JP2017176166A - 核酸プローブを用いた測定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】シグナル増幅が可能で、一定温度条件下で機能しうる測定方法の提供。
【解決手段】プローブＡ、プローブＢ、プロモーター配列と、プローブＡの一部と相同的な配列のプロモータープライマー、を用いて、二重鎖形成配列がプローブＡ及びプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれ、プロモーター配列はプロモータープライマーに含まれ、増幅配列は、プローブＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、プローブＡとプローブＢの抗体を測定対象と反応させ、プローブＡとプローブＢの二重鎖形成配列をハイブリダイズさせて、ＤＮＡ−ＲＮＡの二重鎖を形成させ、それを起点としてＤＮＡを伸長させた後、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリット二重鎖中のＲＮＡ鎖を分解し、生成した一本鎖ＤＮＡとプロモータープライマーによる二重鎖を形成させ、それを起点としてＤＮＡを伸長させることにより、プロモーター配列の二重鎖を形成させ、ＲＮＡを増幅させ、検出する。
【選択図】図１
【解決手段】プローブＡ、プローブＢ、プロモーター配列と、プローブＡの一部と相同的な配列のプロモータープライマー、を用いて、二重鎖形成配列がプローブＡ及びプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれ、プロモーター配列はプロモータープライマーに含まれ、増幅配列は、プローブＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、プローブＡとプローブＢの抗体を測定対象と反応させ、プローブＡとプローブＢの二重鎖形成配列をハイブリダイズさせて、ＤＮＡ−ＲＮＡの二重鎖を形成させ、それを起点としてＤＮＡを伸長させた後、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリット二重鎖中のＲＮＡ鎖を分解し、生成した一本鎖ＤＮＡとプロモータープライマーによる二重鎖を形成させ、それを起点としてＤＮＡを伸長させることにより、プロモーター配列の二重鎖を形成させ、ＲＮＡを増幅させ、検出する。
【選択図】図１
Description
本発明は、核酸増幅反応を利用した測定方法に関するものである。
酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）の原理を用いた測定法は、臨床診断や基礎研究の分野で広く用いられている。しかし、ＥＬＩＳＡによる測定では、標識化合物の非特異吸着を除去するための洗浄工程（Ｂ／Ｆ分離）が必要であり、操作に時間がかかること、また洗浄操作に耐えることのできない弱い相互作用のホスト分子は使用できないなどの問題があった。そのため、Ｂ／Ｆ分離を必要としないホモジニアスアッセイ方法が、生物医学研究の現場でのハイスループットスクリーニングに用いられる（非特許文献１）。従来のホモジニアスアッセイにおける検出方法は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）などの手法を用いて検出される。これらの検出系は、ＥＬＩＳＡなどの酵素を用いた検出系と異なり、反応系中でシグナルの増幅が行われないため、検出感度が問題となることがあった。
例えば非特許文献２では、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）の抗原結合領域近傍に修飾した蛍光分子がタンパク中のトリプトファンによる消光を受けることを利用して、抗原結合により蛍光回復するプローブを開発している。また非特許文献３では、ホスト分子と蛍光色素のピレンで修飾された２つのＤＮＡ鎖が、ゲスト分子との会合により二重鎖形成をして、結果としてピレンが近接位にくることで、ピレン由来の発光のスイッチングが起こるプローブを開発している。これらの測定方法は、どちらもＢ／Ｆ分離を必要としないホモジニアスな系で機能するが、シグナル増幅系を有する測定系ではなかった。
シグナル増幅の機能を有し、ホモジニアスな系で働く測定方法の例として、非特許文献４に記載のホスト分子で修飾された二本のＤＮＡ鎖を利用したものがあげられる。この測定系では、ゲスト分子との会合により形成されたＤＮＡ二重鎖の末端をＤＮＡリガーゼにより結合し、形成された長鎖ＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、増幅配列を検出することで、測定を行っている。しかし、この測定方法ではＰＣＲの過程で温度変化が必要であり、またＰＣＲサイクルが終了するまでに１時間以上の時間が必要であった。
化学と生物 Ｖｏｌ．３８ Ｎｏ．８， ２０００．５５５
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１１，１３３（４３），１７３８６
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２００８，１９，１１３２
Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．，２０１２，８４，８７７
本発明の目的は、シグナルの増幅が可能で、一定温度条件下で機能しうる測定方法を提供することである。
上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
