CN1632587A - 一种检测肉毒毒素的免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测肉毒毒素的免疫层析试纸及其制备方法。本发明所提供的检测肉毒毒素的免疫层析试纸，包括吸水纸垫、紧密连接于所述吸水纸垫的包被有抗肉毒抗体的纤维膜、紧密连接于所述纤维膜上的含有抗肉毒抗体的免疫金胶体探针的金标垫和紧密连接于所述金标垫的样品垫。为了使用方便，所述吸水纸垫的下面还紧密连接有背板。利用本发明所提供的免疫层析试纸检测肉毒，非专业人员按照说明书即可操作，标本处理过程简单，5分钟内观察结果，最少可检出A型肉毒2ng/ml，检测灵敏度不受标本来源的影响。该肉毒毒素免疫检测试纸具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，适于临床和现场使用。

Description

一种检测肉毒毒素的免疫层析试纸及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种肉毒毒素的检测试纸及其制备方法，特别涉及一种检测肉毒毒素的免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

肉毒毒素(Botulinum toxins)是肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)在无氧条件下产生的外毒素，是天然物质中毒力最强的嗜神经毒素。根据抗原性的不同分为A-G7个型，其中A、B、E型主要引起人类中毒，而且以A型肉毒毒素毒力最强，C型则主要引起动物中毒。肉毒毒素作为经典的生物战剂，被列入国际禁止生物武器公约核查清单。9.11以后，又被美国列为最有可能用于进行生物恐怖活动的生物剂。

肉毒毒素检测最经典的方法是小鼠致死及中和试验，目前仍是最敏感、可信的方法。但该方法比较繁琐和耗时，不适于现场和临床使用。

分子生物学和免疫学检测是另外的两类方法，前者有基因探针和PCR，用于检测肉毒梭菌；后者包括放射免疫、反向血凝、反向乳胶凝集、酶联免疫吸附(ELISA)等方法，用于检测肉毒毒素，表1为不同免疫学方法检测肉毒毒素的比较(Szilagyi M，Rivera VR，Neal D，Merrill GA，Poli MA Development of sensitive colorimetriccapture elisas for Clostridium botulinum neurotoxin serotypes A and B.Toxicon2000 Mar；38(3)：381-9)。

    表1.不同免疫学方法检测肉毒毒素的比较

检测方法        可检测物    敏感性       特异性

放射免疫        血清样品    ＞20ng/ml    100％

反向血球凝集    污染食物    10ng/ml      ＞90％

反向乳胶凝集    污染食物    4-8ng/ml

酶联免疫吸附    污染食物    5ng/ml

另外，不同标本用不同方法检测肉毒毒素的敏感性也有差别，如表2显示小鼠致死试验和ELISA在检测不同标本中的差异：同一份生薯条标本中，小鼠致死实验检测出肉毒毒素10⁴MLD/g，而ELISA测出5×10⁵MLD/g；熟薯条中分别为10⁶MLD/g和10⁵MLD/g；呕吐物测出结果是一致的，均为100MLD/g，而培养上清又分别为10⁵MLD/ml和10⁴MLD/ml，说明这些方法的敏感性受标本类型的影响(Ferreira JL，Eliasberg SJ，Harrison MA，Edmonds P.Detection of preformed type A botulinal toxin in hashbrown potatoes by using the mouse bioasssay and a modified ELISA test.J AOACInt 2001 Sep-Oct；84(5)：1460-4)。

表2.小鼠致死试验和ELISA在检测不同标本中肉毒毒素的差异

标本类型    小鼠致死实验(MLD)    ELISA(MLD)

生薯条      1×10⁴              5×10⁴

熟薯条      10⁶                 10⁵

呕吐物      10²                 10²

培养上清    10⁷                 10⁴

1ng肉毒毒素相当5×10⁵MLD(最小致死量)

发明内容

本发明的目的是提供一种检测肉毒毒素的免疫层析试纸。

本发明所提供的检测肉毒毒素的免疫层析试纸，包括吸水纸垫、紧密连接于所述吸水纸垫的包被有抗肉毒抗体的纤维膜、紧密连接于所述纤维膜上的含有抗肉毒抗体的免疫金胶体探针的金标垫和紧密连接于所述金标垫的样品垫。

