BR112013030964B1

BR112013030964B1 - Ensaio botulínico de não fret

Info

Publication number: BR112013030964B1
Application number: BR112013030964-4A
Authority: BR
Inventors: Dhammika ATAPATTU; Ward Tucker
Original assignee: Biomadison, Inc
Priority date: 2011-06-01
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2022-08-16
Also published as: HK1194143A1; CN103842819A; EP2715355B1; WO2012166943A1; KR20140081759A; US9274121B2; JP2016039809A; KR101910490B1; CN107475293A; JP5815852B2; KR101853103B1; KR20180043396A; US20120309039A1; US10100094B2; JP2014518376A; KR101679370B1; KR20160134863A; JP6162766B2; CN103842819B; BR112013030964A2

Abstract

ENSAIO BOTULÍNICO DE NÃO FRET. Uma composição inclui um construto artificial tendo (a) uma porção contendo repórter quimicamente acoplada a (b) um sítio de clivagem. O sítio de clivagem interage com uma substância investigacional de uma maneira que cliva a porção contendo repórter a partir de um restante do construto. A porção clivada é destruída ou de outra maneira degradada pelo ambiente local, e a presença de uma substância investigacional é evidenciada por redução de sinal a partir do repórter. A substância investigacional é, de preferência, uma toxina botulínica (BoTN), e a sequência de clivagem é toda ou parte de uma proteína SNARE. A porção contendo repórter clivável é, de preferência, Proteína Fluorescente Amarela (YFP), citrino, vênus ou uma proteína YPet.

Description

Este pedido reivindica o benefício de prioridade em relação ao Pedido de Patente Provisório Norte-Americano de Número de Série 61/492237, depositado em 01 de junho de 2011. O pedido prioritário, em conjunto com todas as outras publicações referenciadas aqui são incorporados por referência à mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individuais fosse especificamente ou individualmente indicado para ser incorporado por referência. Quando uma definição ou uso de um termo em uma referência incorporada for inconsistente ou contrário à definição daquele termo aqui fornecido, a definição daquele termo fornecida aqui se aplica e a definição daquele termo na referência não se aplica.

Campo da Invenção

O campo da invenção é de ensaios com proteases, especificamente aqueles relacionados às toxinas botulínicas.

Antecedentes

Neurotoxinas botulínicas (BoNTs) são produzidas pelo Clostridium botulinum, e estão entre as mais potentes toxinas conhecidas. Essas toxinas são uma fonte bem reconhecida de envenenamento alimentar, frequentemente resultando em sérios danos ou mesmo na morte das vítimas. Existem sete neurotoxinas ou sorotipos botulínicos estruturalmente relacionados (BoNT/A-G), cada um dos quais é composto por uma cadeia pesada (~ 100 KD) e uma cadeia leve (~ 50 KD). A cadeia pesada media a entrada da toxina em um alvo celular através de endocitose mediada por receptor. Uma vez internalizada, a cadeia leve é translocada a partir do lúmen da vesícula endossomial para o citossol, e atua como uma protease dependente de zinco para clivar proteínas que mediam a fusão vesícula-membrana alvo (“proteínas de substrato”).

Essas proteínas de substrato de BoNT incluem a proteína de membrana plasmática, sintaxina, proteína de membrana periférica, SNAP-25, e uma proteína de membrana de vesícula, sinaptobrevina (Syb). Refere-se coletivamente a essas proteínas como as proteínas SNARE (receptor de proteína de fixação de fator sensível à N-etil-maleimida). A clivagem de proteínas SNARE bloqueia a fusão de vesículas com a membrana plasmática e abole a liberação de neurotransmissores na junção neuromuscular. Dentre as proteínas SNARE, sintaxina e SNAP-25 usualmente residem na membrana alvo e às quais, portanto, refere-se como t-SNAREs, enquanto que a sinaptobrevina é encontrada exclusivamente com vesículas sinápticas dentro da sinapse e é chamada v-SNARE. Juntas, essas três proteínas formam um complexo que se sabe ser o maquinário mínimo para mediar a fusão entre membrana de vesícula e membrana plasmática. BoNT, E e C1 clivam SNAP-25, BoNT/B, D, F, G clivam sinaptobrevina (Syb), em sítios únicos, porém diferentes. BoNT/C também cliva sintaxina em adição à SNAP-25.

A menos que o contexto dite o contrário, todas as faixas mostradas aqui devem ser interpretadas como sendo inclusivas de seus pontos terminais, e faixas com extremidades abertas devem ser interpretadas para incluírem valores comercialmente práticos. Similarmente, todas as listas de valores devem ser consideradas como inclusivas de valores intermediários, a menos que o contexto indique o contrário.

Devido a sua ameaça como uma fonte de envenenamento alimentar, e como armas de bioterrorismo, existe uma necessidade de se detectar, sensivelmente e rapidamente, BoNTs. Atualmente, o método mais sensível de se detectar toxinas é realizar ensaios de toxicidade em camundongos. Esse método exige grandes números de camundongos, é moroso e não pode ser usado para estudar a cinética catalítica de toxinas. Inúmeros sistemas de ensaios imunológicos amplificados, com base no uso de anticorpos contra toxinas também foram desenvolvidos, mas a maioria de tais sistemas exigem processos de amplificação complicados e caros, nem podem ser usados para estudar a atividade catalítica da toxina. Embora HPLC e ensaio imunológico possam ser usados para detectar moléculas de substrato clivadas e para medir atividades enzimáticas dessas toxinas, aqueles métodos são, em geral, morosos e complicados, alguns deles demandam anticorpos especializados, tornando-os inaplicáveis para seleção em grande escala. Portanto, existe uma demanda por métodos e composições novos e aperfeiçoados para detectar BoNTs.

Nos últimos anos recentes, os pesquisadores começaram a investigar o uso de ensaios FRET para detectar BoNTs. Em ensaios FRET, dois derivados de aminoácidos fluorigênicos são usados para substituir dois aminoácidos nativos em um peptídeo sintético curto (12-35 aminoácidos), que contêm sítios de divagem de toxina. O sinal de fluorescência de um derivado de aminoácido é extinto (quenched) por outro derivado de aminoácido, quando eles estiverem próximos um do outro no peptídeo. Esse mecanismo é chamado de “transferência de energia de ressonância de Forster” (FRET). A divagem do peptídeo separa os dois derivados de aminoácidos, tal que uma diminuição em FRET possa ser detectada.