（１）・会合部位と一本鎖ＲＮＡを有するプローブＡ、
・会合部位と一本鎖ＤＮＡを有するＢ、及び
・プロモーター配列と、プローブＡの一本鎖ＲＮＡの一部と相同的な配列とを有するプロモータープライマー、
を用いた測定対象の測定方法であって、
（ｉ）二重鎖形成配列がプローブＡの一本鎖ＲＮＡ及びプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、
プロモーター配列はプロモータープライマーに含まれており、
増幅配列は、プローブＡの一本鎖ＲＮＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、
（ｉｉ）プローブＡの会合部位とプローブＢの会合部位を測定対象と会合させ、
（ｉｉｉ）プローブＡの二重鎖形成配列とプローブＢの二重鎖形成配列をハイブリダイズさせて、ＤＮＡ−ＲＮＡの二重鎖を形成させ、
（ｉｖ）それを起点として逆転写酵素によってＤＮＡを伸長させ、
（ｖ）ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素により、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリット二重鎖中のＲＮＡ鎖を分解し、
（ｖｉ）それによって生成した一本鎖ＤＮＡとプロモータープライマーによる二重鎖を形成させ、
（ｖｉｉ）それを起点としてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを伸長させることにより、プロモーター配列の二重鎖を形成させ、
（ｖｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列下流の増幅配列のアンチセンス鎖を鋳型としてＲＮＡを増幅させ、
（ｉｘ）増幅したＲＮＡを検出する、
ことを特徴とする、測定方法。
（２）ホモジニアス系で行われる、（１）に記載の方法。
（３）ＲＮＡの増幅が一定温度条件下で行われる、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）測定シグナルが指数関数的に増幅する、（１）〜（３）いずれかに記載の方法。
（５）会合部位が抗体である、（１）〜（４）いずれかに記載の方法。
（１）・会合部位と一本鎖ＲＮＡを有するプローブＡ、
・会合部位と一本鎖ＤＮＡを有するＢ、及び
・プロモーター配列と、プローブＡの一本鎖ＲＮＡの一部と相同的な配列とを有するプロモータープライマー、
を用いた測定対象の測定方法であって、
（ｉ）二重鎖形成配列がプローブＡの一本鎖ＲＮＡ及びプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、
プロモーター配列はプロモータープライマーに含まれており、
増幅配列は、プローブＡの一本鎖ＲＮＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、
（ｉｉ）プローブＡの会合部位とプローブＢの会合部位を測定対象と会合させ、
（ｉｉｉ）プローブＡの二重鎖形成配列とプローブＢの二重鎖形成配列をハイブリダイズさせて、ＤＮＡ−ＲＮＡの二重鎖を形成させ、
（ｉｖ）それを起点として逆転写酵素によってＤＮＡを伸長させ、
（ｖ）ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素により、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリット二重鎖中のＲＮＡ鎖を分解し、
（ｖｉ）それによって生成した一本鎖ＤＮＡとプロモータープライマーによる二重鎖を形成させ、
（ｖｉｉ）それを起点としてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを伸長させることにより、プロモーター配列の二重鎖を形成させ、
（ｖｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列下流の増幅配列のアンチセンス鎖を鋳型としてＲＮＡを増幅させ、
（ｉｘ）増幅したＲＮＡを検出する、
ことを特徴とする、測定方法。
（２）ホモジニアス系で行われる、（１）に記載の方法。
（３）ＲＮＡの増幅が一定温度条件下で行われる、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）測定シグナルが指数関数的に増幅する、（１）〜（３）いずれかに記載の方法。
（５）会合部位が抗体である、（１）〜（４）いずれかに記載の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）測定方法
本発明の測定方法は、測定対象の有無を測定する定性測定であってもよく、また測定対象の量を測定する定量測定であってもよい。本発明の測定方法は、Ｂ／Ｆ分離を必要としない、いわゆるホモジニアス系で行われることが好ましい。
本発明の測定方法は、測定対象の有無を測定する定性測定であってもよく、また測定対象の量を測定する定量測定であってもよい。本発明の測定方法は、Ｂ／Ｆ分離を必要としない、いわゆるホモジニアス系で行われることが好ましい。
（２）プローブ
本発明に用いられるプローブＡは会合部位と一本鎖ＲＮＡ有するものであり、プローブＢは会合部位と一本鎖ＤＮＡを有するものである。会合部位とＲＮＡ、ＤＮＡ鎖の結合は３’末端側、５’末端側のどちらで行っても良く、反応原理に応じて適宜選択すればよい。例えばプローブＡとプローブＢにおいて、プローブＡは会合部位と一本鎖ＲＮＡの３’末端側とが結合しており、プローブＢは会合部位と一本鎖ＤＮＡの５’末端側とが結合しているものをあげることができ、これは例えば後述の測定原理１に用いることができる。
