に供しても良い。また、血液、唾液および生物等の夾雑物が含まれるような検体の場合は、そのまま検出に供しても良いし、公知の技術や、市販の核酸抽出キットを用いて、精製した後、検出に供しても良い。
標的核酸の検体中の濃度は０ｎＭ以上１００ｎＭ以下の範囲内にあることが好ましい。
以下、図１を参照しつつ本発明に係る標的核酸の検出方法における各工程についてそれぞれ説明する。図１は、本発明に係る標的核酸の検出方法で検出される複合体の模式図である。
（第１の工程）
第１の工程では、標的核酸１０１に、第一のガイドＲＮＡ１０２および第一のＣａｓタンパク質１０３を接触させる。第一のガイドＲＮＡ１０２は標的核酸１０１が有する第一の塩基配列１０４を認識し、第一のガイドＲＮＡ１０２と第一のＣａｓタンパク質１０３とが標的核酸１０１に結合する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおける「ガイドＲＮＡ」という用語は、公知であり、標的核酸の検出のために利用され、標的核酸が有する一部の配列を認識する役割を担う。ガイドＲＮＡは、標的核酸が有する一部の配列を認識するための配列を含み、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおける標的核酸の検出の特異性を担う。ガイドＲＮＡは、後述のＣａｓタンパク質に合わせて設計する必要がある。ガイドＲＮＡの設計方法および作製方法は公知であり、設計ツールが提供されているほか、供給元から提供、販売がなされている。本発明における第一のガイドＲＮＡおよび後述の第二のガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡを用意する一般に公知である方法に準じて、用意することができる。ある様態では、第一のガイドＲＮＡおよび後述の第二のガイドＲＮＡはそれぞれ約２０～約１００塩基からなる。
また、本発明における第一のＣａｓタンパク質および後述の第二のＣａｓタンパク質は、いずれもＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおける公知の「Ｃａｓタンパク質」という用語に対応するものである。
本発明において、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡの特異性に依存して、標的核酸を切断することなく標的核酸の特定部位に結合することができるものである。例えば、Ｃａｓタンパク質はヌクレアーゼ活性が不活化されるように変更または修飾されていてもよい。そのような変更または修飾には、ヌクレアーゼ活性またはヌクレアーゼドメインを不活化するような１または複数のアミノ酸の変更が含まれる。また、そのような修飾としては、ヌクレアーゼ活性を示す１または複数のポリペプチド配列、すなわちヌクレアーゼドメインが、Ｃａｓタンパク質に存在しないようにするため、ヌクレアーゼドメインを除去することが含まれる。
ある様態では、標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、第一のＣａｓタンパク質および第二のＣａｓタンパク質は、それぞれヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）である。ｄＣａｓ９の作製方法は公知であり、また、多数の供給元から市販されている。
ｄＣａｓ９以外でも標的核酸を認識し、切断することなく、複合体を検出できるものであれば、第一のＣａｓタンパク質あるいは第二のＣａｓタンパク質として使用することができる。例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ１３ｂ（ｄＣａｓ１３ｂ）や、ｄＣａｓ９と蛍光タンパク質とＰＡＭｍｅｒなどで構成されるＲＣａｓ９を第一のＣａｓタンパク質あるいは第二のＣａｓタンパク質として使用することができる。
Ｃａｓタンパク質は標的核酸に対して選択性があることが知られており、その選択性と感度の観点から、適宜、最適なＣａｓタンパク質の種類を選択することが好ましい。例えば、二本鎖ＤＮＡを標的核酸として検出したい場合は、ｄＣａｓ９を使用することが可能である。ＲＮＡを検出したい場合は、ＲＣａｓ９やｄＣａｓ１３ｂなどＲＮＡを認識するＣａｓタンパク質を用いてもよいし、標的となるＲＮＡを逆転写することで得られるＤＮＡを標的核酸とし、ＤＮＡを認識するＣａｓタンパク質を用いて検出してもよい。
また、例えば、Ｃａｓ１３ｂを用いる場合、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．Ｐ５－１２５（ＰＳｐ）Ｃａｓ１３ｂを用いても構わないし、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ（Ｐｇｕ）Ｃａｓ１３ｂを用いても構わない。
第一の工程において、第一のガイドＲＮＡと、第一のＣａｓタンパク質とを至適な条件下で混合した後に、第一のガイドＲＮＡおよび第一のＣａｓタンパク質を標的核酸に接触させることが好ましい。また、第一のガイドＲＮＡと、第一のＣａｓタンパク質と、標的核酸とは、これらを同時に混合して、第一のガイドＲＮＡおよび第一のＣａｓタンパク質を標的核酸に接触させてもよい。
（第２の工程）
第２の工程では、標的核酸１０１に第二のガイドＲＮＡ１０５および第二のＣａｓタンパク質１０６を接触させる。第二のガイドＲＮＡ１０５は、標的核酸１０１が有する第二の塩基配列１０７を認識し、第二のガイドＲＮＡ１０５と第二のＣａｓタンパク質１０６とが標的核酸１０１に結合する。ここで、第二の塩基配列１０７は、第一の塩基配列１０４と異なる配列である。
第二の工程において、第二のガイドＲＮＡと、第二のＣａｓタンパク質とを至適な条件下で混合した後に、第二のガイドＲＮＡおよび第二のＣａｓタンパク質を標的核酸に接触させることが好ましい。また、第二のガイドＲＮＡと、第二のＣａｓタンパク質と、標的核酸とは、これらを同時に混合して、第二のガイドＲＮＡおよび第二のＣａｓタンパク質を標的核酸に接触させてもよい。
標的核酸が二本鎖である場合、第一の塩基配列と第二の塩基配列とは同じ鎖の上にあってもよく、また、互いに異なる鎖の上にあってもよい。
ガイドＲＮＡはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接する配列部分に結合するため、第一の塩基配列あるいは第二の塩基配列を、ＰＡＭ配列に隣接する部位とすることが好ましい。なお、ＰＡＭ配列は細菌が有するＣａｓタンパク質の種類それぞれに特有である。例えば、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９タンパク質（ｓｐＣａｓ９）の場合は、ＰＡＭ配列は、３塩基（５’－ＮＧＧ－３’）であり、そのＰＡＭ配列に隣接する配列の相補鎖にガイドＲＮＡが結合する。また、ＵＣ Ｂｅｒｋｅｌｅｙの Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ａ. ＤｏｕｄｎａらがＮａｔｕｒｅ誌で発表した、ＰＡＭｍｅｒを利用する場合は、第一の塩基配列あるいは第二の塩基配列を、ＰＡＭ配列に隣接する部位としなくてもよい。
第一の塩基配列と第二の塩基配列とは、それぞれに結合するＣａｓタンパク質間の立体障害をさけるため、一定以上離れていることが好ましい。具体的には、標的核酸は、第一の塩基配列と、第二の塩基配列との間に２０以上の塩基を有することが好ましい。また、前記標的核酸は、前記第一の塩基配列と、前記第二の塩基配列との間に１００以上の塩基を有することがより好ましい。また、前記標的核酸は、前記第一の塩基配列と、前記第二の塩基配列との間に２００以上の塩基を有することがさらに好ましい。また、前記標的核酸は、前記第一の塩基配列と、前記第二の塩基配列との間に５００以下の塩基を有することが好ましい。
先に述べたように、本発明においては、標的核酸が２本鎖であり、第一の塩基配列と第二の塩基配列とがそれぞれ異なる鎖上にある態様も含まれる。この場合、標的核酸が、第一の塩基配列と第二の塩基配列との間に２０、１００あるいは２００以上の塩基を有する、とは、それぞれ、第一の塩基配列と第二の塩基配列との間に２０、１００あるいは２００以上の塩基対を有することを意味する。
第一の塩基配列および第二の塩基配列としては、例えば、標的核酸がウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡである場合、遺伝子変異の少ない保存領域から一部の配列を選択して定めることができる。また、多型が存在するウイルスについて、その型を見分けたい場合においては、第一の塩基配列および第二の塩基配列のいずれか少なくとも一方を、検出対象とする型に特異的な配列を含む領域から一部の配列を選択して定めることが好ましい。
また、例えば、標的核酸が病原性細菌由来のＤＮＡである場合、疾病に関与する遺伝子（病原遺伝子）を含む領域から一部の配列を選択することで、第一の塩基配列あるいは第二の塩基配列としてもよい。
第１の工程と第２の工程とは、図１に示す複合体１０８が形成される限りにおいて、第１の工程と第２の工程とを順次実施してもよいし、第１の工程と第２の工程とを同時に実施してもよい。
また、例えば、第１の工程で、あらかじめ第一のＣａｓタンパク質と第一のガイドＲＮＡとを接触させた後、それらの複合体を基板に固定化し、そこへ標的核酸を加えたのち、第二の工程を実施してもよい。あるいは、第一のＣａｓタンパク質を基板に固定化した後、第一のガイドＲＮＡと標的核酸とを基板に固定化した第一のＣａｓタンパク質に接触させ、その後、第２の工程を実施してもよい。
また、第１の工程の後に、第一のＣａｓタンパク質と第一のガイドＲＮＡとが標的核酸に結合して形成された複合体を基板へ固定化し、その後第２の工程を実施してもよい。なお、Ｃａｓタンパク質の固定化は、これらに限定されるものではないが、物理吸着により行ってもよいし、Ｃａｓタンパク質が有する官能基を利用して共有結合を形成することで行ってもよい。あるいは、Ｃａｓタンパク質に対し、例えば、メルカプト基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、およびビオチン等を含む修飾を行うことで官能基を付与し、付与した官能基を利用して基板等へ固定化してもよい。
（第３の工程）
第３の工程では、標的核酸１０１、第一のガイドＲＮＡ１０２、第一のＣａｓタンパク質１０３、第二のガイドＲＮＡ１０５および第二のＣａｓタンパク質１０６を含む複合体１０８を検出することで、標的核酸を検出する。複合体１０８において、第一のガイドＲＮＡ１０２および第一のＣａｓタンパク質１０３は第一の塩基配列１０４に結合しており、第二のガイドＲＮＡ１０５および第二のＣａｓタンパク質１０６は第二の塩基配列１０７に結合している。
本発明においては、標的核酸が有する第一の塩基配列と第二の塩基配列との２か所を、第一のガイドＲＮＡと第二のガイドＲＮＡとでそれぞれ独立して認識させて検出を行う。そのため、第一の塩基配列あるいは第二の塩基配列のいずれか一方のみを認識させて検出する場合に比べ、特異性高く標的核酸を検出することができる。
すなわち、検出において、第一のガイドＲＮＡおよび第一のＣａｓタンパク質の組、または、第二のガイドＲＮＡおよび第二のＣａｓタンパク質の組のいずれか一方が、標的核酸以外の核酸に非特異的に結合して非特異凝集体を形成することが考えられる。この非特異凝集体の形成は、いわゆるＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓシステムにおけるオフターゲットと呼ばれる現象に起因するものである。しかし、本発明において、標的核酸の検出対象となる２か所の配列の両方において、同時にオフターゲットが生じる可能性は非常に低く、すなわち、誤検出の可能性も非常に低くなる。
ある様態では、第３の工程における複合体の検出は、構造や物性の変化に基づいて行われる。
例えば、ナノポア法を利用する場合は核酸に結合した複合体がナノポアセンサー中を移動している最中、または、ナノポアもしくはナノギャップセンサーに近接した際の電流の変化をみることで検出することができる。本発明において検出対象となる複合体がナノポアに侵入すると、ポア中のイオンの流れを乱すため、イオン電流が低下する。標的核酸にガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質が結合している場合、その結合位置がポアに侵入すると、さらにイオンの流れが低下し、イオン電流が低下する。
ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質の結合が１か所のみの場合は、そのイオン電流低下が１回であるのに対し、結合が２か所の場合、イオン電流の低下が２回生じる。すなわち、例えば、検出において、第一のガイドＲＮＡおよび第一のＣａｓタンパク質の組、または、第二のガイドＲＮＡおよび第二のＣａｓタンパク質の組のいずれか一方が、標的核酸以外の核酸に非特異的に結合して非特異凝集体を形成した場合を考える。この時、標的核酸を検出した場合は、イオン電流の低下が２回であるのに対し、非特異凝集体を検出した場合はイオン電流低下が１回である。これにより検出対象とする複合体を、非特異凝集体と区別して検出することが可能となる。
また、複合体の検出には、核酸とタンパク質とが互いに結合した物質を検出するための公知の手法を用いることができる。この手法の例としては、電子顕微鏡、光学顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡、原子間力顕微鏡、カンチレバー検出法、水晶発振子検出法、電界効果トランジスター、表面プラズモン共鳴スペクトル法、偏光解消法および凝集法等が挙げられる。これらの手法においては、検出対象とする複合体と非特異凝集体とではサイズや分子量が異なることを利用し、両者を区別して検出することができる。
ある態様では、第二のガイドＲＮＡおよび第二のＣａｓタンパク質のいずれか一方は第二の標識物質と結合しており、第３の工程において、複合体は、第二の標識物質を用いることで発せられる第二の信号により検出される。
また、ある態様では、第二のガイドＲＮＡおよび第二のＣａｓタンパク質のいずれか一方は第二の標識物質と結合しており、さらに第一のガイドＲＮＡおよび第一のＣａｓタンパク質のいずれか一方は第一の標識物質と結合している。第一の標識物質は、第二の標識物質と異なる物質であり、第３の工程において、複合体は、第一の標識物質を用いることで発せられる第一の信号による検出と、第二の信号による検出との２通りにより検出される。例えば、第一のガイドＲＮＡにシアン色蛍光タンパク質ＣＦＰを結合させ、第二のガイドＲＮＡに黄色蛍光タンパク質ＹＦＰを結合させるというようにＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用してもよい。第一の信号と、第二の信号との２つの信号を利用して複合体を検出することで、検出対象とする複合体を非特異凝集体と区別して検出することが可能となる。
また、検出のための信号強度を高くする等の目的で、第一の標識物質と第二の標識物質とを互いに同じ物質としてもよい。
標識物質と結合しているガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質としては、あらかじめタグが修飾されているような市販のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を用いてもよいし、標識物質を結合させたガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を作製して用いてもよい。
第一の信号および第二の信号は、放射性物質、酵素、捕捉分子、蛍光物質、発光物質、金属粒子、タンパク質―タンパク質結合対、および、タンパク質―抗体結合対、で構成される群から選択される少なくとも１つを用いることで発せられるものであることが好ましい。
なお、本明細書において、抗体とは、任意のクラスの抗体分子またはその断片、例えば、Ｆａｂ領域断片を含んで指すものとする。
蛍光物質としては、次にあげる物質を用いることが可能であるがこれらに限定されない。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、シアニン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ６４７等。
また、発光物質としては、ルシフェラーゼ（例えば、細菌、ホタルおよびコメツキムシ由来等）、ルシフェリンおよびエクオリン等が含まれるが、これらに限定されない。
信号の発信に用いられる酵素の例としては、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼ等が含まれるが、これらに限定されない。酵素を用いた場合、視覚的に検出可能な信号を得ることが可能となる。
放射性物質としては、例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈ等が含まれる。
タンパク質―タンパク質結合対としては、ビオチン―酵素標識アビジン等を含み、タンパク質―抗体結合対としては、ビオチン―蛍光標識抗ビオチン抗体等を含む。
上記で例示した信号を発信するための標識物質を利用したシステムに必要な物質は、種々の供給元から市販されており、公知の手法を用いて、ガイドＲＮＡまたはＣａｓタンパク質に標識物質を付与する等して利用することが可能である。例えば、市販のＣａｓタンパク質には既にアフィニティータグが結合されているものもあり、そのタグを利用し、標識物質を付与することができる。例えば、ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社より提供されているｄＣａｓ９はＨｉｓタグを含んでおり、このＨｉｓタグを利用して、ｄＣａｓ９に蛍光物質やビオチンを付与することができる。
第一の信号および第二の信号の検出方法としては、蛍光検出法、エレクトロルミナンス検出法、化学発光検出法、生物発光検出法、および比色検出法等を用いることができる。
ある様態では、第３の工程は、第二の信号に基づいて標的核酸の濃度に関する情報を取得する工程を含む。また、標的核酸の濃度に関する情報は、第一の信号と第二の信号との２つの信号に基づいて取得してもよい。標的核酸の濃度に関する情報は、標的核酸の有無、標的核酸の濃度の値、および標的核酸の濃度の基準値に対する標的核酸の濃度の割合、で構成される群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。
ある態様では、第一のＣａｓタンパク質が基板に固定化されており、固相表面上で複合体が検出される。また、ある態様では、第一のＣａｓタンパク質に加えて、さらに第二のＣａｓタンパク質が基板に固定化されており、固相表面上で複合体が検出される。
基板としては、Ｃａｓタンパク質あるいはＣａｓタンパク質を含む複合体を好適に担持することができれば、形状、材質等限定されるものではなく、樹脂、ガラス、シリコン等の無機材料、金属、金属酸化物等の一般的な基板を用いることができる。
検出の際に、光の透過を利用する場合は、基板は、入射光および検出を行う光の波長に対して、光学的に透明な、ガラス基板、石英基板、ポリカーボネートやポリスチレン等の樹脂基板やＩＴＯ基板等を用いることが好ましい。
