KR100995560B1 - 트리코모나스 검출을 위한 방법 및 장치 - Google Patents
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Abstract
인체 내의 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 방법 및 키트가 개시된다. 본 발명에 의한 방법에서, 질 면봉채취 샘플 또는 소변과 같은 체액 샘플이 환자로부터 획득되고, 트리코모나스 아드헤진 펩타이드에 특이성을 가지는 항체에 접촉되어, 그 환자가 트리코모나스에 감염되었을 경우 항체-아드헤진 펩타이드 복합체를 형성한다. 복합체의 존재 또는 비존재는, 질 면봉채취 샘플의 경우 적어도 80%의 신뢰도를 가지고, 소변 샘플의 경우 적어도 40%의 신뢰도를 가지고, 트리코모나스의 존재 또는 비존재 각각을 결정한다.
Description
본 발명은 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 면역 분석 (immunoassay) 방법 및 키트에 관한 것이다.
참고문헌
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트리코모나스 (Trichomonad)은 인간과 동물들을 감염시키는 원생동물 기생충이다. 약 15종 이상의 트리코모나스가 있다. 질 트리코모나스 (Trichomonas vaginalis, T. vaginalis)는 사람을 감염시키는 종으로서, 남성과 여성 모두에게 조건성 트리코모나스 감염 (condition trichomoniasis) 또는 질염 (trichomonosis 또는 trich)을 일으키는 트리코모나스의 한 종이다. 이 기생충은 성관계에 의하여 전염되고, 현재는 성관계에 의하여 전염되는 질병 (STD) 중 가장 흔한 비바이러스성 병원체이다. 미국에서는 연간 약 5백만 내지 8백만 명의 여성들이 질염을 앓는 것으로 추산되며, 성 활을 하는 여성의 경우, 최대 25%의 여성이 언젠가는 감염되는 것으로 보고된다.
남성의 경우, 트리코모나스 감염은 비클라미디아 비임균성 요도염의 17%를 차지하는 것으로 추산된다. 임상적인 증상들은 여성 가운데 자각 증상이 없는 상태로부터 명백한 질염에 이르기까지 굉장히 다양하고, 감염은 무기한으로 지속된다. 심한 증상은 질 효모 감염과 유사한 염증 및 불쾌감을 동반하는 악취를 내뿜 는 배변을 야기하는 복통을 포함한다. 남성은 평균 4달간 계속되는 자각 증상이 없는 질병을 앓는 경향이 있지만, 한편으로 감염된 남성들의 경우에도 요도염, 전립선염, 귀두 표피염 등과 같은 질병의 명백한 표상들이 발생되는 것으로 기록되었다.
인체의 경우, 트리코모나스의 감염은 심각한 건강상의 문제점을 야기한다. 트리코모나스는 질 항체, 보호 세포층 및 면역 반응 세포들을 퇴화시키는 프로티나제를 분비하며, 이에 의해 감염된 여성이 다른 성관계로 전염되는 질병에 감염될 가능성을 증가시킨다. 만약 어떤 여성이 질염에 감염되면, 그 여성의 HIV 감염 위험성은 2배 내지 10배 더 커지고, HIV와 트리코모나스 모두에 양성 반응을 보이는 남성은 정액에 6배 더 많은 HIV가 포함되기 때문에, 성관계 상대방에게 전염시킬 가능성이 증가된다는 것이 연구에 의하여 밝혀졌다 (Wasserheit, 1992). 더구나, 트리코모나스에 의한 감염은 경부암에 감염될 위험을 증가시키고, 이것은 여성의 가임 능력 및 임신 상태 모두에 불리한 영향을 끼칠 수 있다 (Yap et al., 1995; Zhang et al., 1995). 다행히도, 만약 기생충에 의한 감염이 성공적으로 진단된다면, 환자는 대부분의 경우에 치료될 수 있다.
트리코모나스 감염에 대한 현 진단 방법은 여성의 질구나 남성의 요도로부터 추출된 생 유기체를 검출하고 형태학적으로 식별하는 데에 의존한다. 식별 작업은 자력운동성 유기체의 직접 육안으로 관찰하기 위해 염류 습식 마운트 (saline wet mount) 방법을 이용하여 처리된 시료를 현미경으로 검사하는 작업을 수반한다. 양성일 경우의 특이성은 매우 높지만, 습식 마운트는 자각 증상이 없거나 약한 증상 이 나타나는 환자들에게 있어서, 또한 24시간 내에 감염된 여성들에게 있어서는 가끔 음성으로 나타나는 단점을 가진다. 습식 마운트 현미경 검사법의 전체 민감도 또는 신뢰도는 58%이고 (Weise et al. 참조), 심지어 30%로 낮아질 수 있다. 또한, 습식 마운트 현미경 검사는 펠렛 내에 트리코모나스를 밀집시키기 위한 원심분리에 이은 소변 표본에 시도될 수도 있는데, 그러면 표본은 현탁되고 검사된다. 소변 샘플에 적용되는 습식 마운트 현미경 검사는 7% 정도로 낮은 민감도를 가지므로 매우 비효과적이다 (배양에 대한 검사는 40%의 민감도를 가지는 것에 비교할 경우 민감도가 낮다) (van Der Schee C., et al. J. Clin Microbiol. 1999 Dec: 37 (12)4127-30). 또한, 기술된 어떤 종류의 샘플을 이용하든 습식 마운트 현미경 검사법은 사람이 시도해야 하는 작업이고, 지루하며, 시간이 많이 걸리고, 훈련된 요원에 의하여 수행되어야 한다.