本発明に用いられるプローブＡは会合部位と一本鎖ＲＮＡ有するものであり、プローブＢは会合部位と一本鎖ＤＮＡを有するものである。会合部位とＲＮＡ、ＤＮＡ鎖の結合は３’末端側、５’末端側のどちらで行っても良く、反応原理に応じて適宜選択すればよい。例えばプローブＡとプローブＢにおいて、プローブＡは会合部位と一本鎖ＲＮＡの３’末端側とが結合しており、プローブＢは会合部位と一本鎖ＤＮＡの５’末端側とが結合しているものをあげることができ、これは例えば後述の測定原理１に用いることができる。
会合部位と一本鎖ＲＮＡ、又は一本鎖ＤＮＡとは直接結合されていてもよく、またスペーサー等を介して間接的に結合されていてもよい。その結合方法は特に限定されないが、例えば、非特許文献３に記載のように、会合部位をホスホロアミダイト化して、ＤＮＡ固相合成に組み込むことで一本鎖核酸と結合させてもよいし、固相合成により一本鎖核酸中にアミノ基、チオール基などの反応性の官能基を導入し、会合部位と反応させてもよい。スペーサーの種類も特に限定されないが、例えばポリオキシエチレン（ＰＥＧ）鎖をスペーサーとして用いてもよいし、核酸自体をスペーサーとして用いてもよい。このスペーサーとして用いられる核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、会合部位と結合している側の核酸に、プローブＡ又はＢ中の二重鎖形成配列を有する一本鎖核酸が結合していてもよく、また反対に会合部位と結合している核酸の相補鎖側に、プローブＡ又はＢ中の二重鎖形成配列を有する一本鎖核酸が結合していてもよい。
（３）会合部位
会合部位は、プローブＡとプローブＢに含まれるものであり、測定対象と会合しうるものであればよく特に限定されない。例えば、会合部位としては、ホスト分子として用いられる小分子（シクロデキストリン、クラウンエーテル、ボロン酸など）や、測定対象と親和性を有するタンパク（レクチン、抗体など）または親和性を有する核酸（アプタマーなど）、アビジン又はビオチン等を用いればよい。プローブＡとプローブＢが共に測定対象に会合した状態をとることができる限り、プローブＡとプローブＢの会合部位は同一のものであっても異なっていてもよい。またプローブＡとプローブＢの会合部位は、測定対象に対してどちらを先に会合させてもよく、また同時に会合させてもよい。
会合部位は、プローブＡとプローブＢに含まれるものであり、測定対象と会合しうるものであればよく特に限定されない。例えば、会合部位としては、ホスト分子として用いられる小分子（シクロデキストリン、クラウンエーテル、ボロン酸など）や、測定対象と親和性を有するタンパク（レクチン、抗体など）または親和性を有する核酸（アプタマーなど）、アビジン又はビオチン等を用いればよい。プローブＡとプローブＢが共に測定対象に会合した状態をとることができる限り、プローブＡとプローブＢの会合部位は同一のものであっても異なっていてもよい。またプローブＡとプローブＢの会合部位は、測定対象に対してどちらを先に会合させてもよく、また同時に会合させてもよい。
（４）二重鎖形成配列
本発明における二重鎖形成配列は、プローブＡの一本鎖ＲＮＡとプローブＢの一本鎖ＤＮＡ中にそれぞれ存在するものであるが、それぞれの一本鎖核酸中の位置は特に限定されるものではない。それらは互いに相補的な配列を有するものであり、その核酸鎖長は特に限定されないが、好ましくは３〜１０塩基、さらに好ましくは４〜６塩基である。
本発明における二重鎖形成配列は、プローブＡの一本鎖ＲＮＡとプローブＢの一本鎖ＤＮＡ中にそれぞれ存在するものであるが、それぞれの一本鎖核酸中の位置は特に限定されるものではない。それらは互いに相補的な配列を有するものであり、その核酸鎖長は特に限定されないが、好ましくは３〜１０塩基、さらに好ましくは４〜６塩基である。
（５）プロモータープライマー
本発明においてプロモータープライマーは、プロモーター配列と、プローブＡの一本鎖ＲＮＡの一部と相同的な配列とを有する、一本鎖ＤＮＡプライマーである。一本鎖ＤＮＡ中のプロモーター配列の位置は特に限定されるものではない。その配列は特に限定されず、ＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡへの転写を行うことが可能なプロモーターであればよい。具体的には、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターなどがあげられる。特に、本発明ではＴ７プロモーターを用いることが好ましい。またプローブＡの一本鎖ＲＮＡの一部と相同的な配列としては特に限定されるものではなく、一本鎖ＤＮＡ中での位置も特に限定されるものではないが、その長さは好ましくは５〜２５塩基、更に好ましくは１２〜１８塩基である。
本発明においてプロモータープライマーは、プロモーター配列と、プローブＡの一本鎖ＲＮＡの一部と相同的な配列とを有する、一本鎖ＤＮＡプライマーである。一本鎖ＤＮＡ中のプロモーター配列の位置は特に限定されるものではない。その配列は特に限定されず、ＲＮＡポリメラーゼ存在下でＲＮＡへの転写を行うことが可能なプロモーターであればよい。具体的には、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターなどがあげられる。特に、本発明ではＴ７プロモーターを用いることが好ましい。またプローブＡの一本鎖ＲＮＡの一部と相同的な配列としては特に限定されるものではなく、一本鎖ＤＮＡ中での位置も特に限定されるものではないが、その長さは好ましくは５〜２５塩基、更に好ましくは１２〜１８塩基である。
