CN107475293A - 非‑fret肉毒梭菌测定法 - Google Patents

非‑fret肉毒梭菌测定法 Download PDF

Info

Publication number
CN107475293A
CN107475293A CN201710697371.3A CN201710697371A CN107475293A CN 107475293 A CN107475293 A CN 107475293A CN 201710697371 A CN201710697371 A CN 201710697371A CN 107475293 A CN107475293 A CN 107475293A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
fluorogen
hybrid protein
reporter
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710697371.3A
Other languages
English (en)
Inventor
D.阿塔帕图
W.塔克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomadison Inc
BIOSENTINEL Inc
Original Assignee
BIOSENTINEL Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BIOSENTINEL Inc filed Critical BIOSENTINEL Inc
Publication of CN107475293A publication Critical patent/CN107475293A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/33—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Clostridium (G)

Abstract

本发明涉及非‑FRET肉毒梭菌测定法。包含人工构建体的组合物，所述构建体具有(a)含报道物的部分，其化学偶联到(b)切割位点。所述切割位点以从所述构建体的剩余部分切割含报道物的部分的方式与研究的物质相互作用。所切割的部分被局部环境破坏或另外降解，并通过降低来自报道物的信号而证实研究的物质的存在。所述研究的物质优选地是肉毒梭菌毒素(BoTN)，所述切割序列是SNARE蛋白的全部或部分。所述可切割的含报道物的部分优选地是黄色荧光蛋白(YFP)、Citrine、Venus或YPet蛋白。

