CN103145850A - 底物蛋白snvp及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种梭菌属神经毒素底物蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的梭菌属神经毒素底物蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与梭菌属神经毒素检测相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明所提供的底物蛋白SNVP具有肉毒毒素7个血清型和破伤风毒素的酶解位点，可以特异识别A、B、E、C、D、F、G型肉毒毒素和破伤风毒素，作为核心检测试剂，可应用于多型肉毒毒素和破伤风毒素的检测和分型甄别。

Description

底物蛋白SNVP及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种梭菌属神经毒素底物蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种将SNAP-25蛋白与VAMP-2蛋白融合后得到的梭菌属神经毒素（肉毒毒素和破伤风毒素）底物蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

肉毒毒素（botulinum neurotoxin，BoNT）是世界上已知毒性最强的物质，由肉毒梭状芽孢杆菌（clostridium botulinum）在厌氧条件下产生，共有7种血清型（A-G），其中引起人类致病的主要是A、B型，能引起严重的中毒症状，死亡率高达40%，人体的半数致死剂量LD50仅为0.1-1ng/kg。中毒通常表现为眼部及喉部肌群的麻痹，然后发展为全身骨骼肌麻痹，最终由于呼吸衰竭而死。近几年，肉毒中毒事件时有发生，虽然肉毒中毒主要以食物污染、伤口感染、婴儿肠道中毒等方式出现，但由于肉毒毒素的毒性强烈，易于制备获得，使得其成为潜在的生物恐怖剂之一。

肉毒毒素由肉毒梭状芽孢杆菌产生，最初是以无毒的单链多肽形式存在，约150kDa，之后经菌体蛋白酶或体外蛋白酶作用，将毒素前体消化成为由一个二硫键相连的双链形式多肽存在才具有毒性，包括通过羧基端与靶细胞受体结合并通过氨基端介导细胞内吞将毒素转运至细胞内部的重链部分（Heavy chain，Hc），约100kDa，以及具有锌依赖内肽酶活性的轻链部分（Light chain，Lc），约50kDa，可以特异切割靶细胞内肉毒毒素的底物，而发挥神经毒力。其中，重链是毒素的非毒性部分，而轻链则是毒素的毒性部分。肉毒毒素的底物根据其血清型不同而不同，并且针对同一种底物的几种不同血清型毒素各自的作用位点也不同。A、E、C型肉毒毒素作用的底物为突触小体相关蛋白（Synaptosomal associated protein of molecular mass25kDa，SNAP-25），作用位点分别为：A型：Q197-R198；E型：R180-I181；C型：R198-A199；B、D、F、G型肉毒毒素作用的底物为囊泡相关膜蛋白（Vesicle associated membraneprotein，VAMP or Synaptobrevin），作用位点分别为：B型：Q76-F77；D型：K59-L60；F型：Q58-K59；G型：A81-A82。另外，与肉毒毒素同为梭菌属神经毒素的破伤风毒素的作用底物也为囊泡相关膜蛋白，其作用位点与B型肉毒毒素作用位点相同。再有，C型肉毒毒素还可以切割可溶N2乙基马来酰亚胺敏感因子胞膜整合蛋白（Syntaxin），位点为K253-A254。这些底物共同被称为SNARE蛋白，在介导小泡定向和融合方面起重要作用。

实现对于微量肉毒毒素的快速、准确的检测分析，是及时准确采取防治措施、减少其危害的前提和最重要的手段之一。迄今为止，对于肉毒毒素的检测分析法中，唯一公认的金标准是小鼠分析法（mouse bioassay），这种分析方法主要通过向小鼠腹腔注射待测样品，进而观察小鼠是否出现中毒症状，如出现蜂腰，皮毛倒立，呼吸微弱，四肢麻痹，甚至死亡等症状，从而分析待测样品中毒素量的多少并用特异抗体确定型别如何，可以实现对皮克级（pg）毒素的分析。虽然传统金标准对绝大部分样品分析的结果都是真实可靠的，但也存在许多限制，主要表现在成本高（动物饲养条件要求高，操作人员专业技能要求高），耗时长（需要4天），样品需要量大，不易推广等，无法满足突发公共卫生事件中样本应急分析的要求，因此亟需简便、快速、灵敏的新技术方法实现对传统金标准的有效替代。