また、Ｃａｓタンパク質を共有結合で固定するために、基板表面にアミノ基やカルボキシル基といった官能基が修飾されていてもよい。また、基板の形状は、プレート等平らなものであってもよいし、磁性ビーズや金微粒子やポリスチレンビーズ等球状のものでもよい。
第一のＣａｓタンパク質を基板に固定化し、標識物質を用いることで発せられる信号により複合体を検出する例を図２に示す。
ある態様では、図２（ａ）に示すように、第一のＣａｓタンパク質１０３は基板２０１に固定化されており、これにより基板２０１上に固定化された複合体は、第二のＣａｓタンパク質１０６に結合された第二の標識物質２０２を標識として検出される。ここで、第二の標識物質２０２は、図２（ｂ）に示すように、第二のガイドＲＮＡ１０５に結合されていてもよい。また、図２（ｃ）に示すように、第二の標識物質２０２を、さらに酵素等の触媒２０４で修飾し、検出のための信号を発信する信号発信物質２０５を触媒２０４に作用させることで検出を行ってもよい。
また、ある態様では、図２（ｄ）に示すように、基板２０１に固定化された第一のＣａｓタンパク質１０３は、さらに第一の標識物質２０３と結合しており、また、第二のＣａｓタンパク質１０６は第二の標識物質２０２と結合している。検出においては、第一の標識物質２０３を標識とした検出と第二の標識物質２０２を標識とした検出との２通りにより検出される。
ポリスチレンビーズ等のラテックス粒子に第一のＣａｓタンパク質と第二のＣａｓタンパク質とを固定化する場合においては、ラテックス粒子の凝集を利用して目視により複合体を検出し、標的核酸の有無を確認することができる。また、凝集法による複合体の検出においては、吸光度の変化を測定することで標的核酸の有無の確認や濃度の測定することも可能である。また、例えば、金微粒子に第一のＣａｓタンパク質を固定化する等により、ラテラルフローアッセイを利用して複合体を検出することができる。
（標的核酸を検出するためのキット）
本発明に係るキットは、標的核酸を検出するためのキットであって、第一のガイドＲＮＡ、第一のＣａｓタンパク質、第二のガイドＲＮＡ、および第二のＣａｓタンパク質を有し、第一のガイドＲＮＡは、標的核酸が有する第一の塩基配列を認識することが可能な配列を有し、第二のガイドＲＮＡは、標的核酸が有する第二の塩基配列を認識することが可能な配列を有し、第二の塩基配列は、第一の塩基配列とは異なる配列である。
ある態様においては、キットは、ラテラルフローストリップをさらに有する。
また、ある態様においては、キットは、ラテックス粒子をさらに有する。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型の検出に、ラテックス粒子の凝集を利用する例を記載する。
ＨＰＶは、パピローマウイルス科に属するウイルスの１つであり、子宮頸がんのほとんどが、ＨＰＶの感染が原因であることが知られている。ＨＰＶには１５０種類以上の型があり、その中で、子宮頸がんの原因と考えられているのは、一部の型であり、子宮頸がんの約６５％は、ＨＰＶ１６型およびＨＰＶ１８型が原因である。ＨＰＶ１６型とＨＰＶ１８型とは、いずれも高危険型であるが、がん化のリスクの程度や、なりやすいがんの種類が互いに異なる。そのため、ＨＰＶ１６型とＨＰＶ１８型とを区別することは重要であるが、ＨＰＶ１６型およびＨＰＶ１８型は、それらが有するＤＮＡの塩基配列の相同性が高く、ＤＮＡの塩基配列を基に区別して検出することが難しいとされている。
本実施例では、第一の塩基配列および第二の塩基配列を、ＨＰＶ１６が有するＥ６遺伝子のアンチセンス鎖の配列から選択して設計した。Ｅ６遺伝子のセンス鎖、Ｅ６遺伝子のアンチセンス鎖、第一の塩基配列、第二の塩基配列、第一のガイドＲＮＡおよび第二のガイドＲＮＡの配列をそれぞれ以下に示す。ここで、第一のガイドＲＮＡの特異性はやや低く、標的核酸となるＨＰＶ１６のＤＮＡだけでなく、ＨＰＶ１８のＤＮＡに対して非特異的に結合する可能性がある。一方で、第二のガイドＲＮＡの特異性は高く、標的核酸となるＨＰＶ１６のＤＮＡには結合するが、ＨＰＶ１８のＤＮＡには結合しない。なお、標的核酸となるＨＰＶ１６のＤＮＡは２本鎖であり、第一のＣａｓタンパク質および第二のＣａｓタンパク質としてはそれぞれｄＣａｓ９を用いる。
ＨＰＶ１６のＥ６遺伝子のセンス鎖（配列番号１）
ATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTATGTGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAACTGTCAAAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA
ＨＰＶ１６のＥ６遺伝子のアンチセンス鎖（配列番号２）
TTACAGCTGGGTTTCTCTACGTGTTCTTGATGATCTGCAACAAGACATACATCGACCGGTCCACCGACCCCTTATATTATGGAATCTTTGCTTTTTGTCCAGATGTCTTTGCTTTTCTTCAGGACACAGTGGCTTTTGACAGTTAATACACCTAATTAACAAATCACACAACGGTTTGTTGTATTGCTGTTCTAATGTTGTTCCATACAAACTATAACAATAATGTCTATACTCACTAATTTTAGAATAAAACTTTAAACATTTATCACATACAGCATATGGATTCCCATCTCTATATACTATGCATAAATCCCGAAAAGCAAAGTCATATACCTCACGTCGCAGTAACTGTTGCTTGCAGTACACACATTCTAATATTATATCATGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGTGCATAACTGTGGTAACTTTCTGGGTCGCTCCTGTGGGTCCTGAAACATTGCAGTTCTCTTTTGGTGCAT
ＨＰＶ１６型を検出する際の標的となる第一の塩基配列および第二の塩基配列
第一の塩基配列（配列番号３）TGCTTTTCTTCAGGACACAG
第二の塩基配列（配列番号４）TGCAGCTCTGTGCATAACTG
ＨＰＶ１６型の第一の塩基配列を検出するための第一のガイドＲＮＡ（配列番号５）
UGCUUUUCUUCAGGACACAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