Ensaios FRET têm sido usados de maneira bem sucedida para detectar BoNTs. (ver, por exemplo, Pedido de Patente Norte-Americano N° 2004/0191887 para Chapman, depositado em 28 de outubro de 2003, Pedido de Patente Norte-Americano N° 2006/0134722 para Chapman, depositado em 20 de dezembro de 2004, Patente Norte-Americana N° 7.208.285 para Steward (abril de 2007), Patente Norte-Americana N° 7.183.066 para Fernandez-Salas (fevereiro de 2007), e Pedido N° US2011/0033866 (publicado em fevereiro de 2010).

Embora algum sucesso tenha sido demonstrado na aplicação de ensaios FRET para detecção de BoNTs, a sensibilidade e a especificidade ainda são indesejáveis para muitas finalidades.

Em ensaios FRET para a localização de proteínas de substratos BoNT, por exemplo, as medições relativas à perda de emissão FRET quando da divagem do peptídeo podem padecer de severas interferências, tal que, em alguns casos, não haja diferença entre células não tratadas com NoNT versus células tratadas com concentrações saturantes de BoNT. Portanto, pode-se dizer que métodos com base na perda de FRET relatam mudanças induzidas por BoNT muito pobremente e, assim, seus baixos desempenho e reprodutibilidade estatísticos os tornam uma metodologia não confiável. O Pedido Norte-Americano N° 2009/0191583, para Ester Fernandez-Salas, reivindica um ensaio BoNT de não FRET usando somente um único fluoróforo. Os ensaios revelados nesse documento usam células, que são capazes de assimilação de toxinas de clostrídios e que incluem um substrato de toxina de clostrídio localizado na membrana contendo um marcador fluorescente.

Como um exemplo, uma célula útil nesse artigo pode expressar uma proteína de fusão de proteína fluorescente verde intensificada por SNAP252O6 (EGFP), que se localiza na membrana plasmática. Quando do tratamento com BoNT/A desta célula, a divagem do substrato SNAP25206-EGFP localizado na membrana ocorre, liberando o fragmento contendo EGFP para o citoplasma. Quando da excitação da célula tratada com um laser de 484 nm, o EGFP é excitado e emite luz em 510 nm. No entanto, porque uma porção do EGFP não é citoplásmico, uma mudança de distribuição entre o substrato de toxina SNAP25206-EGFP localizado na membrana, não clivado, e o fragmento de EGFP localizado no citoplasma, clivado, pode ser observado em células tratadas com BoNT/A. Portanto, o ensaio poderia funcionar para análise qualitativa, mas a presença de porções emissoras de EGFP tanto na membrana quanto no citoplasma torna esse método indesejável para análise quantitativa.

Assim, aparelho, sistemas e métodos aperfeiçoados são, portanto, ainda necessários, que superem as desvantagens e os limites da técnica anterior em relação a ensaios tanto de FRET quanto não FRET.

Sumário da Invenção

A presente invenção fornece método e ensaios caracterizados pelo fato de que uma composição inclui um construto artificial tendo (a) uma porção contendo repórter quimicamente acoplada a (b) um sítio de clivagem que interage com uma substância investigacional de uma maneira que clive a porção contendo repórter a partir de um restante do construto. Uma classe particular de modalidades é dirigida a um método para a detecção qualitativa e quantitativa de uma toxina botulínica, compreendendo: (i) fornecimento de uma composição, que inclui um construto artificial e uma enzima, sendo que o construto tem (a) uma porção contendo repórter e (b) um sítio de clivagem, que interage com uma porção da toxina botulínica de uma maneira que produza uma clivagem da porção contendo repórter a partir de um a partir de um restante do construto, sendo que a composição exibe emissões que identificam um sinal de linha de base; e sendo que a enzima facilita a degradação da porção contendo repórter pelo menos dez vezes mais rápido depois da clivagem dos que antes da clivagem; (ii) obtenção de primeiras medições de emissão a partir do sinal de linha de base; (iii) exposição da composição à toxina botulínica; e, então, (iv) obtenção de medições de emissão adicionais por testagem da composição em relação a uma redução do sinal de linha de base como uma indicação; - da toxina clivando o construto no sítio de clivagem, e - de degradação da porção contendo repórter; e (v) comparação das primeiras medições de emissão da etapa (ii) com as medições adicionais da etapa (iv).

Conforme usado aqui, e a menos que o contexto dite de outra maneira, a expressão “acoplado(a) a” pretende incluir tanto acoplamento direto (no qual dois elementos, que estão acoplados um ao outro, entram em contato um com outro) quanto acoplamento indireto (no qual pelo menos um elemento adicional está localizado entre os dois elementos). Portanto, as expressões “acoplado(a) a” e “acoplado(a) com” são usadas de maneira sinônima.

Além disso, a matéria objeto da invenção se refere também a um ensaio para testagem da presença de uma substância investigativa, compreendendo um construto artificial e uma enzima, senso que o construto tem uma porção protegida e uma porção de proteção, selecionada tal que a porção protegida inclua um repórter, e que a substância investigativa atue para desproteger a porção protegida in vitro, sendo que a enzima facilita a degradação da porção protegida pelo menos dez vezes mais rápido quando desprotegida do que quando protegida, por meio disto reduzindo um sinal obtenível a partir do repórter, que é usado para a determinação quantitativa da substância investigativa.

A porção contendo repórter clivada é destruída ou de outra maneira degradada pelo ambiente local, e a presença da substância investigacional é, então, evidenciada por redução de sinal a partir do repórter. No contexto deste pedido, contempla-se que a degradação da porção protegida ocorrerá tipicamente intracelularmente em pelo menos uma de duas vias, pelo processo dependente de ubiquitina, que de dirige a proteínas para o proteossoma, ou pela via lipossomial de autofagia. Em uma via, o proteossoma é uma enzima. Nas vias de lisossoma, contempla- se que as enzimas de interesse sejam hidrolases, incluindo especialmente uma família de proteases chamada de catepsinas.