Description

非-FRET肉毒梭菌测定法
本申请为分案申请，原申请的申请日为2012年5月31日，申请号为201280036866.7(PCT/US2012/040240)，发明名称为“非-FRET肉毒梭菌测定法”。
本申请要求2011年6月1日提交的美国临时专利申请序列号61/492237的优先权权益。优先权申请，以及本文中所引用的所有其它出版物都通过引用结合到本文中，其程度如同特别并且逐一地指明每个出版物或专利申请以通过引用结合。如果所结合的参考文献中的某术语的定义或用途与本文所提供的该术语的定义不一致或有冲突的话，以本文所提供的该术语的定义为准，而不采用参考文献中的该术语的定义。
发明领域
本发明的领域是蛋白酶测定，具体而言是肉毒梭菌毒素相关的那些。
背景
肉毒梭菌神经毒素(BoNT)是由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生的，是已知的最强毒素之一。这些毒素是公认的食物中毒的来源，常导致严重危害，甚至受害者死亡。有7种结构相关的肉毒梭菌神经毒素或血清型(BoNT/A-G)，每种都是由一条重链(约100 KD)和一条轻链(约50 KD)组成。重链通过受体-介导的胞吞作用而介导毒素进入靶细胞。一旦内在化之后，轻链从内体小泡腔易位到胞质溶胶，并起到锌-依赖性蛋白酶的作用，以切割介导小泡-靶膜融合的蛋白质(“底物蛋白”)。
这些BoNT底物蛋白包括质膜蛋白突触融合蛋白、外周膜蛋白SNAP-25和小泡膜蛋白小突触泡蛋白(Syb)。这些蛋白质统称为SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺-敏感因子连接蛋白受体)蛋白。SNARE蛋白的切割阻断了小泡与质膜融合并废止了在神经肌肉接头的神经递质的释放。在SNARE蛋白中，突触融合蛋白和SNAP-25通常驻留在靶膜上并因此而称为t-SNARE，而小突触泡蛋白则仅在突触内的突触小泡中被发现并称为v-SNARE。这3种蛋白一起构成复合体，这被认为是介导小泡膜和质膜间融合的最小机器。在单一但不同的位点上，BoNT/A、E和C1切割SNAP-25，BoNT/B、D、F、G切割小突触泡蛋白(Syb)。除了SNAP-25之外，BoNT/C也切割突触融合蛋白。
除非上下文有相反说明，否则本文中所给出的所有范围都应理解为包括它们的端点在内，开放式的范围应当理解为包括工业上实用的数值。同样，数值的所有列表都应视为包括中间数值，除非上下文有相反说明。
因为BoNT作为食物中毒来源和作为生物恐怖武器的威胁，所以需要灵敏而快速地检测它们。目前，检测毒素的最灵敏方法是在小鼠中进行毒性测定。该方法需要大量小鼠，耗费时间，且不可用于研究毒素的催化动力学。也已开发出大量的扩增免疫测定系统(其基于使用针对毒素的抗体)，但大多数这类系统都需要复杂而昂贵的扩增过程，而且也不可用于研究毒素的催化活性。尽管HPLC和免疫测定可用于检测切割的底物分子并测量这些毒素的酶活性，但这些方法通常耗时而复杂，它们中的某些需要专门的抗体，使得它们不适用于大规模筛选。因此，需要用于检测BoNT的新的和改进的方法和组合物。
在过去几年中，研究人员已经开始研究FRET测定法在检测BoNT中的用途。在FRET测定中，2个荧光生成的(fluorigenic)氨基酸衍生物用于置换含有毒素切割位点的合成短肽(12-35个氨基酸)中的2个天然氨基酸。一个氨基酸衍生物的荧光信号被另一个氨基酸衍生物猝灭，当它们在肽中彼此靠近时。该机制称为“荧光共振能量转移(Förster resonanceenergy transfer，FRET)”。肽的切割将这两个氨基酸衍生物分开，使得可以检测在FRET中的降低。
FRET测定法已经成功用于检测BoNT。(参见例如美国专利申请号2004/0191887(授予Chapman)，2003年10月28日申请，美国专利申请号2006/0134722(授予Chapman)，2004年12月20日申请，美国专利号7208285(授予Steward)(2007年4月)，美国专利号7183066(授予Fernandez-Salas)(2007年2月)和申请US2011/0033866 (2010年2月公布)。
尽管在应用FRET测定法以检测BoNT中已经证明了某些成功，但是对于许多目的而言，灵敏性和特异性仍不合乎需要。
在用于BoNT底物蛋白定位的FRET测定中，例如，对于在肽切割之后FRET发射损失的测量可受到严重干扰，使得在某些情况下在无BoNT处理的细胞与用饱和浓度的BoNT处理的细胞之间没有差异。因此，可以说，基于FRET损失的方法报道BoNT诱导的改变非常差并且因此其低的统计学表现和再现性使之成为不可靠的方法。美国申请2009/0191583 (授予Ester Fernandez-Salas)要求保护仅使用单个荧光团的非-FRET BoNT测定法。该文件中公开的测定法使用能有效摄取梭菌毒素并包含膜定位的梭菌毒素底物(其含有荧光标记)的细胞。
作为一个实例，可用于此文的细胞可表达定位在质膜上的SNAP25206-增强的绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白。在BoNT/A处理该细胞之后，膜定位的SNAP25206-EGFP底物发生切割，将含EGFP的片段释放到细胞质中。经处理细胞用484nM激光激发之后，EGFP被激发并在510nM发光。然而，因为EGFP的一部分是细胞质的，所以在BoNT/A处理的细胞中可观察到未切割的、膜定位的SNAP25206-EGFP毒素底物与已切割的、细胞质定位的EGFP片段之间的分布变化。因此，该测定法可用于定性分析，但在膜和细胞质中均存在EGFP发射部分，使得该方法用于定量分析时不合乎需要。
因此，仍然需要改进的设备、系统和方法，其克服FRET和非-FRET两种测定法相关的现有技术的缺陷和局限。
发明概述
本发明提供方法和测定法，其特征在于组合物包含人工构建体，所述构建体具有(a)含报道物(reporter)的部分，其化学偶联到(b)切割位点，其以从构建体的剩余部分切割含报道物的部分的方式与研究的物质相互作用。具体的一类实施方案涉及定性和定量检测肉毒梭菌毒素的方法，包括：
(i) 提供包含人工构建体和酶的组合物，
其中所述构建体具有(a)含报道物的部分和(b)切割位点，其以引起从所述构建体的剩余部分切割含报道物的部分的方式与肉毒梭菌毒素的一部分相互作用，
其中所述组合物显示出鉴别基线信号的发射；和
其中所述酶促进含报道物的部分降解，切割后至少10倍于切割前；
(ii) 获取来自所述基线信号的第一发射测量；
(iii) 使所述组合物暴露给肉毒梭菌毒素；和然后