（６）増幅配列
本発明における増幅配列は、プローブＡの一本鎖ＲＮＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれるものであるが、その位置は特に限定されるものではない。その配列はＲＮＡ合成の鋳型となるアンチセンス鎖又はセンス鎖であればよく、特に限定されない。
本発明における増幅配列は、プローブＡの一本鎖ＲＮＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれるものであるが、その位置は特に限定されるものではない。その配列はＲＮＡ合成の鋳型となるアンチセンス鎖又はセンス鎖であればよく、特に限定されない。
（７）検出
本発明におけるシグナルの検出は、ＲＮＡポリメラーゼによって転写・増幅されたＲＮＡ鎖を検出することで行えばよく、特に限定されない。例えばＲＮＡの検出にはモレキュラービーコンやＩＮＡＦプローブなどの配列特異的に結合し、蛍光変化する検出系を用いてもよいし、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎなどインターカレーター性の蛍光色素を用いてもよい。また、合成されるＲＮＡ配列がＲＮＡｚｙｍｅ活性を有するように配列を設計し、その酵素活性を測定することでシグナルの検出を行なってもよい。また核酸クロマトの方法を用いて、目視による検出を行ってもよい。
本発明におけるシグナルの検出は、ＲＮＡポリメラーゼによって転写・増幅されたＲＮＡ鎖を検出することで行えばよく、特に限定されない。例えばＲＮＡの検出にはモレキュラービーコンやＩＮＡＦプローブなどの配列特異的に結合し、蛍光変化する検出系を用いてもよいし、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎなどインターカレーター性の蛍光色素を用いてもよい。また、合成されるＲＮＡ配列がＲＮＡｚｙｍｅ活性を有するように配列を設計し、その酵素活性を測定することでシグナルの検出を行なってもよい。また核酸クロマトの方法を用いて、目視による検出を行ってもよい。
検出装置を必要とする場合は、リアルタイムＰＣＲ装置を用いればよい。また本実施例で用いた、ＴＲＣＲリアルタイムモニター（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０ 東ソー製）を用いてもよい。
（８）酵素
本発明の測定方法には、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、逆転写酵素活性を有する酵素及びＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を用いる。その際、各酵素活性を兼ね備えた酵素を用いてもよいし、それぞれのポリメラーゼ活性を有する異なる酵素をそれぞれ用いてもよい。例えばＤＮＡポリメラーゼとしては、ｐｈｉ２９、Ｂｓｔ、Ｃｓａ、９６−７などを用いればよく、ＲＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３などを用いればよく、逆転写酵素としては、ＡＭＶ、ＭＬＶなどを用いればよく、ＲＮＡａｓｅＨ活性を有する酵素としてはＲＮａｓｅＨを用いればよい。特に本発明では、ＤＮＡポリメラーゼとしては９６−７を、ＲＮＡポリメラーゼとしてはＴ７を、逆転写酵素及びＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素としてはＡＭＶを用いることが好ましい。
本発明の測定方法には、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、逆転写酵素活性を有する酵素及びＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素を用いる。その際、各酵素活性を兼ね備えた酵素を用いてもよいし、それぞれのポリメラーゼ活性を有する異なる酵素をそれぞれ用いてもよい。例えばＤＮＡポリメラーゼとしては、ｐｈｉ２９、Ｂｓｔ、Ｃｓａ、９６−７などを用いればよく、ＲＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３などを用いればよく、逆転写酵素としては、ＡＭＶ、ＭＬＶなどを用いればよく、ＲＮＡａｓｅＨ活性を有する酵素としてはＲＮａｓｅＨを用いればよい。特に本発明では、ＤＮＡポリメラーゼとしては９６−７を、ＲＮＡポリメラーゼとしてはＴ７を、逆転写酵素及びＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素としてはＡＭＶを用いることが好ましい。
（９）反応温度
本発明における反応温度は各酵素反応が進行する温度であればよく特に限定されない。本発明における反応温度は、好ましくは２５〜５０℃、さらに好ましくは３７〜４６℃の範囲であればよい。特にＲＮＡの増幅が一定温度条件下で行われることが好ましい。また全工程が一定温度条件下で行われることも好ましい。
本発明における反応温度は各酵素反応が進行する温度であればよく特に限定されない。本発明における反応温度は、好ましくは２５〜５０℃、さらに好ましくは３７〜４６℃の範囲であればよい。特にＲＮＡの増幅が一定温度条件下で行われることが好ましい。また全工程が一定温度条件下で行われることも好ましい。
（１０）測定原理
