CN104774263B - 抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C‑scFv，它是利用人工合成的重组蛋白BontB，及筛选抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C‑scFv的底物GFP‑HIS6‑SNAP25（62）‑VAMP（57）‑C，人源化抗B型肉毒毒素酶抗体库中筛选出来的，亲和常数为（4.38±0.445）×10⁵L/mol，为生产抗B型肉毒毒素特效救治药物及快速检测B型肉毒毒素奠定了基础。

Description

抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv及其应用

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv，及其应用，在生产治疗B型肉毒毒素酶中毒药物方面、检测B型肉毒毒素酶方面的应用。

背景技术

肉毒毒素可导致人及动物肉毒中毒，其感染剂量极低，从灵长类动物实验中得出，最低致死剂量（LD50）为1ng/kg，因此，它已被美国疾病控制和预防中心指定为对人类的威胁类似于炭疽的生物武器。导致肉毒中毒的原因大致分为四个类型，一、成人肉毒中毒。二、婴儿感染性肉毒中毒。三、伤口感染性肉毒中毒。

肉毒毒素是肉毒梭菌在自然状态下或者是在培养基中形成，通过细菌裂解释放到环境或培养液中，这种形态的毒素被称为前体毒素，其分子量范围在300 kDa到900 kDa。前体毒素通常以复合体的形式存在，由神经毒素（Bont），由一个或多个能够包围和保护毒素的非毒性蛋白组成，包括血凝素（HA）,非毒素非血凝素（NTNH）。临床上所说的肉毒毒素通常指具有神经毒性作用的神经毒素部分。

肉毒毒素根据其抗原性的不同，共存在七种血清型（A、B、C、D、E、F、G、），尽管七种血清型的肉毒毒素组成成分与它的作用机制略有差别，但是它们有着相近的分子量和相似结构。成熟肉毒毒素均由约150 kDa的单链多肽组成，蛋白质成熟时通过细菌介导的蛋白酶将150kDa的单链多肽切割裂解成两个不相等的多肽片段，两个片段由一个二硫键连接，形成一个分子量为50kDa的轻链片段（LC）和一个分子量为100kDa的重链片段（HC）。其中轻链有一个催化功能域，重链包含分子量均为50kDa的两个功能域， N端部分为跨膜域，C端部分为神经节苷脂结合域。单独的轻链和重链均无毒性，只有双链才具有生物学毒性。

轻链由细胞内毒素蛋白组成，具有锌离子依赖内切酶活性，可抑制神经递质的释放。肉毒毒素的活性区埋藏（~20 Å深）于轻链中，表面负电荷，可通过一个通道获得。梭状神经毒素的活性位点包括一个单一的锌原子，这个锌原子历来被认为有功能，但是不起结构性作用。可以通过用金属螯合剂去除锌，但是通过在二级结构上加入游离的锌原子来重新获得锌，毒素与底物结合的能力几乎不变，但轻链的生物学活性却大大的降低了，只相当于原来的30%。位于轻链中心有一个高度保守的锌结合模块HExxH （X是任意的氨基酸）序列。HExxH 序列中含有一个由3个组氨酸整合的锌离子，并对突触泡膜蛋白质具有特异性蛋白水解活性，这个催化位点位于蛋白质表面较深的裂缝中。

在人类肉毒中毒中，A型肉毒毒素和B型肉毒毒素占据最重要的地位，其中A型肉毒毒素轻链上的His 222, Glu223 和His226残基共同组成了锌结合模块HExxH 序列的一部分，并且在协调活性区锌（His 222 和His226）和一个水分子（Glu223残基）的作用机制中起了直接的作用。Glu261 是协调锌的第三配体。甚至有人认为A型肉毒毒素的催化机理与嗜热菌蛋白酶是相似的，这是因为基于结构和序列相似的基础上，他们的活性位点也是相似的。从Glu223到 Asp的突变使得活性几乎全部失去，去除His226使A型肉毒毒素失去了催化活性。通过对肉毒毒素结构分析表明，A 、B型肉毒毒素中与作用机制相关的关键氨基酸残基是相同的。与突触泡蛋白结合的B型肉毒毒素的晶体结构表明，Arg369 和 Tyr372残基位于接近被毒素裂解的肽键。肉毒毒素中中和残基的突变使催化速度常数明显降低，但是不影响锌结合和底物结合，人们提出，这些残基在过渡态稳定中发挥了作用。

另外，在LC活性中心还有一些氨基酸残基，如Phe266、Glu350Arg363和Tyr366。它们的功能主要是维持和稳定轻链活性中心的结构和/或它与被结合底物的相对位置，以此保证轻链最佳的酶解能力。

LC通过二硫键与HC的N端连接。在二硫键存在的状态下，毒素重链HN结构域形成一条loop结构，将深陷于轻链表面裂缝中的Zn²⁺催化部位遮蔽住，从而不表现酶活性。在双链毒素进入神经细胞后，二硫键被还原，释放出的轻链才能表现锌离子内肽酶活性，催化部位能够容纳底物16个氨基酸残基。催化部位的锌离子除同4个组氨酸残基的咪唑环、1个结合于保守谷氨酸的水分子形成配位键外，还与另一分子的谷氨酸羧基形成配位键，1个色氨酸分子很可能也参与锌离子的配位。毒素轻链的这种独特锌离子配位形式、空间结构与其他所有已知的金属蛋白酶的三维结构都不同，应当属于一个新型的金属蛋白酶家族。

