TWI490495B - 肉毒桿菌ａ型毒素的檢測方法及其套組 - Google Patents

Description

肉毒桿菌A型毒素的檢測方法及其套組

本發明係有關於利用紙牒檢測生物流體裡的肉毒桿菌A型毒素。利用簡單的操作程序去除食物中的油脂，再利用檢測紙牒進行分析。於15分鐘內即可檢出食物中是否含有肉毒桿菌毒素。檢測紙牒的好處是用肉眼即可以直接判讀結果。因此，對肉毒桿菌毒素的檢測來說，紙牒是一種非常專一、容易操作、成本低廉、且靈敏度高的檢測方式。

生物檢測主要是利用流通設備或橫向流動分析來完成，其通常用於檢測液體樣本中的物質，包括抗原、賀爾蒙等(如，以人類絨毛膜性腺激素來驗孕，以抗體來檢測感染物質)。

近年來，生物檢測技術迅速發展，檢測範圍也愈來愈廣，如為了因應美國911而發展的炭疽桿菌紙牒，醫療院所使用的霍亂偵檢紙牒，導致食物中毒的金黃色葡萄球菌腸毒素B紙牒及檢驗是否懷孕的驗孕紙牒等。國內亦曾傳出遭肉毒感染而引發的中毒事件。因此為將此偵檢技術廣泛應用於日常生活環境，特選用肉毒桿菌A型毒素做偵檢標的。

一般所使用的偵檢肉毒桿菌毒素的方法，包括PCR、ELISA、傳統致病原分離等，由於肉毒桿菌中毒個案常需要快速診斷與檢驗，傳統肉毒桿菌的分離與毒素鑑定，需要厭氧培養及動物試驗，其中血清之毒素檢測需時5天，糞便之細菌培養需時14天，且厭氧操作技術需特製之厭氧操作平台，而非一般實驗室之抽氣櫃，且於細菌培養時需要特定之厭氧包以防此空氣進入培養皿，使培養皿內維持無氧環境，因此檢測之過程不僅繁瑣並且耗時，但在肉毒桿菌中毒之時，若無即時以特定之醫療方法治療，所造成之致死率相當高，就防疫時效、快速鑑定以及即時之醫療照顧三者所要求之層面而言，傳統類型之培養與鑑定方法則無法達到需求。

先前對肉毒桿菌A型毒素的紙牒研發，主要是針對可能被使用之生物戰劑或新興傳染病之肉毒A型毒素而開發紙牒式快速偵檢驗試劑。而另一方面，由於因食品處理或保存不當等因素造成肉毒桿菌毒素產生，因此國人常經由攝食含有肉毒毒素的食物導致中毒。

本案發明人雖然於2011年已經開發一實驗室等級肉毒桿菌A型毒素的紙牒，且該紙牒在檢測肉毒桿菌A型毒素具有很高的靈敏度，但在一般的食物檢測時產生了極大的困擾，由於食物的烹調與處理過程有許多的添加物，包含油脂、醬油、味素、辣椒、胡椒粉、醋、糖等調味料，或者經由煎、炸、烤或發酵等烹飪手法，故當使用肉毒桿菌A型毒素的紙牒檢測食物時，由於食物在經烹調過程以及所加之調味料均會對於紙牒的檢測造成不同程度的影響，而影響紙牒對肉毒桿菌A型毒素之靈敏度，進一步影響到結果之判斷，也因此在檢測食物中之肉毒桿菌A型毒素時，準確率大幅度為之降低。

有鑑於上述紙牒具有對肉毒桿菌A型毒素檢測之高靈敏度，卻無法於坊間迅速且確實的檢驗出食品中是否確實含有肉毒毒素的存在。經本案發明人之研究分析，其癥結點主要在食品中或多或少皆含有油脂，而油脂會產生黏滯效果並且阻擋樣本流經之通道，而此等效應將使紙牒上之抗體無法偵測肉毒桿菌A型毒素，也因此直接影響紙牒對肉毒桿菌A型毒素的檢驗結果。所以，若欲將先前研發的紙牒直接應用於坊間食品的偵檢，則必需作進一步的改良。