本発明の測定原理の一例を模式図（図１）に示す。プローブＡは一本鎖ＲＮＡの３’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＲＮＡの３’側に二重鎖形成配列を含み、プローブＢは一本鎖ＤＮＡの５’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＤＮＡの３’側に向かって増幅配列、二重鎖形成配列を含み、プロモータープライマーの５’側にプロモーター配列を含む場合を例として説明するが、各プローブの構成、配列の順序はこれに限定されるものではない。
（１０−１）プローブＡとプローブＢの会合部位を、測定対象物質と会合させる。
（１０−２）その結果、プローブＡとプローブＢ中の二重鎖形成配列が、近接位置に配置されることとなり、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖が形成される。
（１０−３）それを起点として、逆転写酵素によって、ＤＮＡの伸長が行われる。
（１０−４）ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素の作用によってＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖中のＲＮＡ鎖が分解される。
（１０−５）それによって生成した一本鎖ＤＮＡとプロモータープライマーの間でＤＮＡ二重鎖が形成される。
（１０−６）ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応により、プロモータープライマー中のプロモーター配列の二重鎖が形成される。
（１０−７）プロモーター配列の二重鎖が形成されたことで、ＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列下流の増幅配列のアンチセンス鎖を鋳型としてＲＮＡを繰り返し転写・増幅させる。
（１０−８）増幅されたＲＮＡをＩＮＡＦプローブなどで検出する。
本発明の測定原理の一例を模式図（図１）に示す。プローブＡは一本鎖ＲＮＡの３’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＲＮＡの３’側に二重鎖形成配列を含み、プローブＢは一本鎖ＤＮＡの５’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＤＮＡの３’側に向かって増幅配列、二重鎖形成配列を含み、プロモータープライマーの５’側にプロモーター配列を含む場合を例として説明するが、各プローブの構成、配列の順序はこれに限定されるものではない。
（１０−１）プローブＡとプローブＢの会合部位を、測定対象物質と会合させる。
（１０−２）その結果、プローブＡとプローブＢ中の二重鎖形成配列が、近接位置に配置されることとなり、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖が形成される。
（１０−３）それを起点として、逆転写酵素によって、ＤＮＡの伸長が行われる。
（１０−４）ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素の作用によってＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖中のＲＮＡ鎖が分解される。
（１０−５）それによって生成した一本鎖ＤＮＡとプロモータープライマーの間でＤＮＡ二重鎖が形成される。
（１０−６）ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応により、プロモータープライマー中のプロモーター配列の二重鎖が形成される。
（１０−７）プロモーター配列の二重鎖が形成されたことで、ＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列下流の増幅配列のアンチセンス鎖を鋳型としてＲＮＡを繰り返し転写・増幅させる。
（１０−８）増幅されたＲＮＡをＩＮＡＦプローブなどで検出する。
（１１）測定原理２
本発明の測定原理の他の一例を模式図（図３）に示す。プローブＡは一本鎖ＲＮＡの３’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＲＮＡの３’側に二重鎖形成配列を含み、プローブＢは一本鎖ＤＮＡの５’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＤＮＡの３’側に向かって増幅配列、二重鎖形成配列を含む。また反応系中に５’側にプロモーター配列を含むプロモータープライマー、逆転写プライマーを含む場合を例として説明するが、各プローブの構成、配列の順序はこれに限定されるものではない。
（１１−１）プローブＡとプローブＢの会合部位を、測定対象物質と会合させる。
（１１−２）その結果、プローブＡとプローブＢ中の二重鎖形成配列が、近接位置に配置されることとなり、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖が形成される。
（１１−３）それを起点として、逆転写酵素によって、ＤＮＡの伸長が行われる。
（１１−４）ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素の作用によってＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖中のＲＮＡ鎖が分解される。
（１１−５）それによって生成した一本鎖ＤＮＡとプロモータープライマーの間でＤＮＡ二重鎖が形成される。