肉毒毒素的致病机理

1、靶细胞的识别与结合

前体毒素进入胃肠道，在消化过程中，非毒素组分对神经毒素起到保护作用，使其不会受到各种消化酶和胃酸的侵蚀。由于分子量过大，毒素分子不是以扩散的方式，而是以“内凹”和细胞摄入的方式通过肠粘膜上皮屏障，而不会破坏胃肠道。然后进入小肠中，在小肠的微碱性环境下，前提毒素中的神经毒素解离出来，进入血液及淋巴循环，在运动神经和交感神经处发挥其毒性作用。尽管神经毒素可侵入不同的组织和器官,但不能穿透血脑屏障,其惟一的亲和靶点是外周胆碱能神经末梢。在胆碱能神经末梢，毒素的轻链能够抑制神经递质乙酰胆碱在神经肌肉接头处的释放，导致肌肉麻痹。在这一毒性作用过程中，神经毒素的各功能域都有参与，具体的过程可分为三个阶段。

靶细胞的结合与内化

在靶细胞的识别与结合这一过程中，肉毒毒素重链的结合域发挥了作用。结合域能够识别胆碱能神经末梢，并与其发生特异性结合。结合域结合到运动神经元的神经节苷脂和位于末端神经细胞膜表面小结上的蛋白受体，特别是具有亲和力的GD1b, GT1b 和GQ1b类神经节苷脂。然后由含有唾液酸的寡糖组成的神经节苷脂连接到神经酰胺。通过对神经节苷脂分布及对其亲和结合力的研究，可以确定，神经节苷脂不是唯一能促进肉毒毒素结合的分子，而双受体模型的提出表明，在发生内化作用前，肉毒毒素就已经结合到了蛋白受体上。尽管有一些证据表明，突触结合蛋白可能参与了A、B和E型的内化作用，但是梭菌属家族每一个成员的受体，还没有完全确定。每个毒素与其蛋白共受体都是特异性同源的，B型肉毒毒素与唾液酸乳糖的混合物就与肉毒毒素蛋白部分相似，表明了神经毒素与神经节苷脂结合的一个"锁和钥匙"原理。这个观察成功说明了一个观点，那就是神经节苷脂结合使肉毒毒素靠近蛋白受体，促进了毒素的识别和内化。

一旦结合到神经元表面，母体分子裂解，重链和轻链通过锌原子结合到达神经元细胞膜，并且被内化进入细胞囊泡，形成一个包裹着毒素分子的酸性小囊泡。即内化过程。这一受体介导的内吞过程与时间，温度及突触活动均有关。

2、易位

肉毒毒素的轻链必须从囊泡小室或者胞内体中出来，并且在H链N-末端作用下的通过膜运输能够成功进入细胞溶质的靶蛋白，这一过程是称为轻链易位。

与其它梭菌毒素一样，肉毒毒素进入细胞内的酸性小泡后，会因pH的变化而发生结构重组。尽管进入突触小泡和胞内小泡是显而易见，但是肉毒毒素易位进入胞内小泡的特性尚未断然确定。pH的降低使肉毒毒素结构发生变化，从而导致其在分子中有较大的疏水性，并且增加了脂双层的渗透性。这样毒素的重链和轻链能够嵌入小泡的脂双层内，一旦嵌入，就会在磷脂双层和PC12膜上形成离子通道。这个通道是具有选择性的，分子量大的分子无法通过，所以目前普遍认为毒素轻链可以通过离子通道从小泡腔内转运到神经细胞胞质。据此有三种轻链跨膜转运假说模型，即管道模型（tunnel model），裂缝模型(cleftmodel)和裂解模型(lysis model)。其中裂缝模型理论认为，在低pH时，蛋白质的分子构想发生了改变，此时HC可形成一个亲水性的裂隙，并且在轻链穿膜过程中将其亲水表面包围。在此模式中形成了亲水性和疏水性的相互作用。轻链的羧基端因为二硫键与重链氨基端相连而最先进入到胞质。实现易位后，由于胞质的pH高于酸性小泡，使轻链结构重新折叠，重新回到具有催化活性。

在低pH值下，A和B型肉毒毒素的HN域发生构象上的变化，最终跨越人工膜形成离子通道，并且在体内pH的环境下，形成的通道的活性是最大的。C型肉毒毒素在脂膜形成的离子通道与白喉毒素形成的相似，并且也是只在低pH下形成。肉毒毒素离子通道只允许阳离子通过，但是可以在体外阻止氯喹。然而对于小孔径离子通道的研究，我们尚未清楚肉毒毒素形成的通道是不是毒素轻链进入细胞溶质的必经之路。数据显示，在低 pH下轻链的结构有一个戏剧性的变化，就是可能产生一个选择性的LC结构并且更适合于易位。尽管这在体内还没被证实，但是通过低pH诱导结构变化是完全可逆的。

肉毒毒素能够在神经传递发挥作用，就必须通过蛋白水解使LC与HN接头处暴露的表面产生缺口，从而使非活性的单链分子量为150-kDa的毒素活化。少数的细菌和组织蛋白酶能够实现这个裂解反应，并产生有活性的双链神经毒素。产生切口后，轻链和重链仍然通过非共价键相互作用，并且由一个单一的二硫键连接。这种链间的二硫键(A型肉毒毒素中的Cys430–Cys454)的减少是轻链活化的第二阶段，这是轻链自由进入运动神经元胞质溶胶和与底物间相互作用必不可少的阶段。正如前面提到的，在低pH情况下，轻链有一个戏剧性的变化。这种结构的变化有助于易位带（如果在易位点HN域确实是靠近轻链）的重组和导致轻链的最终活化。神经元信号转导通路可以与肉毒毒素-LC活动密切联系在一起的。因此，轻链活化的完成最终可能是发生在胞质溶胶中的，紧接着从低pH的小室中易位。