為了解決食物中油脂影響紙牒檢測結果之問題，本發明發展出一種肉毒桿菌A型毒素的檢測方式並提供一種樣本前處理之方法，此樣本前處理步驟能有效且輕易地去除樣本內所含之油脂，所以能夠大幅度地提升紙牒偵測樣本中肉毒桿菌A型毒素之靈敏度。本發明之肉毒桿菌A型毒素偵檢方法具有操作簡易、攜帶方便、容易判讀、可在室溫儲存，且價格低廉等優點。

本發明係提供一種肉毒桿菌A毒素的檢測方法，包括：a)提供一樣本；b)利用一前處理去除該樣本中的 油脂，以獲得一經前處理的樣本；c)將該經前處理的樣本置於一免疫層析紙牒中進行反應；以及d)判讀檢測結果。

在本發明一實施例中，其中此樣本為一食物。

在本發明一實施例中，其中此前處理包括將該樣本磨碎。

在本發明一實施例中，其中此前處理包括將該樣本溶於一溶液中。

在本發明一實施例中，其中此前處理包括將該樣本過濾。

在本發明一實施例中，其中此經前處理的樣本不含油脂。

本發明另提供一種肉毒桿菌A毒素的檢測方法，包括：a)提供一樣本；b)將該樣本置於一溶液中磨碎，以獲得一含有樣本的溶液；c)過濾該含有樣本的溶液，以獲得一經前處理的樣本；d)將該經前處理的樣本置於一免疫層析紙牒中進行反應；以及e)判讀檢測結果。

在本發明一實施例中，其中此樣本為一半固體或固體樣本。

在本發明一實施例中，其中此樣本為一食物

在本發明一實施例中，其中此樣本以一針頭過濾膜過濾。

在本發明一實施例中，其中此經前處理的樣本不含油脂。

在本發明一實施例中，其靈敏度為約100-200ng/ml。

本發明另提供一種肉毒桿菌A毒素的套組，包括a)一免疫層析紙牒，含有抗-肉毒桿菌A毒素的抗體；以及b)一樣本處理裝置，包括一緩衝液與一濾膜。

在本發明一實施例中，其中此樣本處理裝置被使用來去除一樣本中的油脂。

200‧‧‧免疫層析紙牒

201‧‧‧樣本區

203‧‧‧結合墊

205‧‧‧檢測區

207‧‧‧吸水墊

C‧‧‧控制組區

T‧‧‧實驗組區

第1圖為本發明免疫層析紙牒的判讀方式。

第2圖為本發明之免疫層析紙牒。

第3圖為本發明免疫層析紙牒之一實施例。

一、本發明係提供一種樣本前處理之方法

本發明之檢測方法可用於檢測樣本中的肉毒桿菌A毒素。本發明中所述之“樣本”可為生物樣本或環境樣本。例如，樣本可為尿液、糞便、血液、組織、食物、飲水等，較佳為食物。食品包括，但不限於，牛奶、冷飲、發酵乳、優格、奶酪(起司)、麵包、餅乾、奶粉、流質食品、病患用食品、營養食品、冷凍食品、食品組成物、加工食品等其他市售食品等。另外，樣本也可來自於環境。

1.利用3M濾紙過濾法做為樣本前處理之方法

以地心引力將磨碎之食品懸浮液檢體以Whatman #4濾紙過濾，可以有效地將油脂留在表面，濾紙價格也相對便宜，但其缺點在於其過濾速度過慢，過濾液在過濾過程中會被濾紙所吸附，使得樣本隨過濾時間變得濃稠，也因此影響過濾效果。

由於此過濾方法所需耗費時間過長、樣本趨於濃稠，且樣本易被濾紙所吸收而降低紙牒之靈敏度，故不符合快速鑑定之原則。

2.利用分離管柱法做為樣本前處理之方法

以市售之凝膠管柱對磨碎之食品懸浮液檢體進行油脂分離實驗，可以有效低將油脂留於管柱內，且樣本不會過於濃稠，但其缺點在於此過濾法需要一蠕動幫浦協助，以及該凝膠管柱為不可重復使用之一次性物品且該抽氣幫浦因體積與重量之原因，故攜帶不方便。

由於此過濾方法需要凝膠管柱與使用蠕動幫浦，而該凝膠管柱不可重復使用且該蠕動幫浦之體積與重量並不方便攜帶，故不符合操作便利與價格便宜經濟實惠之原則。

3.利用針筒濾膜做為樣本前處理之方法

以市售之針筒濾膜對磨碎之食物懸浮液檢體進行油脂分離實驗，經實驗證實，經針筒濾膜所過濾之懸浮液置於冰上30分鐘，並未發現懸浮液表層有油脂出現，顯示油脂均存在於針筒濾膜上，而達到油脂分離效果。