为了使用更加方便，所述吸水纸垫的下面还紧密连接有背板。背板的材料优选的是塑料。

本发明的另一个目的是提供制备上述检测肉毒毒素的免疫层析试纸的方法。

本发明所提供的制备检测肉毒毒素的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：

1)制备抗肉毒抗体；将抗肉毒抗体溶液喷到纤维膜上，室温晾干，然后将其粘贴在吸水纸垫上；

2)制备抗肉毒抗体的免疫胶体金探针溶液；将玻璃纤维膜或树脂浸泡到该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，干燥后粘贴在步骤1)得到的粘贴在吸水纸垫上的喷有抗肉毒抗体的纤维膜上；

3)在步骤2)中的金标垫上面再粘贴样品垫，得到检测肉毒毒素的免疫层析试纸。

为了使用更加方便，所述吸水纸垫的下面还粘贴有背板。

在本发明所提供的检测肉毒毒素的免疫层析试纸及其制备方法中，所述抗肉毒抗体按如下方法制备：皮下多点注射家兔(2ml/只)：毒素0.25mg+福氏完全佐剂免疫，10天后追加免疫，共追加2次，末次追加后10天抽血。

而抗肉毒抗体的免疫金胶体探针的制备方法如下：

1)将0.01％HAuCl₄水溶液，加热煮沸，每100ml HAuCl₄溶液进行如下操作：搅动下加入1.5ml的1％柠檬酸三钠水溶液，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液；

2)确定最低偶联抗体浓度：调节胶体金溶液pH9.0，将抗肉毒抗体稀释为不同浓度，分别取5ul、10ul、15ul、20ul、25ul加入到1ml胶体金溶液中，混匀后于室温下放置5min，加入10％NaCl水溶液0.1ml，混匀，静置，10-20min后观察液体颜色，胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量，为稳定1ml胶体金溶液所需最低偶联抗体量；

3)将120％上述最低偶联抗体量的抗肉毒抗体加入到50ml胶体金溶液中，混匀后得到抗肉毒抗体的免疫胶体金探针溶液。

在实际应用中，所述纤维膜为硝酸纤维膜，宽度控制在2.5-3mm为宜；所述金标垫的材料为玻璃纤维膜、聚脂等，宽度为5-7mm；所述样品垫为玻璃纤维膜，宽度为20-30mm。

A型肉毒对人具有极强的神经毒性，经口的绝对致死量约为0.3mg。利用本发明所研制的胶体金ICA检测试纸检测肉毒，非专业人员按照说明书即可操作，标本处理简单，5分钟内观察结果，最少可检出A型肉毒2ng/ml，检测灵敏度不受标本来源的影响。该肉毒毒素免疫检测试纸具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，适于临床和现场使用。

具体实施方式

实施例1、检测肉毒毒素的免疫层析试纸的制备

材料

氯金酸(HAuCl₄·4H₂O)，分析纯，上海试剂一厂；

柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，分析纯，北京化工厂；

A型肉毒，兰州生物制品研究所，110U/支；

牛血清白蛋白(BSA)，分析纯，进口分装

聚乙二醇(PEG)，分析纯，进口分装

硝酸纤维膜，购于美国Millipore公司，HF B 504；

玻璃纤维膜，购于南京双威实业公司；

1、制备抗肉毒抗体

皮下多点注射家兔(2ml/只)：毒素0.25mg+福氏完全佐剂免疫，10天后追加免疫，共追加2次，末次追加后10天抽血。

2、制备免疫胶体金探针

1)将HAuCl₄配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸腾，搅动下准确加入1.5ml的1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)水溶液，液体颜色稳定成葡萄酒红色，即得到胶体金溶液。

2)确定最低偶联抗体浓度：调节胶体金溶液pH9.0，将抗肉毒抗体稀释为不同浓度，分别取5ul、10ul、15ul、20ul、25ul加入到1ml胶体金溶液中，混匀后于室温下放置5min，加入10％NaCl水溶液0.1ml，混匀，静置，10-20min后观察液体颜色，胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量，即为稳定1ml胶体金所需抗体的最低浓度。

3)将120％上述最低偶联抗体量的抗肉毒抗体加入到50ml胶体金溶液中，混匀后即得免疫胶体金探针溶液。

3、胶体金颗粒与免疫金探针的电镜观察

于透射电镜下，可见胶体金颗粒呈圆形或椭圆形，大小均匀一致，计数100个金颗粒，颗粒直径约为25nm；胶体金偶联抗体后，可见金颗粒外围有明显的低电子密度晕圈，表面吸附有蛋白。结果表明，按照以上技术路线制备的胶体金颗粒和免疫金探针合格。