3、抑制神经递质释放

神经小结处有突触小囊泡，其中包含乙酰胆碱，它是能穿过神经肌肉接头刺激肌肉收缩的一种神经递质。该乙酰胆碱的小囊泡被一个叫做SNARE复合体的蛋白聚合物所结合。为了穿过神经肌肉交界处实现信号的传递，突触前神经小结中的乙酰胆碱小囊泡必须被释放到突触间隙中。在这里，神经递质在肌肉板上结合到特定受体上，触发离子通道打开，从而导致相邻横纹肌的去极化和收缩。乙酰胆碱的释放，需要有SNARE 蛋白的参与，它能够介导突触小泡与神经元细胞膜的融合。

SNARE复合体蛋白参与突触小泡上质膜融合，而肉毒毒素轻链的作用是阻碍胞吐作用。更具体地说，就是在肌肉接头处，神经毒素通过切割SNARE蛋白（乙酰胆碱分子胞吐作用所必须的物质）阻断了囊泡内容物释放到细胞外环境中，抑制乙酰胆碱的释放，从而抑制神经传递。据证实，单独的SNARE蛋白裂解不会妨碍SNARE复合体形成，但是却会导致非功能性复合物在Ca²⁺内流和融合之间的耦合被破坏。毒素在抑制神经递质释放时，需要Ca²⁺的参与，而在突触末梢Ca²⁺浓度增加会影响肉毒毒素的作用效果。

轻链作为锌肽链内切酶蛋白切割致使SNARE复合物不稳定，成为非功能性，从而抑制乙酰胆碱释放到突触间隙。囊泡释放到突触间隙的数量越少，动作电位传播的概率就越低，从而引起肌肉纤维的收缩。结果导致肌肉自身的化学去神经术而引起弛缓性麻痹。现有研究表明SNARE复合物由VAMP、SNAP-25和syntaxin三种蛋白质组成，下表所示为不同类型的肉毒毒素的靶蛋白及其切割位点。

噬菌体展示技术的基本原理是把外源DNA插入噬菌体编码外壳蛋白pIII或pVIiI的基因中，使外源DNA片断对应的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白(fusion protein)，呈现在噬菌体表面。噬菌体展示技术的显著优点是：建立了基因型(genotype)和表型(phenotype)之间直接的物理联系，从而使筛选简便高效。将外源蛋白或多肽表达于噬菌体表面，就可根据其性质利用它与其他生物或非生物物质的亲和性对含目的基因的噬菌体进行筛选。以噬菌体抗体库的筛选为例，将Fab(fragment antigenbinding)表达在噬菌体表面，以相应的抗原为亲和性配体筛选，可以快速高效地从大量克隆中筛选表达特异性抗体的噬菌体。因此，用噬菌体展示技术制备高亲和性抗体与传统的杂交瘤单克隆抗体技术相比具有明显的优势。

噬菌体抗体在膜表面表达，是通过Fab段或ScFv 与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白而完成。其特点是“ 它既可识别相应的抗原并与其结合，又能够感染宿主菌进行再扩增”。利用其可再扩增的特性，以靶抗原通过亲和吸附-洗脱-扩增，可筛选到靶分子的配体肽链。再经突变和链置换方法改进抗体亲和力，最终便获得高亲和力的特异性抗体。噬菌体抗体库的筛选包括两个主要步骤：淘筛和鉴定。淘筛是将噬菌体抗体库与选择用的抗原共同孵育，通过几轮洗脱，收集结合的噬菌体。将获得的噬菌体感染细菌并扩增，再进行下一轮的淘筛。经几轮淘筛后，便可富集到与抗原特异性结合的噬菌体感染的多克隆菌株。鉴定过程是从噬菌体感染的多克隆菌株中挑选出单克隆菌株。即将淘筛出的噬菌体感染细菌、铺板、挑选，即可得到高特异性单克隆菌株。

从噬菌体抗体库中筛选表达特异性抗体的噬菌体的经典方法主要有两种：(1)将纯抗原包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体。(2)将抗原与生物素基团相连，再将其固定在包被有streptavidin的顺磁珠上对噬菌体进行筛选。两种方法中均需加脱脂牛奶(或BSA，其效果较差)封闭未被抗原占据的位点，以避免噬菌体非特异性的结合。对于前一方法，回收与抗原特异性结合的噬菌体可用碱性溶液(如三乙基胺，(triethy—lamine)或酸性溶液(如甘氨酸一盐酸，glycine_HCl)洗脱，或用可溶的抗原或半抗原洗脱；对于后一方法，用二巯基苏糖醇(dithiothret01，DTT)通过破坏抗原与生物素之间的二硫键来洗脱。回收的噬菌体感染宿主菌，增殖后进行下一轮筛选。一般经过3—5轮这样的筛选可得到表达高亲和性的目的抗体的克隆。每一轮筛选都需要进行检测，以证实筛选的有效性。

英国MRC HGMP资源中心创建的Human Single Fold scFv Libraries I+J(Tomlinson I + J)是当今成熟的全人源噬菌体抗体库，其库容超过10⁸全人源噬菌体单链抗体，本研究利用该噬菌体库淘选特异性抗B型肉毒毒素单链抗体，并对阳性单链抗体进行系统分析，以期创制B型肉毒毒素中毒治疗抗体类药物奠定物质基础。