(iv) 通过测试所述组合物对基线信号的降低作为以下的指示，获取进一步发射测量：
- 所述毒素在切割位点切割所述构建体，和
- 含报道物的部分的降解；
(v) 将步骤(ii)的第一发射测量与步骤(iv)的进一步测量进行比较。
如本文中所用，除非上下文另有说明，否则术语“偶联到”旨在包括直接偶联(其中彼此偶联的两个元件彼此接触)和间接偶联(其中至少一个额外元件位于这两个元件之间)两者。因此，术语“偶联到”和“与…偶联”是同义词。
此外，本发明的主题也涉及测试研究的物质(investigative substance)的存在情况的测定法，包括具有人工构建体和酶的细胞，其中所述构建体具有受保护的部分(protected portion)和保护部分(protecting portion)，对其进行选择使得所述受保护的部分包含报道物，并且所述研究的物质在体外对所述受保护的部分起到脱保护的作用，其中所述酶促进所述受保护的部分的降解，在脱保护时为受保护时的至少10倍，从而降低了可得自报道物的信号，其用于定量测定所述研究的物质。
切割的含报道物的部分被局部环境破坏或另外降解，然后，通过降低来自报道物的信号而证实研究的物质(investigational substance)的存在。在本申请的情况下，考虑到受保护的部分的降解通常将在胞内通过两个途径中的至少一个，通过将蛋白靶向蛋白酶体的泛素-依赖性过程，或通过自体吞噬-溶酶体途径。在一个途径中，蛋白酶体是所述酶。在溶酶体途径中，考虑到目标酶是水解酶，尤其包括被称为组织蛋白酶的蛋白酶家族。
在优选的实施方案中，研究的物质是肉毒梭菌毒素(BoTN)，并且切割序列与所述研究的物质适当匹配。例如，在单一、但不同的位点上，BoNT/A、E和C切割SNAP-25，BoNT/B、D、F、G切割小突触泡蛋白(Syb)。除了SNAP-25之外，BoNT/C还切割突触融合蛋白。
所考虑的切割位点序列可有利地包含(a) SNARE蛋白、基序或突变蛋白。蛋白的“突变蛋白”在本文中应当视为与相应的天然蛋白具有至少30%同一性，包括例如与天然蛋白具有至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%同一性的组合物。同一性的变化可包括任何或更多的添加、缺失和取代。所考虑的突变蛋白包括片段、截短物和融合蛋白。
在优选实施方案的另一方面，可切割的含报道物的部分包含荧光蛋白，例如，黄色荧光蛋白(YFP)。YFP是绿色荧光蛋白的遗传突变体，衍生自维多利亚多管发光水母(Aequorea Victoria)，具有的激发峰为514nm，发射峰为527nm。
还考虑用于可切割的含报道物的部分是密切相关的Citrine、Venus和YPet蛋白。修饰具有降低的氯化物敏感性、更快的成熟和增加的亮度(消光系数和量子产率的产物)。当然，可修饰本文中所提到的任何荧光蛋白，使其包含特定的特性(例如光谱的)或使其截短到特定的大小。
切割之后，所述构建体被切割成两部分，含报道物的部分(其被胞质溶胶或其它局部环境破坏或另外降解)和第二部分。为了使信号检测标准化，该第二部分可有利地包含第二荧光蛋白，优选地在与报道物的相对端，其可有助于使测定标准化。第二荧光蛋白可以是例如青色荧光蛋白(CFP)、mCherry或mStrawberry。含报道物的部分不与第二荧光团以产生荧光共振能量转移(FRET)的方式偶联。
因此，在使构建体暴露给BoTN或其它切割物质之前，含构建体(无论是基于细胞的还是其它的)的组合物显示出基线信号，而在暴露之后则显示出降低的信号。对于YFP降解的测量，收集直接、分别激发的YFP发射(顶端, Ex500, Em526)和CFP发射(中间, Ex434,Em470)。随后将这样的发射减去背景并且将YFP发射除以CFP发射以控制细胞密度和各个细胞中的报道物表达。该发射比率(YFP/CFP, 底部)是该测定如何报道的。
含报道物的部分的破坏或其它降解以在BoTN暴露后比暴露前快得多的速率发生。在优选的实施方案中，考虑到含报道物部分的破坏或其它降解的发生在暴露后比暴露快，为至少2x (2倍)，但更优选地，暴露后速率是暴露前速率的至少5x、至少10x、至少100x。
在优选实施方案的另外方面，局部环境是活细胞的胞质溶胶。例如，YFP可用作C-端荧光团，CFP可用作N-端荧光团。实验工作现在已经证实在BoNT/A不存在时，YFP可被直接激发并收集发射。激发的发生通常在505nM，而相应的发射在527nM。在BoNT/A存在时，切割报道物，释放含YFP的片段。该片段被细胞降解，破坏了YFP及其发射。因此，通过测量YFP发射的损失而检测BoNT/A活性。因此不需要FRET，避免了上述的所有局限和问题。
在转染的细胞中形成的杂合蛋白优选地包括跨膜结构域，其倾向于定位于胞内小泡，并因此呈现小泡-结合的底物。重链-介导的BoNT胞吞到转染的细胞，接着是小泡外表面上轻链的呈现，允许轻链的蛋白酶活性切割杂合蛋白的切割序列，因此切割含报道物的部分，其然后被破坏或降解，以降低测试的信号。全长Syb，例如，含有116个氨基酸，并且通过单一跨膜结构域而定位于小泡。在某些所考虑的测定法中，膜-锚定结构域包含含有棕榈酰化位点的片段。合适的膜-锚定结构域描述于例如US 20060134722 (授予Chapman)。
尽管特别优选地是跨膜结构域是小突触泡蛋白的跨膜结构域，但其突变(例如转换、颠换、插入、缺失、倒位等)和甚至非小突触泡蛋白跨膜结构域也被视为适用于本文中。同样，应当理解，跨膜结构域也可被另一多肽部分置换，这允许杂合蛋白至少暂时锚定在膜上，使得杂合蛋白的剩余部分暴露给胞质溶胶。
对于表达杂合蛋白的转染的细胞，通常优选的是细胞是稳定转染的。然而，也考虑到瞬时转染。另外通常还优选的是转染的细胞是神经元细胞。然而，本文中也考虑到大量其它非神经元细胞(包括哺乳动物细胞、啮齿类细胞和昆虫细胞、甚至酵母细胞和细菌细胞)。最典型地，所述细胞将会组成型地表达杂合蛋白，因此处于合适的调节元件之下。在备选的方面，也可诱导所述表达。
依据一个优选的实施方案，将编码BoNT底物多肽和合适报道物的重组核酸分子，优选表达载体，引入合适的宿主细胞。普通技术人员可选择合适的表达载体，优选哺乳动物表达载体，并将认识到有大量选择。例如，pcDNA系列载体，例如pCI和pSi (来自Promega,Madison, Wis.)、CDM8、pCeo4。许多这样的载体使用病毒启动子。优选地，使用诱导型启动子，例如来自Clontech (Mountain View, CA)的tet-off和tet-on载体。