4、检测肉毒毒素的免疫层析试纸的制备

检测肉毒毒素的免疫层析试纸由吸水纸垫、硝酸纤维膜、金标垫和玻璃纤维膜样品垫四部分组成。

用浓度为0.01M，pH7.0-pH7.5的PBS稀释抗肉毒抗体到7mg/ml，用BioDot公司XYZ3000点样仪喷到2.5mm宽的NC膜上，室温晾干，然后将其用双面胶粘贴在吸水纸垫上；将5-7mm宽的玻璃纤维膜浸泡到制备好的免疫胶体金探针溶液中制备成金标垫，4℃放置30min，-50℃冷冻抽干后，将该金标垫用双面胶粘贴在上述包被有抗肉毒抗体的硝酸纤维膜上，再在该金标垫上面用双面胶粘贴25mm宽的玻璃纤维膜样品垫，最后将它们用双面胶粘贴在塑料背板上，按所需大小切割，即为检测肉毒毒素的免疫层析试纸，加干燥剂后密封保存。

实施例2、肉毒检测试验

1、ICA试纸检出A型肉毒的敏感性

以兰州生物制品研究所生产的精制注射用A型肉毒为标准，经生理盐水有限稀释后，作为样品检测液，取肉毒ICA检测试纸，分别浸入不同肉毒浓度样品检测液中，2分钟后开始观察结果，15分钟观察终止。结果报告：出现1条红色(对照)沉淀线为阴性，即无A型肉毒检出；出现2条红色(样品和对照)沉淀线为阳性，即有A型肉毒检出。

本发明所提供的肉毒ICA试纸可检出20U/ml，即20LD₅₀(约2ng/ml)。文献报道，ELISA方法检测A型肉毒纯品的敏感性为100DLM(最小致死量)，ICA试纸有更高的敏感性。

2、ICA检测试纸对B型和E型肉毒的检出以及与A型和B型肠毒素的交叉反应

将粗制的B型和E型肉毒毒素，以及金黄色葡萄球菌A型和B型肠毒素稀释成不同浓度100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、6.25ug/ml，用ICA试纸检测，结果表明，该试纸能检测出少于10ug/ml B型和E型肉毒，并且不与A型肠毒素(168ug/ml)和B型肠毒素(50ug/ml)交叉。

引起人类中毒的A、B、E型肉毒中，A型占95％以上，各型肉毒间存在交叉抗原，我们在ICA试纸制备中采用的是抗肉毒多抗，所以除能检出A型肉毒外，还能检出B型和E型肉毒，这也是临床和现场检测所需要的。

3、模拟标本中的肉毒检测

选用几种常见肉毒中毒食品，如火腿肠、腐乳、豆豉、蘑菇、牛奶和普通肉汤培养基等用于制备模拟标本。先分别称取火腿肠、腐乳、豆豉和蘑菇各2g，土壤1g，捣碎置容器中，加入5ml无菌生理盐水，充分搅拌混匀，静置沉淀，牛奶1∶4稀释，普通肉汤用原液。每种样品一式4份，1份取上清用作阴性对照，其他3份分别加入浓度为32ng/ml、16ng/ml、8ng/ml的A型肉毒，作为模拟阳性标本。

ICA试纸检测模拟标本中A型肉毒的结果如表1所示。除土壤标本需离心外，其它标本按上述采样及处理后，可直接用于检测，ICA试纸检测的特异性不受标本来源的影响；从表中可以看出，检测腐乳敏感性为4ng/g，火腿肠、蘑菇为8ng/g，豆豉为16ng/g，检测牛奶、血清和普通肉汤分别为128ng/ml、64ng/ml和16ng/ml。

      表1.ICA试纸检测模拟标本中A型肉毒

               处理方法    阴性对照  32ng/ml  16ng/ml  8ng/ml

火腿肠     2g+5ml生理盐水     -         +        -       -

腐乳       2g+5ml生理盐水     -         +        +       -

豆豉       2g+5ml生理盐水     -         +        +       -

蘑菇       2g+5ml生理盐水     -         +        -       -

牛奶       1∶4稀释           -         +        -       -

血清       1∶2稀释           -         +        -       -

普通肉汤   原液               -         +        +       -

土壤       1g+5ml生理盐水     -         +        +       -

Claims (10)