本发明人通过对肉毒毒素的作用机理的了解及研究，确定肉毒毒素能够引起人畜共患病，且主要攻击体内的神经突触系统，其致病机理为，肉毒毒素通过其重链C端结构域结合于胆碱能神经元的突触前膜，形成毒素受体复合物内化进入细胞囊泡，然后轻链锌内肽酶酶活性区从细胞内的酸性空间释放进入细胞质。一旦从囊泡中释放出来，轻链通过切割SNARE复合物蛋白来阻止乙酰胆碱的释放，引起肌肉麻痹。因此轻链为主要的致病部位。目前，国内外关于A型肉毒毒素的报道已相对比较全面，但关于B型肉毒毒素的研究报道相对较少，同时缺乏B型肉毒毒素治疗方法和药物，这样就造成了一旦有人罹患B型肉毒中毒，将无法及时进行正确治疗的境况。抗体是治疗肉毒中毒最有效的方法，但目前研究或有限使用的异源性血清抗体存在着许多缺点，如引起免疫反应或传染疾病等，导致无法推广应用。由于此类抗体分子量较大，难于穿透细胞膜，针对已经进入细胞的毒素轻链则无治疗效果，因此本发明旨在克隆表达B 型肉毒毒素，通过重组蛋白在人源化抗体库中筛选中和性人源化单链抗体，为研制抗B 型肉毒毒素特效救治药物及快速检测B型肉毒毒素奠定基础。

发明内容

本发明的目的是为解决异源性血清抗体在治疗B型肉毒毒素中毒，存在引起免疫反应或传染疾病的问题，而提供一种全人源的单链抗体4C-scFv，抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv。

抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv，其碱基序列如序列表SEQ IDNO.9所示。

抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.10所示。

抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv在生产治疗B型肉毒毒素酶中毒药物方面的应用。

抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv在检测B型肉毒毒素方面的应用。

本发明提供了抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv，它是利用人工合成的重组蛋白BontB，及筛选抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体的底物GFP-HIS6-SNAP25（62）-VAMP（57）-C，人源化抗B型肉毒毒素酶抗体库中筛选出来的，亲和常数为（5.35±0.903）×10⁵L/mol，为生产抗B 型肉毒毒素特效救治药物及快速检测B型肉毒毒素奠定了基础。

附图说明

图1为双酶切pMD-19T-Bont-B质粒电泳结果；1.EcoR和Nde双酶切质粒pMD-19T-Bont-B ； 2. DNA marker DL2000。

图2为PCR鉴定重组质粒PET-28a-BontB结果图；1. DNA marker DL2000；2.3.4.均为BontB区域PCR扩增产物。

图3为双酶切重组质粒PET-28a-BontB鉴定结果；其中：1.2.均为EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切质粒PET-28a-BontB 3.DNA marker DL2000；

图4为重组蛋白表达形式鉴定其中：1.未诱导菌超声沉淀；2.诱导菌超声沉淀；3.未诱导菌超声上清；4.诱导菌超声上清国5:诱导的全菌体 ；6.蛋白质Marker；

图5为重组蛋白SDS-PAGE结果分析；其中： 1.蛋白质marker；2.初步纯化的目的蛋白；3.最终纯化的目的蛋白；

图6 重组质粒 PET-28a -GFP的双酶切鉴定（NcoI和BamHI）；其中1:质粒PET-28a-GFP的双酶切产物 ； M： DNA marker DL2000；

图7质粒PET-28a-GFP-SV的双酶切产物；M：DNA marker DL5000；

图8纯化后4C-scFv SDS-PAGE结果分析；1:流穿 2:55%硫酸铵原样 3:纯化后scFv。

具体实施方式

实施例1：B型肉毒毒素轻链基因的合成

根据Genbank 报道的B型肉毒毒素全基因序列，设计并合成轻链基因，同时插入EcoR和Nde酶切位点，将基因片段克隆入pMD-19T vector，转化入JM109中。

实施例2：B型肉毒毒素轻链基因与PET-28a载体连接

利用内切酶EcoR和Nde双酶切质粒pMD-19T-Bont-B,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图2所示，可见到大小约为1335的目的基因BontB，与预期的大小相符；

将EcoR和Nde双酶切的载体PET-28a大片段与目的基因BontB小片段回收，并用T4DNA连接酶连接，得到重组质粒PET-28a-BontB，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，含kan抗性的琼脂糖平板进行初步筛选。挑选单菌落于LB液体培养基中培养；用质粒回收试剂盒提取质粒。

通过合成插入EcoR和Nde酶切位点的B型肉毒毒素轻链基因序列，为其设计引物，上游引物标为P1，下游引物标为P2。

P1（23bp）：5' CATATgCCAgTTACAATAAATAA-3'

P2（23bp）：5' gAATTCTCATTTAACACTTTTAC-3'

以重组质粒PET-28a-BontB为模板，P1和P2为引物进行扩增反应，得到的PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳鉴定分析，（见图3）；

用限制性内切酶和EcoRⅠ和NdeⅠ进行双酶切鉴定，并进行序列的测定。可见质粒经双酶切后，PCR扩增目的条带后，在1335bp上均有目的基因带（见图4），证明目的基因BontB基因已经连接到载体上，成功的构建了重组质粒PET-28a-BontB。