ＨＰＶ１６型の第二の塩基配列を検出するための第二のガイドＲＮＡ（配列番号６）
UGCAGCUCUGUGCAUAACUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
図３（ａ）は、ラテックス粒子の凝集を利用した標的核酸の検出を示す模式図である。
まず、事前準備として、第一のガイドＲＮＡ３０２－第一のＣａｓタンパク質３０３複合体、第二のガイドＲＮＡ３０４－第二のＣａｓタンパク質３０５複合体をあらかじめ形成させる。続いて、それらをラテックス粒子３０１に固定化し、標的核酸検出用のラテックス粒子を調製する。なお、ガイドＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体は、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質とを混合し、３７℃で３０分反応させることで形成させることができる。なお、ガイドＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体をラテックス粒子へ固定化する方法としては、例えば、物理吸着法、化学結合法等の、タンパク質をラテックス粒子に固定化するための公知の方法を用いることができる。
ここでは、物理吸着法を用いてラテックス粒子３０１として用いるポリスチレン粒子に、ガイドＲＮＡ－Ｃａｓタンパク質複合体を固定化する方法を示す。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に懸濁したポリスチレン粒子に第一のガイドＲＮＡ－第一のＣａｓタンパク質複合体および第二のガイドＲＮＡ－第二のＣａｓタンパク質複合体を加え、室温で１時間攪拌する。その後、遠心分離を行うことで粒子の洗浄を行い、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングをし、さらに洗浄後、ＰＢＳを用いて粒子濃度０．５質量％に調整した。これにより、第一のガイドＲＮＡ－第一のＣａｓタンパク質複合体および第二のガイドＲＮＡ－第二のＣａｓタンパク質複合体がポリスチレン粒子に物理吸着した、検出用ラテックス粒子を調製する。なお、本実施例ではブロッキング剤としてＢＳＡを用いたが、他のブロッキング剤を用いても構わない。
検出では、例えば、調製した検出用ラテックス粒子を分散した溶液に標的核酸３０６を含む検体を混合し、図３（ａ）に示すように検出用ラテックス粒子と標的核酸３０６とを反応させて凝集を誘起させる。検体としては、あらかじめ、市販のキットを用い、子宮頚管粘液等の検体から二本鎖ＤＮＡを抽出することが好ましい。
誘起された凝集は、次のようにして吸光度を測定することで検出することが可能である。すなわち、まず予め、図３（ｂ）に示すように、検体を混合する前の、検出用ラテックス粒子を分散した溶液について吸光度を測定しておく。このとき、検出用ラテックス粒子はほぼ均一に分散しているため、特定の波長の光の入射光３０９の強度と、透過光３１０の強度との差は小さい。続いて、図３（ｃ）に示すように、検体を混合した後の、検出用ラテックス粒子を分散した溶液について吸光度を測定する。凝集が誘起された場合、誘起された凝集体により光の透過が妨げられ、入射光３０９の強度と、透過光３１０の強度との差が大きくなる。検体を混合する前後において測定した吸光度の差から、凝集の程度を評価することができる。検体が標的核酸を多く含むほど、凝集の程度は大きくなることから、凝集の程度を評価することで、検体中に含まれる標的核酸の量を評価することが可能である。なお、吸光度を測定する代わりに、目視にて凝集の有無を判断してもよい。すなわち、凝集が誘起されたことを確認することで、検体中の標的核酸の存在を検出することができる。
ここでは、吸光度の測定により検出する例について記載する。
まず、吸光度を測定するためのキュベット内に、反応緩衝液としてＰＢＳ２３０μＬおよび上記で調製した検出用ラテックス粒子を分散した溶液４０μＬを分注する。続いて、各溶液を分注したキュベットについて、波長９５０ｎｍの吸光度を測定する。その後、キュベットにさらに標的核酸を含む検体溶液３０μＬを添加し、再度波長９５０ｎｍの吸光度を測定する。検体を添加する前後における吸光度の変化を求め、凝集の程度を評価する。
検体中に標的核酸が存在する場合、図３（ａ）に示すように、標的核酸３０６の第一の塩基配列３０７に、第一のガイドＲＮＡ３０２－第一のＣａｓタンパク質３０３複合体が結合する。また、第二の塩基配列３０８に、第二のガイドＲＮＡ３０４－第二のＣａｓタンパク質３０５複合体が結合する。これによりラテックス粒子の凝集が誘起され、それに伴って吸光度が変化するため、ＨＰＶ１６の検出が可能となる。
（実施例２）
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型の検出に、ラテラルフローアッセイを利用する例を記載する。本実施例で用いる第一のガイドＲＮＡ、第一のＣａｓタンパク質、第二のガイドＲＮＡ、第二のＣａｓタンパク質および標的核酸を含む検体は、いずれも実施例１で用いたものと同じものである。
図４はラテラルフローアッセイを利用した標的核酸の検出を示す模式図である。
ラテラルフローアッセイに用いるラテラルフローストリップ４０１は、サンプルパッド４０２、コンジュゲーションパッド４０３および反応メンブレン４０４を含む。なお、予め、標的核酸を含む検体を第二のガイドＲＮＡと第二のＣａｓタンパク質を含む試薬と反応させる場合には、コンジュゲーションパッド４０３はなくてもよい。また、反応メンブレン４０４を通過した後の液を回収するための廃液リザーバー等をさらに有していても構わない。
コンジュゲーションパッド４０３には予め第二のガイドＲＮＡ３０４および第二のＣａｓタンパク質３０５が添加されている。また、反応メンブレン４０４は、互いに一定の距離を置いて隔てられたテストライン４０４ａと、コントロールライン４０４ｂとからなる。テストライン４０４ａには、予め第一のガイドＲＮＡ３０２と第一のＣａｓタンパク質３０３との複合体が固定化されている。また、コントロールライン４０４ｂには、予め第二のガイドＲＮＡ３０４と第二のＣａｓタンパク質３０５複合体を補足するための物質として、抗ｄＣａｓ９抗体４０７が固定化されている。