Em modalidades preferidas, a substância investigacional é uma toxina botulínica (BoTN), e a sequência de divagem é pareada de maneira apropriada com a substância investigacional. Por exemplo, a BoTN/A, E e C clivam SNAP-25, e BoNT/B, D, F, G clivam sinaptobrevina (Syb), em sítios únicos, porém diferentes. BoNT/C também cliva sintaxina em adição à SNAP-25.

Sequências de sítios de clivagem contempladas podem compreender, vantajosamente, (a) uma proteína, motivo ou muteína SNARE. “Muteínas” de uma proteína devem ser interpretadas aqui como tendo pelo menos 30% de identidade com uma proteína nativa correspondente, incluindo, por exemplo, composições tendo pelo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade com a proteína nativa. Variações de identidade podem compreender qualquer uma ou mais de adições, eliminações e substituições. Muteínas contempladas incluem fragmentos, truncados e proteínas de fusão.

Em outros aspectos de modalidades preferidas, a porção contendo repórter clivável compreende uma proteína fluorescente, como, por exemplo, Proteína Fluorescente Amarela (YFP). YFP é um mutante genético de proteína fluorescente verde, derivada de Aequorea victoria, e tem um pico de excitação de 514 nm e um pico de emissão de 527 nm.

Também contempladas para uso da porção contendo repórter clivável são as proteínas proximamente relacionadas citrino, vénus e proteínas YPet. As modificações reduziram a sensibilidade a cloreto, aceleraram a maturação e aumentaram o brilho (produto do coeficiente de extinção e rendimento quântico). Obviamente, qualquer uma das proteínas fluorescentes aqui mencionadas pode ser modificada para incluir características específicas (por exemplo, espectrais) ou ser truncada para um tamanho específico.

Quando da clivagem, o construto é clivado em duas partes, uma porção contendo repórter, que é destruída ou de outra maneira degradada pelo citossol ou outro ambiente local, e uma segunda porção. Para a detecção do sinal, aquela segunda porção pode incluir vantajosamente uma segunda proteína fluorescente, de preferência, em uma extremidade oposta a partir do repórter, que pode auxiliar na normalização do ensaio. A segunda proteína fluorescente pode ser, por exemplo, Proteína Fluorescente Ciano (CFP), mCereja ou mMorango. A porção contendo repórter não está acoplada com o segundo fluoróforo de uma maneira que produza transferência de energia de ressonância de Forster (FRET).

Portanto, antes da exposição do construto a BoTN ou a outra substância clivante, a composição contendo o construto (seja com base em célula ou de outra maneira) exibe um sinal de linha de base, e, então, depois da exposição, exibe um sinal reduzido. Para a medição da degradação de YFP, emissões de YFP excitadas separadamente, diretamente (topo, Ex500, Em526) e emissões de CFP (meio, Ex434, Em470) são coletadas. Aquelas emissões são, então, subtraídas de fundo e a emissão de YFP é dividida por emissão de CFP, para controlar a densidade celular e a expressão de repórter nas células individuais. Aquela razão de emissão (YFP/CFP, fundo) é como o ensaio é relatado.

A destruição ou outra degradação da porção contendo repórter ocorre em uma pós-exposição com velocidade muito mais rápida à BoTN do que a pré-exposição. Em modalidades preferidas, contempla-se que a destruição ou outra degradação da porção contendo repórter ocorra pelo menos 2 x (duas vezes) mais rápida como pós-exposição do que como pré-exposição, mas, mais preferivelmente, a velocidade de pós-exposição é pelo menos 5 x, pelo menos 10 x, pelo menos 100 x, em relação à velocidade de pré-exposição.

Em ainda outros aspectos de modalidades preferidas, o ambiente local é o citossol de uma célula viva. Por exemplo, YFP pode ser usada como fluoróforo C-terminal, e CFP pode ser usada como o fluoróforo N-terminal. Trabalho experimental verificou agora que, na ausência de BoNT/A, YFP pode ser diretamente excitada e a emissão coletada. A excitação ocorre tipicamente em 505 nm e a emissão correspondente em 527 nm. Na presença de BoTN/A, o repórter é clivado liberando um fragmento contendo YFP. Aquele fragmento é degradado pela célula, destruindo a YFP e sua emissão. Assim, a atividade de BoTN/A é detectada por medições relativas à perda de emissão de YFP. Portanto, nenhuma FRET é necessária, o que evita todos os limites e os problemas indicados acima.

Proteína(s) híbrida(s), que são formadas nas células transfectadas, de preferência, incluem um domínio de transmembrana, que tende a se localizar em vesículas intracelulares, e, por meio disto, apresenta um substrato ligado a vesícula. A endocitose mediada pela cadeia pesada da BoTN na célula transfectada é seguida por apresentação da cadeia leve na superfície exterior da vesícula, possibilitando à atividade de protease da cadeia leve clivar a sequência de clivagem da(s) proteína(s) híbrida(s), clivando, assim, a porção contendo repórter, a qual é, então, destruída ou degradada para reduzir o sinal sendo testado. Syb de comprimento completo, por exemplo, contém 116 aminoácidos e é localizada em vesículas através de um domínio de transmembrana único. Em alguns ensaios contemplados, o domínio de ancoragem de membrana compreende um fragmento que contém um sítio de palmitoilação. Domínios de ancoragem de membrana são descritos, por exemplo, no documento norte-americano de N° 20060134722 para Chapman.

Embora seja especialmente preferido que o domínio de transmembrana seja o domínio de transmembrana de sinaptobrevina, mutações (por exemplo, transições, transversões, inserções, eliminações, inversões, etc.) do mesmo, e mesmo domínios de transmembrana de não sinaptobrevina são também considerados adequados para uso aqui. Similarmente, deve ser apreciado que o domínio de transmembrana também possa ser substituído por outra porção de polipeptídeo, que permita pelo menos ancoragem temporária da proteína híbrida à membrana, tal que o restante da proteína híbrida seja exposto ao citossol.