비뇨 생식기 시료를 배양하면 검출되는 경우의 수가 증가될 수 있다. 불행하게도, 배양 작업은 완료하는데 며칠 (보통 2-5일)을 요하고, 훈련된 요원들이 특수한 실험실에서 수행되어야 한다. 또한, 이 두 방법 모두 샘플 속에 기생 생물이 생존하여야 검출 가능하므로 특정 샘플 타입에는 적합하지 않다. 예를 들어, 비록 습식 마운트보다 민감도가 높음에도 불구하고, 소변은 트리코모나스의 배양에 기초한 진단을 위한 적합한 샘플 매체가 아니라는 것이 결정되었다 (Mohamed et al. Sex. Transmitted Infect., 2001. 77 (1) 78-9). 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여, 다른 샘플 타입은 물론 소변으로부터의 트리코모나스의 진단을 개선하기 위해 많은 시도들이 행해져왔다. 비록 PCR이 습식 마운트나 배양법보다 잠재적으 로 민감도가 높지만 (위 참고문헌에 의하면 87%), 어떤 프라이머 서열이 트리코모나스에 특이한지에 대한 과학적 합의는 부족하다 (PCR은 FDA 승인 진단법이 아니다). 더구나, 상호 모순되는 샘플들 및 오염된 임상 샘플사인더 (sampleshinder) 모두에서 발생되는 잘못된 양성 반응은, 이러한 기법들이 적용되는 것을 방해한다. 높은 배율로 증폭된 샘플들은 실제 감염 상태를 나타내는 것이 아니라 이전의 감염 흔적들마저 증폭함으로써 양성 결과가 나타나기도 한다. 또한, PCR은 고도의 많은 조작과 절차적 통제를 가진 기술적 방법이며, 고가의 장비를 필요로 하고, 검사 도중의 진단 (point of care diagnosis)이 불가능하다. 이러한 모든 인자들이 트리코모나스의 실용적 진단법으로서 사용되기에 부적합하도록 한다.
샘플 속의 미생물을 분해하고 핵산을 떼어냄으로써 트리코모나스 감염을 검출하는 방법이 개시된다. 트리코모나스의 존재는 탐침과 함께 떼어진 핵산을 혼성화시킴으로써 결정된다. 이 방법을 이용하기 위해서는 많은 조작이 필요한 것은 물론 값비싼 검출 장치가 사용되어야 하고, 습식 마운트 현미경 검사법에 비해 민감도가 낮다.
트리코모나스 감염은 더욱 빈번해지고 있으며, 신속히 치료되지 않는 경우들에 대한 결과가 치명적일 수 있으므로, 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 신속하고, 민감하고, 정확한 진단 테스트와 치료의 유효성을 평가하기 위한 능력이 절실히 필요하다. 진단 테스트는, 샘플이 살아있는 유기체를 포함하는지 여부에 관계없이, 트리코모나스를 포함한다고 의심되는 다양한 샘플의 사용에 적합하여야 하고, 특히, 소변 (남성 및 여성 모두에 적용하기 위한)과 질 면봉채취 샘플 (vaginal swab sample)에서의 검출이 모두 가능하게 하여야 한다. 또한, 이 방법은 감염된 개인들에게 높은 신뢰성있는 결과로서, 예를 들면 양성 결과를 높은 신뢰도로 제공하여야 한다.
본 발명의 일 측면은 환자 인체 내의 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 방법을 포함한다. 본 방법을 실시하기 위하여, 소변 또는 질 면봉채취 샘플과 같은 체액이 환자로부터 획득되어 트리코모나스 아드헤진 펩타이드에 특이성을 가지는 항체와 접촉되어, 그 환자가 트리코모나스에 감염되어 있다면 항체-아드헤진 펩타이드 복합체를 형성한다. 임상적 시료가 질 면봉채취 샘플일 경우에 복합체의 존재 또는 부존재는, 적어도 약 80%의 신뢰도를 가지고 진단 가능하고, 전형적으로는 90% 이상의 신뢰도를 가지며, 임상 시료가 소변일 경우에는 40% 이상의 신뢰도를 가지고 진단 가능하다.
본 발명의 더 일반적인 측면은 항체 시약을 이용하여 예를 들어 소 또는 다른 가축과 같은 포유류 트리코모나스 감염을 검출하는데 사용될 수 있는데, 예를 들어, 소의 Tt. foetus 감염을 검출하는데 사용되는데, 사용되는 항체 시약은 질 트리코모나스 아드헤진 단백질에 특이성을 가지거나, 예를 들어 Tt. foetus를 감염시키는 종으로부터의 상동성 아드헤진 단백질에 특이성을 가지는 항체이다.
인체 내의 질 트리코모나스 (T. vaginalis) 검출을 위한 예시로서 제시되는 아드헤진 단백질은 질 트리코모나스 AP65, AP51, AP33, AP23 아드헤진 단백질, 및 그들의 면역학적 반응성을 가지는 단편으로서, 특히 AP65 및 AP33 아드헤진 단백질 이다. 유사하게, 예시 항체는 항-AP65 항체이며, 예를 들어, 세포주 DM116 또는 세포주 C55에 의하여 생성되는 항체들이다. 인체가 아닌 분석에 사용되는 예시적인 펩타이드는 동물을 전염시키는 트리코모나스 종으로부터 유도된 상동성 아드헤진 펩타이드들이다.
바람직한 일 분석 포맷에서, 접촉시키는 단계는 샘플을 건식 스트립 (dry strip)의 샘플-적용 지역 상에 샘플을 위치시키는 단계로서, 건식 스트립은 상향에서 하향 방향으로, 샘플-적용 지역, 트리코모나스 아드헤진 펩타이드에 대한 특이성을 가지는 비고 표지 항체를 포함하는 반응 지역 및 복합체 내의 트리코모나스 아드헤진 펩타이드에 대한 특이성을 가지는 고정 항체를 포함하는 검출 지역을 포함한다. 동작시에, (i) 샘플이 스트립 상에서 반응 지역을 향하여 하향으로 이전하고, (ii) 샘플 내의 아드헤진 펩타이드 피분석물 (analyte)은 반응 지역 내의 비고정 항체와 반응하여 이동성 표지 아드헤진 펩타이드-항체 복합체를 형성하며, (iii) 복합체가 검출 지역으로 이전하고, (iv) 복합체가 검출 지역 내의 고정 항체와 반응하여 검출 지역 내에 고정 표지 복합체를 형성하며 및 (v) 복합체가 되지 않은 고정 (nonmobilized) 표지 항체는 검출 지역의 하향으로 이전한다. 검출 단계는 검출 지역 내의 고정 표지 복합체의 존재 또는 비존재를 검출하는 단계를 포함한다.