（１１−６）ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応により、プロモータープライマー中のプロモーター配列の二重鎖が形成される。
（１１−７）プロモーター配列の二重鎖が形成されたことで、ＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列下流の増幅配列のアンチセンス鎖を鋳型としてＲＮＡを繰り返し転写・増幅させる。
（１１−８）転写・増幅されたＲＮＡ鎖と逆転写プライマーとの間で二重鎖が形成され、それを起点として、逆転写酵素によって、ＤＮＡの伸長が行われ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成される。
（１１−９）形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、次いで（１１−４）〜（１１−７）に相当するのＲＮＡ増幅反応が行われる。（但し、ＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖は、図３に示すような会合部位は持たない。）
（１１−１０）このようにして、（１１−７）で増幅されたＲＮＡをテンプレートとして（１１−８）〜（１１−９）が繰り返し行われ、ＲＮＡ量が指数関数的に増幅する。
（１１−１１）増幅されたＲＮＡをＩＮＡＦプローブなどで検出する。
（１２）逆転写プライマー
本発明における逆転写プライマーは、プローブＢの一本鎖ＤＮＡの一部と相同的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプライマーであり、その長さは好ましくは５〜２５塩基、更に好ましくは１２〜１８塩基である。
本発明の測定原理の他の一例を模式図（図３）に示す。プローブＡは一本鎖ＲＮＡの３’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＲＮＡの３’側に二重鎖形成配列を含み、プローブＢは一本鎖ＤＮＡの５’側末端に会合部位が結合し、一本鎖ＤＮＡの３’側に向かって増幅配列、二重鎖形成配列を含む。また反応系中に５’側にプロモーター配列を含むプロモータープライマー、逆転写プライマーを含む場合を例として説明するが、各プローブの構成、配列の順序はこれに限定されるものではない。
（１１−１）プローブＡとプローブＢの会合部位を、測定対象物質と会合させる。
（１１−２）その結果、プローブＡとプローブＢ中の二重鎖形成配列が、近接位置に配置されることとなり、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖が形成される。
（１１−３）それを起点として、逆転写酵素によって、ＤＮＡの伸長が行われる。
（１１−４）ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素の作用によってＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖中のＲＮＡ鎖が分解される。
（１１−５）それによって生成した一本鎖ＤＮＡとプロモータープライマーの間でＤＮＡ二重鎖が形成される。
（１１−６）ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応により、プロモータープライマー中のプロモーター配列の二重鎖が形成される。
（１１−７）プロモーター配列の二重鎖が形成されたことで、ＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列下流の増幅配列のアンチセンス鎖を鋳型としてＲＮＡを繰り返し転写・増幅させる。
（１１−８）転写・増幅されたＲＮＡ鎖と逆転写プライマーとの間で二重鎖が形成され、それを起点として、逆転写酵素によって、ＤＮＡの伸長が行われ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが形成される。
（１１−９）形成されたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドは、次いで（１１−４）〜（１１−７）に相当するのＲＮＡ増幅反応が行われる。（但し、ＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖は、図３に示すような会合部位は持たない。）
（１１−１０）このようにして、（１１−７）で増幅されたＲＮＡをテンプレートとして（１１−８）〜（１１−９）が繰り返し行われ、ＲＮＡ量が指数関数的に増幅する。
（１１−１１）増幅されたＲＮＡをＩＮＡＦプローブなどで検出する。
（１２）逆転写プライマー
本発明における逆転写プライマーは、プローブＢの一本鎖ＤＮＡの一部と相同的な配列を有する一本鎖ＤＮＡプライマーであり、その長さは好ましくは５〜２５塩基、更に好ましくは１２〜１８塩基である。
ホモジニアス系で行われる測定においても、シグナル増幅ができないために、目標の感度に達しないことがある。本発明の測定法では、ＲＮＡポリメラーゼにより合成されたＲＮＡを測定するため、シグナルを増幅して検出することが可能である。このため、高感度な測定が可能である。
以下、本発明を、会合部位としてビオチンを用いた場合の実施例によって具体的に示すが、本発明はこれに限定されない。
実施例１ 図１に示す模式図の測定系
（１）プローブ作製