细胞系的许多选择都适合作为宿主细胞。优选地，所述细胞是其中各自的BoNT显示出其有毒活性的种类。换句话说，细胞优选显示合适的细胞表面受体，或另外允许毒素充分有效地易位到细胞中，并且允许毒素切割合适的底物多肽。具体的实例包括原代培养的神经元(皮质神经元、海马神经元、脊髓运动神经元等)；PC12细胞或衍生的PC12细胞系；原代培养的嗜铬细胞；若干培养的成神经细胞瘤细胞系，例如鼠胆碱能Neuro 2a细胞系、人肾上腺素能SK-N-SH细胞系和NS-26细胞系。参见例如Foster和Stringer (1999), GeneticRegulatory Elements Introduced Into Neural Stem and Progenitor CellPopulations, Brain Pathology 9: 547-567。
报道物/切割位点构建体的编码区处于合适启动子的控制之下。根据所用的宿主细胞的种类，许多合适的启动子在本领域是已知的和容易得到的。这样的启动子可以是诱导型的或组成型的。可选择组成型启动子以指导所需多肽的表达。这样的表达构建体可提供额外的优势，因为它避免了在含有诱导底物的培养基上培养表达宿主的需要。合适启动子的实例可为：在哺乳动物系统中的LTR、SV40和CMV；在细菌系统中的大肠杆菌(E. coli)lac或trp；在昆虫系统中的杆状病毒多角体启动子(polh)；以及在真核细胞和原核细胞或它们的病毒中已知控制表达的其它启动子。优选用于真菌表达宿主的强的组成型和/或诱导型启动子的实例是可得自以下真菌基因的那些：木聚糖酶(xlnA)、植酸酶、ATP-合成酶、亚单位9 (oliC)、磷酸丙糖异构酶(tpi)、醇脱氢酶(AdhA)、α-淀粉酶(amy)、淀粉葡糖苷酶(AG—来自glaA基因)、乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子。强的酵母启动子的实例是可得自以下基因的那些：醇脱氢酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸激酶和磷酸丙糖异构酶。强的细菌启动子的实例包括SPO2启动子以及来自胞外蛋白酶基因的启动子。
杂合启动子也可用于改进表达构建体的诱导型调控。所述启动子可额外地包括在合适宿主中确保或增加表达的特征。例如，所述特征可以是保守区，例如Pribnow Box或TATA盒。启动子甚至可以含有影响(例如维持、增加或减少)核苷酸序列表达水平的其它序列。例如，合适的其它序列包括Shl-内含子或ADH内含子。其它序列包括诱导的元件--例如温度、化学、光或应激诱导的元件。另外，可存在增加转录或翻译的合适元件。后一种元件的实例是TMV 5'信号序列(参见Sleat, 1987, Gene 217: 217-225；和Dawson, 1993, PlantMol. Biol. 23: 97)。
表达载体也可含有作用于启动子的序列，以扩增表达。例如，SV40、CMV和多瘤病毒(polyoma)顺式作用元件(增强子)和选择标记可提供用于选择的表型性状(例如对于哺乳动物细胞而言的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或对于大肠杆菌而言的氨苄青霉素/四环素抗性)。含有合适启动子和选择标记的合适载体的选择完全在本领域技术人员的水平之内。
优选地，构建体的编码区处于诱导型启动子的控制之下。与组成型启动子相比，诱导型启动子是优选的，因为它允许适当控制细胞中的报道物浓度，因此极大地方便了对信号改变的测量。
例如，使用Tet-on & Tet-off系统Clontech (Mountain View, CA)可控制表达。在该启动子控制之下，可以精确、可逆和定量方式调节基因表达。简而言之，对于Tet-on系统。下游基因的转录仅发生在当培养基中存在多西环素(doxycycline)时。经过一段时间的转录之后，可以改变培养基，以耗尽多西环素，因此，终止了新的报道蛋白的合成。因此，新合成的报道蛋白没有背景，可以看见毒素处理之后的更快的改变。
可进行荧光分析，使用例如光子计数落射荧光显微镜系统(含有合适的分色镜和滤镜，用于在特定范围监测荧光发射)、光子计数光电倍增管系统或荧光计。用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧灯、光纤光源或经适当过滤而在所需范围内激发的其它高强度光源可以进行激发，以启动能量发射。本领域技术人员显而易见的是激发/检测方法可通过结合光电倍增管方法而强化，以增强检测灵敏度。例如，这两种光子交叉相关方法可用于实现对单分子规模的检测(参见例如Kohl等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 99:12161, 2002)。
也考虑到对构建体而言的除活细胞之外的局部环境，包括例如，裂解细胞的胞质溶胶、和包含一种或多种酶的合成培养基，所述酶能够降解从报道分子上切割下来的可切割片段，但在从报道分子上切割下来之前不能或更少能降解可切割的片段。
进一步考虑的是提供编码上述构建体的分离的多核苷酸分子。所述构建体优选地是表达载体，其包含与启动子操作性连接的多核苷酸分子。优选的启动子是诱导型启动子。
在又一实施方案中，试剂盒在合适容器中包含本文所考虑的构建体。
本发明的主题也提供用于筛选肉毒梭菌神经毒素的抑制剂的方法，包括提供经遗传改造而表达上述构建体的细胞，在候选抑制剂化合物存在时，使所述细胞暴露给肉毒梭菌神经毒素；和在所述暴露给肉毒梭菌毒素之前和之后检测所述细胞的荧光或其它信号，和将所述信号与在候选抑制剂不存在暴露给肉毒梭菌神经毒素的细胞的信号进行比较。在避免信号降低的程度上，候选抑制剂被认为是能够抑制肉毒梭菌神经毒素。在某些所考虑的实施方案中，候选化合物可以是化合物文库的成员，和所述方法可以是高通量方法。
发明详述
根据以下优选的实施方案的详述，并结合附图，本发明主题的各个目标、特征、方面和优势将会更加显而易见，所述附图中同样的数字代表同样的组分。
图1图示示例性的测定法，其中基于BoNT/A细胞的报道物用于通过YFP荧光的损失而检测BoNT/A活性。
(A) BioSentinel’s BoCell™ A BoNT/A构建体。报道荧光团YFP，和标准化荧光团CFP，通过切割序列SNAP-25 (绿色)而偶联。SNAP-25棕榈酰化将报道物定位到质膜。
(B) 通过YFP荧光的损失而检测BoNT/A活性。在BoNT/A不存在时，直接激发YFP部分，导致荧光发射。BoNT/A切割报道物，将含YFP部分的C-端报道片段释放到胞质溶胶中。所述片段被快速降解，因此，丧失了YFP发射。CFP信号仍然用于控制细胞-到-细胞(cell-to-cell)的报道物表达水平和细胞密度。