다른 분석 포맷에서, 획득된 샘플은, 팹 스메어 (pap smear)이며, 이 샘플은 고정된다 (예를 들어 에탄올 또는 메탄올을 이용하여 고정된다). 이러한 팹 스메어 샘플은, 종래 기술에 의한 팹 스메어이거나 유체 기반 분석 (liquid based assay)일 수 있으며, 예를 들어 싸이틱사 (Cytyc)에 의하여 생산된 씬-프렙 (thin-prep) 팹 스메어일 수 있다. 샘플은 고정 프로세서의 변성 조건에 노출된 바 있는 아드헤진 단백질을 검출하는 표지 항체가 존재하는 환경에서 준비된다. 이러한 항체의 예시에는 AP33 항체가 있다. 본 방법은 씬 프렙을 처리하여 비결합 표지 항체를 제거하는 처리를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 환자 인체 내의 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 키트를 포함한다. 본 발명의 다른 측면에 따른 키트는 스트립 내의 모세현상에 의하여 건식 스트립 상에 적용된 유체를 위킹 (wicking)할 수 있으며, 상향에서 하향 방향으로, 샘플-적용 지역, 반응 지역 및 검출 지역을 포함하는 건식 스트립을 포함한다. 반응 지역은, 트리코모나스 아드헤진 펩타이드에 대한 특이성을 가지는 비고정 표지 항체를 포함하고 그것을 이용하여 이동성 아드헤진-단백질-항체 복합체를 형성하고, 검출 지역은, 복합체 내의 트리코모나스 아드헤진 펩타이드에 대한 특이성을 가지는 고정 항체를 포함한다. 체액 샘플을 샘플 적용 지역에 적용한 이후에는 (i) 샘플이 스트립 상에서 반응 지역을 향하여 하향으로 이전하고, (ii) 샘플 내의 아드헤진 펩타이드 피분석물 (analyte)은 반응 지역 내의 비고정 항체와 반응하여 이동성 표지 아드헤진 펩타이드-항체 복합체를 형성하며, (iii) 복합체가 검출 지역으로 이전하고, (iv) 복합체가 검출 지역 내의 고정 항체와 반응하여 검출 지역 내에 고정 표지 복합체를 형성하며 및 (v) 복합체가 되지 않은 고정 (nonmobilized) 표지 항체가 검출 지역의 하향으로 이전함으로써, 검출 지역 내의 검출 가능한 표지 (detectable label)의 존재 또는 비존재에 의하여 환자 내의 트 리코모나스 감염의 존재 또는 비존재가 결정되도록 한다.
키트 내의 비고정 항체의 예를 들면, AP65, AP51, AP33, AP23 아드헤진 단백질, 및 그들의 면역학적 반응성을 가지는 단편들을 들 수 있으며, 이 중 AP65가 바람직하다. 키트 내의 항체의 예시에는 DM116 세포주에 의하여 생성되는 항체가 포함된다.
본 발명의 또다른 측면에서, 인체 내의 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 방법은, 환자로부터 타액 또는 혈액과 같은 체액 샘플을 획득하는 단계, 샘플을 트리코모나스 아드헤진 펩타이드에 접촉하여 환자가 트리코모나스에 감염되었을 경우 항체-아드헤진 펩타이드 복합체를 형성하는 단계를 포함한다. 복합체의 존재 또는 부존재를 검출함으로써, 환자 내의 트리코모나스 감염의 존재 또는 비존재가 각각 결정된다.
아드헤진 펩타이드의 예를 들면 AP65, AP51, AP33, AP23 아드헤진 단백질, 및 그들의 면역학적 반응성을 가지는 단편이 포함된다.
한 분석 포맷에서, 샘플은 건식 스트립의 샘플-적용 지역 (sample-application zone) 상에 샘플을 위치되는데, 건식 스트립은 상향에서 하향 방향으로, 샘플-적용 지역, 비고정 트리코모나스 아드헤진 펩타이드를 포함하고 트리코모나스에 감염된 개체 내에 존재하는 항-트리코모나스 항체와 반응하여 이동성 항체-아드헤진 펩타이드 복합체를 형성하는 표지된 항체를 포함하는 반응 지역 인체 항체에 대한 특이성을 가지는 고정화된 포획 항체를 포함하는 검출 지역을 포함한다. 샘플의 적용 이후에, (i) 샘플이 스트립 상에서 반응 지역을 향하여 하향으로 이전 하고, (ii) 샘플 내의 아드헤진 펩타이드 피분석물 (analyte)은 반응 지역 내의 비고정 항체와 반응하여 이동성 표지 아드헤진 펩타이드-항체 복합체를 형성하며, (iii) 복합체가 검출 지역으로 이전하고, (iv) 복합체가 검출 지역 내의 고정 항체와 반응하여 검출 지역 내에 고정화되고 표지된 복합체를 형성하며 및 (v) 복합체가 되지 않은 고정 (nonmobilized) 표지 항체는 검출 지역의 하향으로 이전한다. 키트 내의 고정 항체로서 사용될 수 있는 것들 중 하나의 예를 들면 C55 세포주에 의하여 생성되는 항체이다. 검출 지역 내의 고정 표지 복합체의 존재 또는 비존재는 검출 지역 내의 표지 복합체의 존재 또는 비존재에 의하여 결정된다.
전술된 바와 같은 목적 및 본 발명의 다른 목적 및 특징들은 후술되는 상세한 설명 및 첨부 도면들과 함께 충분히 이해될 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 트리코모나스-분석 키트 내의 테스트 스트립의 평면도를 나타낸다.
도 2는 도 1에 도시된 테스트 스트립의 측면도를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 분석 키트의 평면도이다.
도 4는 도 3의 분석 키트의 측면 단면도이다.