図４（ａ）に示すように、まず、標的核酸３０６を含む検体４０５をラテラルフローストリップ４０１上のサンプルパッド４０２に加える。検体４０５は毛細管現象により、サンプルパッド４０２からコンジュゲーションパッド４０３に移動する。そこで、第二のガイドＲＮＡ３０４および第二のＣａｓタンパク質３０５が標的核酸３０６の第二の塩基配列に結合する。
第二のガイドＲＮＡ３０４と第二のＣａｓタンパク質３０５とはあらかじめ反応させ、複合体となっていることが好ましい。また、第二のＣａｓタンパク質３０５には、標識物質として金ナノ粒子４０６が固定化されている。
なお、Ｃａｓタンパク質への金ナノ粒子の固定化方法は、公知の技術を用いることが可能である。例えば、受動的な吸着法や共有結合法等がある。例えば、共有結合法を利用する場合、カルボキシ基修飾金ナノ粒子を用い、カルボジイミド架橋剤（ＥＤＣ）を用いることで金ナノ粒子表面の末端カルボキシ基にＣａｓタンパク質を結合させることが可能である。なお、ＥＤＣを加える際、スルホ―ＮＨＳを添加することで安定なアミド結合を形成することも可能である。
標的核酸３０６を含む検体４０５は、図４（ｂ）に示すように反応メンブレン４０４に向かって移動する。その後、標的核酸３０６と結合した第二のガイドＲＮＡ３０４および第二のＣａｓタンパク質３０５は、図４（ｃ）に示すようにテストライン４０４ａで捕捉される。
具体的には、テストライン４０４ａにおいて、第一のガイドＲＮＡ３０２と第一のＣａｓタンパク質３０３との複合体が標的核酸３０６の第一の塩基配列と結合する。これにより、テストライン４０４ａ上で、標的核酸３０６、第一のガイドＲＮＡ３０２、第一のＣａｓタンパク質３０３、第二のガイドＲＮＡ３０４および第二のＣａｓタンパク質３０５を含む複合体が形成される。
未反応の第二のガイドＲＮＡ３０４および第二のＣａｓタンパク質３０５は、テストライン４０４ａを通過し、コントロールライン４０４ｂまで流れ、そこで図４（ｃ）に示すように抗ｄＣａｓ９抗体４０７と結合し、捕捉される。
テストライン４０４ａに捕捉された複合体、および未反応の第二のガイドＲＮＡ３０４および第二のＣａｓタンパク質３０５の検出は、それぞれ第二のＣａｓタンパク質に結合された金ナノ粒子４０６を利用して実施する。本実施例では、標識物質として金ナノ粒子を用いる例を記載したが、銀ナノ粒子、ビオチン、フルオレセイン等を標識物質として使用してもよい。なお、標識物質の検出方法については、標識物質の種類に合わせ、適宜選択すればよい。
検体４０５が標的核酸３０６を含む場合においては、テストライン４０４ａとコントロールライン４０４ｂとの２本の線が検出される。一方で、検体４０５が標的核酸３０６を含まず、標的核酸と相同性が高いが異なる配列を有する、ＨＰＶ１８のＤＮＡを含む場合は、次のようになる。
すなわち、第二のガイドＲＮＡ３０４は、先に述べたように特異性が高いため、まずサンプルパッド４０２において、第二のガイドＲＮＡ３０４および第二のＣａｓタンパク質３０５はＨＰＶ１８のＤＮＡに結合しない。
その後、検体４０５は反応メンブレン４０４に向かって移動するが、基本的には第一のガイドＲＮＡ３０２および第一のＣａｓタンパク質３０３は、ＨＰＶ１８のＤＮＡと結合しない。そのため、第二のガイドＲＮＡ３０４と第二のＣａｓタンパク質３０５とからなる複合体およびＨＰＶ１８のＤＮＡは、いずれもテストライン４０４ａを通過する。
続いて、第二のＣａｓタンパク質３０５はコントロールライン４０４ｂに固定化された抗ｄＣａｓ９抗体４０７と結合する。そのため、第二のガイドＲＮＡ３０４と第二のＣａｓタンパク質３０５とからなる複合体がコントロールライン４０４ｂで捕捉される。その結果、テストライン４０４ａの線は検出されず、コントロールライン４０４ｂの１本の線のみが検出される。
なお、先に述べたように、第一のガイドＲＮＡ３０２の特異性はやや低いため、テストライン４０４ａにおいて、ＨＰＶ１８のＤＮＡは、第一のガイドＲＮＡ３０２および第一のＣａｓタンパク質３０３と非特異的に結合する可能性がある。すなわちＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓシステムにおけるオフターゲットが生じる可能性がある。
しかしこの場合においても、先に述べたように、第二のガイドＲＮＡ３０４の特異性は高いため、ＨＰＶ１８の核酸は、第二のガイドＲＮＡと第二のＣａｓタンパク質が結合していない。つまり、テストライン４０４ａに固定化されているＨＰＶ１８のＤＮＡを含む複合体は、金ナノ粒子などの標識物質を有していない状態である。そのため、第一のガイドＲＮＡ３０２と第一のＣａｓタンパク質３０３がＨＰＶ１８のＤＮＡを誤検知した場合においても、テストライン４０４ａの線が検出されることはない。以上のように、本発明に係る標的核酸の検出方法を用いることで、ＨＰＶ１６をＨＰＶ１８と区別して検出することが可能となる。
（実施例３）
本実施例では、第一のＣａｓタンパク質を基板に固定化し、標的核酸を検出する例を示す。本実施例に係る検出方法の工程を図５に示す。
標的核酸として二本鎖ＤＮＡを、第一のＣａｓタンパク質および第二のＣａｓタンパク質としては、ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社のｄＣａｓ９を用いた。
標的核酸として用いた二本鎖ＤＮＡの、一方の鎖の配列、第一の塩基配列および第二の塩基配列を以下に示す。なお、第一の塩基配列および第二の塩基配列は、いずれも以下に示した鎖にある配列である。第一のガイドＲＮＡおよび第二のガイドＲＮＡの配列についても以下に示す。
標的核酸として用いた二本鎖ＤＮＡの一方の鎖の配列（配列番号７）
TCGAAGGGTGATTGGATCGGAGATAGGATGGGTCAATCGTAGGGACAATCGAAGCCAGAATGCAAGGGTCAATGGTACGCAGAATGGATGGCACTTAGCTAGCCAGTTAGGATCCGACTATCCAAGCGTGTATCGTACGGTGTATGCTTCGGAGTAACGATCGCACTAAGCATGGCTCAATCCTAGGCTGATAGGTTCGCACATAGCATGCCACATACGATCCGTGATTGCTAGCGTGATTCGTACCGAGAACTCACGCCTTATGACTGCCCTTATGTCACCGCTTATGTCTCCCGATATCACACCCGTTATCTCAGCCCTAATCTCTGCGGTTTAGTCTGGCCTTAATCCATGCCTCATAGCTACCCTCATACCATCGCTCATACCTTCCGACATTGCATCCGTCATTCCAACCCTGATTCCTACGGTCTAACCTAGCCTCTATCCTACCCAGTTAGGTTGCCTCTTAGCATCCCTGTTACGTACGCTCTTACCATGCGTCTTACCTTGGCACTATCGATGGG