一本鎖ＲＮＡ（配列番号１）の３’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＡ、一本鎖ＤＮＡ（配列番号２）の５’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＢは、それぞれグライナー社による受託合成により作製した。プローブＡにおけるＲＮＡ配列は二重鎖形成配列（配列番号１の１６〜２１位）を含むように設計し、プローブＢにおけるＤＮＡ配列は増幅配列（配列番号２の３１〜５０位）、二重鎖形成配列（配列番号２の４５〜５０位）を含むよう設計した。
（１）プローブ作製
一本鎖ＲＮＡ（配列番号１）の３’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＡ、一本鎖ＤＮＡ（配列番号２）の５’末端にビオチン（会合部位）修飾したプローブＢは、それぞれグライナー社による受託合成により作製した。プローブＡにおけるＲＮＡ配列は二重鎖形成配列（配列番号１の１６〜２１位）を含むように設計し、プローブＢにおけるＤＮＡ配列は増幅配列（配列番号２の３１〜５０位）、二重鎖形成配列（配列番号２の４５〜５０位）を含むよう設計した。
（２）プロモータープライマーの作製
プロモータープライマー（配列番号３）はグライナー社による受託合成により作製した。プロモータープライマーはプロモーター配列（配列番号３の１〜２８位）を含むよう設計した。また、プロモータープライマーの一部（配列番号３の３３〜４７位）はプローブＡのＲＮＡ鎖の一部（配列番号１の１〜１５位）と相同的な配列になるよう設計した。
プロモータープライマー（配列番号３）はグライナー社による受託合成により作製した。プロモータープライマーはプロモーター配列（配列番号３の１〜２８位）を含むよう設計した。また、プロモータープライマーの一部（配列番号３の３３〜４７位）はプローブＡのＲＮＡ鎖の一部（配列番号１の１〜１５位）と相同的な配列になるよう設計した。
（３）ＩＮＡＦプローブ作製
配列番号４のＩＮＡＦプローブは特開２００６−３４０６６３号公報に記載のプローブを用いた。
配列番号４のＩＮＡＦプローブは特開２００６−３４０６６３号公報に記載のプローブを用いた。
（４）ストレプトアビジンの測定
ビオチンと会合することで知られるストレプトアビジンをプローブＡ、プローブＢ、プロモータープライマー、ＩＮＡＦプローブを用いて測定した。測定溶液中の酵素濃度、基質濃度などの詳細を以下に示す。
ビオチンと会合することで知られるストレプトアビジンをプローブＡ、プローブＢ、プロモータープライマー、ＩＮＡＦプローブを用いて測定した。測定溶液中の酵素濃度、基質濃度などの詳細を以下に示す。
１８ｍＭ ＭｇＣｌ２、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、１ｍＭ ＤＴＴ，０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ、３ｍＭ ＮＴＰ、３．０６ｍＭ ＩＴＰ、０．１２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、２％ ｓｏｒｂｉｔｏｌ、８０ｍＭ ＫＣｌ、０．２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、４Ｕ／３０μＬ ９６−７ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１４４Ｕ／３０μＬ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、７．４Ｕ／３０μＬ ＡＭＶ（逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ活性有）、プローブＡ ２００ｎＭ、プローブＢ ２００ｎＭ、ＤＭＳＯ ７％，プロモータープライマー ０．５μＭ。反応温度４３℃。
上記測定溶液中に図２に示す各濃度のストレプトアビジンを添加し、ＩＮＡＦプローブ由来の蛍光強度を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて測定した。結果を図２に示す。その結果、ストレプトアビジン濃度の増加に応じて、蛍光強度増幅までの時間が短縮されることが確認された。これは、ストレプトアビジンと各プローブ中のビオチンの会合によって形成されるプロモーター配列の二重鎖の量が増加したためと考えられる。
以上の結果から、本発明の方法により、測定対象を測定できることが確認された。
実施例２ 図３に示す模式図の測定系
プローブ、プロモータープライマー、ＩＮＡＦプローブは実施例１に記載のものと同様のものを用いた。
（１）逆転写プライマーの作製
逆転写プライマー（配列番号５）はグライナー社による受託合成により作製した。逆転写プライマーはプローブＢのＤＮＡ鎖の一部（配列番号２の７〜２２位）と相同的な配列になるよう設計した。
プローブ、プロモータープライマー、ＩＮＡＦプローブは実施例１に記載のものと同様のものを用いた。
（１）逆転写プライマーの作製
逆転写プライマー（配列番号５）はグライナー社による受託合成により作製した。逆転写プライマーはプローブＢのＤＮＡ鎖の一部（配列番号２の７〜２２位）と相同的な配列になるよう設計した。
（２）ストレプトアビジンの測定
ビオチンと会合することで知られるストレプトアビジンをプローブＡ、プローブＢ、プロモータープライマー、ＩＮＡＦプローブ、逆転写プライマーを用いて測定した。測定溶液中の酵素濃度、基質濃度などの詳細を以下に示す。
ビオチンと会合することで知られるストレプトアビジンをプローブＡ、プローブＢ、プロモータープライマー、ＩＮＡＦプローブ、逆転写プライマーを用いて測定した。測定溶液中の酵素濃度、基質濃度などの詳細を以下に示す。