1. 용어 정의
후술하는 용어들은, 본 명세서에서 특별히 다르게 기술되지 않는 한 다음과 같은 의미를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 "트리코모나스 (Trichomonas)" 이라는 용어는, 인체 및 동물 모두를 감염시키는 다중 종을 포함하는, 오더 트리코모나디다 (order trichomonadida), 게네라스 디트리코모나스 (Generas Ditrichomonas), 트리코모나스 (Trichomonas), 트리트리코모나스 (Tritrichomonas), 및 펜타트리코모나스 (Pentatrichomonas)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. "트리코모나스"이라는 용어는, 예를 들면 Tritrichomonas foetus (Trichomonas foetus, Tt. fetus 라고도 알려짐)와 같은 트리코모나스 종, Tt. enteris 및 소를 감염시키는 T. pavlovi, Tt. suis, Tt. rotunda, 및 돼지를 감염시키는 T. buttreyi, 양을 감염시키는 Dt. ovis, 말을 감염시키는 T. equibuccalis, 조류를 감염시키는 T. anatis, Tt. eberthi, T. gallinae, 및 T. gallinarum, 설치류를 감염시키는 Tt caviae, Tt muris, Tt. wenoni, Tt. minuta, 및 T. microti, 개 및 고양이를 감염시키는 T. canistomae 및 T. felistomae, 영장류 (사람 포함)를 감염시키는 T. tenax, T. vaginalis, Pt. Homonis, 및 T. macacovaginae들이 포함된다. 인간의 질병의 경우에, "트리코모나스"이라는 용어는 질 트리코모나스를 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. "질 트리코모나스 (Trichomonas vaginalis)"라는 용어는 인간을 감염시킬 수 있는 T vaginalis의 모든 균주를 가리키는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "항체 (antibody)"라는 용어는, 특히 피분석물 (항원 또는 항체)를 결합 및 식별하는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들, 또는 이들의 단편에 의하여 실질적으로 인코딩된 폴리펩피드를 가리키나, 이에 한정되지 않는다. 또한, "항체"는, 트리코모나스 항원 (들)에 노출된 결과에 응답 하여 숙주에 의하여 생성되는 항체의 항원-특이성 결합 부분 (이디오타입, idiotype)을 특별히 결합 및 식별하는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들, 또는 이들의 단편에 의하여 실질적으로 인코딩된 폴리펩피드를 가리키나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 예시에는 다중클론 항체, 모노클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 단일 사슬 항체와 같은 것을 포함한다. 면역글로불린의 단편에는 파아지 디스플레이를 포함하는 발현 라이브러리에 의하여 생성되는 마브 (Fab) 단편 및 단편들이 포함된다. 이러한 항체의 구조 및 관련 용어들에 대해서 참조하려면 예를 들어, Paul, Fundamental Immunology, 3rd Ed., 1993, Raven Press, New York. 을 참고한다.
"에피토프 (epitope)"라는 용어는 어떤 항체에 대한 특이적 결합이 가능한 항원 결정기를 의미한다. 항원결정인자는 일반적으로 아미노산 또는 당측쇄과 같은 분자들의 표면 그루핑을 포함하고, 특이적 전하 특성은 물론이고 특이적 3차원 구조 특성을 가지는 것이 일반적이다.
"특이적 결합 (specifically binds to)" 및 "특이적 면역 반응 (specifically immunoreactive with)" 라는 용어는 단백질 및 다른 생물학적 제재가 비균질하게 존재하는 가운데에서 대상 피분석물의 존재를 검출하는 결정기로서 동작하는 결합 반응을 의미한다. 그러므로, 지정된 분석 조건 하에서, 특이성 결합 모이어티들은 특정 대상 피분석물에만 선별적으로 결합하고 테스트 샘플 내에 존재하는 다른 성분에는 대량으로 결합하지 않는다. 이러한 조건 하에서의 대상 피분석물에 대한 특이적 결합은 특정한 대상 피분석물을 위하여 선택된 결합 모이 어티를 요구할 수 있다. 다양한 면역학적 분석 포맷들이 특정 항원과 면역학적으로 특이 반응하는 항체를 선택하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 어떤 피분석물에 대해 특이 면역반응성을 가지는 모노클론 항체를 선택하는데, 고상 (solid-phase) ELISA 면역 분석 방법이 일반적으로 사용된다. Harlow 및 Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Publication, New Your, (1988)를 참조하여 특이 면역반응성을 결정하기 위하여 사용될 수 있는 면역 분석 포맷 및 조건에 대한 설명을 구할 수 있다. 전형적으로, 특이 또는 선택적 반응은 배경 신호대 잡음비의 적어도 두 배가 되는 것이 일반적이고, 특히, 배경보다 10배 내지 100배 이상 큰 것이 일반적이다.
"단백질 (protein)"이란 용어는 아미노산 및 아미노산 유사 서브 유니트 (subunit)로 이루어진 생물학적 중합체 (biopolymer)를 나타내며, 전형적으로는 생물학적 단백질 내에서 발견되는 20 개의 범용 L-아미노산의 일부 또는 모두이다. 비록 "단백질"이란 용어는 일반적으로 대형 폴리펩티드 (즉, 100개 또는 그 이상의 아미노산을 포함하는)를 나타내고, "펩티드 (peptide)" 라는 용어는 이보다 작은 폴리펩티드를 나타내지만, 이러한 용어들은 상호 교환되어 사용된다. 즉, 단백질이란 용어는, 소형 펩티드를 가리키는 것은 물론 대형 폴리펩티드를 나타내는 것으로 사용될 수 있으며, 이와 반대도 가능하다.
단백질의 "면역학적 반응성을 가지는 단편 (immunologically reactive fragments)"란 용어는 그 단백질 자체와 면역학적으로 반응성을 가지는 결합 상대방 (예를 들면 항체와 같은 상대방)과 면역학적으로 반응성을 가지는 단백질의 일 부분을 나타낸다.
"특이성 (Specificity)"란 용어는, 본 발명의 분석 방법에 관련되고, 특히 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 분석법의 능력을 나타낸다.
"신뢰도 (Reliability)"라는 용어는 본 발명의 분석 방법에 관련되고, 확실히 양성으로 검출된 모집단)의 퍼센티지를 나타낸다. 예를 들어, 적어도 80%의 신뢰도라는 것은, 배양법 또는 PCR과 같은 확인 테스트 결과 실제로 트리코모나스에 감염된 환자들 중 적어도 80%를 검출해 낸다는 것을 의미한다. 이 용어는 또한 "민감도 (sensitivity)"와 상호 교환가능하다.