实施例3：重组蛋白PET-28a-BontB表达产物的SDS-PAGE结果分析

将重组质粒PET-28a-BontB转化表达菌-大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达后，SDS-PAGE结果显示：重组蛋白PET-28a-BontB在50KD左右处有一明显表达带，大小与理论值相符；见图5；

将重组蛋白表达菌裂解液上清和沉淀同时做SDS-PAGE电泳，其中上清与沉淀的比例为1:10，结果显示，目的蛋白绝大多数在上清中，沉淀中相应位置也存在少量目的蛋白，认为通过诱导条件的优化，在适宜的诱导环境下能够以可溶形式表达，见图5。

实施例4：重组蛋白PET-28a-BontB的纯化

重组蛋白的初步纯化：大量制备细菌，诱导表达重组蛋白，可溶性蛋白先进行DEAE阴离子交换层析柱，并收集流川峰，再进行属螯合层析Cu2+柱，收集200mM咪唑洗脱的目的蛋白。

用Thrombin酶切除His-Tag

重组蛋白的二次纯化：酶切后的蛋白进行属螯合层析Cu2+柱，收集250mM咪唑洗脱的目的蛋白。收集的蛋白经SDS-PAGE结果分析，如图，可在50KD左右处有一明显条带，且纯化效率可达90%以上，见图5。

实施例5：全人源抗Bont-B-scFv抗体的筛选

纯化的重组蛋白为抗原包被于96孔酶标板上，4℃过夜。次日弃上清，用2%的Milk-PBS 37℃封闭2h，加入噬菌体抗体库，滴度为1.0×10¹³，室温下剧烈晃动孵育60min，静置60min。后弃去液体，用含0.1%Twenn-20的PBS洗涤10次，洗涤后将每孔中残留的液体轻轻拍干，每孔加入50µL洗脱液（5mg/mL的胰酶-PBS），室温下剧烈晃动10min，洗脱噬菌体，收集4℃保存。

用洗脱下的噬菌体侵染E.coli TG1，并涂布于TYE平板上（含100µg/mLAmp和1%的葡萄糖）37℃过夜培养。利用辅助噬菌体KM13扩增噬菌体库，通过PEG/NaCl回收噬菌体。重复以上过程3次，共4轮筛选，收集筛选的噬菌体库。

实施例6：Bomt-B活性检测底物—GFP-SV的基因构建与纯化

根据GenBank 中登录的SNAPE25、VAMP基因序列，设计并合成HIS6-SNAPE62-EcoRI-VAMP57C-TAA基因，同时在基因两端分别插入BamHI和HindⅢ酶切位点，合成重组质粒pMD19-T- SV。

根据绿色荧光蛋白GFP基因，设计一对特异性引物，

上游引物P1: 5′-CATGccATGGTGAGCAAGGGCG-3′

下游引物P2: 5′-GCGGATCCcttgtacagCTCGTCCATG-3′

以P1和P2为引物，GFP质粒为模板，PCR扩增GFP基因，利用内切酶NcoI、BamHI双酶切载体pET-28a和720bp PCR回收产物，，以T4DNA连接酶连接pET-28a和GFP基因片段，连接产物转化感受态E.coli JM109，次日挑取单菌落，提取质粒。对其进行 PCR、双酶切以及测序鉴定，得出GFP成功克隆到pET-28a中，并未发生碱基丢失和突变，成功构建载体pET-28a-GFP。

用内切酶HindⅢ和BamHI对合成的重组质粒pMD19-T-SV和重组表达质粒pET-28a-GFP双酶切，分别回收393bp小片段和pET-28a-GFP载体大片段，以T4DNA连接酶连接。连接产物（pET-28a-GFP-SV）转化感受态E.coli JM109，涂布Kan（50 μg/ml）的LB平板上，37℃培养过夜。次日挑取单菌落，提取质粒，经双酶切和测序鉴定后，得出SV基因成功插入到pET-28a-GFP载体中，成功构建pET-28a-GFP-SV表达载体。

将重组质粒pET-28a-GFP-SV转化表达菌-大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，确定了最佳的表达方式：LB培养基，37℃，3 h。超声破碎菌体后经SDS-PAGE电泳检测，确定目的蛋白绝大多数在上清中，故目的蛋白以可溶形式表达。

重组蛋白GFP-SV的纯化，重组蛋白表达菌体经超声裂解，先后经过DEAE阴离子交换层析，金属螯合层析，Q阳离子交换层析，获得纯度在90%以上的纯品GFP-SV。热原质检测<20EU/mg，满足蛋白性质研究的需要。

实施例7：抗Bont-B-scFv阳性菌株鉴定

筛选后的噬菌体侵染E.Coli HB2151，诱导表达后，利用ELISA鉴定，置酶标仪测定OD值（波长为490nm），每个样品做双孔测定，取OD平均值。以2%Milk-PBS为阴性对照，阳性克隆菌株确定标准为：OD值为阴性对照的3倍以上，共获得200株阳性克隆菌株。

阳性菌株生物活性检测，将GFP-SV用包被液稀释，每孔包被30µg于检测板（PierceMaleimide Activated 96-well Plates,Black,15153）中，4℃过夜，用Wash buffer洗涤3次，将200株阳性菌株，诱导表达离心后，将100µL上清和4 µg Bont-B混匀，加入到检测板中，37℃作用2h，每份样品做双孔测定，再用Wash buffer洗涤3次，在多功能酶标仪上检测荧光强度，得出3株活性较好的菌株。按照Tomlinson I+J试剂盒上的pIT-2载体的基因序列，合成两条特异性PCR引物扩增scFv全基因片段。