第一の塩基配列（配列番号８）AGGGTCAATGGTACGCAGAA
第二の塩基配列（配列番号９）CATTCCAACCCTGATTCCTA
第一のガイドＲＮＡ（配列番号１０）
AGGGUCAAUGGUACGCAGAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
第二のガイドＲＮＡ（配列番号１１）
CAUUCCAACCCUGAUUCCUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
本実施例における標的核酸の検出の流れを図５に沿って説明する。
まず、図５（ａ）に示すように、第一のガイドＲＮＡ５０２と第一のＣａｓタンパク質５０３とからなる複合体を基板５０１に固定化した。具体的には、第一のガイドＲＮＡ５０２を２５μＭの濃度で含む溶液と、第一のＣａｓタンパク質５０３を２０μＭの濃度で含む溶液とを準備し、これらを１：１の体積比で混合した。その後、３７℃で３０分反応させることで、あらかじめ、第一のガイドＲＮＡ５０２－第一のＣａｓタンパク質５０３複合体を形成させた。
第一のＣａｓタンパク質５０３の基板５０１への固定化には物理吸着法を用いた。基板５０１としてはＩｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢプレートを用いた。第一のＣａｓタンパク質５０３の濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように第一のガイドＲＮＡ５０２－第一のＣａｓタンパク質５０３複合体をＰＢＳで希釈し、得られた溶液を基板５０１に１００μＬ加えた。その後、基板５０１を４℃で一晩おくことで、第一のガイドＲＮＡ５０２と第一のＣａｓタンパク質５０３とを基板５０１に固定化した。
固定化の後、基板５０１上の液を除去し、続いて、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以降、ＰＢＳＴと示す）を用いて基板５０１を洗浄した。その後、ＢＳＡを基板５０１上に加えることでブロッキングを行い、さらにＰＢＳＴで洗浄した。
続いて、図５（ｂ）に示すように、第一の塩基配列５０５および第二の塩基配列５０６を有する標的核酸５０４を加え、第一の塩基配列５０５に第一のガイドＲＮＡ５０２と第一のＣａｓタンパク質５０３とを結合させた。なお、標的核酸５０４は０ｎＭ～５ｎＭの濃度となるように調整した溶液を使用し、基板５０１には各溶液１００μＬを加え、３７℃で２時間反応させた。
次に第二のガイドＲＮＡ５０７と標識物質を結合させた第二のＣａｓタンパク質５０８とからなる複合体を調製した。本実施例で用いたｄＣａｓ９にはあらかじめタグが付与されており、そのタグを利用し、ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ社のＳＮＡＰ－ｂｉｏｔｉｎを用いて、プロトコルに従って第二のＣａｓタンパク質５０８にビオチン５０９を結合させた。
その後、第二のガイドＲＮＡ５０７を２、５μＭの濃度で含む溶液と、ビオチン５０９を結合させた第二のＣａｓタンパク質５０８を２μＭの濃度で含む溶液とを、１：１の体積比で混合した。さらに、得られた混合溶液を、３７℃で３０分反応させることで、第二のガイドＲＮＡ５０７－第二のＣａｓタンパク質５０８複合体を作製した。なお、反応後は未反応のＳＮＡＰ－ｂｉｏｔｉｎを除くため、限外ろ過を行い、第二のＣａｓタンパク質の濃度が５０ｎＭとなるように希釈した。希釈には０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴを用いた。
このようにして調製した第二のガイドＲＮＡ５０７－第二のＣａｓタンパク質５０８複合体を基板５０１に添加し、標的核酸５０４が有する第二の塩基配列５０６に結合させた。これにより、図５（ｃ）に示すように、標的核酸５０４、第一のガイドＲＮＡ５０２、第一のＣａｓタンパク質５０３、第二のガイドＲＮＡ５０７および第二のＣａｓタンパク質５０８を含む複合体を、基板５０１上に固定化させた。なお、標的核酸５０４が有する第二の塩基配列５０６へ第二のガイドＲＮＡ５０７－第二のＣａｓタンパク質５０７複合体を結合させるための反応は、３７℃で２時間の条件で行った。
その後、基板５０１上の液を除去し、ＰＢＳで基板５０１を洗浄後、図５（ｄ）に示すように、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）５１０で標識されたアビジン５１１を加え、室温で２時間反応させた。その後、基板５０１上の液を除去し、ＰＢＳＴで基板５０１を洗浄した
続いて、図５（ｅ）に示すように、ペルオキシダーゼ発色キットを用い、ＨＲＰ５１０と発色基質５１２とを１０分程度反応させた後、停止液を加え、波長４５０ｎｍの吸光度を計測した。吸光度の測定結果を図６に示す。
図６（ａ）は、標的核酸の濃度と、上記測定により得られた吸光度との関係を棒グラフで示した図であり、図６（ｂ）は、標的核酸の濃度と、上記測定により得られた吸光度との関係を散布図で示した図である。図６に示すように、標的核酸５０４の濃度に依存した吸光度の変化を観察することができ、標的核酸５０４の検出ができることが示された。さらに、図６（ｂ）に示すように、標的核酸５０４と吸光度とについて得られたデータから検量線を作成することで、本発明に係る検出方法を用いて標的核酸５０４の濃度の計測が可能なことが示された。
１０１、３０６、５０４ 標的核酸
１０２、３０２、５０２ 第一のガイドＲＮＡ
１０３、３０３、５０３ 第一のＣａｓタンパク質
１０４、３０７、５０５ 第一の塩基配列
１０５、３０４、５０７ 第二のガイドＲＮＡ
１０６、３０５、５０８ 第二のＣａｓタンパク質
１０７、３０８、５０６ 第二の塩基配列
１０８ 複合体
２０１、５０１ 基板
２０２ 第二の標識物質
２０３ 第一の標識物質
２０４ 触媒
２０５ 信号発信物質
３０１ ラテックス粒子
３０９ 入射光
３１０ 透過光
４０１ ラテラルフローストリップ
４０２ サンプルパッド
４０３ コンジュゲーションパッド
４０４ 反応メンブレン
４０４ａ テストライン
４０４ｂ コントロールライン
４０５ 検体