2. 본 발명의 분석법
본 발명은 트리코모나스 감염, 특히 인체 내의 질 트리코모나스 감염이 트리코모나스 아드헤진 단백질, 또는 그들의 면역학적 단편 및 이 단백질에 대한 면역학적 특이성을 가지는 항체 간의 면역 복합체를 형성하고, 그 복합체를 검출함으로써, 높은 민감도를 가지고 용이하게 검출될 수 있다는 발견에 기반한다. 본 발명의 일반적인 일 실시예에서, 트리코모나스 감염은 인체 샘플 (예를 들어 소변 샘플 또는 질 면봉채취 샘플) 내의 아드헤진 단백질 또는 그들의 면역학적 단편의 존재에 의하여 검출된다. 이러한 실시예에서, 분석 시약은 그 샘플 내에 존재하는 아드헤진 단백질과 검출될 수 있는 복합체를 형성할 수 있는 표지된 항-아드헤진 항체이다. 이러한 테스트 방법의 중요한 장점은, 이러한 단백질은 질 면봉채취 샘플, 즉, 질부 (vaginal tract) 또는 자궁 경부 (cervix) 또는 자궁경부목관 (cervical canal) 또는 팹 스메어 (pap smear)으로부터 채취된 질 분비액 (vaginal secretion), 질 찰과샘플 (scrapings) 또는 면봉 샘플 내에, 현존 분석법에 의하여 트리코모나스 감염 검사를 받은 결과 트리코모나스에 감염된 것으로 판명된 여성들의 거의 모두에게서 검출될 수 있는 양 만큼 존재한다는 것이 발견되었다는 점이다. 이와 유사하게, 아드헤진 단백질은 본 발명에 의한 분석법에 의하여 테스트되어 트리코모나스에 양성 반응을 나타내는 남성 및 여성의 소변에서 검출될 수 있는 양만큼 발견되었다. 그러므로, 이 분석법은 매우 민감도가 높으며, 여성의 경우에 소변 샘플 또는 질 면봉채취 샘플 또는 질경부 면봉채취 샘플 중 하나에 의하여 여성에 대해서 실행할 수 있음은 물론, 소변 샘플을 이용하여 남성에 대해서도 잘 실행될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 트리코모나스 감염은 표지 트리코모나스 아드헤진 단백질 분석 시약과 면역학적 반응성을 가지는 신체-샘플 항체의 존재에 의하여 검출된다. 이 실시예에서, 표지 분석 시약은 감염된 개체 내에 존재하는 항-아드헤진 항체와 검출될 수 있는 양의 복합체를 형성할 수 있는 표지 트리코모나스 아드헤진 단백질이다.
본 발명의 분석법은 면역생물학적 결합 반응에 기반한다. 면역-분석법의 일반 과정을 검토하기 위하여는, 본 명세서에 참조되어 통합되는 BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY, 7th Edition, D. Stites and A. Terr, ed., 1991을 참조한다. 본 발명의 일 실시예에서, 분석법은 트리코모나스 면역원 (immunogen)의 존재를 검출한다. 본 발명의 다른 실시예에서, 분석법은 숙주에 의하여 생성된 항-트리코모나스 항체를 검출한다. 트리코모나스 면역원 또는 숙주에 의하여 발생된 항-트리코모 나스 항체 중 하나가 생물학적 샘플에 존재한다는 것은 트리코모나스에 감염되었다는 것을 나타낸다.
본 발명의 분석법은 높은 특이성 및 민감도를 가진다. 전술된 바와 같이, 본 발명에 따른 분석법에서, 질 트리코모나스에 대한 특이성은 80% 이상의 민감도를 가지고, 습식 마운트법에 의하여 음성으로 판정된 환자들 중 21% (28/131)가 질 트리코모나스에 양성인 것으로 판정되었다 (검증 테스트로써 배양법이 사용되었다). 이렇듯이 민감도 레벨이 증가되므로 추가적으로 37%의 질 트리코모나스 감염 환자들 (103/75)을 식별하는 것이 가능하다. 본 발명의 분석법의 전체 특이성은 약 98%이다.
본 발명에 의한 방법을 실시하는데 있어서, 실험자는 우선 테스트 환자로부터 체액 샘플을 획득한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서와 같이 테스트 대상이 인체인 경우, 적합한 체액 샘플은 질 면봉채취 샘플, 즉, 여성의 질부 또는 자궁 경부 또는 자궁경부목관 또는 팹 스메어 (pap smear)으로부터 채취된 질 분비물, 질 찰과샘플 (scrapings) 또는 면봉 샘플이거나, 여성 또는 남성의 소변 샘플이다. 적합한 체액 샘플의 다른 예에는 (특히, 항-트리코모나스 항체를 검출하는데 적합한 다른 예에는), 혈청, 혈액, 및 타액이 포함된다. 테스트 대상이 동물 또는 가축일 경우, 소변 및 점막 면봉채취 샘플 (swab)과 같은 적합한 체액이 선택된다.
또는, 샘플은 환자로부터 체취된 세포들을 포함할 수 있는데, 예를 들어 감염부 중 어느 부분에서나 체취된 샘플로서, 자궁경부목관, 자궁, 나팔관, 고환 (, 항문, 목, 폐, 피부, 눈, 위장관, 또는 체강와 같은 부분으로부터 체취된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이러한 샘플은 바로 사용될 수도 있고, 추후 사용을 위하여 저장 (냉동, 건조, 냉동보관 등 적합한 처리)될 수 있다. 샘플들은 그 자체 형태 (소변의 경우)로 사용될 수도 있고, 처리되거나, 추출되거나, 용해되거나 또는 조작될 수 있다. 이러한 샘플 내의 트리코모나스는 생존된 상태이거나 죽은 상태일 수 있고, 전체 세포 상태이거나 파열될 수도 있고, 처리된 상태로 사용되거나 처리되지 않은 상태로 사용될 수도 있다.