P1 LMB3: 5’—CAG GAA ACA GCT ATG AC—3’

P2 pHEN: 5’ —CTA TGC GGC CCC ATT CA—3’

经检测3株阳性菌株，均能够出现明显900bp条带，含有完整的scFv。

测序鉴定其序列并经Blast数据库分析得出：得出3株阳性菌株均为人源单链抗体，分析如下：

3A-scFv：

ATA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC

I M K Y L L P T A A A G L L L L A A

CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA

Q P A M A E V Q L L E S G G G L V

CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT

Q P G G S L R L S C A A S G F T F

CDR-H1

AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG

S S Y A M S W V R Q A P G K G L E

CDR-H2

TGG GTC TCA AAT ATT TCT TCT AAT GGT AAT GCT ACA GCT TAC GCA GAC TCCGTG

W V S N I S S N G N A T A Y A D S V

AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA AAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG

K G R F T I S R N N S K N T L Y L

CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG AAA

Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K

CDR-H3

TAT ACT TAT GCT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCG

Y T Y A F D Y W G Q G T L V T V S

Linker

AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC GGC GGT GGC GGG TCG ACG

S G G G G S G G G G S G G G G S T

GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC

D I Q M T Q S P S S L S A S V G D

AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT TTA AAT

CDR-L1

R V T I T C R A S Q S I S S Y L N

TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT TAT GCA

W Y Q Q K P G K A P K L L I Y Y A

CDR-L2

TCC AAT TTG CAA AGC GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG

S N L Q S G V P S R F S G S G S G

ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA ACTTAC

T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y

CDR-L3

TAC TGT CAA CAG GAT TCT TAT ACT CCT TCT ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG

Y C Q Q D S Y T P S T F G Q G T K

GTG GAA ATC AAA CGG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC GGG GCC GCA

V E I K R A A A H H H H H H G A A

GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA TAG

E Q K L I S E E D L N G A A

2F-scFv：

ATA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG

I M K Y L L P T A A A G L L L L A

GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG

A Q P A M A E V Q L L E S G G G L

CDR-H1

GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC

V Q P G G S L R L S C A A S G F T

TTT AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG

F S S Y A M S W V R Q A P G K G L

CDR-H2

GAG TGG GTC TCA TCT ATT GCT TCT ACT GGT TCT AAT ACA GCT TAC GCA GAC TCC

E W V S S I A S T G S N T A Y A D S

GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA AAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT

V K G R F T I S R N N S K N T L Y

CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG

L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A

CDR-H3

AAA GGT ACT GGT ACT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC

K G T G T F D Y W G Q G T L V T V

Linker

TCG AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC GGC GGT GGC GGG TCG

S S G G G G S G G G G S G G G G S

ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA

T D I Q M T Q S P S S L S A S V G

CDR-L1

GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT TTA

D R V T I T C R A S Q S I S S Y L

AAT TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTA ATC TAT ACT

N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y T

CDR-L2

GCA TCC TAC TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT

A S Y L Q S G V P S R F S G S G S

GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA

G T D F T L T I S S L Q P E D F A

CDR-L3

ACT TAC TAC TGT CAA CAG GCT ACT ACT AGT CCT TAT ACG TTC GGC CAA GGG

T Y Y C Q Q A T T S P Y T F G Q G

ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC GGG

TKVEIKRAAAHHHHHHG

GCC GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA TAG

A A E Q K L I S E E D L N G A A

4C-scFv：

ATA ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC

I M K Y L L P T A A A G L L L L A A

CAG CCG GCC ATG GCT GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA

Q P A M A E V Q L L E S G G G L V

CAG CCT GGG GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT

Q P G G S L R L S C A A S G F T F

CDR-H1

AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG

S S Y A M S W V R Q A P G K G L E

CDR-H2

TGG GTC TCA GGT ATT TCT CCT ATG GGT ACT CGT ACA TCG TAC GCA GAC TCC

W V S G I S P M G T R T S Y A D S

GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT

V K G R F T I S R D N S K N T L Y

CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT GCG

L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A

CDR-H3

AAA AAT GCT AAT GGG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC

K N A N G F D Y W G Q G T L V T V

Linker

TCG AGC GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC AGC GGC GGT GGC GGG TCG

S S G G G G S G G G G S G G G G S

ACG GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTA GGA

T D I Q M T Q S P S S L S A S V G

CDR-L1

GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT AGC AGC TAT TTA

D R V T I T C R A S Q S I S S Y L

AAT TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGG

N W Y Q Q K P G K A P K L L I Y R

CDR-L2

GCA TCC GTT TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT

A S V L Q S G V P S R F S G S G S

GAG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCA

E T D F T L T I S S L Q P E D F A

CDR-L3

ACT TAC TAC TGT CAA CAG CGG AGT CGG CCG CCT ATT ACG TTC GGC CAA GGG

T Y Y C Q Q R S R P P I T F G Q G

ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG GCG GCC GCA CAT CAT CAT CAC CAT CAC GGG

T K V E I K R A A A H H H H H H G

GCC GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA TAG

A A E Q K L I S E E D L N G A A

实施例8：抗Bont-B-scFv纯化以及抗体亲和常数KD值测定

3株强阳性克隆菌株在37℃培养，至OD600到0.9，加入诱导剂30℃培养过夜（16h），过夜培养物4℃，3500×g离心30min，上清为表达的scFv，大小为31000。诱导上清先后经过55%饱和度硫酸铵沉淀和rProtein-A亲和层析后，得到纯度在90%以上的样品。