近几年，国内外许多学者在肉毒毒素的分析方法方面开展了相关研究，也已经有一些新型的分析方法问世，除了上面提到过的传统金标准外，主要包括：（1）内肽酶活性分析法（endopeptidase activity assay），可以使用人工合成或重组表达的含有特异血清型酶切位点的肽段作为底物，利用检测标记的荧光信号等方法对待测样品中毒素进行分析；（2）质谱分析法，对毒素酶解底物产物直接进行检测，可以达到小鼠分析法的灵敏度甚至更高，但依赖特殊设备，且其结果容易被待测样品中其他物质所干扰；（3）细胞分析法，可以体外模拟肉毒中毒的过程，解决了小鼠分析法使用大量动物的问题，但操作较复杂，耗时长。目前，这些方法和配套试剂产品多数是针对特定的血清型毒素进行检测分析，还没有简便应用单一检测产品可以覆盖所有血清型毒素的检测系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种梭菌属神经毒素（肉毒毒素和破伤风毒素）底物蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的梭菌属神经毒素底物蛋白是将两个单一底物SNAP-25与VAMP-2应用组氨酸重复序列作为连接肽进行分子融合，并在C末端添加Tag纯化标签后得到的融合蛋白，命名为SNVP，是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与肉毒毒素检测相关的由序列2衍生的蛋白质。

为了便于SNVP融合蛋白的纯化，可将的序列2所示氨基酸序列中的Tag纯化标签（第95-102位）替换为如下表所示的其他纯化标签，当然纯化标签也可根据需要连接在融合蛋白的N末端。

表：标签的序列

标签

残基

序列

Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
			Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

编码所述SNVP融合蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述SNVP融合蛋白的基因（命名为SNVP）；所述基因是如下1）或2）所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列1的DNA分子；

2）序列表中序列1所示的DNA分子。

其中，序列1由948个核苷酸组成，整个序列即为编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质，序列2由315个氨基酸组成。

更进一步，序列1的第1-618位属于SNAP-25蛋白的编码区序列，编码所述SNAP-25蛋白的第1-206位氨基酸，对应序列2的第1-206位；序列1的第619-639位为组氨酸连接肽的编码序列，对应序列2的第207-213位；序列1的第640-921位属于VAMP-2蛋白的编码区序列，编码所述VAMP-2蛋白的第1-94位氨基酸，对应序列2的第214-307位；序列1的第922-945位为Tag纯化标签的编码序列，对应序列2的第308-315位。

下述a）-e）中的任一种生物材料也属于本发明的保护范围：

a）含有所述核酸分子的重组载体；

b）含有所述核酸分子的表达盒；

c）含有所述核酸分子的重组细胞；

d）含有所述核酸分子的重组菌；

e）含有所述核酸分子的重组病毒。

上述生物材料中，a）所述的重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述SNVP基因转录的启动子具体为T7启动子。更为具体的，所述重组表达载体为在pET22b载体的多克隆位点处插入所述SNVP基因得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为NcoⅠ和XhoⅠ。b）所述的表达盒由能够启动所述SNVP基因表达的启动子，所述SNVP基因，以及转录终止序列组成。c）所述重组细胞不包括动植物繁殖材料。d）所述重组微生物具体可为细菌，酵母，藻和真菌。在本发明中，所述重组微生物具体为表达所述SNVP融合蛋白的大肠杆菌BL21（DE3）Rosetta。e）所述重组病毒可为携带有所述SNVP基因的重组腺病毒、重组腺相关病毒等。