1、一种检测肉毒毒素的免疫层析试纸，包括吸水纸垫、紧密连接于所述吸水纸垫的包被有抗肉毒抗体的纤维膜、紧密连接于所述纤维膜上的含有抗肉毒抗体的免疫金胶体探针的金标垫和紧密连接于所述金标垫的样品垫。

2、根据权利要求1所述的检测肉毒毒素的免疫层析试纸，其特征在于：所述吸水纸垫的下面还紧密连接有背板。

3、根据权利要求1所述的检测肉毒毒素的免疫层析试纸，其特征在于：所述抗肉毒抗体按如下方法制备：皮下多点注射毒素0.25mg+福氏完全佐剂免疫，10天后追加免疫，共追加2次，末次追加后10天抽血。

4、根据权利要求1所述的检测肉毒毒素的免疫层析试纸，其特征在于：所述抗肉毒抗体的免疫金胶体探针按如下过程制备：

1)将0.01％HAuCl₄水溶液，加热煮沸，每100ml HAuCl₄溶液进行如下操作：搅动下加入1.5ml的1％柠檬酸三钠水溶液，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液；

2)确定最低偶联抗体浓度：调节胶体金溶液pH9.0，将抗肉毒抗体稀释为不同浓度5ul、10ul、15ul、20ul、25ul，分别取加入到1ml胶体金溶液中，混匀后于室温下放置5min，加入10％NaCl水溶液0.1ml，混匀，静置，10-20min后观察液体颜色，胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量，为稳定1ml胶体金溶液所需最低偶联抗体量；

3)将120％上述最低偶联抗体量的抗肉毒抗体加入到50ml胶体金溶液中，混匀后得到抗肉毒抗体的免疫胶体金探针溶液。

5、根据权利要求1或2所述的检测肉毒毒素的免疫层析试纸，其特征在于：所述纤维膜为硝酸纤维膜、醋酸纤维膜；所述金标垫的材料为玻璃纤维膜、树脂；所述样品垫为玻璃纤维膜。

6、一种制备检测肉毒毒素的免疫层析试纸的方法，包括以下步骤：

1)制备抗肉毒抗体；将抗肉毒抗体溶液喷到纤维膜上，室温晾干，然后将其粘贴在吸水纸垫上；

2)制备抗肉毒抗体的免疫胶体金探针溶液；将玻璃纤维膜或树脂浸泡到该免疫胶体金探针溶液，得到金标垫，干燥后粘贴在步骤1)得到的粘贴在吸水纸垫上的喷有抗肉毒抗体的纤维膜上；

3)在步骤2)中的金标垫上面再粘贴样品垫，得到检测肉毒毒素的免疫层析试纸。

7、根据权利要求6所述的制备检测肉毒毒素的免疫层析试纸的方法，其特征在于：所述吸水纸垫的下面还粘贴有背板。

8、根据权利要求6或7所述的制备检测肉毒毒素的免疫层析试纸的方法，其特征在于：所述抗肉毒抗体按如下方法制备：皮下多点注射毒素0.25mg+福氏完全佐剂免疫，10天后追加免疫，共追加2次，末次追加后10天抽血。

9、根据权利要求6或7所述的制备检测肉毒毒素的免疫层析试纸的方法，其特征在于：所述抗肉毒抗体的免疫金胶体探针按如下过程制备：

1)将0.01％HAuCl₄水溶液，加热煮沸，每100ml HAuCl₄溶液进行如下操作：搅动下加入1.5ml的1％柠檬酸三钠水溶液，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液；

2)确定最低偶联抗体浓度：调节胶体金溶液pH9.0，将抗肉毒抗体稀释为不同浓度，分别取5ul、10ul、15ul、20ul、25ul加入到1ml胶体金溶液中，混匀后于室温下放置5min，加入10％NaCl水溶液0.1ml，混匀，静置，10-20min后观察液体颜色，胶体金溶液颜色不变时所含最少抗体量，为稳定1ml胶体金溶液所需最低偶联抗体量；

3)将120％上述最低偶联抗体量的抗肉毒抗体加入到50ml胶体金溶液中，混匀后得到抗肉毒抗体的免疫胶体金探针溶液。

10、根据权利要求6或7所述的制备检测肉毒毒素的免疫层析试纸的方法，其特征在于：所述纤维膜为硝酸纤维膜、醋酸纤维膜；所述金标垫的材料为玻璃纤维膜、树脂；所述样品垫为玻璃纤维膜。