利用非竞争酶免疫法测定2F、4C和3A单链抗体的亲和常数，分别以4 µg/mL、2µg/mL、1µg/mL和0.5 µg/mL包被Bont-B，将单链抗体浓度调整到10^-6 mol/L，倍比稀释1:2~1:512，用1:5000倍稀释的Protein A-HRP抗体作为二抗，OPD显色，测定OD490nm吸光值，每个样品做双孔测定，取OD平均值。根据抗原抗体结合反应的S形曲线图，能够求解出在不同抗原浓度下板书吸光值的抗体浓度，带入到公式KA=（n-1）/2(nAb’-Ab)计算亲和常数，其中Ab’和Ab表示当抗原为Ag’和Ag时，产生半数吸光值的抗体浓度（mol/L），n=Ag/Ag’，当n=2时可以得到3个KA值，n=4时可得2个KA值，n=8时得1个KA值，把六个KA值取平均数就是最终的亲和常数数值。

从表 看出4C单链抗体的亲和常数为（4.38±0.445）×10⁵L/mol，3A的亲和常数为（5.35±0.903）×10⁵L/mol，2F为（1.146±0.525）×10⁶L/mol。

<110> 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所

<120> B 型肉毒毒素轻链基因碱基序列

<160> 10

<210> 1

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

catatgccag ttacaataaa taattttaat tataatgatc ctattgataa taataatatt 60

attatgatgg agcctccatt tgcgagaggt acggggagat attataaagc ttttaaaatc 120

acagatcgta tttggataat accggaaaga tatacttttg gatataaacc tgaggatttt 180

aataaaagtt ccggtatttt taatagagat gtttgtgaat attatgatcc agattactta 240

aatactaatg ataaaaagaa tatattttta caaacaatga tcaagttatt taatagaatc 300

aaatcaaaac cattgggtga aaagttatta gagatgatta taaatggtat accttatctt 360

ggagatagac gtgttccact cgaagagttt aacacaaaca ttgctagtgt aactgttaat 420

aaattaatca gtaatccagg agaagtggag cgaaaaaaag gtattttcgc aaatttaata 480

atatttggac ctgggccagt tttaaatgaa aatgagacta tagatatagg tatacaaaat 540

cattttgcat caagggaagg cttcgggggt ataatgcaaa tgaagttttg cccagaatat 600

gtaagcgtat ttaataatgt tcaagaaaac aaaggcgcaa gtatatttaa tagacgtgga 660

tatttttcag atccagcctt gatattaatg catgaactta tacatgtttt acatggatta 720

tatggcatta aagtagatga tttaccaatt gtaccaaatg aaaaaaaatt ttttatgcaa 780

tctacagatg ctatacaggc agaagaacta tatacatttg gaggacaaga tcccagcatc 840

ataactcctt ctacggataa aagtatctat gataaagttt tgcaaaattt tagagggata 900

gttgatagac ttaacaaggt tttagtttgc atatcagatc ctaacattaa tattaatata 960

tataaaaata aatttaaaga taaatataaa ttcgttgaag attctgaggg aaaatatagt 1020

atagatgtag aaagttttga taaattatat aaaagcttaa tgtttggttt tacagaaact 1080

aatatagcag aaaattataa aataaaaact agagcttctt attttagtga ttccttacca 1140

ccagtaaaaa taaaaaattt attagataat gaaatctata ctatagagga agggtttaat 1200

atatctgata aagatatgga aaaagaatat agaggtcaga ataaagctat aaataaacaa 1260

gcttatgaag aaattagcaa ggagcatttg gctgtatata agatacaaat gtgtaaaagt 1320

gttaaatgag aattc 1335

<210> 2

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工

<400> 2

Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn

5 10 15

Asn Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Met Gly Arg

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu

35 40 45

Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly

50 55 60

Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn

65 70 75 80

Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe

85 90 95

Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile

100 105 110

Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu

115 120 125

Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn

130 135 140

Pro Gly Glu Val Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile

145 150 155 160

Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly

165 170 175

Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln

180 185 190

Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu

195 200 205

Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro

210 215 220

Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Gly Ile Lys Val Asn Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe

245 250 255

Phe Met Gln Ser Thr Asp Ala Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe

260 265 270

Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Ser Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile

275 280 285

Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn

290 295 300

Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr

305 310 315 320

Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly

325 330 335

Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ser Leu

340 345 350

Met Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys

355 360 365

Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys

370 375 380

Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asp Ile

385 390 395 400

Ser Asp Lys Asn Met Glu Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile

405 410 415

Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr

420 425 430

Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys

435 440

<210> 3

<211> 1112

<212> DNA

<213> 人工

<400> 3

ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg 60

acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct 120

acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca 180

ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga 240

agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct 300

tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc 360

tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc 420

acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga 480

acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg 540

ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc 600

actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg 660

tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagg 720

gatcccatca tcatcatcat catatggatg aaaacctaga gcaggtgagc ggcatcatcg 780

ggaacctccg tcacatggcc ctggatatgg gcaatgagat cgatacacag aatcgccaga 840

tcgacaggat catggagaag gctgattcca acaaaaccag aattgatgag gccaaccaac 900

gtgcaacaaa gatgctggga agtggtgaat tcgcccaggt ggatgaggtg gtggacatca 960

tgagggtgaa cgtggacaag gtcctggagc gagaccagaa gctgtcggag ctggacgacc 1020

gtgcagatgc actccaggcg ggggcctccc agtttgaaac aagcgcagcc aagctcaagc 1080

gcaaatactg gtggaaaaac tgctaaaagc tt 1112

<210> 4

<211> 367

<212> PRT

<213> 人工

<400> 4

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly

225 230 235 240

Ser His His His His His His Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser

245 250 255

Gly Ile Ile Gly Asn Leu Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu

260 265 270

Ile Asp Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp

275 280 285

Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met

290 295 300

Leu Gly Ser Gly Glu Phe Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met

305 310 315 320

Arg Val Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu

325 330 335

Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu

340 345 350

Thr Ser Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Cys

355 360 365 367

<210> 5

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工

<400> 5

ataatgaaat acctattgcc tacggcagcc gctggattgt tattactcgc ggcccagccg 60

gccatggccg aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc 120

ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttagca gctatgccat gagctgggtc 180

cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcaaata tttcttctaa tggtaatgct 240

acagcttacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagaaacaa ttccaagaac 300

acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg 360

aaatatactt atgcttttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcggt 420

ggaggcggtt caggcggagg tggcagcggc ggtggcgggt cgacggacat ccagatgacc 480

cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca 540

agtcagagca ttagcagcta tttaaattgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag 600

ctcctgatct attatgcatc caatttgcaa agcggggtcc catcaaggtt cagtggcagt 660

ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgcaact 720

tactactgtc aacaggattc ttatactcct tctacgttcg gccaagggac caaggtggaa 780

atcaaacggg cggccgcaca tcatcatcac catcacgggg ccgcagaaca aaaactcatc 840

tcagaagagg atctgaatgg ggccgcatag 870

<210> 6

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工

<400> 6

Ile Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu

5 10 15

Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

35 40 45

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro

50 55 60

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Asn Ile Ser Ser Asn Gly Asn Ala

65 70 75 80

Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn

85 90 95

Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

100 105 110

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Thr Tyr Ala Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

165 170 175

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Ser Tyr Thr Pro Ser Thr Phe Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His His

260 265 270

Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala

275 280 285

Ala

289

<210> 7

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工

<400> 7

ataatgaaat acctattgcc tacggcagcc gctggattgt tattactcgc ggcccagccg 60

gccatggccg aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc 120

ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttagca gctatgccat gagctgggtc 180

cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcatcta ttgcttctac tggttctaat 240

acagcttacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagaaacaa ttccaagaac 300

acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg 360

aaaggtactg gtacttttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcggt 420

ggaggcggtt caggcggagg tggcagcggc ggtggcgggt cgacggacat ccagatgacc 480

cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca 540

agtcagagca ttagcagcta tttaaattgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag 600

ctcctaatct atactgcatc ctacttgcaa agtggggtcc catcaaggtt cagtggcagt 660

ggatctggga cagatttcac tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgcaact 720

tactactgtc aacaggctac tactagtcct tatacgttcg gccaagggac caaggtggaa 780

atcaaacggg cggccgcaca tcatcatcac catcacgggg ccgcagaaca aaaactcatc 840

tcagaagagg atctgaatgg ggccgcatag 870

<210> 8

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工

<400> 8

Ile Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu

5 10 15

Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Thr Gly Thr Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

165 170 175

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Ala Ser Tyr

195 200 205

Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Thr Thr Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His His

260 265 270

Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala

275 280 285

Ala

289

<210> 9

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工

<400> 9

ataatgaaat acctattgcc tacggcagcc gctggattgt tattactcgc ggcccagccg 60

gccatggctg aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc 120

ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttagca gctatgccat gagctgggtc 180

cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcaggta tttctcctat gggtactcgt 240

acatcgtacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac 300

acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg 360

aaaaatgcta atgggtttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagcggt 420

ggaggcggtt caggcggagg tggcagcggc ggtggcgggt cgacggacat ccagatgacc 480

cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccgggca 540

agtcagagca ttagcagcta tttaaattgg tatcagcaga aaccagggaa agcccctaag 600

ctcctgatct atagggcatc cgttttgcaa agtggggtcc catcaaggtt cagtggcagt 660

ggatctgaga cagatttcac tctcaccatc agcagtctgc aacctgaaga ttttgcaact 720

tactactgtc aacagcggag tcggccgcct attacgttcg gccaagggac caaggtggaa 780

atcaaacggg cggccgcaca tcatcatcac catcacgggg ccgcagaaca aaaactcatc 840

tcagaagagg atctgaatgg ggccgcatag 870

<210> 10

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工

<400> 10

Ile Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu

5 10 15

Ala Ala Glu Pro Ala Met Ala Gly Val Gln Leu Leu Glu Ser Glu Glu

20 25 30

Glu Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

35 40 45

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro

50 55 60

Gly lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Pro Met Gly Thr Arg

65 70 75 80

Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

85 90 95

Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

100 105 110

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Thr Gly Thr Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Glu Asp Arg Val Thr Ile

165 170 175

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu leu Ile Tyr Arg Ser Val leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr

210 215 220

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Arg Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His His

260 265 270

Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala

275 280 285

Ala

289

Claims (4)

1.抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.9所示。

2.抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.10所示。

3.权利要求1所述的抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv在生产治疗B型肉毒毒素酶中毒药物方面的应用。

4.检测B型肉毒毒素的试剂盒，它包括权利要求1所述的抗B型肉毒毒素酶活性的人源单链抗体4C-scFv。