４０６ 金ナノ粒子
４０７ 抗ｄＣａｓ９抗体
５０９ ビオチン
５１０ 西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
５１１ アビジン
５１２ 発色基質

Claims (20)

  1. 標的核酸に、第一のガイドＲＮＡおよび第一のＣａｓタンパク質を接触させる第１の工程であって、前記第一のガイドＲＮＡは、前記標的核酸が有する第一の塩基配列を認識する、第１の工程と、
    前記標的核酸に、第二のガイドＲＮＡおよび第二のＣａｓタンパク質を接触させる第２の工程であって、前記第二のガイドＲＮＡは、前記標的核酸が有する第二の塩基配列を認識し、前記第二の塩基配列は、前記第一の塩基配列と異なる配列である、第２の工程と、
    前記標的核酸、前記第一のガイドＲＮＡ、前記第一のＣａｓタンパク質、前記第二のガイドＲＮＡおよび前記第二のＣａｓタンパク質を含む複合体を検出する第３の工程であって、前記複合体において、前記第一のガイドＲＮＡおよび前記第一のＣａｓタンパク質は前記第一の塩基配列に結合しており、前記第二のガイドＲＮＡおよび前記第二のＣａｓタンパク質は前記第二の塩基配列に結合している、第３の工程と、
    を有する標的核酸の検出方法。
  2. 前記標的核酸が二本鎖ＤＮＡであり、前記第一のＣａｓタンパク質および前記第二のＣａｓタンパク質は、それぞれヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１に記載の標的核酸の検出方法。
  3. 前記第１の工程において、前記第一のガイドＲＮＡと、前記第一のＣａｓタンパク質とを混合した後に、前記第一のガイドＲＮＡおよび前記第一のＣａｓタンパク質を前記標的核酸に接触させる請求項１または２に記載の標的核酸の検出方法。
  4. 前記第２の工程において、前記第二のガイドＲＮＡと、前記第二のＣａｓタンパク質とを混合した後に、前記第二のガイドＲＮＡおよび前記第二のＣａｓタンパク質を前記標的核酸に接触させる請求項１～３のいずれか１項に記載の標的核酸の検出方法。
  5. 前記標的核酸は、前記第一の塩基配列と、前記第二の塩基配列との間に２０以上の塩基を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の標的核酸の検出方法。
  6. 前記標的核酸は、前記第一の塩基配列と、前記第二の塩基配列との間に１００以上の塩基を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の標的核酸の検出方法。
  7. 前記標的核酸は、前記第一の塩基配列と、前記第二の塩基配列との間に２００以上の塩基を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の標的核酸の検出方法。
  8. 前記第二のガイドＲＮＡおよび前記第二のＣａｓタンパク質のいずれか一方は第二の標識物質と結合しており、前記第３の工程において、前記複合体は、前記第二の標識物質を用いることで発せられる第二の信号により検出される、請求項１～７のいずれか１項に記載の標的核酸の検出方法。
  9. 前記第二の信号は、放射性物質、酵素、捕捉分子、蛍光物質、発光物質、金属粒子、タンパク質―タンパク質結合対、および、タンパク質―抗体結合対、で構成される群から選択される少なくとも１つを用いることで発せられる、請求項８に記載の標的核酸の検出方法。
  10. 前記第一のガイドＲＮＡおよび前記第一のＣａｓタンパク質のいずれか一方は第一の標識物質と結合しており、
    前記第一の標識物質は、前記第二の標識物質と異なる物質であり、
    前記第３の工程において、前記複合体は、前記第一の標識物質を用いることで発せられる第一の信号による検出と、前記第二の信号による検出との２通りにより検出される、請求項８または９に記載の標的核酸の検出方法。
  11. 前記第３の工程は、前記第二の信号に基づいて前記標的核酸の濃度に関する情報を取得する工程を含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載の標的核酸の検出方法。
  12. 前記標的核酸の濃度に関する情報は、前記標的核酸の有無、前記標的核酸の濃度の値、および、前記標的核酸の濃度の基準値に対する前記標的核酸の濃度の割合、で構成される群から選択される少なくとも一つである、請求項１１に記載の標的核酸の検出方法。
  13. 前記第３の工程において、ラテラルフローアッセイを利用して前記複合体を検出する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の標的核酸の検出方法。
  14. 前記第３の工程において、ラテックス粒子の凝集を利用して前記複合体を検出する、請求項１～７のいずれか１項に記載の標的核酸の検出方法。
  15. 標的核酸を検出するためのキットであって、
    第一のガイドＲＮＡ、第一のＣａｓタンパク質、第二のガイドＲＮＡ、および第二のＣａｓタンパク質を有し、
    前記第一のガイドＲＮＡは、前記標的核酸が有する第一の塩基配列を認識することが可能な配列を有し、
    前記第二のガイドＲＮＡは、前記標的核酸が有する第二の塩基配列を認識することが可能な配列を有し、
    前記第二の塩基配列は、前記第一の塩基配列とは異なる配列である、キット。
  16. 前記第一のＣａｓタンパク質および前記第二のＣａｓタンパク質は、それぞれヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１５に記載のキット。
  17. 前記第二のガイドＲＮＡおよび前記第二のＣａｓタンパク質のいずれか一方は第二の標識物質と結合している、請求項１５または１６に記載のキット。
  18. 前記第二の標識物質は、放射性物質、酵素、捕捉分子、蛍光物質、発光物質、金属粒子、タンパク質―タンパク質結合対およびタンパク質―抗体結合対、で構成される群から選択される少なくとも１つを用いることで発せられる第二の信号の発信に用いられる物質である、請求項１７に記載のキット。
  19. ラテラルフローストリップをさらに有する、請求項１４～１８のいずれか１項に記載のキット。
  20. ラテックス粒子をさらに有する、請求項１５または１６のいずれか１項に記載のキット。
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