由於此過濾方法僅需使用針筒濾膜，雖然該針筒濾膜為不可重覆使用之一次性物品，但該針筒濾膜具有體積小、快速過濾、容易攜帶、操作簡易、不需滅菌、不耗損樣本體積、完全清除油脂，且非一般知識領域者所可以聯想得知，因此符合快速鑑定及非相關領域知識者均可方便操作之特性。

發明人為確切了解何種孔徑之針筒濾膜對油脂分離效果為最佳，因此多方嘗試各種不同孔徑之針筒濾膜對油脂分離之影響，而各種孔徑之針筒濾膜均可以有效地達目油脂分離這個目標，然而當濾膜孔徑小於5μm(例，0.22μm或0.45μm)，孔徑極易被檢體塞滿而無法過濾，但孔徑大於5μm，則會有食物殘渣通過濾膜而影響紙牒對樣本之檢測。因此，5μm之針筒濾膜因其孔徑略大於其他濾膜，使懸浮液經擠壓經過濾膜時較為簡單與方便且食物殘渣不會通過該5μm之針筒濾膜，故發明人推薦使用以5μm之針筒過濾膜為本發明之前處理技術之主要濾膜。

表1為綜合以上各過濾方法之表格，以比較各方法之優缺點：

二、本發明係提供一種肉毒桿菌A毒素的檢測方法，包括：a)提供一樣本；b)利用一前處理去除該樣本中的油脂，以獲得一經前處理的樣本；c)將該經前處理的樣本置於一免疫層析紙牒中進行反應；以及d)判讀檢測結果。

步驟(a)：提供一樣本

本發明之檢測方法可用於檢測樣本中的肉毒桿菌A毒素。本發明中所述之“樣本”可為生物樣本或環境樣本。例如，樣本可為尿液、糞便、血液、組織、食物、飲水等，較佳為食物。食品包括，但不限於，牛奶、冷飲、發酵乳、優格、奶酪(起司)、麵包、餅乾、奶粉、流質食品、病患用食品、營養食品、冷凍食品、食品組成物、加工食品等其他市售食品等。另外，樣本也可來自於環境。

步驟(b)：樣本的前處理

本發明之樣本可為一液體、膏狀、粉末、半固體或固體，其處理方式如下所述。

1.固體樣本

若樣本為半固體或固體時，可將樣本置於研磨管中，加入緩衝液，將樣本磨碎。將磨碎的樣本，以濾膜過濾。收集經過濾的樣本以進行後續的試驗。

在一實施例中，取約1cm³的樣本置入研磨管中，加入1ml的緩衝液將樣本磨碎，使樣本溶於緩衝液中。利用針筒(套上針頭)吸取研磨管中的樣本，利用針頭濾膜過濾樣本。樣本與緩衝液的體積可視不同的情況做適當的調整。

若樣本為粉末狀，其處理方式類似於固體的處理方式，但可省略“研磨”程序。

2.液體樣本

若樣本為液體，則可直接進行實驗。若有需要，液體樣本也可經過濾處理。

在一實施例中，利用針筒(套上針頭)吸取液體樣本。除去針頭，將針筒套上濾膜，推擠針筒以過濾樣本。

過濾的次數可為1次以上，例如，可為2次、3次、4次等。此技藝人士可根據樣本油脂的含量增加過濾的次數。原則上，油脂量愈高，過濾的次數應愈多。

本發明中所述之“過濾”包括，但不限於，使用重力、壓力、真空或其組合的程序。過濾步驟可使用一濾膜、篩孔、離心完成，較佳為濾膜。

濾膜的材質可為有機、無機、玻璃纖維、或金屬材質。例如，市售的分離管柱、層析管柱、濾紙(如Whatman 3M®)、針頭濾膜(Millipore®)等。濾膜較佳為一針頭濾膜。濾膜的厚度可為0.2至5mm，較佳為0.4至2mm，孔徑可為0.2至8μm，較佳為5μm。