Com respeito às células transfectadas que expressam a proteína híbrida, em geral, prefere-se que a célula seja transfectada de maneira estável. No entanto, a transfecção transiente é também contemplada. É ainda adicionalmente tipicamente preferido que a célula transfectada seja uma célula neuronal. No entanto, inúmeros outras células não neuronais (incluindo células de mamíferos, roedores e insetos, e mesmo células de leveduras e bactérias) também estão contempladas aqui. Muitíssimo tipicamente, as células expressarão constitutivamente a(s) proteína(s) híbrida(s) e, portanto, sob elementos reguladores apropriados. Em aspectos alternativos, a expressão também pode ser induzida.

De acordo com uma modalidade preferida, uma molécula de ácido nucléico recombinante, de preferência um vetor de expressão, que codifica um polipeptídeo de substrato de BoNT e um repórter apropriado, é introduzido em uma células de hospedeiro adequada. Um técnico especializado no assunto pode escolher um vetor de expressão adequado, de preferência, um vetor de expressão de mamífero, e reconhecerá que existem enormes números de escolhas. Por exemplo, a série de vetores pcADN, tais como pCI e pSi (a partir de Promega, Madison, Wis.), CDM8, pCeo4. Muitos desses vetores usam promotores virais. De preferência, são usados promotores indutíveis, tais como os vetores tet-off e tet-on a partir de Clontech (Mountain View, CA).

Muitas escolhas de linhagens de células são adequadas como a célula de hospedeiro. De preferência, a célula é de um tipo, no qual a respectiva BoNT exiba suas atividades tóxicas. Em outras palavras, de preferência, as células exibem receptores de superfície celular adequados, ou que de outra maneira permitam que a toxina seja translocada para a célula de maneira suficientemente eficiente, e que permitam que a toxina clive o polipeptídeo de substrato adequado. Exemplos específicos incluem neurônios cultivados primários (neurônios corticais, neurônios do hipocampo, neurônios motores do cordão espinhal, etc.); células PC12 ou linhagens de células PC12 derivadas; células de cromafina cultivadas primárias; várias linhagens de células de neuroblastoma cultivadas, tais como linhagem de células Neuro 2a colinérgicas murinas, linhagem de células SK-N-SH adrenérgicas humanas e linhagem de células NS-26. Ver, por exemplo, Foster e Stringer (1999), Genetic Regulatory Elements Introduced Into Neural Stem and Progenitor Cell Populations, Brain Pathology 9: 547-567.

A região codificante para o repórter I construto de sítio de clivagem está sob o controle de um promotor adequado. Dependendo dos tipos de células de hospedeiro usadas, muitos promotores adequados são conhecidos e estão prontamente disponíveis na técnica. Tais promotores podem ser indutíveis ou constitutivos. Um promotor constitutivo pode ser selecionado para dirigir a expressão do polipeptídeo desejado. Um tal construto de expressão pode fornecer vantagens adicionais, uma vez que ele contorna a necessidade de cultivar os hospedeiros de expressão em um meio contendo um substrato indutor. Exemplos de promotores adequados seriam LTR, SV40 e CMV em sistemas de mamíferos; lac ou trp de E. coli em sistemas bacterianos; promotor de poliedro de baculovírus (polh) em sistemas de insetos e outros promotores que sejam conhecidos para controlar a expressão em células eucarióticas e procarióticas ou seus vírus. Exemplos de promotores constitutivos e/ou indutíveis fortes, que são preferidos para uso em hospedeiros de expressão fúngicos, são aqueles que são obteníveis a partir de genes de fungos para promotores de xilanase (xlnA), fitase, ATP-sintetase, subunidade 9 (oliC), triose fosfato isomerase (tpi), álcool desidrogenase (AdhA), a-amilase (amy), amiloglicosidase (AG - a partir do gene glaA), acetamidase (amdS) e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gpd). Exemplos de promotores de leveduras fortes são aqueles obteníveis a partir dos genes para promotores de álcool desidrogenase, lactase, 3-fosfog lice rato quinase e triose fosfato isomerase. Exemplos de promotores bacterianos fortes incluem promotores SPO2, assim como promotores a partir de genes de proteases extracelulares.

Promotores híbridos também podem ser usados para aperfeiçoar a regulação indutível do construto de expressão. O promotor pode adicionalmente incluir características para assegurar ou para aumentar a expressão em um hospedeiro adequado. Por exemplo, as características podem ser regiões conservadas, tais como uma Pribnow Box ou uma TATA box. O promotor pode mesmo conter outras sequências para afetar (tal como manter, intensificar ou diminuir) os níveis de expressão da sequência de nucleotídeos. Por exemplo, outras sequências adequadas incluem o Shl-íntron ou um intron ADH. Outras sequências incluem elementos indutíveis, tais como elementos indutíveis de temperatura, entes químicos, luz e estresse. Além disso, elementos adequados para intensificar a transcrição ou a tradução podem estar presentes. Um exemplo do último elemento é a sequência de sinal TMV 5’ (ver Sleat, 1987, Gene 217: 217-225; e Dawson, 1993, Plant Mol. Biol. 23: 97).

O vetor de expressão também pode conter sequências que atuem no promotor para amplificar a expressão. Por exemplo, os elementos SV40, CMV e polioma cis-atuante (intensificador) e um marcador selecionável podem fornecer um descritor fenotípico para seleção (por exemplo, di-hidrofolato redutase ou resistência à neomicina, para células de mamíferos, ou resistência à ampicilina / tetraciclina, para E. coli). A seleção do vetor apropriado contendo o promotor e o marcador de seleção apropriados está bem dentro do nível dos técnicos especializados no assunto.

De preferência, a região codificante para o construto está sob o controle de um promotor indutível. Em comparação a um promotor constitutivo, um promotor indutível é preferível porque ele propicia controle adequado da concentração do repórter na célula, portanto, a medição de mudanças de sinais são grandemente facilitadas.