令人吃惊的是，并非所有YFP相关的荧光蛋白都可有效作为报道荧光团。例如，图2提供证据表明含YFP或密切相关衍生物Venus的报道物可在细胞中检测BoNT/A活性，而mCherry或mStrawberry则不可。在此，使Neuro2A细胞在96孔板中生长到70%汇合，然后用Lipofectamine 2000 (Invitrogen™)瞬时转染，其中报道物含有所示N-端和C-端(N-term/C-term)荧光团对。24小时之后，在10 nM BoNT/A存在或不存在时，在100 μl无酚红的MEM培养基中，在37°C将细胞孵育72小时。
图2A显示BoNT/A-诱导的荧光反应的变化。用20x放大倍数的Nikon™ TE2000-U荧光显微镜和Nikon NIS Elements 3.4软件进行半自动化YFP和CFP荧光测量。显示的是随机选择的视野，针对C-端/N-端荧光蛋白(FP)荧光比率对其进行假染色。根据各荧光团直接激发之后所收集的发射计算比率。
图2B表示荧光比率和基于细胞的报道物的BoNT/A灵敏度。在10 nM BoNT/A存在或不存在时，分析每种条件的30个随机选择的细胞的荧光比率。显示来自3个不同孔的5个显微镜视野的30个细胞的平均信号。排除显示出过饱和荧光的细胞。
图2C. 这是一个印迹图，显示BoNT/A在细胞中是有活性的，而与报道物无关。所有报道物在BoNT/A存在时都显示出某些切割，并且所有天然SNAP25都被切割。转染细胞并且用BoNT/A如上所述地处理，但按比例放大到6-孔板。在与BoNT/A一起孵育72小时后，细胞用无血清MEM洗涤3X，通过刮取收集，然后用M-Per裂解缓冲液(Pierce™)裂解。对40 μg细胞裂解物进行SDS-PAGE，然后将其转移到硝基纤维素纸上并用针对SNAP-25的抗体(克隆71.2, Synaptic Systems)进行免疫印迹分析。箭头指示报道物的全长(封闭)和切割的(开放)形式的位置。指出了全长(*)和切割的(**)天然SNAP-25。
从另一观点看，可将本发明的主题延伸到超出可切割的底物，延伸到具有以下构建体的任何测定法：所述构建体含有报道物，所述报道物可被脱保护，然后以某种方式被胞质溶胶或其它局部环境所降解。例如，可修饰敏感的报道物使其包含“诱饵(bait)”结构域，这种诱饵结构域用于针对可能与该诱饵结构域结合的重组蛋白文库而筛选。没有被结合蛋白保护的诱饵结构域，敏感的报道物就会被降解。在这样的测定法中，表达结合蛋白的细胞将形成复合物，以保护敏感的报道物免于降解，而表达诱饵的结合配偶体的细胞则会变亮(light up)。诱饵结构域可有利地为小肽，而结合配偶体可以是蛋白文库成员(或蛋白突变体)。该系统也可以反过来，使得针对单个测试蛋白(或测试蛋白文库)而测试诱饵结构域文库。
在这些情况的每一种情况下，考虑有利的是包括第二报道物，其在暴露后不被胞质溶胶或其它局部环境所降解，或者与第一报道物相比在暴露后的降解至少缓慢得多。
再另外，鉴于可从合适的荧光团中方便地选择报道物，考虑的是报道物可被具有确定功能的任何其它蛋白或其它组分置换或强化，所述确定的功能已知是：(a) 在细胞内具有相当快的更新(turnover)，没有保护，和(b) 可通过与结合配偶体相互作用而被保护。确定的功能包括报道基因的转录活化剂，致死基因的阻遏剂等(可针对其而容易地被鉴定或选择的任何物质)。
图3. 在本实施方案中，按照现有技术水平，从完全相同的细胞板中对于YFP降解和FRET损失两者而收集数据。对于YFP降解，收集直接和单独地(singularly)激发的YFP发射(顶部, Ex500, Em526)和CFP发射(中间, Ex434, Em470)。然后将这样的发射减去背景并且将YFP发射除以CFP发射以控制细胞密度和各个孔中的报道物表达。该发射比率(YFP/CFP, 底部)然后用于测定报道。
对于FRET的损失，收集FRET发射(顶端, Ex434, Em526)和CFP发射(中间, Ex434,Em470)。然后将这样的发射减去背景，并且将FRET发射除以CFP发射以控制细胞密度和各个孔中的报道物表达。此处示出该发射比率(FRET/CFP, 底部)以与正常方法进行比较。
关键比较是直接激发的YFP的损失与FRET发射的损失。根据测量与相应的曲线的比较，即可显然的是，YFP降解的总体动态范围比FRET发射的损失的动态范围大得多。在某些情况下，当仅看原始FRET发射时，无BoNT处理的细胞与用饱和浓度BoNT处理的细胞之间没有统计学差异。对于FRET损失的方法，BoNT剂量反应仅在将FRET发射除以CFP (供体)发射之后才明显。CFP (供体)发射显示小的增加的发射，因为响应报道物切割的脱-猝灭(de-quenching)。
总之，FRET损失的方法非常差地报道在报道物中的BoNT诱导的变化，或根本不报道，因此不可用于准确定性和定量测定。相反，本文中所考虑的优选的方法具有高度特异性和再现性，这允许依赖数据进行定性和定量两种分析。
替代的报道物的遗传构建
在4种质粒背景中产生了20种替代的荧光团构建体。以下就是每种构建体的内部名称以及背景和克隆片段的简述。随后是更详细的构建方法概述。
pMD0076a、pMD0076b、pMD0097和pMD0098
通过扩增具有工程改造的KpnI和XhoI限制位点的mRaspberry、mCherry、mKate2和TagRFP荧光团，产生构建体。然后，所产生的扩增的片段和先前使用的pcDNA4/TO BoCell载体用KpnI/XhoI消化。然后将载体DNA，减去切除的CFP，与mRaspberry、mCherry、mKate2和TagRFP片段连接以产生最终的载体。
pMD0079和pMD0091
对于pMD0079，扩增具有工程改造的BamHI和XhoI限制位点的SNAP YFP。然后扩增的片段和pcDNA4/TO载体DNA用BamHI/XhoI消化，然后连接在一起。然后，通过扩增具有工程改造的EcoRI和XbaI限制位点的Venus荧光团而产生pMD0091。然后，扩增的Venus片段和pMD0079用EcoRI/XbaI消化。然后将pMD0079载体DNA，减去切除的YFP，与Venus片段连接以产生pMD0091。
pMD0077和pMD0090
对于pMD0077，扩增具有工程改造的NheI和XhoI限制位点的SNAP YFP。然后扩增的片段和pIRES载体DNA用NheI/XhoI消化，然后连接在一起。然后，扩增具有工程改造的XbaI/NotI限制位点的CFP荧光团。然后，扩增的片段和先前产生的含SNAP YFP的pIRES载体用XbaI/NotI消化并连接在一起以产生pMD0077。然后通过扩增具有工程改造的EcoRI和MluI限制位点的Venus荧光团而产生pMD0090。然后，扩增的Venus片段和pMD0077用EcoRI/MluI消化。然后将pMD0077载体DNA，减去切除的YFP，与Venus片段连接以产生pMD0090。