本發明中所使用的緩衝液可固定樣本以進行分析。適合的緩衝液包括含有氯化鈉、磷酸鈉、乙二胺四乙酸鹽(EDTA)或其它鹽類。緩衝液可含有防腐劑以維持樣本的完整及最低程度的降解。防腐劑可抑制酵素的蛋白質分解特性，其可為酵素抑制劑、抗菌劑、抗真菌劑等其它成分。抗菌劑可抑制微生物的生長。防腐劑包括ProClin®疊氮化鈉與硫柳汞。

緩衝液也可包含界面活性劑，如可使用Tween-20(聚山梨醇酯)與十二烷基硫酸鈉(SDS)、Triton X-100、氯己啶(chlorhexidine)及其它等。例如，可使用Tween-20以降低抗體非專一性的結合。Tween-20的濃度可介於0.1%-1%。此外，根據不同需要，也可額外加入低濃度(0.1-4.0%)的小分子量醇類(甲醇、乙醇、丙醇等)。在一實施例，本發明之緩衝液較佳為chase緩衝液。

步驟(c)：將經前處理的樣本置於一免疫層析紙牒中進行反應

將經前處理的樣本置於於一免疫層析紙牒中的樣本區。樣本因毛細作用而緩慢移動至免疫層析紙牒中的檢測區。

本發明中所述免疫層析紙牒為一聚合物膜。此聚合物膜具廣泛圍的孔徑，且經界面活性劑處理，以優化其特性。聚合物膜有助於達成高靈敏度、高穩定度及具再現性的分析。膜的特性包括聚合物種類、多孔性、界面活性劑成分、與強度。可根據蛋白質的結合能力、多孔性、與強度來選擇適合的膜。

可結合蛋白質的聚合物包括纖維素(硝化纖維素、醋酸纖維素、再生纖維素)、耐龍、聚二氟乙烯(PVDF)。醋酸纖維素與再生纖維素的結合活性通常不足以進行大部分的免疫分析，而硝化纖維素、耐龍與PVDF膜具有足夠的結合能力。雖然硝化纖維素的結合能力低於耐龍，但仍可作為免疫分析的膜，且其具有廣泛圍孔徑，介於0.05μm至約12μm，可提供廣泛圍的結合能力與毛細上升速率，以增加反應物在分析中的流動。膜的孔徑較佳為至少約1μm，大於約5μm，更佳為約8-12μm。

聚合物膜塗佈至少一種抗體，較佳為抗-肉毒桿菌A型毒素抗體(抗-BoNT/A抗體)。在另一實施例中，聚合物膜塗佈2種以上的抗體，其中試驗組區塗佈抗-BoNT/A抗體，且控制組區塗佈山羊、兔子、或老鼠的免疫球蛋白(IgG)。

本發明之抗體可為任何結構，包括，但不限於，抗體片段、多株抗體、單株抗體、雙特異抗體、微型抗體(minibodies)、合成抗體、嵌合抗體、人源化抗體、融合抗體及其片段，較佳為單株抗體。

在免疫層析紙牒的樣本區上方(樣本區與檢測區之間)具有一結合墊。結合墊塗佈經標定的抗-BoNT/A抗體。

本發明之標定(例如膠金及染劑)已為習知。藉由標定產生一可判讀的訊號，不需其它額外試劑即可獲得檢測結果。檢測裝置中的標定物質應充足且穩定。

本發明之標定為一直接標定，在自然的狀態下可直接以肉眼觀察，或在光學濾鏡及/或刺激(如，UV光)下產生螢光。例如，可使用微小的膠體粒子，如染劑溶膠、金屬溶膠(如，金)及有色乳膠粒子。標定物的濃度應足以在一小區域或小體積中產生一可判讀的訊號，此訊號可以肉眼或儀器評估。

步驟(d)：結果的判讀

樣本受毛細現象作用而緩慢移動至免疫層析紙牒中的檢測區，免疫層析紙牒中的試驗區具有抗-BoNT/A抗體，若樣本中含有抗-肉毒桿菌A型毒素，則會在免疫層析紙牒中的試驗區呈現顏色。

整個檢測時間為15分鐘以內，較佳為10分鐘以內，更佳為5至10分鐘。應注意的是，檢測時間不可超過30分鐘，以避免非專一性的結合。

本發明之檢測方法可檢測50ng/ml以上之純肉毒桿菌素A毒素，較佳為60、70、80、90、100ng/ml以上的肉毒桿菌A毒素。在一實施例中，其偵測極限約為100-200ng/ml。

參照第1圖，當免疫層析紙牒中檢測區的試驗組區與控制組區皆呈現顏色(紅線)時，表示陽性結果，樣本中具有肉毒桿菌A型毒素(第1(a)圖)。當僅控制組區呈現顏色(紅線)時，表示陰性結果，樣本中不含有肉毒桿菌A型毒素(第1(b)圖)。應注意的是，若控制組區沒有呈色，則表示為無效結果(第1(c)及1(d)圖)，無法判定。

由於食品中含有油脂，而油脂會嚴重影響紙牒的檢驗結果，因此無法迅速且確實的檢驗出食品中是否含有肉毒桿菌毒素的存在。然而，樣本在經過本發明方法之前處理(步驟(b))後，可去除樣本中的油脂，即可以簡便、經濟以及快速之方式偵測肉毒桿菌A型毒素。

本發明之方法具有以下優點：(1)檢測時間少於10分鐘，(2)操作簡易，勿需專業訓練人員，(3)反應清晰，顏色分明，容易判讀，肉眼即可觀測，(4)室溫儲存，不必冷藏，且(5)價格低廉，無須使用其他輔助儀器。

本發明另提供一種肉毒桿菌A毒素的檢測套組，包括一免疫層析紙牒，以及一樣本處理裝置。

參照第2圖，本發明之免疫層析紙牒200，包括樣本區201、結合墊203、檢測區205、與吸水墊207。

樣本區201具有可接受液體樣本的樣本墊。

結合墊203鄰接樣本區201，結合墊203具有經標定的抗-BoNT/A抗體。

檢測區205鄰接結合墊203。檢測區205具有一可結合蛋白質的聚合物膜，如纖維素、耐龍、PVDF。檢測區205具有試驗組區T與控制組區C，其中試驗組區T塗佈有抗-BoNT/A抗體，而控制組區C塗佈有山羊、兔子、或老鼠的IgG，例如，山羊抗兔子IgG、山羊抗老鼠IgG等。

在塗佈抗體後，必須封阻(block)聚合物膜剩餘的部分。可利用蛋白質(胎牛血清、牛奶)、聚乙烯醇、乙醇胺或上述組合對檢測區205進行封阻。

吸水墊207鄰接檢測區205。吸水墊207具吸水特性，可提供足夠的吸附能力。在一實施例中，吸水墊207也可為檢測區205(纖維素、耐龍、PVDF)的延伸。

應注意的是，本發明之肉毒桿菌A毒素的檢測套組包括一樣本處理裝置。樣本處理裝置包括，但不限於，研磨管、滴管、收集管(如，離心管)、針筒、針頭、濾膜及/或緩衝液。熟悉此技藝人士自可參照上述方法，利用本發明之樣本處理裝置將樣本磨碎、過濾，以去除樣本中的油脂，並收集經處理的樣本。

本發明之檢測套組可用於檢測環境/食品檢體以及與臨床診斷，應用的範圍包括食品製造業、食品加工業、小吃業、食品販賣業、衛生(稽查)單位、生物科技業、軍隊及實驗室。

【實施例】

1.免疫層析紙牒的製備

利用Biodot XYZ 3000 1414塗佈機，將2μl之山羊抗兔抗體(goat anti-rabbit IgG,SIGMA)(0.5mg/ml)及2μl之兔子抗-肉毒桿菌毒素A抗體(rabbit anti-BoNT/A IgG)(1mg/ml in K₂CO₃,pH 8.5)分別塗於硝化纖維膜上(HiFlow Plus HFB18004,Millipore Co.Ltd.,Ireland)，使分別形成控制組(C)及試驗組(T)呈色區。將纖維紙膜置於常溫下1小時乾燥使抗體固定。接著將紙膜浸入低熔點聚乙烯醇溶液中30分鐘，以封阻纖維膜上任一未被抗體吸附的位置。此纖維膜接著以二次水清洗，置於室溫下乾燥，並浸入蔗糖溶液中30分鐘以增強試劑之可動性。當再度乾燥後，便將纖維膜黏貼於含背膠的紙板(2.44 x 11.81寸)。

此外，藉由Biodot XYZ 3000 1414塗佈機，將與肉毒A抗體結合之膠體金粒子塗佈於結合墊(AccuFlowTM G,Schleicher & Schuell GmbH,Dassel,Germany)上，待此結合墊完全乾燥。最後，將硝化纖維膜、結合墊樣本墊(#12-S,S&S)及吸水墊(470 Zuschnitte/Cuts,S&S)一同固定於塑膠卡匣內， 如第3圖所示。

2.樣本的前處理

液體樣本

利用滴管吸取3滴之液態檢體，將其滴入免疫層析紙牒之樣本區中，於室溫靜置3分鐘。檢體因受毛細現象之作用而緩慢移動至檢測區。此時再加入2滴緩衝液於紙牒之樣本區。5分鐘後，進行結果判讀(判讀結果不要超過30分鐘)。

半固體樣本

取約1cm³樣本，置入研磨管中，加入1ml緩衝液，將樣本磨碎。以針筒吸取研磨管中的樣本，並以針頭濾膜過濾樣本，收集濾後之樣本。以滴管吸取3滴樣本，將其滴入紙牒之樣本區中，於室溫靜置3分鐘。樣本因受毛細現象之作用而緩慢移動至檢測區。此時再加入2滴緩衝液於紙牒之樣本區。5分鐘後，進行結果判讀(判讀結果不要超過30分鐘)。

固體樣本

取約1cm³樣本，切成小塊，置入研磨管中，加入1ml緩衝液，將樣本磨碎。以針筒吸取研磨管中的樣本，並以針頭濾膜過濾樣本，收集濾後之樣本。以滴管吸取3滴樣本，將其滴入紙牒之樣本區中，於室溫靜置3分鐘。樣本因受毛細現象之作用而緩慢移動至檢測區。此時再加入2滴緩衝液於紙牒之樣本區。5分鐘後，進行結果判讀(判讀結果不要超過30分鐘)。

3.結果的判讀

參照第3圖，若樣本中具有肉毒桿菌A型毒素，則會在控制組(C)及試驗組(T)顯現紅線，若樣本中不具有肉毒桿菌A型毒素，則僅在控制組(C)出現紅線(呈色線)。

所有說明書中所揭示之發明技術特點可以任意方式組合。說明書中揭示之每一技術特點可以提供相同、等同或相似目的之其他方式替換。因此，除非另有特別說明，文中所有揭示之特點均只是等同或相似特點之一般系列之實例。

由上述可知，熟習此技藝者能輕易地了解本發明之必要特徵，在不脫離其精神與範圍之下能就本發明做許多改變與調整以應用於不同用途與條件。

C‧‧‧控制組區

T‧‧‧實驗組區

Claims (11)

1. 一種肉毒桿菌A毒素的檢測方法，包括：a)提供一樣本；b)利用一前處理技術去除該樣本中的油脂，以獲得一經前處理的樣本，該前處理技術係用一濾膜過濾該樣本，c)將該經前處理技術的樣本置於一免疫層析紙牒中進行反應，該免疫層析紙牒包含一抗-肉毒桿菌A毒素之抗體；以及d)判讀檢測結果。
2. 如申請專利範圍第1項所述之肉毒桿菌A毒素的檢測方法，該樣本若為固體或半固體，則需增加一a1磨碎步驟，該磨碎步驟係將固體或半固體樣本加入一緩衝液中並進行磨碎。
3. 如申請專利範圍第1項所述之肉毒桿菌A毒素的檢測方法，其靈敏度為約100-200ng/ml。
4. 一種肉毒桿菌A毒素的套組，包括a)一免疫層析紙牒，含有一抗-肉毒桿菌A毒素之抗體；以及b)一樣本處理裝置，包括一緩衝液與一濾膜。
5. 如申請專利範圍第4項所述之套組，該抗體為兔子抗-肉毒桿菌毒素A之抗體。
6. 如申請專利範圍第4項所述之套組，該抗體濃度為0.5~1.5mg/ml。
7. 如申請專利範圍第4項所述之套組，該抗體濃度最佳為1mg/ml。
8. 如申請專利範圍第4項項所述之套組，該緩衝液為chase緩衝液。
9. 如申請專利範圍第4項所述之套組，該緩衝液之pH值為7.5~8.5。
10. 如申請專利範圍第6項所述之套組，該濾膜為針筒濾膜。
11. 如申請專利範圍第6項所述之套組，該濾膜孔徑為5μm。