Por exemplo, a expressão pode ser controlada usando-se o sistema Tet-on & Tet-off Clontech (Mountain View, CA). Sob o controle desse promotor, a expressão de genes pode ser regulada de uma maneira precisa, reversível e quantitativa. De maneira breve, para o sistema Tet-on, a transcrição do gene à jusante somente acontece quando doxiciclina estiver presente no meio de cultura. Depois da transcrição durante um certo período de tempo, pode-se mudar o meio de cultura para se remover a doxiciclina, e, assim, parar a síntese de novas proteínas de repórter. Portanto, não há antecedentes a partir de proteínas de repórter recém-sintetizadas, e se pode ser capaz de ver uma mudança mais rápida depois do tratamento com toxina.

A análise fluorescente pode ser realizada usando-se, por exemplo, um sistema de microscópio epifluorescente de contagem de fótons (contendo o espelho dicróico e filtros apropriados para monitoramento da emissão fluorescente na faixa particular), um sistema fotomultiplicador de contagem de prótons ou um fluorômetro. A excitação para iniciar a emissão de energia pode ser realizada com um laser de íons de argônio, uma lâmpada de arco de mercúrio (Hg) de elevada intensidade, uma fonte de luz de fibra óptica ou outra fonte de luz de elevada intensidade apropriadamente filtrada para excitação na faixa desejada. Será evidente para os técnicos especializados no assunto que meios de excitação / detecção possam ser aumentados pela incorporação de meios de fotomultiplicador, para intensificar a sensibilidade de detecção. Por exemplo, o método de correlação cruzada de dois fótons pode ser usado para se conseguir a detecção em uma escala de molécula única (ver, por exemplo, Kohl et al., Proc. Nat'l. Acad. Sei., 99:12161, 2002).

Ambientes locais para o construto diferentes de células vivas são também contemplados, incluindo, por exemplo, citossol de células lisadas, e meios sintéticos que contenham uma ou mais enzimas capazes de degradar o fragmento clivável, quando clivado a partir da molécula de repórter, mas incapazes ou muito menos capazes de degradar o fragmento clivável antes da clivagem a partir da molécula de repórter.

É adicionalmente contemplado fornecer uma molécula de polinucleotídeo isolada que codifica um construto descrito acima. O construto é, de preferência, um vetor de expressão compreendendo a molécula de polinucleotídeo operavelmente ligada a um promotor. Um promotor preferível é um promotor indutível.

Em uma outra modalidade, um kit compreende um construto conforme contemplado aqui, em um recipiente adequado.

A matéria objeto da invenção também fornece um método para seleção de um inibidor de uma neurotoxina botulínica, compreendendo o fornecimento de uma célula engenheirada geneticamente para expressar um construto conforme descrito acima, a exposição da célula à neurotoxina botulínica na presença de um composto inibidor candidato; e a detecção de um sinal fluorescente ou de outro sinal da célula antes e depois da exposição à toxina botulínica, e a comparação do sinal com aquele de uma célula exposta à neurotoxina botulínica na ausência do inibidor candidato. Na extensão em que a redução de sinal foi contornada, o inibidor candidato seria considerado capaz de inibir a neutoxina botulínica. Em algumas modalidades contempladas, o composto candidato poderia ser um membro de uma biblioteca de compostos, e o método poderia ser um método de elevado rendimento.

Descrição Detalhada

Vários objetos, características, aspectos e vantagens da matéria objeto da invenção tornar-se-ão mais evidentes a partir da seguinte descrição detalhada de modalidades preferidas, ao longo das figuras de desenho acompanhantes, nos quais números iguais representam componentes iguais.

A Figura 1 diagrama um ensaio exemplificative, no qual repórteres com base em célula de BoNT/A são usados para detectar a atividade de BoNT/A por perda de fluorescência de YFP. (A) Construto de BioSentinel’s BoCell™ A BoNT/A. O fluoróforo de repórter, YFP, e o fluoróforo de normalização, CFP, estão acoplados por uma sequência de divagem, SNAP-25 (verde). A palmitoilação de SNAP_25 localiza o repórter em uma membrana de plasma. (B) Detecção de atividade de BoNT/A por perda de fluorescência de YFP. A porção de YFP é diretamente excitada conduzindo a emissão de fluorescência na ausência de BoNT/A. A divagem do repórter por BoNT/A libera um fragmento de repórter C-terminal contendo a porção de YFP para o citossol. O fragmento é rapidamente degradado e, assim, a emissão de YFP é perdida. O sinal de CFP é ainda usado para controlar os níveis de expressão de repórter célula a célula e a densidade celular.

Surpreendentemente, nem todas as proteínas fluorescentes relacionadas à YFP são eficazes como o fluoróforo de repórter. Por exemplo, a Figura 2 fornece evidência de que repórteres contendo YFP ou o derivado proximamente relacionado vénus podem detectar a atividade de BoNT/A em células, mas não mCereja ou mMorango. Aqui, células Neuro 2A foram cultivadas em uma placa com 96 cavidades até 70% de confluência e transfectadas de maneira transiente usando-se Lipofectamine 2000 (Invitrogen™), com repórteres contendo o par de fluoróforos N-terminal e C-terminal (N-term/C-term) indicado. Depois de 24 horas, as células foram incubadas na presença ou na ausência de BoNT/A 10 nM, à 37°C durante 72 horas, em 100 μl_ de meio MEM livre de Vermelho de Fenol.

A Figura 2A mostra mudanças induzidas por BoNT/A em respostas de fluorescência. Medições de fluorescência de YFP e de CFP semiautomáticas foram realizadas usando um microscópio Nikon™ TE2000-U com aumento de 20 x e programa de computador Nikon N/S Elements 3.4. São mostrados campos selecionados aleatoriamente pseudo-coloridos para a razão de fluorescência de proteína fluorescente (FP) C-terminal/N-terminal. As razões foram calculadas a partir de emissões coletadas quando da excitação direta de cada fluoróforo.

A Figura 2B representa razões de fluorescência e sensibilidades de BoNT/A dos repórteres com base em célula. 30 células selecionadas aleatoriamente por condição foram analisadas em relação às razões de fluorescência, na presença ou na ausência de BoNT/A 10 nM. É mostrado o sinal médio a partir das 30 células a partir de 5 campos microscópicos em 3 diferentes cavidades. Células exibindo fluorescência super-saturada foram excluídas.