트리코모나스 검출을 위한 면역학적 분석법의 개발은, 안정성을 가지며, 종에 의존하는 항원의 결핍 때문에 크게 성공적이지 않았다. 본 발명의 성공은, 일부분에 있어서는 트리코모나스 내의 아드헤진 단백질의 안정성에 기반한다. 트리코모나스는 현저한 항원 비균질성을 보여 왔다 (Alderete 등, 1985b; 1986a, 1987a). 감염시키고 감염된 상태로 유지하기 위하여, 이 기생체는 비뇨생식기관의 적대적 환경에 견딜 수 있으며 면역 감시 매커니즘을 회피할 수 있는데, 즉, 용균 항체 및 숙주의 보체 (complement)에 저항할 수 있다. 트리코모나스는 표현형 천이 (phenotypic shifting)을 견뎌낼 능력을 가지고 있는데 (Alderete emd, 1986; Alderete 등, 1985) 이것은 검출되지 않기 위하여 많은 기생충들이 취하는 수법이다. 동일한 환자로부터 상이한 시각에 개별적으로 추출된 분리주 (isolate)들은 상이한 표현형을 가질 수 있다는 것이 관찰되었다 (Alderete 등, 1987). 또한, 트리코모나스는 환경에 응답하여 표현형 천이를 수행할 수 있다는 것이 발견되었다. 예를 들어, 생체 내 (in vivo) 환경이 특정 표면 면역원 (P270)의 표현의 결핍된 질 트리코모나스 유기체에게 더욱 선호되지만, 시험관 내 (in vitro)에서 배양되면, 이 기생충들은 P270을 생산하는 반대 표현형으로 변환된다. 다른 예시에서, 아드헤진 단백질 AP65는 전형적인 배양 환경에서는 낮은 레벨로 발현되지만, 숙주, 또는 생체 내 (in vivo)와 유사한 환경에서는 매우 높은 레벨로 발현된다. 그러므로, 시험관 내 (in vitro) 환경에서 배양된 유기체에 대하여 성장된 항체들은 생체 내 (in vivo) 샘플에 포함된 트리코모나스에 결합되기에는 효과적이지 않을 수 있다. 전형적인 배양 환경에서 성장한 트리코모나스의 발현 레벨에 기반하면, 아드헤진 AP65 단백질은 분석 방법에 사용될 수 있는 적합한 피분석물이라고 판단되지 않을 수 있다. 더 나아가, 트리코모나스는 단백질 분해성을 가지는데, 즉, 트리코모나스는 표면 항원 및 항체들을 열화시키는 프로테아제를 분비할 수 있다. 전술된 바와 같은 트리코모나스의 방어 매커니즘의 결과로, 항-트리코모나스 항체의 개발을 위한 환경 내에는 안전한 면역원이 알려진 바 없다.
전형적으로, 트리코모나스 아드헤진 단백질은 표면에 발현된 단백질이고, 이 기생충의 숙주 동물의 비뇨생식기강 내막의 상피 세포에 대한 세포점착성 (cytoadherence)과 관련된다 (Alderete 및 Garza, 1988 참조, Arroyo 등, 1992 참조; Lehker 등, 1991 참조). 또한, 아드헤진은 기능적으로 활성 효소이다.
그들이 대사 효소이며 그들은 전형적인 배양 환경에서는 발현되지 않는다는 사실에 기인하여, 당업자에 의하여 사용될 진단 용도로 사용될 명백히 적합한 후보는 아니다. 대사 효소들은 모든 기관 내에서 기본적 역할을 공유하기 때문에 고도로 보존성되어 있으며 모든 지역의 숙주 단백질 (다른 대사 효소들과 같은)과 상동 성을 공유한다. 일반적으로 발견되는 단백질과 상동성을 공유하는 항원은, 일반적으로 진단 테스트에 사용되는 항체를 생성하는데 적합하지 않다. 전형적으로, 이들은 면역학적 반응성을 가지지 않거나, 명백하고 분명한 면역 응답을 나타낸 확률이 매우 낮다. 그러므로, 이러한 항원들은 검출하기 위한 항체 감염-반응을 충분히 유도하지 못할 가능성이 높고, 항원 자신의 적합한 폴리 및 모노클론 항체를 생성할 가능성도 낮다. 또한, 아드헤진은 면역학적으로 열성 (immunorecessive)이며, 이것은 실험 동물 내의 고역가 항혈청 및 모노클론 항체 (mAb)를 생성하는게 힘든 사실에서도 증명된다 (Alderete 및 Garza, 1988; Arroyo 등, 1992, 1993; Lehker 등, 1991). 더 나아가, 이러한 항원으로 향하는 항체들은 낮은 특이성을 겪을 가능성이 높은데, 그것은 숙주 및 다른 공동-병원체 (co-pathogen)로부터의 유사한 단백질과 반응하기 때문이다. 사실, 숙주 단백질에 대한 아드헤진의 유사성 (모방성, mimicry)는 병원체가 검출되고 면역 공격을 받는 것을 회피할 수 있도록 하는 기본이 된다. 본 발명의 발명자들은, 특정 아드헤진 단백질들이 동물 숙주 내에서 매우 잘 발현되며 특정 생체 내 (in vivo)와 같이 배양된 환경 하에서 면역학적으로 반응성을 가진다는 것을 발견했다. 또한, 아드헤진은 항체의 배양을 허용하는 충분한 양으로 발현된다. 그러므로, 아드헤진 단백질을 선택하는 것은, 면역학적 방법에 기반한 분석법을 위한 항원 선택에 있어서 신규한 전술로서 받아들여진다.
인체에 감염되는 기생충인 질 트리코모나스를 위한 아드헤진 단백질 및 그들의 코딩 서열들은 미국 특허번호 제5,922,563호에 개시되는데, 이것은 본 명세서에 참조되어 통합된다. 질 상피 세포 수용체 (receptor)에 대한 부착을 특이하게 매개하는 아드헤진으로서, 4개의 아드헤진 단백질 패밀리인 AP65, AP51, AP33 및 AP23이 식별된다. 이러한 4 군의 질 트리코모나스 아드헤진은 그들의 상대적인 분자량 (Mr)에 기반하여 그룹화된다. 즉, AP65는 65-kDa, AP51은 51-kDa, AP33은 33-kDa, 및 AP23은 23kDa를 가진다. 아드헤진 패밀리들 중 적어도 세 개의 패밀리는 상호 밀접하게 관련되는 개별 핵산 레퍼런스 (references)를 포함한다. 그러므로, 개별 아드헤진 각각은 다유전자 패밀리의 구성원이고, 본 명세서에서는, AP65, AP51, AP33 및 AP23라는 용어는 상응하는 분자량을 가지는 질 트리코모나스 아드헤진 단백질 패밀리의 모든 구성 요소를 나타낸다. 또한, 이러한 아드헤진은 다중 카피 (multiple copies) 내의 질 트리코모나스의 게놈 내에 존재한다.