pMD0078和pMD0080
对于pMD0080，扩增具有工程改造的NheI和XhoI限制位点的SNAP YFP。然后扩增的片段和pECFP-C1用NheI/XhoI消化。然后将载体DNA，减去切除的CFP，与SNAP YFP连接以产生pMD0080。然后，通过扩增具有工程改造的AseI和NheI限制位点的突触蛋白启动子而产生pMD0078。然后扩增的片段和pMD0080用AseI/NheI消化。然后将pMD0080载体DNA，减去切除的CMV启动子，与突触蛋白启动子连接以产生pMD0078。
pMD0081、pMD0082、pMD0099、pMD0100
通过扩增具有工程改造的NheI和XhoI限制位点的mRaspberry、mCherry、mKate2和TagRFP荧光团，产生构建体。然后扩增的片段和来自Min (pECFP-C1背景)的原始BoCell构建体用NheI/XhoI消化。然后将BoCell构建体，减去切除的CFP片段，与mRaspberry、mCherry、mKate2和TagRFP片段连接以产生pMD0081、pMD0082、pMD0099和pMD0100。
pMD0092
对于pMD0092，扩增具有工程改造的EcoRI和XbaI限制位点的Venus荧光团。然后扩增的片段和pMD0080用EcoRI/XbaI消化。然后将pMD0080，减去切除的YFP片段，与Venus片段连接以产生pMD0092。
pMD0103、pMD0104和pMD0105
扩增具有工程改造的XbaI和BamHI限制位点的SNAP YFP构建体。然后扩增的片段和pBudCE4.1载体用XbaI/BamHI消化并连接在一起。然后，扩增具有工程改造的KpnI和BglII限制位点的CFP、mRaspberry和mCherry荧光团。然后扩增的片段和先前产生的含有SNAPYFP的pBudCE4.1载体用KpnI/BglII消化并连接在一起以产生pMD0103、pMD0104和pMD0105。
pMD0106、pMD0107和pMD0108
扩增具有工程改造的XbaI和BamHI限制位点的SNAP Venus构建体。然后扩增的片段和pBudCE4.1载体用XbaI/BamHI消化并连接在一起。然后，扩增具有工程改造的KpnI和BglII限制位点的CFP、mRaspberry和mCherry荧光团。然后扩增的片段和先前产生的含有SNAPVenus的pBudCE4.1载体用KpnI/BglII消化并连接在一起以产生pMD0106、pMD0107和pMD0108。
替代的报道物的初级筛选
将Neuro2A细胞接种到96孔板并让其扩增24-48小时，然后按照制造商的说明书，用以上遗传构建体和Lipofectamine 2000™瞬时转染细胞。让转染的细胞恢复24小时，然后施加0或30 nM BoNT/A全毒素并将细胞在370C, 5% CO2再孵育24小时。然后，用Nikon-TE2000U荧光显微镜对细胞成像，每一条件最少拍3个图像。使用适用于所列的荧光团的滤镜，收集荧光发射。也使用Varioskan™荧光微量板读板器(microplate reader)，使用合适的激发和发射波长设定，收集总的荧光发射。
对于指定通道，根据像素强度，处理荧光显微镜术数据，以便门输出(gate out)过量表达的(饱和的)细胞。然后收集各通道的总发射，并且当指出时，将BoNT/A-反应的YFP或Venus发射除以BoNT/A-无反应的CFP, RFP (mKate2, mRaspberry或mCherry)、或外源添加的膜染料(替代的报道物2)发射。
使用以上收集的数据，分析各报道物构建体如下：通过质膜上均匀的荧光表达的存在而判断各报道物的细胞靶向。不良的质膜靶向与细胞内的明亮的小点(punctatespot)的存在相关。缺乏质膜靶向的报道物被排除，而不进一步考虑。通过相对于背景发射而言的给定荧光探针(Probe)的发射而判断总的荧光发射，以及由此的总的报道物表达。未给出信号>2倍背景的探针被排除，而不进一步考虑。
替代的报道物的次级筛选: BoNT/A-剂量反应
如上所述地将通过初级筛选的遗传构建体瞬时转染到细胞中，但使用不同的DNA浓度。不同的DNA浓度产生具有不同报道物表达水平的细胞。在转染和24小时恢复期之后，用10pM至30 nM BoNT/A滴定转染的细胞，让其进一步孵育。孵育之后，使用Varioskan荧光微量板读板器，使用合适的激发和发射波长设定，收集荧光发射。对于所有实验，将试验报道物反应与平行进行的瞬时转染的现有的BoCell报道物CFP-SNAP25-YFP直接比较。
将BoNT/A-反应的YFP的荧光发射除以BoNT/A-无反应的CFP, RFP (mKate2,mRaspberry或mCherry)、或外源添加的膜染料(替代的报道物2)发射，得到发射比率。然后将发射比率随着BoNT/A浓度变化而作图。将数据与BoCell报道物进行比较。通过与BoCell报道物比较而定性地评价试验报道物的适用性：与现有BoCell报道物相比，BoNT/A引发了试验报道物的类似反应吗.
替代的报道物的次级筛选: FRET发射
按照制造商的方案，使用Lipofectamine，将报道物遗传构建体转染到铺板在玻璃盖片上的细胞。对于每种构建体，也转染单个荧光团对照。24小时恢复期之后，用或不用30 nMBoNT处理细胞。对于每种报道物使用对照，通过荧光显微镜术捕获图像并且通过3-滤镜组方法将图像用于标定FRET测定。然后在BoNT/A存在和不存在时，评价报道物的FRET效率。对于所有实验，将试验报道物反应与平行进行的瞬时转染的现有的BoCell报道物CFP-SNAP25-YFP直接比较。针对FRET的存在，评价每种试验报道物以及FRET发射是否对BoNT/A有反应。结论是FRET发射不代表可靠的筛选方法，与在实施例3中已经观察到的情况是一致的。
对于本领域技术人员应显然的是，除了已描述的之外可以进行更多修饰，而不偏离本文中本发明的概念。因此本发明的主题不受除了所附权利要求书的范围之外的限制。此外，在解释本说明书和权利要求书两者时，所有术语应当以与上下文一致的最宽泛的可能方式理解。具体地讲，术语“包括”和“包含”应当理解为以非排他的方式涉及要素、组分或步骤，表明所涉及的要素、组分或步骤可以存在、或被利用、或与未明确涉及的其它要素、组分或步骤组合。当说明书权利要求书是指选自A、B、C….和N的某物中的至少一个时，文本应当理解为仅需要来自该组的一个要素，而不是A加上N，或B加上N等。