如下I）或II）的应用也属于本发明的保护范围：

I）所述SNVP融合蛋白在作为梭菌属神经毒素（肉毒毒素和破伤风毒素）底物中的应用；

II）所述SNVP融合蛋白，或所述核酸分子，或所述生物材料在制备检测梭菌属神经毒素（肉毒毒素类型和破伤风毒素）的产品中的应用。所述产品可为试剂盒。

在本发明的一个实施例中，所述梭菌属神经毒素具体为A型肉毒毒素或B型肉毒毒素。

本发明的再一个目的是提供一种用于检测梭菌属神经毒素（肉毒毒素和破伤风毒素）的产品。

本发明所提供的用于检测梭菌属神经毒素（肉毒毒素和破伤风毒素）的产品，其活性成分为所述SNVP融合蛋白，或所述核酸分子，或所述生物材料。所述产品可为试剂盒。

本发明的另一个目的是提供一种检测待测样品中是否含有梭菌属神经毒素（肉毒毒素和破伤风毒素），以及含有哪种梭菌属神经毒素（肉毒毒素和破伤风毒素）的方法。

本发明所提供的检测待测样品中是否含有梭菌属神经毒素（肉毒毒素和破伤风毒素），以及含有哪种梭菌属神经毒素（肉毒毒素和破伤风毒素）的非疾病诊断或治疗方法，具体可包括如下步骤：

（1）将所述SNVP融合蛋白与待测样品进行反应；

（2）根据反应产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品中是否含有梭菌属神经毒素（肉毒毒素和破伤风毒素），以及含有哪种梭菌属神经毒素（肉毒毒素和破伤风毒素）：

若满足（a1）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有A型肉毒毒素（作用位点为所述SNVP融合蛋白的Q197-R198）；

若满足（a2）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有B型肉毒毒素或破伤风毒素（作用位点为所述SNVP融合蛋白的Q289-F290）；

若满足（a3）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有C型肉毒毒素（作用位点为所述SNVP融合蛋白的R198-A199）；

若满足（a4）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有D型肉毒毒素（作用位点为所述SNVP融合蛋白的K272-L273）；

若满足（a5）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有E型肉毒毒素（作用位点为所述SNVP融合蛋白的R180-I181）；

若满足（a6）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有F型肉毒毒素（作用位点为所述SNVP融合蛋白的Q271-K272）；

若满足（a7）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有G型肉毒毒素（作用位点为所述SNVP融合蛋白的A294-A295）；

若同时不满足（a1）-（a7）的条件，则所述待测样品中不含有或候选不含有梭菌属神经毒素（肉毒毒素和破伤风毒素）；

（a1）反应产物中含有大小为22.41KDa和/或13.10KDa的蛋白质；

（a2）反应产物中含有大小为32.15KDa和/或3.36KDa的蛋白质；

（a3）反应产物中含有大小为22.57KDa和/或12.94KDa的蛋白质；

（a4）反应产物中含有大小为30.40KDa和/或5.10KDa的蛋白质；

（a5）反应产物中含有大小为20.46KDa和/或15.04KDa的蛋白质；

（a6）反应产物中含有大小为30.28KDa和/或5.23KDa的蛋白质；

（a7）反应产物中含有大小为32.68KDa和/或2.82KDa的蛋白质。

在实际应用中，由于8种梭菌属神经毒素（7种不同血清型的肉毒毒素，以及破伤风毒素）中的一些对作为底物的所述SNVP融合蛋白的作用位点非常接近，导致SNVP融合蛋白被酶解后产生的蛋白片段非常接近，从SDS-PAGE结果上不易区分。所以当根据SDS-PAGE电泳结果判定待测样品中含有哪种梭菌属神经毒素时，可将以上所述“检测待测样品中是否含有梭菌属神经毒素，以及含有哪种梭菌属神经毒素的方法”中步骤（2）对结果的判定方法转化为如下：

若满足（b1）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有A、C和E型肉毒毒素中的至少一种；

若满足（b2）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有B、G型肉毒毒素和破伤风毒素中的至少一种；

若满足（b3）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有D和F型肉毒毒素中的至少一种；

若同时不满足（b1）-（b3）的条件，则所述待测样品中不含有或候选不含有梭菌属神经毒素；

（b1）反应产物经SDS-PAGE得到的蛋白条带中有大小为20-23KDa和/或12-16KDa的蛋白条带；

（b2）反应产物经SDS-PAGE得到的蛋白条带中有大小为32-34KDa和/或1-4KDa的蛋白条带；

（b3）反应产物经SDS-PAGE得到的蛋白条带中有大小为28-31KDa和/或5-7KDa的蛋白条带。

在上述方法的步骤（1）中，所述反应的温度可为30-38℃（如37℃）；所述反应的时间可为≥5min（如10min）；所述反应是在如下反应液中进行的：所述反应液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：50mmol/L HEPES，2.5mmol/L DTT，10μmol/L ZnCl₂，pH7.5。