１８ｍＭ ＭｇＣｌ２、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６） 、１ｍＭ ＤＴＴ， ０．２５ｍＭ ｄＮＴＰ、３ｍＭ ＮＴＰ、 ３．０６ｍＭ ＩＴＰ、０．１２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、２％ ｓｏｒｂｉｔｏｌ、 ８０ｍＭ ＫＣｌ、０．２Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、４Ｕ／３０μＬ ９６−７ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１４４Ｕ／３０μＬ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、７．４Ｕ／３０μＬ ＡＭＶ（逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨ活性有） 、プローブＡ ０．２ｎＭ、プローブＢ ０．２ｎＭ、ＤＭＳＯ ７％、プロモータープライマー １．０μＭ、逆転写プライマー １．０μＭ、ＩＮＡＦプローブ ３０ｎＭ。反応温度４３℃。
上記測定溶液中に図４に示す各濃度のストレプトアビジンを添加し、ＩＮＡＦプローブ由来の蛍光強度を時間経過ごとにＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０（東ソー製）を用いて測定した。結果を図４に示す。その結果、ストレプトアビジン濃度の増加に応じて、蛍光強度が増幅することが確認された。これは、ストレプトアビジンと各プローブ中のビオチンの会合によって形成されるプロモーター配列の二重鎖の量が増加したためと考えられる。
以上の結果から、本発明の方法により、測定対象を測定できることが確認された。
Claims (5)
- ・会合部位と一本鎖ＲＮＡを有するプローブＡ、
・会合部位と一本鎖ＤＮＡを有するプローブＢ、及び
・プロモーター配列と、プローブＡの一本鎖ＲＮＡの一部と相同的な配列とを有するプロモータープライマー、
を用いた測定対象の測定方法であって、
（ｉ）二重鎖形成配列がプローブＡの一本鎖ＲＮＡ及びプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、
プロモーター配列はプロモータープライマーに含まれており、
増幅配列は、プローブＡの一本鎖ＲＮＡ又はプローブＢの一本鎖ＤＮＡに含まれており、
（ｉｉ）プローブＡの会合部位とプローブＢの会合部位を測定対象と会合させ、
（ｉｉｉ）プローブＡの二重鎖形成配列とプローブＢの二重鎖形成配列をハイブリダイズさせて、ＤＮＡ−ＲＮＡの二重鎖を形成させ、
（ｉｖ）それを起点として逆転写酵素によってＤＮＡを伸長させ、
（ｖ）ＲＮａｓｅＨ活性を有する酵素により、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリット二重鎖中のＲＮＡ鎖を分解し、
（ｖｉ）それによって生成した一本鎖ＤＮＡとプロモータープライマーによる二重鎖を形成させ、
（ｖｉｉ）それを起点としてＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡを伸長させることにより、プロモーター配列の二重鎖を形成させ、
（ｖｉｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼにより、プロモーター配列下流の増幅配列のアンチセンス鎖を鋳型としてＲＮＡを増幅させ、
（ｉｘ）増幅したＲＮＡを検出する、
ことを特徴とする、測定方法。 - ホモジニアス系で行われる、請求項１に記載の方法。
- ＲＮＡの増幅が一定温度条件下で行われる、請求項１又は２に記載の方法。
- 測定シグナルが指数関数的な増幅をすることを特徴とする、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
- 会合部位として抗体を用いることを特徴とする、請求項１〜４いずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP2016060322 | 2016-03-24 | ||
| JP2016060322 | 2016-03-24 |
Publications (1)
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|---|---|
| JP2017176166A true JP2017176166A (ja) | 2017-10-05 |
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ID=60008885
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016214768A Pending JP2017176166A (ja) | 2016-03-24 | 2016-11-02 | 核酸プローブを用いた測定方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP2017176166A (ja) |
-
2016
- 2016-11-02 JP JP2016214768A patent/JP2017176166A/ja active Pending
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