A Figura 2C. Essa é um blot mostrando que BoNT/A era ativa em células independentemente do repórter. Todos os repórteres mostra alguma clivagem na presença de BoNT/A, e todas as SNAP25s nativas estão clivadas. As células foram transfectadas e tratadas com BoNT/A conforme descrito acima, mas sofreram aumento de escala para placas com 6 cavidades. Depois de incubação por 72 horas com BoTN/A, as células foram lavadas 3 X com MEM livre de soro, coletadas por raspagem e lisadas usando-se tampão de lise M-Per (Pierce™). 40 μg de lisado de células foram submetidos à SDS-PAGE antes da transferência para papel de nitro-celulose e análise por imunoblot, usando-se um anticorpo dirigido contra SNAP-25 (clone 71.2, Synaptic Systems). As setas indicam a posição das formas de comprimento completo (fechada) e clivada (aberta) dos repórteres. São indicadas SNAP-25 nativa de comprimento completo (*) e clivada (**).

Visto de outra perspectiva, a matéria objeto da invenção pode ser estendida para além de substratos clivados, para qualquer ensaio tendo um construto com um repórter que possa ser desprotegido e, então, degradado de alguma maneira pelo citossol ou outro ambiente local. Por exemplo, um repórter suscetível poderia ser modificado para incluir um domínio de “isca”, que é usado para seleção em face de uma biblioteca de proteínas recombinantes, que, possivelmente, poderiam se ligar ao domínio de isca. Se o domínio de isca protegido por uma proteína de ligação, o repórter suscetível será degradado. Em um tal ensaio, células que expressam proteínas de ligação formarão um complexo para proteger o repórter suscetível contra degradação, enquanto que células que expressam um parceiro de ligação à isca se iluminarão. O domínio de isca, vantajosamente, serão um peptídeo pequeno, e os parceiros de ligação poderiam ser membros de uma biblioteca de proteínas (ou mutantes de proteínas). O sistema também poderia ser revertido, tal que haja uma biblioteca de domínios de isca testados em face de uma única proteína de teste (ou biblioteca de proteínas de teste).

Em cada um desses casos, considera-se vantajoso incluir um segundo repórter que não seja degradado, pelo citossol ou outro ambiente local, depois da exposição, ou que seja pelo menos degradado muito mais lentamente depois da exposição do que o primeiro repórter.

Ainda adicionalmente, enquanto que o repórter pode ser convenientemente selecionado a partir de fluoróforos adequados, contempla-se que o repórter poderia ser substituído ou aumentado por qualquer outra proteína ou outro componente com uma função definida, que sejam conhecidos por (a) terem uma reposição (turnover) relativamente rápida na célula sem proteção, e (b) o fato de poderem ser protegidos por interação com um parceiro de ligação. Funções definidas incluem ativadores de transcrição para gene repórter, repressores para genes letais, etc. (qualquer coisa que possa ser facilmente identificada ou selecionada em face de).

Figura 3. Nessa modalidade, os dados foram coletados tanto para degradação de YFP quanto para perda de FRET de acordo com a prática do estado da técnica a partir de exatamente as mesmas placas de células. Para degradação de YFP, são coletadas emissões de YFP excitadas diretamente e singularmente (topo, Ex500, Em526) e emissões de CFP excitadas diretamente e singularmente (meio, Ex434, Em470). Aquelas emissões são, então, subtraídas de fundo e a emissão de YFP é dividida por emissão de CFP, para controlar a densidade celular e a expressão de repórter nas células individuais. Aquela razão de emissão (YFP/CFP, fundo) é, então, usada para o ensaio é relatado.

Para perda de FRET, são coletadas emissões de FRET (topo, Ex434, Em526) e emissões de CFP (meio, Ex434, Em470). Aquelas emissões são, então, subtraídas de fundo e a emissão de FRET é dividida por emissão de CFP, para controlar a densidade celular e a expressão de repórter nas células individuais. Aquela razão de emissão (FRET/CFP, fundo) é mostrada aqui para se comparar com o método normal.

A comparação chave é a perda de emissão de YFP excitada diretamente versus a perda de emissão de FRET. A partir da comparação entre as medições e das curvas correspondentes, torna-se imediatamente evidente que a faixa dinâmica global para degradação de YFP é muito maior do que a faixa dinâmica de perda de emissões de FRET. Em alguns caso, não há diferença, estatisticamente, entre células não tratadas com BoNT versus células com concentrações saturantes de BoNT, quando se olha somente para as emissões de FRET brutas. Para a perda do método com FRET, a resposta à dose de BoNT somente se torna clara depois da divisão da emissão de FRET pela emissão de CFP (doador). A emissão de CFP (doador) mostra um pequeno aumento de emissão devido ao re-extinção (dequenching) em resposta à divagem do repórter.

Em resumo, a perda do método com FRET relata mudanças induzidas por BoNT no repórter muito pobremente, ou não em absoluto, e, portanto, não pode ser usada para um determinação qualitativa e quantitativa correta. Ao contrário, os métodos preferidos aqui contemplados têm um elevado grau de especificidade e de reprodutibilidade, os quais permitem fundamentar os dados para a análise tanto qualitativa quanto quantitativa.

Construção Genética de Repórteres Alternativos

Vinte construtos de fluoróforos alternativos foram gerados em quatro bases (backgrounds) de plasmídeo. Abaixo está o nome interno de cada construto, com uma breve descrição da base e do fragmento clonado. Um resumo mais detalhado dos métodos de construção se segue.

pMD0076a, pMD0076b, pMD0097 e pMD0098

Foram gerados construtos por amplificação dos fluoróforos mFramboesa, mCereja, mKate2 e TagRFP com sítios de restrição de Kpnl e Xhol engenheirados. Os fragmentos amplificados e o vetor pcDNA4/TO BoCell previamente usado gerado foram, então, digeridos com Kpnl/Xhol. O ADN de vetor, menos a CFP extirpada, foi, então, ligado aos fragmentos de mFramboesa, mCereja, mKate2 e TagRFP, para criar os vetores finais.

PMD0079 e pMD0091

Para pMD0079, SNAP YFP foi amplificado com sítios de restrição de BamHI e Xhol engenheirado. O fragmento amplificado e o ADN de vetor pcDNA4/TO foram, então, digeridos com BamHI/Xhol e, então, ligados em conjunto. pMD0091 foi, então, gerado por amplificação do fluoróforo Vénus com sítios de restrição de EcoRI e Xbal engenheirados. O fragmento de Vénus amplificado e pMD0079 foram, então, digeridos com EcoRI/Xbal. O ADN de vetor pMD0079, menos a YFP extirpada, foi, então, ligado com o fragmento de Vénus para criar pMD0091.

PMD0077 e pMD0090

Para pMD0077, SNAP YFP foi amplificado com sítios de restrição de Nhel e Xhol engenheirados. O fragmento amplificado e o ADN de vetor pIRES foram, então, ligados com Nhel/Xhol e, então, ligados em conjunto. O fluoróforo de CFP foi, então, amplificado com sítios de restrição de Xbal/Notl engenheirados. O fragmento amplificado e o vetor pIRES contendo SNAP YFP previamente gerado foram, então, digeridos com Xbal/Notl e ligados em conjunto para criar pMD0077. pMD0090 foi, então, gerado por amplificação do fluoróforo de Vénus com sítios de restrição de EcoRI e Mlul engenheirados. O fragmento de Vénus amplificado e pMD0077 foram então digeridos com EcoRI/MIul. O ADN de vetor pMD0077, menos a YFP extirpada, foi então ligado com o fragmento de Vénus para criar pMD0090.

PMD0078 e pMD0080

Para pMDOOδO, SNAP YFP foi amplificado com sítios de restrição de Nhel e Xhol engenheirados. Então, o fragmento amplificado e pECFP-C1 foram, então, digeridos com Nhel/Xhol. O ADN de vetor, menos a CFP extirpada, foi, então, ligado com SNAP YFP para criar pMD0080. pMD0078 foi, então, gerado por amplificação do promotor de sinapsina com sítios de restrição de Asei e Nhel engenheirados. O fragmento amplificado e pMD0080 foram, então, digeridos com Asel/Nhel. O ADN de vetor pMD0080, menos o promotor de CMV extirpado, foi, então, ligado com o promotor de sinapsina, para criar pMD0078.

PMD0081, pMD0082, pMD0099, pMDOIOQ

Foram gerados construtos por amplificação dos fluoróforos mFramboesa, mCereja, mKate2 e TagRFP com sítios de restrição de Nhel e Xhol engenheirados. Os fragmentos amplificados e o construto BoCell original a partir de Min (base em pECFP-C1) foram, então, digeridos com Nhel/Xhol. O construto BoCell, menos o fragmento de CFP extirpado, foi, então, ligado com os fragmentos de mFramboesa, mCereja, mKate2 e TagRFP, para criar pMD0081, pMD0082, pMD0099 e pMDOlOO.

PMD0092

Para pMD0092, o fluoróforo de Vénus foi amplificado com sítios de restrição de EcoRI e Xbal engenheirados. O fragmento amplificado e pMD0080 foram, então, digeridos com EcoRI/Xbal. O pMD0080, menos o fragmento de YFP extirpado, foi, então, ligado com o fragmento de Vénus, para gerar pMD0092.

PMD0103, PMD0104 e pMD0105

O construto SNAP YFP foi amplificado com sítios de restrição Xbal e BamHI engenheirados. O fragmento amplificado e o vetor pBudCE4.1 foram, então, digeridos com Xbal/BamHI e ligados em conjunto. Os fluoróforos CFP, mFramboesa e mCereja foram, então, amplificados com sítios de restrição de Kpnl e BgIII engenheirados. Os fragmentos amplificados e o vetor pBudCE4.1 previamente gerado contendo SNAP YFP, foram, então, digeridos com Kpnl/Bglll e ligados em conjunto para gerar pMD0103, pMD0104 e pMD0105.

PMD0106, PMD0107 e pMD0108

O construto SNAP Vénus foi amplificado com sítios de restrição de Xbal e BamHI engenheirados. O fragmento amplificado e o vetor pBudCE4.1 foram, então, digeridos com Xbal/BamHI e ligados em conjunto. Os fluoróforos de CFP, mFramboesa e mCereja foram, então, amplificados com sítios de restrição de Kpnl e Bglll engenheirados. Os fragmentos amplificados e o vetor pBudCE4.1 previamente gerado contendo SNAP Vénus foram, então, digeridos com Kpnl/Bglll e ligados em conjunto, para gerar pMD0106, pMD0107 e pMD0108.

Seleção Primária dos Repórteres Alternativos

Células Neuro2A foram semeadas em placas com 96 cavidades e deixadas expandir 24-48 horas, antes de se transfectar, de maneira transiente, as células usando-se os construtos genéticos acima e Lipofectamine 2000™ de acordo com as instruções do fabricante. As células transfectadas foram deixadas em recuperação durante 24 horas de aplicação de 0 ou 30 nM de holotoxina BoNT/A e incubação das células em um adicional de 24 horas à 37°C, com CO2 à 5%. As células foram, então, submetidas à formação imagem usando-se um microscópio de fluorescência Nikon-TE2000U tirando-se um mínimo de três imagens por condição. Emissões de fluorescência foram coletadas usando-se filtros apropriados para os fluoróforos listados. Emissões de fluorescência totais foram, então, coletadas usando-se um leitor de microplacas de fluorescência Varioskan™ usando-se ajustes de comprimentos de onda de excitação e de emissão apropriados.

Dados de microscopia de fluorescência foram processados para se isolar a expressão de células (saturadas) com base em intensidades de pixel para um dado canal. Emissões totais a partir de cada canal foram, então, coletadas e, quando indicado, as emissões de YFP ou Vénus que respondem à BoNT/A foram divididas pelas emissões de CFP, RFP (mKate2, mFramboesa ou mCereja) que não respondem à BoNT/A ou emissões de corante (Repórter Alternativo 2) de membrana adicionado exogenamente.