在上述方法中，所述待测样品主要为食品，也可为离体血清等。在本发明的一个实施例中，所述待测样品具体为A型肉毒毒素或B型肉毒毒素。

以上所有所述的梭菌属神经毒素均可为如下八种中的至少一种：A型肉毒毒素、B型肉毒毒素、C型肉毒毒素、D型肉毒毒素、E型肉毒毒素、F型肉毒毒素、G型肉毒毒素和破伤风毒素。

所述SNVP融合蛋白的制备方法也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的所述SNVP融合蛋白的制备方法，具体可包括如下步骤：将所述SNVP融合蛋白的编码基因在生物细胞中进行表达得到所述SNVP融合蛋白；所述生物细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。在本发明的一个实施例中，所述生物细胞具体为大肠杆菌（具体如BL21（DE3）Rosetta）。

在上述方法中，所述SNVP融合蛋白的编码基因（SNVP基因）的核苷酸序列具体如序列表中序列1所示。

在本发明的一个实施例中，所述SNVP基因具体通过重组表达载体的形式导入目的大肠杆菌中；所述重组表达载体具体为在pET22b载体的多克隆位点（如NcoⅠ和XhoⅠ）处插入所述SNVP基因得到的重组质粒。

本发明设计并生物制备的新的肉毒毒素底物融合蛋白SNVP，具有肉毒毒素7个血清型的酶解位点，可以特异识别A、B、E、C、D、F、G型肉毒毒素，作为核心检测试剂，SNVP融合蛋白可应用于多型肉毒毒素的检测和分型甄别。

附图说明

图1为SNVP基因的分子构建示意图。其中，A-G表示A-G型肉毒毒素的切割位点。

图2为纯化后的SNVP融合蛋白的SDS-PAGE分析结果。其中，泳道M为蛋白分子量标志物；泳道1为纯化后的SNVP融合蛋白。

图3为SDS-PAGE分析肉毒毒素（A、B型）切割SNVP融合蛋白底物产生的肽段图谱。其中，泳道1为SNVP融合蛋白未经肉毒毒素作用；泳道2为SNVP融合蛋白经A型肉毒毒素作用；泳道3为SNVP融合蛋白经B型肉毒毒素作用。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta感受态细胞，大肠杆菌DH5α和pEASY-T1克隆载体购自北京TransGen生物技术公司。TRIzol和RNA逆转录试剂盒购自Invitrogen。TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶和限制性内切酶购NEB公司。PCR引物合成由北京Sunbio生物科技有限公司。质粒提取和纯化试剂盒购自北京Biomed有限公司。HisTrapFF柱（5毫升）购自北京GE公司。8-10kDa的透析膜购自北京科海军舟生物技术公司。表达载体pET22b为Novage公司产品。挪威小鼠购自军事医学科学院实验动物中心。其他试剂为常用分析纯试剂。

LB培养基：1%蛋白胨、1%酵母提取物、0.5%氯化钠，pH7.2。各百分含量均为100mL培养基中相应组分的克数。

Ni-NTA平衡缓冲液（A液）：20mmol/L磷酸钠、500mmol/L氯化钠、40mmol/L咪唑、pH7.4（上样前用于平衡柱子，以及用于稀释待测样品）或pH6.5（上样后用于平衡柱子）。各浓度为相应组分在溶液中的终浓度。

Ni-NTA洗脱缓冲液（B液）：20mmol/L磷酸钠、500mmol/L氯化钠、400mmol/L咪唑、pH7.4。各浓度为相应组分在溶液中的终浓度。

切割反应缓冲液：50mmol/L HEPES、2.5mmol/L DTT、10μmol/L氯化锌、pH7.4。各浓度为相应组分在溶液中的终浓度。

实施例1、SNVP融合蛋白的获得

一、重组表达载体pET22b-SNVP的构建

1、用于扩增SNAP-25基因和VAMP-2基因的模板的获得

以小鼠脑组织RNA为模板，采用RNA逆转录试剂盒，反转录得到第一条cDNA链。根据Genbank中已报道的小鼠突触小体相关蛋白SNAP-25（Genbank：NM_011428.3）和小鼠囊泡相关膜蛋白VAMP-2（Genbank：NM_009497）的序列，设计特异引物P1（针对SNAP-25基因）和P2（针对VAMP-2基因）逆转录扩增2条cDNA。P1：5’-TTAACCACTTCCCAGCATCTTTGTTGCACG-3’（Genbank：NM_011428.3的第805-834位的反向互补序列，该序列的第4-30位为序列1的第592-618位的反向互补序列）

P2：5’-TCTTAGGCAGGGCAGACTCC-3’（Genbank：NM_009497的第458-477位的反向互补序列）。

2、PCR扩增SNAP-25基因和VAMP-2基因

以步骤1获得的含SNAP-25基因的cDNA为模板，以如下P3和P4为引物对，进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃2min；94℃30s，58℃40s，72℃1min，30次循环；最后72℃延伸10min。

P3：5’CCATGGCCGAAGACGCAGACA-3’（下划线部分为Nco I的识别位点，该序列的第3-21为序列1的第1-19位）；

P4：5’-CCATGGCACCACTTCCCAGCAT-3’（下划线部分为Nco I的识别位点，该序列为序列1的第604-643位的反向互补序列，粗体部分的序列为6×His序列）。

以步骤1获得的含VAMP-2基因的cDNA为模板，以如下P5和P6为引物对，进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃2min；94℃30s，55℃40s，72℃40s，30次循环；最后72℃延伸10min。

P5：5’-GCCATGGCGGCTACCGCTG-3’（下划线部分为Nco I的识别位点，该序列为序列1的第637-655位）；

P6：5’-CTCGAGCTTGAGGTTTTTCCAC-3’（下划线部分为Xho I的识别位点，该序列为序列1的第906-927位的反向互补序列）。

将上述扩增SNAP-25基因和VAMP-2基因的PCR产物分别连接至pEASY-T1载体，转化感受态DH5a，从阳性克隆中提取T载体连接质粒，进行测序鉴定和酶切处理。将经测序表明在pEASY-T1载体中插入“CC+序列1的第1-643位”的T载体连接质粒，命名为pEASY-SNAP-25；将经测序表明在pEASY-T1载体中插入序列1的第637-927位的T载体连接质粒，命名为pEASY-VAMP-2。

3、重组表达载体pET22b-SNVP的构建

用限制性内切酶Nco I和Xho I双酶切步骤2获得的重组质粒pEASY-VAMP-2，回收大小约为300bp的目的条带，与经相同双酶切的pET22b表达载体的骨架大片段连接，转化感受态DH5a，从阳性克隆中提取重组质粒并测序鉴定。将经测序表明在pET22b表达载体的多克隆位点Nco I和Xho I之间插入了序列1的第644-921位所示DNA片段的重组质粒命名为pET22b-VAMP。用限制性内切酶Nco I酶切步骤2获得的重组质粒pEASY-SNAP-25，回收大小约为640bp的目的条带，与经相同酶切的重组表达载体pET22b-VAMP连接，转化感受态DH5a，从阳性克隆中提取重组质粒并测序鉴定。将经测序表明在重组表达载体pET22b-VAMP的酶切位点Nco I处正向插入了序列1的第5-637位所示DNA片段的重组质粒命名为pET22b-SNVP。重组表达载体pET22b-SNVP为在表达载体pET22b的多克隆位点Nco I和Xho I之间插入了序列1的第5-921位后得到的重组质粒（序列1的第1-4位存在于酶切位点Nco I的识别序列中“CC

”，序列1的第922-948位存在于pET22b质粒上，将整个序列1所示的ORF命名为SNVP基因）。在重组表达载体pET22b-SNVP中，含有完整的SNVP基因的开放阅读框（结构图如图1所示），从N端到C端依次为：SNAP-25编码基因（第1-618位，618bp），连接肽序列HHHHHHA编码基因（第619-639位，21bp），对应VAMP-2编码基因（第640-921位，282bp），Tag序列LEHHHHHH编码基因（第922-945位，24bp），末端为终止子TGA（第946-948位，3bp）。在重组表达载体pET22b-SNVP中，启动序列表中序列1所示SNVP基因表达的启动子为T7启动子。

二、SNVP融合蛋白的原核表达及纯化

1、SNVP融合蛋白的原核表达

用步骤一所得的重组表达载体pET22b-SNVP转化大肠杆菌BL21(DE)Rosetta感受态中（实验组），接种于1L的LB培养基（含氨苄青霉素浓度为100μg/ml）置于3L烧杯中。37℃水浴振荡培养，待菌体生长至OD600约为0.6-0.8时，添加IPTG至终浓度为1mmol/L，20℃振荡培养20h。诱导结束后，4℃，6000×g离心20min，收集菌体沉淀，以PBS悬浮，超声（800W，运行3s，间歇5s，600次）破碎后4℃，12000×g离心10min，收集超声上清组分（SNVP融合蛋白表达产物分别为可溶和包涵体形式），获得待纯化的粗制SNVP融合蛋白。SDS-PAGE对所得粗制蛋白进行检测。同时以转化空载体pET22b，并经相同浓度IPTG诱导的菌株作为空载体对照；以未经IPTG诱导的转化重组表达载体pET22b-SNVP的菌株为IPTG零对照；以未经转化的空白菌株作为空白对照。

SDS-PAGE检测结果显示，实验组得到了大小约为35.5KDa的蛋白条带，与预期的SNVP融合蛋白大小相符；而三个对照组均未得到大小约为35.5KDa的目的蛋白条带。可见采用上述方法经IPTG诱导成功制备得到了目的蛋白（SNVP融合蛋白）。

2、SNVP融合蛋白的纯化及鉴定

由于目的蛋白（SNVP融合蛋白）中带有6个His，故而将步骤1得到的待纯化的粗制蛋白经HisTrap FF柱（5毫升，GE产品）分离纯化，根据产品操作说明书进行，平衡镍柱时，以及对用待纯化的粗制蛋白进行稀释时用Ni-NTA平衡缓冲液（A液），洗脱时用Ni-NTA洗脱缓冲液（B液）。获得纯化后的SNVP融合蛋白。

将上述所得纯化后的SNVP融合蛋白用8-10kDa的透析膜（北京科海军舟生物技术公司）经10mmol/L PBS透析，以除去与蛋白结合的盐类等小分子。

一方面，将上述透析后的SNVP融合蛋白进行SDS-PAGE电泳，并用Bandscan5.0分析蛋白纯度。另一方面，用考马斯亮蓝法测定透析后的SNVP融合蛋白的浓度。

SDS-PAGE检测结果如图2所示，纯化后目的条带较单一，无杂带，经Bandscan5.0分析所得SNVP融合蛋白的纯度达95%左右。SNVP融合蛋白的浓度为5mg/ml。

实施例2、SNVP融合蛋白的梭菌属神经毒素底物活性测定

本实施例将测定实施例1制备得到的SNVP融合蛋白的梭菌属神经毒素底物活性，具体涉及检测待测样品中是否含有梭菌属神经毒素，以及含有哪种梭菌属神经毒素的方法，该方法可包括如下步骤：

（1）将实施例1制备得到的SNVP融合蛋白与待测样品在切割反应缓冲液中进行酶解反应；

（2）由于不同血清型肉毒毒素或破伤风毒素酶解作用可使底物（SNVP融合蛋白）产生不同大小的肽段，所以根据反应产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品中是否含有梭菌属神经毒素，以及含有哪种梭菌属神经毒素，即含有七种不同血清型肉毒毒素和破伤风毒素中的哪一种或哪几种：

若满足（a1）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有A型肉毒毒素（作用位点为SNVP融合蛋白的Q197-R198）；

若满足（a2）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有B型肉毒毒素或破伤风毒素（作用位点为SNVP融合蛋白的Q289-F290）；