Claims (16)

1.人工构建体，其包含：
编码杂合蛋白的核酸序列，所述杂合蛋白包含与(b)切割位点偶联的(a)含报道物的部分，所述切割位点以从所述杂合蛋白的剩余部分切割含报道物的部分的方式与肉毒梭菌毒素相互作用，以及(c)对照荧光团，其以使得肉毒梭菌毒素的浓度增加并不导致对照荧光团的荧光发射同步增加的方式经选择和安置在所述杂合蛋白内。
2.权利要求1的人工构建体，其中所述含报道物的部分包含选自下列的至少一个荧光团：黄色荧光蛋白(YFP)、Citrine、Venus和YPet蛋白。
3.权利要求1的人工构建体，其中所述切割位点包含选自SNAP-25、小突触泡蛋白和突触融合蛋白的基序的至少一部分。
4.权利要求1的人工构建体，其中所述对照荧光团包含选自CFP、mStrawberry和mCherry的至少一个荧光团。
5.杂合蛋白，其包含：
与(b)切割位点偶联的(a)含报道物的部分，所述切割位点以从所述杂合蛋白的剩余部分切割含报道物的部分的方式与肉毒梭菌毒素相互作用，以及(c)对照荧光团，其以使得肉毒梭菌毒素的浓度增加并不导致对照荧光团的荧光发射同步增加的方式经选择和安置在所述杂合蛋白内。
6.权利要求5的杂合蛋白，其中所述含报道物的部分包含选自下列的至少一个荧光团：黄色荧光蛋白(YFP)、Citrine、Venus和YPet蛋白。
7.权利要求5的杂合蛋白，其中所述切割位点包含选自SNAP-25、小突触泡蛋白和突触融合蛋白的基序的至少一部分。
8.权利要求5的杂合蛋白，其中所述对照荧光团包含选自CFP、mStrawberry和mCherry的至少一个荧光团。
9.经修饰的细胞，其包含：
杂合蛋白，所述杂合蛋白包含与(b)切割位点偶联的(a)含报道物的部分，所述切割位点以从所述杂合蛋白的剩余部分切割含报道物的部分的方式与肉毒梭菌毒素相互作用，以及(c)对照荧光团，其以使得肉毒梭菌毒素的浓度增加并不导致对照荧光团的荧光发射同步增加的方式经选择和安置在所述杂合蛋白内。
10.权利要求9的经修饰的细胞，其中所述细胞来源于选自下列的细胞系：神经元细胞、神经内分泌肿瘤细胞、杂合细胞和干细胞。
11.权利要求9的经修饰的细胞，其中所述含报道物的部分包含选自下列的至少一个荧光团：黄色荧光蛋白(YFP)、Citrine、Venus和YPet蛋白。
12.权利要求9的经修饰的细胞，其中所述切割位点包含选自SNAP-25、小突触泡蛋白和突触融合蛋白的基序的至少一部分。
13.权利要求9的经修饰的细胞，其中所述对照荧光团包含选自CFP、mStrawberry和mCherry的至少一个荧光团。
14.试剂盒，其包含：
经修饰的细胞，所述经修饰的细胞包含杂合蛋白，所述杂合蛋白包含与(b)切割位点偶联的(a)含报道物的部分，所述切割位点以从所述杂合蛋白的剩余部分切割含报道物的部分的方式与肉毒梭菌毒素相互作用，以及(c)对照荧光团，其以使得肉毒梭菌毒素的浓度增加并不导致对照荧光团的荧光发射同步增加的方式经选择和安置在所述杂合蛋白内；和
在表征肉毒梭菌毒素中使用遗传修饰的细胞的说明书。
15.权利要求14的试剂盒，其中所述经修饰的细胞来源于选自下列的细胞系：神经元细胞、神经内分泌肿瘤细胞、杂合细胞和干细胞。
16.权利要求14的试剂盒，其还包含细胞培养基。
CN201710697371.3A 2011-06-01 2012-05-31 非‑fret肉毒梭菌测定法 Pending CN107475293A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161492237P 2011-06-01 2011-06-01
US61/492237 2011-06-01
CN201280036866.7A CN103842819B (zh) 2011-06-01 2012-05-31 非‑fret肉毒梭菌测定法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280036866.7A Division CN103842819B (zh) 2011-06-01 2012-05-31 非‑fret肉毒梭菌测定法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107475293A true CN107475293A (zh) 2017-12-15