Cada construto de repórter, usando-se os dados coletados acima, foi analisado em relação ao seguinte: Direcionamento celular de cada repórter foi julgado pela presença de expressão de fluorescência uniforme na membrana plasmática. O pobre direcionamento para membrana plasmática foi associado com a presença de pintas pontuais brilhantes dentro da célula, repórteres carecendo de direcionamento para membrana plasmática foram eliminados de consideração adicional. Emissões de fluorescência totais e, portanto, expressão de repórter total, foram julgados pelas emissões de uma dada sonda fluorescente em relação às emissões de fundo. Sondas que não deram um sinal > 2 vezes que aquele de fundo foram eliminadas de consideração adicional.

Seleção Secundária dos Repórteres Alternativos: respostas a dose de BoNT/A

Construtos genéticos que foram aprovados na seleção primária foram transfectados de maneira transiente em células, conforme descrito acima, mas usando concentrações de ADN variáveis. A variação da concentração de ADN gerou células com níveis variáveis de expressão de repórter. Depois de transfecção e de um período de recuperação de 24 horas, as células transfectadas foram tituladas com BoNT/A 10 pM a 30 pM e deixadas a incubar adicionalmente. Depois de incubação, emissões de fluorescência foram coletadas usando-se um leitor de microplacas de fluorescência Varíoskan usando-se ajustes de comprimento de onda de excitação e de emissão apropriados. Para todos os experimentos, respostas de repórter de teste foram comparados diretamente ao repórter BoCell corrente CFP-SNAP25-YFP, que foi transfectado de maneira transiente em paralelo.

Emissões de fluorescência para a YFP de resposta a BoNT/A foram divididas pelas emissões de CFP, RFP (mKate2, mFramboesa ou mCereja) que não respondem à BoNT/A ou emissões de corante (Repórter Alternativo 2) de membrana adicionado exogenamente gerando uma razão de emissão. A razão de emissão foi, então, lançada em gráfico como uma função de concentração BoNT/A. Os dados foram comparados ao repórter BoCell. A adequabilidade do repórter de teste foi avaliada qualitativamente por comparação ao repórter BoCell: BoNT/A desencadeia uma resposta similar com o repórter de teste comparada ao repórter BoCell corrente?

Seleção Secundária dos Repórteres Alternativos: Emissões de FRET

Construtos genéticos de repórter foram transfectados em células plaqueadas em lamínulas de vidro usando-se Lipofectamine de acordo com o protocolo do fabricante. Para cada construto, controles de fluoróforo único também foram transfectados. Depois de um período de recuperação de 24 horas, as células foram tratadas com ou sem BoNT 30 nM. Usando-se os controles para cada repórter, foram capturadas imagens por microscopia de fluorescência e as imagens foram usadas para calibrar determinações de FRET por um método de ajuste de três filtros. Repórteres foram, então, avaliados em relação à eficiência de FRET na presença e na ausência de BoNT/A. Para todos os experimentos, respostas de repórter de teste foram comparadas diretamente ao repórter BoCell corrente CFP-SNAP25-YFP, que foi transfectado de maneira transiente em paralelo. Cada repórter de teste foi avaliado em relação à presença de FRET e de se as emissões de FRET respondiam à BoNT/A. A conclusão foi de que emissões de FRET não representam um método de seleção confiável, em linha com as condições já observadas no Exemplo 3.

Deve ser evidente para os técnicos especializados no assunto que são possíveis muitas modificações, além daquelas já descritas, sem se desviar dos conceitos da invenção acima. A matéria objeto da invenção, portanto, não deve estar restrita, exceto no escopo das reivindicações apensa. Além disso, ao se interpretar tanto o relatório descritivo quanto as reivindicações, todos os termos devem ser interpretados da maneira a mais ampla possível consistente com o contexto. Em particular, os termos “compreende” e “compreendendo” deve ser interpretado como se referindo a elementos, componentes ou etapas de uma maneira não exclusiva, indicando que os elementos, componentes ou etapas referenciados podem estar presentes, ou ser utilizados, ou combinados com outros elementos, componentes ou etapas que não sejam referenciados de maneira expressa. Quando o relatório descritivo e as reivindicações se referirem a pelo menos uma de alguma coisa selecionada a partir do grupo consistindo em A, B, C... e N, o texto deve ser interpretado como exigindo somente um elemento a partir do grupo não A mais N, ou B mais N, etc.

Claims

1. Método para a detecção de uma toxina botulínica, caracterizado pelo fato de compreender: (i) fornecimento de uma composição, que inclui um construto artificial e uma enzima, sendo que o construto compreende (a) uma primeira porção compreendo um primeiro fluoróforo (b) uma segunda porção compreendo um segundo fluoróforo, (c) um sítio de clivagem situada entre a primeira porção e a segunda, que é clivado quando interage com a porção, da toxina botulínica separando assim a primeira porção da primeira porção do restante do construto, (d) em que a enzima é capaz de degradar a primeira porção após ser clivado a partir do restante do constructo por toxina botulínica; (ii) obtenção uma medição de emissão de sinal de linha de base de cada um dos primeiro e segundo fluoróforos ; (iii) exposição da composição à uma amostra suspeita de conter toxina botulínica; (iv) obtenção de medições de emissão adicionais do primeiro fluoróforo, em que a uma redução da emissão de fluorescência seguido da degradação é um indicativo da presença de toxina; do (v) normalizar a medição com o auxílio de uma medição de emissão do segundo fluoróforo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro fluoróforo é selecionado do grupo que consiste em . Proteína Fluorescente Amarela (YFP) e vênus.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira porção inclui um cromóforo.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o construto é produzido endogenamente por uma célula transfectada viva.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição está contida em uma célula transfectada viva, o sítio de clivagem compreende pelo menos uma proteína, motivo ou muteína SNARE, e a primeira porção repórter compreende pelo menos um de Proteína Fluorescente Amarela (YFP) e vênus.

6. 6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a medição de emissão de sinal de linha de base é obtida excitando diretamente o segundo fluoróforo.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a diminuição da emissão de fluorescência é medida pela coleta de emissões diretamente, primeiro fluoróforo excitado separadamente e segundo fluoróforo.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a emissão fluorescente do segundo fluoróforo é usada para corrigir as variações na densidade celular e as variações na expressão do repórter em células individuais.