若满足（a3）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有C型肉毒毒素（作用位点为SNVP融合蛋白的R198-A199）；

若满足（a4）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有D型肉毒毒素（作用位点为SNVP融合蛋白的K272-L273）；

若满足（a5）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有E型肉毒毒素（作用位点为SNVP融合蛋白的R180-I181）；

若满足（a6）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有F型肉毒毒素（作用位点为SNVP融合蛋白的Q271-K272）；

若满足（a7）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有G型肉毒毒素（作用位点为SNVP融合蛋白的A294-A295）；

若同时不满足（a1）-（a7）的条件，则所述待测样品中不含有或候选不含有梭菌属神经毒素；

（a1）反应产物中含有大小为22.41KDa和/或13.10KDa的蛋白质；

（a2）反应产物中含有大小为32.15KDa和/或3.36KDa的蛋白质；

（a3）反应产物中含有大小为22.57KDa和/或12.94KDa的蛋白质；

（a4）反应产物中含有大小为30.40KDa和/或5.10KDa的蛋白质；

（a5）反应产物中含有大小为20.46KDa和/或15.04KDa的蛋白质；

（a6）反应产物中含有大小为30.28KDa和/或5.23KDa的蛋白质；

（a7）反应产物中含有大小为32.68KDa和/或2.82KDa的蛋白质。

在实际应用中，由于8种梭菌属神经毒素（7种不同血清型的肉毒毒素，以及破伤风毒素）中的一些对底物SNVP融合蛋白的作用位点非常接近，导致SNVP融合蛋白被酶解后产生的蛋白片段非常接近，从SDS-PAGE结果上不易区分。所以当根据SDS-PAGE电泳结果判定待测样品中含有哪种梭菌属神经毒素时，可将上述“检测待测样品中是否含有梭菌属神经毒素，以及含有哪种梭菌属神经毒素的方法”中对结果的判定方法转化为如下：

若满足（b1）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有A、C和E型肉毒毒素中的至少一种；

若满足（b2）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有B、G型肉毒毒素和破伤风毒素中的至少一种；

若满足（b3）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有D和F型肉毒毒素中的至少一种；

若同时不满足（b1）-（b3）的条件，则所述待测样品中不含有或候选不含有梭菌属神经毒素；

（b1）反应产物经SDS-PAGE得到的蛋白条带中有大小为20-23KDa和/或12-16KDa的蛋白条带；

（b2）反应产物经SDS-PAGE得到的蛋白条带中有大小为32-34KDa和/或1-4KDa的蛋白条带；

（b3）反应产物经SDS-PAGE得到的蛋白条带中有大小为28-31KDa和/或5-7KDa的蛋白条带。

一、肉毒毒素的提取和鉴定

A型肉毒毒素：提取和鉴定方法参见文献“C.J.Malizio,M.C.Goodnough,E.A.Johnson,Purification of Clostridium botulinum type A neurotoxin,Methods Mol Biol.145(2000)27-39”，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。

B型肉毒毒素：提取和鉴定方法参见文献“H.Arimitsu,K.Inoue,Y.Sakaguchi,J.Lee,Y.Fujinaga,T.Watanabe,T.Ohyama,R.Hirst,K.Oguma,Purification of fullyactivated Clostridium botulinum serotype B toxin for treatment of patients with dystonia,Infect Immun.71(2003)1599-1603”，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得。

以上毒素提取和鉴定过程中涉及的厌氧培养基，配方如下：3%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%葡萄糖、0.05%L-半胱氨酸、0.1%硫代乙醇酸钠，pH7.4。各百分含量均为100mL培养基中相应组分的克数。

二、SNVP蛋白对肉毒毒素的识别

向切割反应缓冲液中加入步骤一的肉毒毒素（A型或B型肉毒毒素）和实施例1所得的纯化后的SNVP融合蛋白，使肉毒毒素在反应体系中的终浓度为5nmol/L，SNVP融合蛋白在反应体系中的终浓度为10μmol/L，于37℃共孵育10min，同时设定一组不加肉毒毒素的阴性对照。SNVP融合蛋白的底物活性分析采用20%SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝显色观察。实验重复3次。

图3显示了A型、B型肉毒毒素切割SNVP融合蛋白的分析结果：SNVP融合蛋白被A型肉毒毒素酶解后产生了大小分别为22.41KDa和13.10KDa的两个肽段，SNVP融合蛋白被B型毒素酶解后产生了大小分别为32.15KDa和3.36KDa的两个肽段。

三、SNVP蛋白对肉毒毒素识别的灵敏度测定

向切割反应缓冲液中加入步骤一的肉毒毒素（A型或B型肉毒毒素）和实施例1所得的纯化后的SNVP融合蛋白，使SNVP融合蛋白在反应体系中的终浓度为10μmol/L，肉毒毒素在反应体系中的终浓度设为以下三梯度10nmol/L、1nmol/L、100pmol/L，形成3个反应体系，分别于37℃共孵育10min，同时设定一组不加肉毒毒素的阴性对照。SNVP融合蛋白的底物活性分析采用20%SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝显色观察。实验重复3次。

三次实验的结果均显示，当反应体系中肉毒毒素的浓度为100pmol/L时仍能清晰的看到SNVP融合蛋白被A型肉毒毒素酶解后产生了大小分别为22.41KDa和13.10KDa的两个肽段，SNVP融合蛋白被B型毒素酶解后产生了大小分别为32.15KDa和3.36KDa的两个肽段。以上结果表明，用实施例1所得的纯化后的SNVP融合蛋白检测待测样品中肉毒毒素，具有较高的灵敏度，其检测限小于100pmol/L。

Claims (10)

1.蛋白质，是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与肉毒毒素检测相关的由序列2衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下1）或2）所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列1的DNA分子；

2）序列表中序列1所示的DNA分子。

4.下述a）-e）中的任一种生物材料：

a）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体；

b）含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒；

c）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组细胞；

d）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌；

e）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组病毒。

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于：在所述重组表达载体中，启动所述基因转录的启动子为T7启动子。

7.如下I）或II）的应用：

I）权利要求1所述蛋白质在作为梭菌属神经毒素底物中的应用；

II）权利要求1所述蛋白质，或权利要求2或3所述核酸分子，或权利要求4-6中任一所述的生物材料在制备检测梭菌属神经毒素的产品中的应用。

8.用于检测梭菌属神经毒素的产品，其活性成分为权利要求1所述蛋白质，或权利要求2或3所述核酸分子，或权利要求4-6中任一所述生物材料。

9.检测待测样品中是否含有梭菌属神经毒素，以及含有哪种梭菌属神经毒素的方法，包括如下步骤：

（1）将权利要求1所述的蛋白质与待测样品进行反应；

（2）根据反应产物的大小，按照如下方法确定所述待测样品中是否含有梭菌属神经毒素，以及含有哪种梭菌属神经毒素：

若满足（a1）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有A型肉毒毒素；

若满足（a2）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有B型肉毒毒素或破伤风毒素；

若满足（a3）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有C型肉毒毒素；

若满足（a4）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有D型肉毒毒素；

若满足（a5）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有E型肉毒毒素；

若满足（a6）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有F型肉毒毒素；

若满足（a7）的条件，则所述待测样品中含有或候选含有G型肉毒毒素；

若同时不满足（a1）-（a7）的条件，则所述待测样品中不含有或候选不含有梭菌属神经毒素；

（a1）反应产物中含有大小为22.41KDa和/或13.10KDa的蛋白质；

（a2）反应产物中含有大小为32.15KDa和/或3.36KDa的蛋白质；

（a3）反应产物中含有大小为22.57KDa和/或12.94KDa的蛋白质；

（a4）反应产物中含有大小为30.40KDa和/或5.10KDa的蛋白质；

（a5）反应产物中含有大小为20.46KDa和/或15.04KDa的蛋白质；

（a6）反应产物中含有大小为30.28KDa和/或5.23KDa的蛋白质；

（a7）反应产物中含有大小为32.68KDa和/或2.82KDa的蛋白质。

10.权利要求1所述蛋白质的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的蛋白质的编码基因在生物细胞中进行表达得到权利要求1所述蛋白质；所述生物细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞；

所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列具体如序列表中序列1所示。

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