Family

ID=46246237

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710697371.3A Pending CN107475293A (zh) 2011-06-01 2012-05-31 非‑fret肉毒梭菌测定法
CN201280036866.7A Active CN103842819B (zh) 2011-06-01 2012-05-31 非‑fret肉毒梭菌测定法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280036866.7A Active CN103842819B (zh) 2011-06-01 2012-05-31 非‑fret肉毒梭菌测定法

Country Status (9)

Country Link
US (2) US9274121B2 (zh)
EP (1) EP2715355B1 (zh)
JP (2) JP5815852B2 (zh)
KR (3) KR101853103B1 (zh)
CN (2) CN107475293A (zh)
BR (1) BR112013030964B1 (zh)
HK (1) HK1194143A1 (zh)
LT (1) LT2715355T (zh)
WO (1) WO2012166943A1 (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130111954A (ko) * 2010-06-11 2013-10-11 시냅틱 리서치, 엘엘씨 N-단부 지배 프로테아제 활성 표시 방법 및 이의 용도
LT2800973T (lt) * 2012-01-04 2018-09-10 Biomadison, Inc. Būdai ir junginiai, skirti botulino tyrimų jautrumo padidinimui
EP3030905B9 (en) * 2013-08-09 2024-04-03 Biomadison, Inc. Botulinum toxin assay with improved sensitivity
RU2683207C2 (ru) * 2013-10-25 2019-03-26 Биомэдисон, Инк. Ферментативный анализ с двойными флуорофорами для исследования ферментативной активности ботулинического нейротоксина
EP3194426A2 (en) * 2014-08-12 2017-07-26 Biomadison, Inc. Botulinum neurotoxins with modified light chain specifity and methods for producing same
CN104861070B (zh) * 2015-04-02 2019-07-02 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体3A-scFv及其应用
CN104774263B (zh) * 2015-04-02 2019-06-04 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv及其应用
EP3438267B1 (en) 2016-05-24 2024-05-01 Medytox Inc. Recombinant polynucleotide coding for polypeptide comprising reporter moiety, substrate moiety and destabilizing moiety, host cell comprising same and use of same
EP3463432B1 (en) 2016-05-27 2020-10-07 Ipsen Biopharm Limited Liquid neurotoxin formulation stabilized with tryptophan or tyrosine
CN106046175B (zh) * 2016-06-16 2020-03-13 浙江省农业科学院 一种特异检测水杨酸(sa)的融合蛋白
CN105969795B (zh) * 2016-06-16 2019-10-29 浙江省农业科学院 一种用于实时检测植物体内水杨酸水平的植物表达载体及其应用
WO2020168061A1 (en) * 2019-02-13 2020-08-20 Biomadison, Inc. Compositions and methods for protease screening
US20230366803A1 (en) * 2020-10-12 2023-11-16 Sony Group Corporation Information processing apparatus, particle analysis apparatus, particle fractionation apparatus, and information processing method
US20230225954A1 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Galderma Holding SA Treatment of moderate to very severe glabellar lines and lateral canthal lines

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005076785A2 (en) * 2003-12-19 2005-08-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Method and compositions for detecting botulinum neurotoxin
CN101932936A (zh) * 2007-09-14 2010-12-29 比奥森蒂内尔有限责任公司 利用切割序列和间隔子的共振能量转移测定

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10038382A1 (de) * 2000-08-07 2002-02-21 Direvo Biotech Ag Zweifarbiges fluorimetrisches Proteaseassay
EP1421210A4 (en) 2001-07-31 2005-02-16 Clontech Lab Inc METHOD FOR DETECTING PROTEASE ACTIVITY IN ONE CELL
US7208285B2 (en) 2001-08-28 2007-04-24 Allergan, Inc. Fret protease assays for botulinum serotype A/E toxins
US7183066B2 (en) * 2002-09-27 2007-02-27 Allergan, Inc. Cell-based fluorescence resonance energy transfer (FRET) assays for clostridial toxins
WO2004031355A2 (en) * 2002-10-01 2004-04-15 University Of Maryland Methods for identifying inhibitors of botulinum neurotoxins
US20040191887A1 (en) 2002-10-31 2004-09-30 Chapman Edwin Raymond Botulinum neurotoxin B receptors and use thereof
US20050214890A1 (en) * 2003-11-26 2005-09-29 Zhiqun Tan Novel "Cleave-N-Read" system for protease activity assay and methods of use thereof
FR2869908B1 (fr) * 2004-05-05 2006-07-28 Pharmaleads Substrat peptidique reconnu par la toxine botulique de type a, bont/a et son utilisation pour detecter et/ou doser ladite toxine ou des inhibiteurs de son activite
AU2006340711C1 (en) 2005-04-05 2013-02-07 Allergan, Inc. Clostridial toxin activity assays
JP4948845B2 (ja) * 2006-02-08 2012-06-06 財団法人 東京都医学総合研究所 神経変性疾患治療用物質のスクリーニング方法
EP2114462B1 (en) 2006-12-21 2013-06-05 Universite De Geneve Compounds for fluorescence imaging
NZ588029A (en) 2008-03-14 2012-12-21 Allergan Inc Immuno-based botulinum toxin serotype a activity assays
RU2535003C2 (ru) 2008-12-10 2014-12-10 Аллерган, Инк. Фармацевтические композиции токсина клостридий

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005076785A2 (en) * 2003-12-19 2005-08-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Method and compositions for detecting botulinum neurotoxin
CN101932936A (zh) * 2007-09-14 2010-12-29 比奥森蒂内尔有限责任公司 利用切割序列和间隔子的共振能量转移测定

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANICL R.RUGC等: "Detection of six scrotypcs of botulinm neurotoxin using fluorogenic reporters", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP5815852B2 (ja) 2015-11-17
JP6162766B2 (ja) 2017-07-12
CN103842819A (zh) 2014-06-04
JP2014518376A (ja) 2014-07-28
LT2715355T (lt) 2017-06-12
KR101679370B1 (ko) 2016-11-24
US20160229898A1 (en) 2016-08-11
US10100094B2 (en) 2018-10-16
US9274121B2 (en) 2016-03-01
BR112013030964B1 (pt) 2022-08-16
WO2012166943A1 (en) 2012-12-06
JP2016039809A (ja) 2016-03-24
KR20160134863A (ko) 2016-11-23
EP2715355A1 (en) 2014-04-09
EP2715355B1 (en) 2017-03-08
HK1194143A1 (zh) 2014-10-10
KR101853103B1 (ko) 2018-04-27
US20120309039A1 (en) 2012-12-06
KR20140081759A (ko) 2014-07-01
CN103842819B (zh) 2017-09-12
KR101910490B1 (ko) 2018-10-22
KR20180043396A (ko) 2018-04-27
BR112013030964A2 (pt) 2020-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103842819B (zh) 非‑fret肉毒梭菌测定法
US20220244256A1 (en) Cell Based Assays for Botulinum Neurotoxins
TWI647237B (zh) 具重複性螢光團之酵素檢測法
KR102059091B1 (ko) 보툴리눔 분석 감도를 증진시키기 위한 방법 및 화합물
US11325954B2 (en) Compositions and methods for stability testing of botulinum toxin
US20220260555A1 (en) Compositions and Methods for Cell-Based Assays

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination