JP2894841B2 - 診断試薬と微生物の間の反応性の制御のための組成物および方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、微生物と標識抗体との複合体の凝集を減ら
すためにその両者の間の反応性の程度を制御するための
組成物および方法に関する。

発明の背景 世界的に見て微生物病は長い間主な健康の関心事とな
っている。そのような病気の予防の際の重要な特色は初
期診断である。疫学者は環境中並びに食品中の微生物汚
染を捜し出して共通の発生原因を見つけなければならな
い。

一例は、汚染された牛挽き肉による1992年の米国の太
平洋北西部における腸管出血性大腸菌（EHEC）の発生で
ある。EHECは比較的「最近発見された」病原体である。
EHECは1975年に初めて単離され、1982年になって初めて
大腸菌O157:H7が米国における２件の食物による出血性
大腸炎の発生に関係づけられた。報告される大腸菌O15
7:H7症例の発生率は増加しつつある。典型的には大腸菌
株は無害の偏共生体であるが、幾つかの株は病原性であ
る。EHECは特に有害で、子供の場合は深刻な腹部痙攣と
急性腎不全並びに心血管および中枢神経系の障害をはじ
めとする致死的な合併症を引き起こし得る。

別の例として、食物性の病気の米国疾病管理センター
（CDC）サーヴェイランスによれば、サルモネラ菌が食
物性の細菌病発生全体の主原因（50％以上）である。平
均すると、入手可能な最も最近の短期間の1983〜1987年
のうちに年間68の発生率と6249の症例がCDCに報告され
た。サルモネラ菌は広範囲の温血動物と冷血動物に感染
することができ、且つ宿主の外でも長期間生存すること
ができる。

グラム陽性菌属であるリステリアは自然界に広く分布
しており、土、水、植物および多数の動物種から単離さ
れている。ヒトリステリア症の重大な発生は頻繁に起こ
ったことはないが、発生率の増加と共に確認されてい
る。加えて、農業環境におけるリステリアの検出頻度は
増加しているように見える。特定のリステリア症の発生
については、死亡率は感染患者の30％〜40％と見積もら
れるが、しかし最小感染量はほとんど知られていない。
食物中のリステリア制御の１つの特定のやっかいな面
は、リステリアが−0.4℃ほどの低温でも44℃ほどの高
温でも増殖できることである。それらの要因は全て食物
病原体としてますます高まるリステリアの重要性に寄与
する。

微生物汚染の潜在的な環境源および食物源を迅速且つ
容易にモニタリングできることが、ヒトへの感染や潜在
する死亡の危険を減少させるだろう。何ら特殊なまたは
工業的な設備を必要とせず、現場で実施することがで
き、そして特殊な技能を必要としない、細菌、酵母、カ
ビ、真菌、寄生生物およびウイルスを含む微生物をアッ
セイできる装置は、診断並びに環境モニタリングおよび
食品サンプリングに有用であろう。食物の細菌汚染の場
合、３つの主な病気関連生物はサルモネラ、リステリア
およびEHECである。

現在利用可能なサルモネラ、リステリアおよびEHEC検
出方法は多数ある。標準的な培養分析方法によりそれら
の生物の証拠を得るためには熟練した実験技術者と最低
２〜５日を要する。より迅速な新規の方法はエンザイム
イムノアッセイ（EIA）、DNAハイブリダイゼーション、
免疫拡散、または増殖／代謝測定といった技術に基づい
ている。培養法よりもずっと少ない時間しかからないけ
れども、それらの迅速試験はまだ技術の熟練、機能的な
研究室および特殊装置を必要とする。それらの試験は一
般に、数時間の実施時間を含み、計２日またはそれ以上
かかる。診断分野における他の開発中の技術、例えばフ
ローサイトメトリーやポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に
目を向けると、そのような試験を現実に実施するのに要
求される装置や技能が、食物微生物学、環境試験および
診療室診断における使用を不適当にする。

診断分野における別の最近の技術は、側方流サンドイ
ッチイムノアッセイを含む。そのような試験はヒト絨毛
性性腺刺激ホルモン（hCG）の検出用に開発され、妊娠
試験に適用されている。典型的には、モノクローナルま
たはポリクローナル抗体が固相担体ストリップの遠位末
端の近くの不連続のバンド（検出域と呼ばれる）に固定
化される。別の量の抗体が検出試薬、例えば無機ゾルま
たは染色したポリスチレン粒子で標識される。この標識
抗体は担体ストリップの近位末端の近くに可逆的に固定
される。もしかすると抗原を含むであろう試料液により
近位末端が水和されると、該抗原が標識抗体と反応し、
その複合体が固定化抗体の区域を通過し、それが固定化
抗体と反応してサンドイッチを形成する。色素産生試薬
−抗原複合体の捕捉が検出域にて可視シグナルの形成を
引き起こす。

ホルモンまたは他の可溶性分子標的を識別することに
対立するものとして、病原性細菌を識別するために取り
かからなければならない少なくとも２つの主なチャレン
ジがある。それらのチャレンジは、偽陽性結果に低寛容
性で且つ偽陰性結果に非常に低い寛容性、好ましくは無
寛容性でありながら、多数の抗原的に類似した微生物の
存在下での標的微生物の標的株の全てを検出する必要
性、および標識それ自体の物理的大きさと不均質性であ
る。典型的な臨床診断試験、例えば尿中のhCG試験は、
十分に特徴付けられた母体（例えば尿）中の単一の小さ
な独特の存在物（即ちホルモン）を検出することに集中
している。更に、分析物（hCG）の構造は限定されてお
り、大きさと組成が均一である。

病原体の検出、例えば大腸菌O157:H7についての試験
は、標的微生物の非病原性株と特定の病原性株とを識別
しなければならない。十分に限定された小さな大きさと
構造を有する大部分のホルモンまたは指標タンパク質と
は対照的に、微生物は非常に大きく、それらの表面は不
均質であり、サルモネラ菌の鞭毛の相変異のような変化
を受けることがある。

臨床化学の側方流技術を微生物の検出に移行する以前
の試みにおいて、サルモネラ、リステリアおよびEHEC抗
原に対して高親和性ポリクローナル抗体が調製された。
それらの抗体は染色したポリスチレン粒子や無機ゾルと
いった色素産生試薬に結合された。標的微生物の添加と
同時に、迅速且つ顕著な凝集が起こり、固相担体に沿っ
た捕捉抗体の区域の方への色素産生試薬−分析物複合体
の流れを妨げる大きな凝集物を生じた。

よって、様々な母体中での不均質な微生物への検出へ
の側方流技術の適応が当業界で要望されている。本発明
は上記および他の関連する利点を提供する。

発明の要約 本発明は、側方流診断装置を使って目視免疫沈澱アッ
セイによるような標的微生物の検出に備える。本発明
は、微生物が検出装置の側方流に沿って移動している
間、標的微生物（特に抗体と結合した標的微生物）の凝
集または他の会合を抑制することにより、そのような検
出を可能にする。本発明は、側方流診断装置の試薬域中
に抗体−検出試薬をカプセル封入し且つ安定化すると思
われる組成物を提供し、次いで抗体−検出試薬−標的微
生物複合体が凝集することなく試薬域から出て下流方向
にそして側方流膜に沿って、前記複合体を特異的に結合
することのできる固定化抗体が置かれている検出域の方
に流れることを助けることにより、そのような凝集を抑
制する。

一観点によれば、本発明は、標的微生物を検出するた
めのアッセイに使われる組成物を提供し、ここで前記組
成物は約0.1重量％〜約60重量％のポリオール、約25重
量％までのタンパク質、約0.1重量％〜約10重量％のゼ
ラチン、および標的微生物に特異的に結合することがで
きる抗体−検出試薬を含んで成る。好ましい態様では、
該組成物は約２重量％までの界面活性剤、好ましくは非
イオン性界面活性剤、更に好ましくはTween（商標）20
とTriton（商標）X100から成る群より選ばれた界面活性
剤を更に含んで成る。

好ましい態様では、ポリオールはサッカリドポリオー
ルであり、そしてショ糖、ポリエチレングリコールおよ
びブドウ糖から成る群より選ばれ、より好ましくはショ
糖である。別の好ましい態様では、タンパク質は標的微
生物および標的微生物に特異的な抗体に対して非反応性
である不活性タンパク質であり、更に好ましくはウシ血
清アルブミン、他のアルブミンおよびカゼインから成る
群より選ばれる。更に別の好ましい態様では、ゼラチン
は高分子量ゼラチンであり、更に好ましくは魚鱗ゼラチ
ンを含んで成る。標的微生物特異的抗体に結合される検
出試薬は、好ましくは染色したポリスチレンまたはコロ
イド状金粒子のような無機ゾルである。

本発明のこの観点の特徴は、前記組成物を標的微生物
の検出用の側方流装置の試薬域に置くことができ、前記
装置が試薬域と検出域を有する側方流膜を含んで成るこ
とである。検出域は、標的微生物、該微生物に特異的な
抗体および検出試薬によって形成される複合体を結合す
ることができる固定化された結合相手を有し、該検出域
は試薬域の下流に置かれる。

好ましい態様では、組成物、検出装置および検出方法
はリステリア、腸管出血性大腸菌（EHEC）またはサルモ
ネラに特異的である。

別の観点では、本発明は標的微生物の検出のための側
方流装置または検出装置を提供する。側方流装置は、上
述したような組成物、典型的には約0.1重量％〜約60重
量％のポリオール、約25重量％までのタンパク質、約0.
1重量％〜約10重量％のゼラチンおよび標的微生物に特
異的に結合することができる抗体−検出試薬を含んで成
る組成物を含有する多孔質非吸収性パッドを含む試薬域
を有する側方流膜を含んで成る。前記多孔質非吸収性パ
ッドは、標的微生物と抗体−検出試薬との複合体の大き
さよりも大きいポアサイズを有する。側方流装置は試薬
域の下流に置かれた検出域も有し、前記検出域は標的微
生物と抗体−検出試薬との複合体を特異的に結合するこ
とのできる固定化された結合相手を含んで成る。

好ましい態様では、側方流装置は、側方流膜上の液体
を吸収することができ且つ検出域の下流に置かれている
吸収性パッドを更に含んで成る。好ましくは、側方流膜
はニトロセルロースまたはナイロンを含んで成る。

更に別の観点によれば、本発明は標的微生物の検出方
法であって、標的微生物を含有する可能性のある試料
を、抗体−検出試薬が標的微生物と結合して標的微生物
と抗体−検出試薬との複合体を提供するのを可能にする
条件下で、側方流膜の試薬域に置かれた上述の組成物と
接触せしめることを含んで成る方法を提供する。次い
で、前記複合体は側方流膜に沿って下流の方に向かい、
該複合体に結合して結合型複合体を提供することができ
る固定化抗体を含む検出域へと移動する。次に、結合型
複合体を検出する。

好ましい態様では、前記試料は野外試料を含んで成る
溶液であり、方法は該試料を試薬域中に置かれた多孔質
非吸収性パッドに添加し、前記多孔質パッドは標的微生
物と抗体−検出試薬との複合体の大きさよりも大きいポ
アサイズを有し、移動前にデトリタスを野外試料から濾
過することを更に含んで成る。更に好ましくは、野外試
料は食物試料、環境試料、例えば土または水、および生
物学的液体試料から成る群より選ばれる。

本発明の上記および他の観点は下記の詳細な説明、実
施例および添付図面への参照によって明らかになるだろ
う。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の側方流診断装置の上面図である。パ
ネルＡは、該装置の試薬パッドへの試料の添加前の装置
を様式的な形で描く。パネルＢは、試料が装置に沿って
下流の方に向かい検出域を横切って吸収性パッドに移動
した後の装置を様式的な形で描く。

図２は、本発明の側方流診断装置の側面図である。

図３は、ケース内に封入された本発明の側方流診断装
置の側面図である。

発明の詳細な説明 本発明は、目視免疫沈澱アッセイによるような標的微
生物の検出であって、診断装置の側方流膜に沿った標的
微生物（典型的には標的微生物−抗体−検出試薬複合
体）の移動を必要とする検出に向けられる。本発明は、
微生物が側方流膜に沿って移動している間、標的微生物
の凝集または他の会合を抑制することにより、そのよう
な検出を可能にする。

本発明は、最初に側方流診断装置の試薬域中に抗体を
カプセル封入しそして安定化すると思われる組成物を提
供し、次いで前記カプセルを試薬域上で脱水することに
より、そのような凝集を抑制する。抗体は検出試薬、例
えば染色したポリスチレン粒子またはコロイド状金粒子
に取りつけられるか、または他の方法で標識される。次
いで、標的微生物を含む可能性のある試料を添加する
と、前記組成物と抗体が再水和され、抗体と標的微生物
の間の結合が可能になり、それによって抗体−検出試薬
−標的微生物複合体が形成される。次に、前記複合体
は、本発明の組成物によって、凝集することなく試薬域
から下流の方にそして側方流膜に沿って、前記複合体を
特異的に結合することができる固定化抗体が置かれてい
る検出域へと流れるのを助けられる。未結合の抗体は、
検出域から更に下流に置かれた吸収性パッドの方に進
む。

本発明はまた、ガラス繊維パッド、または他の多孔質
非吸収性パッドが試薬域に置かれている好ましい側方流
診断装置を提供することにより、そのような凝集を抑制
する。ガラス繊維パッドには、標的微生物に特異的な抗
体−検出試薬と組み合わせた本発明の組成物を含浸させ
る。含浸させたガラス繊維パッドは、試料（典型的には
診断装置への適用前に精製されていない野外試料であ
る）中に存在する望ましくないデトリタス、例えば食物
のカスまたは他の材料を除去する重要な濾過作用を提供
する。ガラス繊維パッドは有意な量の試料を受入れ、該
試料を濾過し、そして有意な量の試料または試料中の微
生物を保持する（例えば吸収する）ことなく該試料を側
方流膜へと放出する。ガラス繊維パッドは標的微生物よ
り大きいポアサイズを有し、好ましくは標的微生物より
も直径で500〜1000倍以上大きいポアサイズを有する。

よって、本発明は一観点では、標的微生物の検出用の
側方流診断装置とともに使われる組成物を提供する。標
的微生物は好ましくは完全な微生物であるが、細胞破片
および／または溶解した細胞であってもよい。該組成物
は通常約0.1〜約60重量％のポリオール、典型的には約
１〜約40重量％のポリオール、好ましくは約２〜約15重
量％のポリオールを含んで成る。前記ポリオールは好ま
しくはサッカリドポリオールであり、更に好ましくはシ
ョ糖、ポリエチレングリコールおよびブドウ糖から成る
群より選ばれ、より好ましくはショ糖である。該組成物
はまた通常０〜約25重量％のタンパク質、典型的には約
0.1〜約10重量％のタンパク質、更に好ましくは約0.5〜
約２重量％のタンパク質も含んで成る。前記タンパク質
は標的微生物または抗体に対して非反応性である不活性
タンパク質であり、更に好ましくはウシ血清アルブミン
（BSA）、他のアルブミンおよびカゼインから成る群よ
り選ばれる。更に好ましくは該タンパク質はBSAであ
る。前記組成物はまた、通常約0.1〜約10重量％のゼラ
チン、典型的には約0.15〜約５重量％のゼラチン、更に
好ましくは約0.2〜約１重量％のゼラチンも含んで成
る。好ましくは、該ゼラチンは高分子量ゼラチン、例え
ば魚鱗ゼラチンである。好ましい態様では、本発明はピ
ロール、ピロリドンまたは他のピロール関連化合物を含
まない。

別の態様では、前記組成物はまた、通常約10重量％ま
で、典型的には約２重量％まで、好ましくは約0.5重量
％までの界面活性剤も含んで成る。界面活性剤は好まし
くは非イオン性界面活性剤であり、更に好ましくはTwee
n（商標）20とTriton（商標）X100から成る群より選ば
れる。前記組成物の各成分が標的微生物に特異的な抗体
−検出試薬と一緒に混合された後、該混合物が診断装置
の試薬域に適用される（もちろん、所望であれば、成分
と診断装置は別の順序であってもよい）。

本発明の範囲内では、用語「抗体」はポリクローナル
抗体、モノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、そ
れらの断片、例えばＦ（ab′）₂およびFab断片、並びに
組換え生産された結合相手を包含する。試薬域中に最初
に置かれる「抗体−検出試薬」を包含する抗体は、典型
的には、ポリクローナル抗体かまたはモノクローナル抗
体のいずれかであり、好ましくはポリクローナル抗体で
ある。更に、ポリクローナル抗体は好ましくは本発明で
の使用前にアフィニティーカラム精製される。そのよう
な抗体の製造は技術の現状で既知である。（例えば、An
tibodies:A Laboratory Manual, HarlowおよびLane編,C
old Spring Harbor Laboratory Press,1988を参照のこ
と；この参考文献および本明細書中に引用される他の全
ての参考文献は特別にその内容が参考として本明細書中
に組み込まれる。）適当なアフィニティー精製抗体は商
業的に入手可能でもある。例えば、リステリアに特異的
なポリクローナル抗血清はKirkegaard and Perry Labor
atories,Gaithersburg,Marylandから入手可能である。

ポリクローナル抗体は、様々な温血動物、例えばウ
マ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、七面鳥、ウ
サギ、マウスまたはラットの免疫処置によって当業者が
容易に作製することができる。簡単に言えば、標的微生
物、または標的微生物に特異的に関連づけられた抗原を
使って、動物を免疫する。フロイト完全または不完全ア
ジュバントのようなアジュバントの使用により、あるい
はオボアルミンまたはアオガイヘモシアニン（KLH）の
ような別のタンパク質への結合により、着目のタンパク
質またはペプチドの免疫原性を増大させることができ
る。

モノクローナル抗体も周知の技術を使って容易に作製
することができる。（例えば、Monoclonal Antibodies,
Hybridomas:A New Dimension in Biological Analysis,
Plenum Press,Kennett,McKearnおよびBechtol編,1980;
並びにAntibodies:A Laboratory Manual,HarlowおよびL
ane編，前掲を参照のこと。）簡単に言えば、一例とし
て、ポリクローナル抗体の生産の場合と同様にして目的
動物を免疫する。あるいは、モノクローナル抗体の生産
に適当な試験管内免疫技術も技術の現状で既知である。
次いで抗体産生細部を不死のミエローマ細胞と融合せし
めて不死ハイブリドーマ細胞系を提供する。融合後、適
当な培地、典型的にはHAT培地（他の適当な培地も既知
である）を含む培養皿に細胞を入れる。約７日後、所望
の抗原を認識する抗体の存在を決定するために、生成し
た融合細胞またはハイブリドーマをスクリーニングする
ことができる。数回のクローン希釈と再アッセイの後、
着目のタンパク質に結合する抗体を産生するハイブリド
ーマを単離することができる。

モノクローナル抗体または結合相手を作製するのに別
の技術を使うこともできる。（例えば、Huse他，“Gene
ration of a Large Combinational Library of the Imm
unoglobulin Repertoire in Phage Lambda,"Science24
6:1275−1281,1989;Sastry他，“Cloning of the Immun
ological Repertoire in Escherichia colifor Generar
ion of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construc−
tion of a Heavy Chain Variable Region−Specific cD
NA Library,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5728−5732,1
989;Alting−Mees他，“Monoclonal Antibody Expressi
on Libraries: A Rapid Alte−rnative to Hybridoma
s,"Strategies in Molecular Biology 3:1−9,1990;Lar
rick他，“Polymerase Chain Reaction Using Mixed Pr
imers:Cloning of Human Monoclonal Antibody Variabl
eRegion Genes From Single Hybridoma Cells,"BioThec
hnology 7:934−938,1989を参照のこと。） 一度適当な抗体が得られれば、当業者に周知である多
くの技術によりそれを単離または精製することができる
（Antibodies:A Laboratory Manual,HarlowおよびLane,
前掲を参照のこと）。

前記抗体は、好ましくは、多数の抗原的に類似した微
生物の存在下で標的微生物の株の全てを選択的に検出す
ることができる。更に、前記抗体は、好ましくは、非特
異的結合（これは偽陽性結果となる）に低寛容性で且つ
標的微生物を結合できないこと（これは偽陰性結果とな
る）が非常に低く好ましくは皆無の状態で、そのような
検出を行うことができる。

典型的には、本発明の組成物と混合される抗体−検出
試薬は標識である。好ましくは、該標識は、標的微生物
に特異的に結合する抗体試薬を有意に妨害することなく
抗体に結合される。好ましい態様では、検出試薬は5nm
〜500nmの直径を有する染色したポリスチレン粒子また
は無機ゾルである。検出試薬がゾルである場合、検出試
薬は好ましくはコロイド状金粒子である。他の色素産生
試薬および別の検出可能標識は当業界で周知であり、あ
まり好ましくないが、本発明の或る観点での使用に適当
である。典型的には、標的特異的抗体が色素産生試薬に
取り付けられるために、複合体は検出可能であろう。し
かし、固体化抗体への抗体−検出試薬の結合が検出可能
現象に備えることもでき、または固相に結合した固体化
抗体または複合体が他の方法で標識されてもよい。標識
の例は米国特許第4,861,711号と米国特許第4,859,604号
に見つけることができる。

本発明の特徴は、標的微生物が完全な微生物であるこ
とができ、そして生存微生物であってもよいことであ
る。更に、標的微生物が細胞破片および／または溶解し
た細胞であることができることも本発明の特徴である。
野外または試料中に存在できる任意の単一細胞存在物も
許容できるが、標的微生物は好ましくは細菌である。例
えば、好ましい態様では、微生物は野外試料中に存在す
ることができる微生物、例えば酵母、細菌、カビ、真
菌、寄生生物またはウイルスを含んで成る。あるいは、
あまり好ましくないが、微生物は実際に細胞、例えば真
核細胞、たとえば赤血球、または動物からの組織細胞で
ある。好ましい試薬域中に置かれる多孔質材料の孔径
は、標的微生物の大きさに適応させるように選択され
る。

更なる観点では、本発明は標的微生物の検出に適当な
好ましい側方流診断装置を提供する。図１に描かれるよ
うに、側方流診断装置２は、通常は診断装置２の第一末
端のところまたはその近くに置かれた試薬域４を有する
側方流膜10を含んで成る。試薬域４に隣接して好ましく
は多孔質パッドまたは固定化抗体を含まない側方流膜10
の部分があり、次に標的微生物−抗体−検出試薬複合体
（この複合体は、ある態様では、抗体と結合した標的微
生物としても知られる）を結合することができる固体化
抗体を含んで成る検出域６がある。固定化抗体（捕捉抗
体としても知られる）は、典型的には側方流膜に結合さ
れるが、別の固相に結合されてもよくあるいはまた別の
方法で固定化されてもよい。好ましくは、側方流膜10
は、微生物の移動および／または伝達に適当なニトロセ
ルロース、ナイロンまたは同様な低吸収性の多孔質材料
のストリップである。側方流膜の孔は、存在する場合に
は、典型的には標的微生物よりも直径が約５〜10倍大き
い。あまり好ましくないが、側方流膜は非孔質、高吸収
性、非吸収性または吸収性であることもできる。ただ
し、そのような性質が標的微生物−抗体−検出試薬複合
体の側方流を妨害せず、且つ検出域６における標的微生
物の検出を妨害しないことを前提とする。

図１のパネルＡは、試薬域４への試料の添加前の装置
の外観を様式的な形で描いたものであり、試料は論理上
は試薬域４に添加される。図１のパネルＢは、試料から
の液体が側方流膜10を横切って移動し、検出域６を通過
し、先の側方流膜10に沿って移動し、次いで吸収性パッ
ド８に吸収された後の装置を様式的に描いたものであ
る。

図２に描かれるように、診断装置の試薬域４は好まし
くは多孔質パッド12を含んで成り、その多孔質パッド上
で本発明の組成物と抗体−検出試薬が乾燥される。多孔
質パッド12は有意な量の試薬を受け止め、次いで試料を
濾過し、そして試料を側方流膜へと放出することができ
る。多孔質パッド12は、目の荒い織布もしくは不織布ま
たはメッシュであり、非吸収性である。あまり好ましく
ない態様ではあるが、吸収性材料のポアサイズが適当で
あり且つ得られる吸収性試薬域の完全飽和に十分な試料
があるならば、多孔質パッド12は吸収性材料であること
ができる。好ましくは、多孔質パッド12はガラス繊維パ
ッドである。試薬域４への多孔質パッド12の包含は、典
型的には横から見ると厚くなった診断装置を提供する
（図２）。特に多孔質パッドが非吸収性である時は、多
孔質パッド12は試料を側方流膜10に沿って試薬域４の下
流に置かれた検出域６の方に押し出すのを助ける頭部圧
力を提供することができる。

多孔質パッド12は標的微生物（または細胞破片）の直
径よりも大きい直径のポアサイズを有する材料を含んで
成る。多孔質パッドのポアサイズは、まだ試料の濾過を
提供しながら標的微生物−抗体−検出試薬複合体の通過
に十分である。一般に、ポアサイズは標的微生物の直径
よりも直径が少なくとも約50倍大きく、典型的には直径
が約100倍大きく、好ましくは直径が約500倍大きく、更
に好ましくは直径が約1000倍大きい。例えば、標的微生
物が約0.3μｍ×１μｍである場合、ポアサイズは好ま
しくは少なくとも50〜100μｍである。検出装置の多孔
質パッド12（存在する場合）を含む試薬域４は、好まし
くは側方流膜の上に配置されるが、側方流膜の末端に取
り付けられてもよい。

好ましい態様では、図１および２に描かれるように、
検出域６の下流に照査域20が置かれる。照査域20は試薬
域４から検出域６を通って吸収性パッド８の方への材料
の通過を示す。好ましくは、照査域20は、試薬域４に予
め置かれた照査用色素産生試薬を結合することができる
対照抗体（または他の結合相手）を含んで成る。例え
ば、照査用色素産生試薬がアビジンであることができ、
対照抗体／結合相手が照査域20に固定されたビオチン化
BSAであることができる。照査域20での使用に適当な他
の物質は当業界で周知であり、例えばpH指示薬、水和指
示薬、および他の結合相手である。

別の好ましい態様では、図１および２に描かれるよう
に、検出装置が照査域20の下流に吸収性パッド８を更に
含んで成る。吸収パッド８は典型的には試料から液体を
吸収するスポンジとして働き、それにより、試料のより
多くの部分を試薬域４を経てそして検出域６を横切って
移動させる。検出装置の吸収性パッド８は、好ましくは
側方流膜の上に配置されるが、側方流膜の末端に取り付
けられてもよい。

図３に描かれるように、診断装置は好ましくは野外で
の使用のためにケース14、例えばプラスチックケースの
中に封入される。ケース14は好ましくは試薬域に隣接し
てまたは接触して置かれた円錐開口部16を有する。円錐
開口部は、漏斗として試料を試薬域へ注ぐこと、並びに
所望により試料を計量することに備える。ケース14は検
出域６の近くに置かれた窓18をを更に含んで成り、それ
によって検出域６における目視観察と陽性または陰性結
果の検出に備える。この窓は照査域20の目視観察を可能
にしてもよく、または照査域20用の第二の窓があっても
よい。典型的には、そのような検出は目視により実施さ
れるが、反射計または当業界で既知の他の手段を使うこ
とにより検出を行ってもよい。

好ましくないけれども、本発明の或る観点での使用に
は適当である検出装置の多数の他の態様は、当業界で既
知でありそして例えば1988年４月25日に出願された英国
特許出願第2,204,398A号および米国特許第4,943,552号
に描写されている。

更なる観点では、本発明は標的微生物を検出する方法
であって、標的微生物を含む可能性のある試料を含む溶
液を診断装置の試薬域に添加し、そして標的微生物に特
異的な抗体−検出試薬と上述の組成物を含有する混合物
と該試料とを接触させることを含んで成る方法を提供す
る。好ましくは組成物はショ糖、BSAおよび魚鱗ゼラチ
ンを含んで成る。好ましい態様では、本発明の組成物は
ピロール、ピロリドンまたは他のピロール関連化合物を
含まない。別の態様では、該組成物はTween（商標）20
またはTriton（商標）X100も含有する。該組成物の成分
を抗体−検出試薬と一緒に混合した後、その混合物が診
断装置の試薬域に適用される（成分と診断装置は所望で
あれば別の順序で混合してもよい）。

好ましくは、試料は未精製の野外試料、例えば食物試
料、環境試料、例えば水または土を含有するかまたはそ
れから本質的に成る溶液である。あるいは、試料は体液
のような生物学的液体であってもよい。あまり好ましく
ない態様では、試料は実験室試料のように診断装置への
適用前に精製してもよい。試料と、該試料中に含まれる
可能性のある標的微生物に特異的な抗体−検出試薬を含
有する組成物とを接触させると、抗体−検出試薬と標的
微生物との間の結合が可能になる。

非常に好ましい態様では、本発明の方法は、試料を該
装置の試薬域内に置かれた多孔質非吸収性パッドに添加
することにより、試料を濾過する（特に試料が野外試料
である場合）ことを更に含んで成る。

次に、抗体−検出試薬が標的微生物に結合するのを可
能にし、次いで標的微生物−抗体−検出試薬複合体が試
薬域から出て、そして標的微生物−抗体−検出試薬複合
体に結合することができる固相結合型の固定化抗体を横
切って流れるのを可能にする。好ましくは、標的微生物
−抗体−検出試薬複合体は、試薬域と検出域の間の距離
の間は側方流膜に沿って運ばれる。

次いで、検出域で標的微生物−抗体−検出試薬複合体
の存在が検出される。そのような検出は通常目視により
行われるが、反射計または当業界で既知の他の手段を使
うことにより検出を行ってもよい。

次の実施例は例示のつもりで提供されるものであっ
て、限定のつもりではない。

実施例 実施例I:サルモネラ カプセル化と抗サルモネラ抗体に取り付けた20nmのコ
ロイド状金粒子の流れを考慮に入れて、きれいな容器の
中で次の成分を一緒に混合した。

成分 濃度 ショ糖 10％ ウシ血清アルブミン ２％ ゼラチン 0.25％ トリス緩衝液,pH8.5 50mM NaCl 100mM 実施例II:リステリア カプセル化と抗リステリア抗体に取り付けた0.3μｍ
の染色したポリスチレン粒子の流れを考慮に入れて、き
れいな容器の中で次の成分を一緒に混合した。

成分 濃度 ショ糖 10％ ウシ血清アルブミン ２％ ゼラチン 0.25％ トリス緩衝液,pH8.5 50mM NaCl 100mM 実施例III:EHEC カプセル化と、EHECに向けられた抗体で置換された0.
3μｍの染色したポリスチレン粒子の流れを考慮に入れ
て、きれいな容器の中で次の成分を一緒に混合した。

成分 濃度 ショ糖 ２％ ウシ血清アルブミン １％ ゼラチン 0.5％ Tween 20 0.2％ トリス緩衝液,pH8.5 50mM NaCl 100mM 実施例IV:診断装置の調製 実施例I,IIおよびIIIにおいて上述した組成物の成
分、抗体−診断試薬および照査試薬（アビジン）を混合
し、そして少なくとも50〜100μｍのポアサイズを有す
るガラス繊維パッドに適用した。次いでこのパッドを減
圧下で高温にて乾燥した。

捕捉抗体と対照抗体を、きれいな替えカートリッジを
有する先細ペンを使って約８μｍのポアサイズを有する
ニトロセルロースのストリップの検出域と照査域にそれ
ぞれ適用した。ニトロセルロースの検出域と照査域を風
乾した後、５％魚鱗ゼラチンを使うこと以外は当業界で
知られるようにしてニトロセルロースの残りの部位を不
可逆的にブロックした。次いでニトロセルロースを蒸留
水ですすぎ、乾燥させた。次いで乾燥したニトロセルロ
ースをスライドガラス上に置き、検出域に最も近い末端
のところでニトロセルロースストリップと重複するよう
に乾燥済試薬パッドを置いた。次いで照査域に最も近い
ニトロセルロースの末端のところで重複するようにクロ
マトグラフィー濾紙を置いた。

実施例V:標的微生物の検出 標的微生物を含む可能性のある食物試料または純粋培
養試料を細菌増殖培地に添加し、一晩インキュベートし
た。試料溶液100μｌ〜250μｌを実施例IVで調製した装
置の試薬パッドに添加した。試料の添加は吸収性パッド
とそれに付着した成分を再水和した。試料と再水和した
成分を含んで成る液体は試薬パッドから流れ出てニトロ
セルロースストリップを通ってクロマトグラフィー濾紙
から成る吸収性パッドの方に移動した。

液体が移動するにつれて、抗体−診断試薬が標的微生
物に結合し、抗体−診断試薬−標的微生物複合体を提供
した。検出域に到達すると、抗体−診断試薬−標的微生
物複合体は検出域中に固定化された捕捉抗体により結合
され、目視検出可能なシグナルを生じた。複合体形成し
なかった抗体−検出試薬と照査試薬は吸収性パッドの方
に移動し続けた。照査域に到達すると、照査試薬は対照
の結合相手（ビオチン化BSA）に結合し、照査域におい
て目視検出可能なシグナルを生成した。全ての未結合の
試薬は吸収性パッドへと更に移動した。試料が標的微生
物を含まなかった場合、可視シグナルは照査域に観察さ
れるが検出域では観察されなかった。リステリア、サル
モネラおよびEHECの各々を含む試料について陽性結果が
得られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ブルネル，シャロン エル. アメリカ合衆国，ワシントン 98052, レッドモンド，ワンハンドレッドセブン ティファースト アベニュ ノースイー スト 8770 (72)発明者 ファルボ−ネルソン，マリア ティー. アメリカ合衆国，ワシントン 98208, エベレット，ワンハンドレッドフォーテ ィファースト プレース サウスイース ト 5411 (72)発明者 スカリー，デニス エム. アメリカ合衆国，ワシントン 98026, エドモンズ，シックスティフィフス プ レース ウエスト 14122 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/569 G01N 33/531 G01N 33/543

Claims (25)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】標的微生物を検出するためのアッセイに使
   われる組成物であって、0.1重量％〜60重量％のポリオ
   ール、25重量％までのタンパク質であってその標的微生
   物及びその標的微生物に特異的な抗体に対して非反応性
   であるもの、0.1重量％〜10重量％のゼラチン、および
   前記標的微生物に特異的に結合することができる抗体−
   検出試薬を含んで成る組成物。
2. 【請求項２】前記組成物が界面活性剤を更に含む、請求
   項１の組成物。
3. 【請求項３】前記ポリオールがショ糖、ポリエチレン・
   グリコールおよびデキストロースから成る群より選択さ
   れる、請求項１の組成物。
4. 【請求項４】前記タンパク質がウシ血清アルブミンおよ
   びカゼインから成る群より選択される、請求項１の組成
   物。
5. 【請求項５】前記ゼラチンが魚鱗ゼラチンを含む、請求
   項１の組成物。
6. 【請求項６】前記抗体−検出試薬の前記試薬が染色した
   ポリスチレンまたは無機ゾルを含む、請求項１の組成
   物。
7. 【請求項７】前記界面活性剤がTween 20（商標）および
   Triton（商標）X100から成る群より選択される、請求項
   ２の組成物。
8. 【請求項８】前記組成物が前記標的微生物の検出用の側
   方流装置の試薬域に置かれ、ここで前記装置は前記試薬
   域と前記試薬域の下流に置かれた固定化結合相手を有す
   る検出域とを有する側方流膜を含む、請求項１の組成
   物。
9. 【請求項９】前記抗体−検出試薬がリステリア菌に特異
   的である、請求項１の組成物。
10. 【請求項１０】前記抗体−検出試薬が腸管出血性大腸菌
    に特異的である、請求項１の組成物。
11. 【請求項１１】前記抗体−検出試薬がサルモネラ菌に特
    異的である、請求項１の組成物。
12. 【請求項１２】標的微生物の検出用の側方流装置であっ
    て、側方流膜を含んで成り、前記側方流膜は（ａ）組成
    物を含有する多孔質パッドを含んで成る試薬域であっ
    て、前記組成物が0.1重量％〜60重量％のポリオール、2
    5重量％までのタンパク質であってその標的微生物及び
    その標的微生物に特異的な抗体に対して非反応性である
    もの、0.1重量％〜10重量％のゼラチンおよび前記標的
    微生物に特異的に結合することができる抗体−検出試薬
    を含んで成り、前記多孔質パッドが前記標的微生物と前
    記抗体−検出試薬との複合体の大きさよりも大きいポア
    サイズを有することを特徴とする試薬域、および（ｂ）
    前記試薬域の下流に置かれた検出域であって、前記標的
    微生物と前記抗体−検出試薬との前記複合体に特異的に
    結合することができる固定した結合相手を含んで成る検
    出域を有する、前記装置。
13. 【請求項１３】前記側方流膜上の液体を吸収することが
    できそして前記検出域の下流に置かれる吸収性パッドを
    更に含む、請求項12の装置。
14. 【請求項１４】前記多孔質パッドが非吸収性である、請
    求項12の装置。
15. 【請求項１５】前記多孔質パッドがガラス繊維パッドで
    ある、請求項12の装置。
16. 【請求項１６】前記側方流膜がニトロセルロースまたは
    ナイロンを含む、請求項12の装置。
17. 【請求項１７】前記抗体−検出試薬がリステリア菌に特
    異的である、請求項12の装置。
18. 【請求項１８】前記抗体−検出試薬が腸管出血性大腸菌
    に特異的である、請求項12の装置。
19. 【請求項１９】前記抗体−検出試薬がサルモネラ菌に特
    異的である、請求項12の装置。
20. 【請求項２０】標的微生物を検出する方法であって、 （ａ）前記標的微生物を含む可能性のある試料を、抗体
    −検出試薬が前記標的微生物に結合して前記標的微生物
    と前記抗体−検出試薬との複合体を形成するのを許容す
    る条件下で、側方流膜の試薬域に置かれた組成物と接触
    せしめ、ここで前記組成物は0.1重量％〜60重量％のポ
    リオール、25重量％までのタンパク質であってその標的
    微生物及びその標的微生物に特異的な抗体に対して非反
    応性であるもの、0.1重量％〜10重量％のゼラチンおよ
    び前記標的微生物に特異的に結合することができる抗体
    −検出試薬を含んで成り； （ｂ）前記複合体を前記側方流膜に沿って下流方向に、
    前記複合体に結合して結合型複合体を提供することので
    きる固定化抗体を含有する検出域へと移動させ；そして （ｃ）前記結合型複合体を検出する ことを含む方法。
21. 【請求項２１】前記試料が野外試料を含む溶液であり、
    そして前記方法が前記試料を前記試薬域中に置かれた多
    孔質非吸収性パッドに添加し、ここで前記多孔質パッド
    は前記標的微生物と前記抗体−検出試薬との前記複合体
    の大きさよりも大きいポアサイズを有し、そして前記移
    動の前に前記野外試料からデトリタスを除去することを
    更に含む、請求項20の方法。
22. 【請求項２２】前記野外試料が食物試料、環境試料およ
    び生物学的液体試料から成る群より選択される、請求項
    21の方法。
23. 【請求項２３】前記抗体−検出試薬がリステリア菌に特
    異的である、請求項20の方法。
24. 【請求項２４】前記抗体−検出試薬が腸管出血性大腸菌
    に特異的である、請求項20の方法。
25. 【請求項２５】前記抗体−検出試薬がサルモネラ菌に特
    異的である、請求項20の方法。