본 발명의 일 실시예에서, AP65 아드헤진 단백질 패밀리가 진단 분석법을 위한 면역원으로서 선택된다. 비록 AP65가 바람직하기는 하지만, 진단 분석법을 위한 면역원으로서 안정성을 가지는 다른 아드헤진 단백질들도 선택될 수 있다. AP65 단백질의 유전자는 그 길이가 약 1.8kb이다. AP65 아드헤진 단백질 패밀리에는 6개의 공지된 구성 요소가 있는데, 그들 중 세 개는 (AP65-1, AP65-2, AP65-3)을 포함하고, 예를 들면 Alderete에게 허여된 미국 특허 번호 제5,922,563호에 상세히 설명되는데, 이 명세서는 본 명세서에 참조되어 통합된다. 구성요소들 각각은 개별 AP65 유전자에 의하여 인코딩된다. AP65-1 및 AP65-2 N-말단 서열들은 매우 유사한데, 즉, 12개의 아미노산 중 9개가 동일하다. AP65-1, AP65-2 및 AP65-3 의 히드로패치 (hydropathy) 그래프 (Kyte 및 Doolittle 1982)은 몇 가지 상이점을 제외하면 매우 유사하다. AP65 아드헤진 단백질은 질 트리코모나스에 고유하다. 질 트리코모나스 아드헤진으로부터 생성된 혈청이 다른 종에 대하여 교차-반응성을 나타내지 않는다는 것은, T. vaginalis, T. suis (돼지 트리코모나스) 및 Tt. foetus (소 트리코모나스)에 대한 프로브으로서 cDNA 삽입물을 이용한 교차-혼성화 연구와 함께 수행되는 리간드 분석법에 의하여 증명된다.
A. 분석법 포맷
본 발명의 분석법은 직접적으로 수행되거나 경쟁적으로 수행될 수 있다. 경쟁적 결합 분석법에서, 목표 피분석물 (예를 들면 질 트리코모나스 아드헤진 단백질과 같은)는, 예를 들어 적합한 고체 표면에 결합된 아드헤진 단백질을 특이하게 결합하는 항체와 같은, 바람직하게는 고정된 결합 물질 (binding agent) 상에서, 특정 결합 지점이 유사한 표지 피분석물과 경쟁한다. 고체 표면의 예로는 니트로셀룰로오스, 나일론, PVC 또는 폴리스틸렌 표면 등이 있다. 포획 시약에 결합된 표지 피분석물의 농도는 샘플 내에 존재하는 자유 피분석물의 양에 반비례하는데, 이것은 용액 또는 결합 형태로 정성적으로 검출될 수 있을 수 있고, 예를 들어 용액 내의 표지 아드헤진 단백질의 분광 결정법 (spectrophotometric determincation)에 의하여 정량적으로 측정될 수 있다.
전형적으로, 직접 분석법은 샌드위치 분석법으로서, 이 방법에서는 예를 들어 질 트리코모나스 아드헤진 단백질과 같은 목표 피분석물이 표지 결합 물질 (예를 들어 표지 항체) 및 구정된 포획 항체 모두와 결합하여, 검출될 수 있는 고정화 되고 표지된 샌드위치 복합체를 형성한다. 일반적으로, 정확한 분석 포맷은 그 분석법에 기대되는 민감도 또는 특이성에 의존한다. 몇 가지 분석법에서는 (특히 불안정 물질 (labile reagent)를 채택하는 분석법에 대해서), 제어 시약 (control reagent)이 추가되어 표지 시약 또는 포획 시약의 효과를 확인할 수 있다.
특히 팹 스메어 (pap-smear) 분석법에 사용되는 다른 직접-결합 분석법 포맷에서, 여성 환자로부터 채취된 경부 면봉채취 샘플 (cervical swab sample)이 방해 물질들을 제거하도록 처리되고, 그 면봉채취 성분이 (예를 들어, 질 트리코모나스 아드헤진 단백질과 같은) 고정되도록 (예를 들어 처리된 유리 슬라이드 표면에 고정되도록 함으로써) 처리되는 고체 상에 투여된다. 그러면, 형광 표지된 항-아드헤진 항체와 같은 표지 결합 물질이 그 슬라이드에 적용되어 면역학적 특이성을 가지는 목표에 결합되도록 허용되고, 결합되지 않은 항체를 세척하여 제거한다. 그러면, 면봉채취 샘플 내의 피분석물의 존재 또는 부존재가 그 슬라이드의 형광 현미경 검사에 의하여 결정된다. 미국 특허번호 제6,174,742호 및 제5,741,662호를 예를 들면, 이 특허들은 질 면봉채취 물질을 채취 및 처리하는 방법 및 염색된 물질을 검출하기 위한 방법을 개시한다. 팹 스메어 테스트를 위한 적합한 포맷 중 하나는 Cytyc 사 (홈페이지는 http://www.cytyc.com)에 의하여 제공되는 상표명 Thin-Prep의 팹 테스트이다.
직접-분석 포맷의 바람직한 실시예 하나로서 사용되는 건식-스트립 분석 키트는 후술되는 섹션 3에서 상세히 설명된다. 이러한 분석 포맷에서는, 모세관 흐름이 일어나도록 허용하는 다공성 또는 섬유질 테스트 스트립이 하향에서 상향 방 향으로, 샘플 적용 지역, 반응 지역 및 검출 지역을 포함한다. 샘플-적용 지역은 단순히 그 샘플이 추가되는 스트립 상의 지역일 수 있다. 반응 지역은 샘플 피분석물 (예를 들어, 아드헤진 단백질)에 결합될 수 있는 비고정 표지 시약을 포함함으로써 표지 이동성 복합체를 형성하는데, 즉, 이러한 표지 이동성 복합체는 그 테스트 스트립을 관통하여 검출 지역을 향하여 하향 방향으로 이동 (전형적으로는 모세관 현상을 이용하여)할 수 있다. 피분석물이 아드헤진 단백질이면, 표지 시약은 전형적으로 후술되는 바와 같이 표지 항-아드헤진 항체이다. 피분석물이 항-트리코모나스 항체이면, 표지 시약은 표지 아드헤진 단백질이다. 전형적으로, 시약은 액체 형태로 스트립에 추가되고 건조됨으로써, 샘플을 스트립에 적용하는 동작에서 습기가 가해지면 건조된 시약이 액상으로 바뀌어 스트립 매체를 통해 이동할 수 있도록 한다. 시약의 제조 및 동작에 대한 자세한 설명은 실시예 3을 포함하여 후술된다.
검출 지역은, 이동성 복합체의 피분석물 모이어티에 결합하여 그 표지 복합체를 그 지역 내에 고정시킬 수 있는 고정된 포획 시약을 포함하는데, 표지 복합체가 고정되는 반면에, 복합체가 되지 않은 표지 시약은 이동성 샘플-유치 매체와 함께 검출 지역을 통과한다. 고정된 결합 시약은 스트립 메트릭스에 공유결합되거나 공유 결합이 아닌 결합 (예를 들어, 정전기력 또는 분산력)으로 단단히 결합될 수 있다. 어떠한 경우라도, 고정은 샘플 유체가 검출 지역을 통과하는 동안에, 결합 시약이 표지 복합체를 포획하고 고정하도록 허용하기에 충분할 만큼 발생된다. 피분석물이 아드헤진 단백질인 경우, 고정된 결합 시약은 복합체 형태 내의 피분석물 에 접근할 수 있는 아드헤진 에피토프 (epitope)에 특이 결합될 수 있는 항-아드헤진 항체인 것이 바람직하다. 즉, 표지 항체 및 고정된 포획 항체는 아드헤진 단백질 내에서 분리되고 개별적인 에피토프들을 식별하는 것이 바람직하다. 피분석물이 인간의 항-트리코모나스 항체일 경우, 결합 시약은 인체 항체와 범용 면역학적 반응성을 가지는 비-인간 항-인간 항체인 것이 바람직하다.
스트립은, 표지 시약이 반응 지역으로부터 해방되어 스트립을 관통하여 움직이고 있다는 점 및 표지 시약이 구정 포획 시약에 의하여 포획되었다는 점을 검증하기 위하여, 복합체가 되지 않은 표지 시약이 포획되는 제어부로서 동작하도록 하는 제2 포획 지역을 더 포함할 수 있다. 표지 시약이 표지 항-아드헤진 항체일 경우에, 제어 포획 물질은 표지 항체와 면역학적 반응하는 항체인 것이 바람직하다. 따라서, 예를 들어 표지 항체가 설치류의 모노클론 항체일 경우에, 제어 포획 시약은 토끼의 항-생쥐 항체일 수 있다.
살펴본 바와 같이, 표지 시약 및 포획 시약의 상이한 조합을 사용함으로써, 본 발명의 분석법은 트리코모나스의 면역원 또는 숙주에 의하여 발생되는 항-트리코모나스 항체를 검출하는데 적합하도록 적응될 수 있다. 동물의 생물학적 샘플 내에 이것들이 존재한다는 것은 트리코모나스 감염이 되었다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 트리코모나스 (예를 들어 질 트리코모나스의 AP65 아드헤진 단백질과 같은) 면역원의 검출을 위한 특이성을 가지는 분석법에서, 표지 시약 및 포획 시약 내의 결합 모이어티는 질 트리코모나스의 AP65 에 역으로 생장된 항체이며, 표지 시약의 불변 지역 (에피토프가 아닌 지역)에 특이한 항체 또는 항원들이 제어 시약 으로서 사용된다. 예를 들어, 항-AP65와 같은 항체와 같이 숙주에 의하여 발생되는 항체들을 검출하기에 적합한 분석법에서, 표지 시약 및 포획 시약 내의 결합 모이어티는 AP65 아드헤진 단백질들이다. 또한, 아드헤진 단백질은 AP65 아드헤진 단백질의 음성, 키메라, 단편화, 또는 재조합된 형태일 수 있다.
이와 유사하게, 본 발명의 분석법은, 트리코모나스의 상이한 변종에 특이성을 가지는 상이한 표지 및 포획 시약들을 사용함으로써, 트리코모나스의 상이한 변종을 검출하는데 사용되도록 정합될 수 있다. 예를 들어, dsRNA 바이러스에 의하여 감염된 질 트리코모나스에 특이성을 가지는 항체가 사용되면, 이 분석법은 바이러스에 감염된 질 트리코모나스 및 바이러스에 감염되지 않은 질 트리코모나스 분리주를 구별할 수 있다. 다른 예시에서, 본 발명의 진단 분석법은 항체를 이용하여, 트리코모나스의 약품 저항성 또는 약품 취약성에 따르거나, 이를 나타내는 피분석물의 존재 또는 비존재를 검출할 수 있다. 예를 들면, 이러한 분석법은, 특정 감염을 처치하기에 적합한 약품의 종류 또는 약품 양에 대한 치료 결정을 내리는데 가이드로서 동작하는 역할을 할 수 있다.
결합 모이어티 (항체 또는 항원)과 함께 사용되어 표지 시약을 형성할 수 있는 표지 물질에는 다양한 종류가 존재한다. 표지 물질의 선택은, 요구되는 민감도의 정도, 결합 모이어티와 활용되기 쉬운 정도, 안정성 요구사항, 사용 가능한 기구들, 및 폐기 규약 등을 참고하여 결정된다. 본 발명의 표지 물질은 액상이거나, 입자상이거나, 금속성이거나, 유기물이거나, 무기물일 수 있으며, 녹색 형광 단백질, 형광 염색제 (예를 들어, 플루오레신 및 그 변성물, 로다민 및 그 변성물, 비 오틴, 아비딘 및 스트렙타비딘 등)과 같은 분광성 표지물질 이거나, 화학적 발광성 화합물 (예를 들어, 루시페린 및 루미놀이거나; 효소 (예를 들어 호스래디쉬퍼옥시다제, 알칼리 인산화효소, 등), 콜로이드 골드, 탄소 입자, 또는 염색된 유리 또는 플라스틱 (예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스, 등) 구슬 등과 같은 스펙트럼 분광성 표지 물질들 일 수 있다.
표지 물질은 당업계에 공지된 방법에 따라서 결합 모이어티의 성분에 직접 또는 간접적으로 커플링되는데, 공지된 기술의 예를 들면 미국 특허 번호 제4,863,875호 및 제4,373,932호가 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 참조되어 통합된다. 라디칼 반응성이 아닌 표지 물질들은 흔히 간접적 수단에 의하여 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자 (예를 들어 비오틴)은 결합 모이어티에 공유 결합한다. 그러면, 리간드는 항-리간드 (예를 들어, 스트렙타비딘) 분자에 결합되는데 이것은 성질상 검출될 수 있거나 검출될 수 있는 효소, 형광 호합물, 또는 화학적 발광성 화합물과 같은 시그널 시스템에 공유 결합된다. 표지 물질은 화학적 결합에 의하여 결합 모이어티에 부착될 수 있다. 전형적으로, 링커 도메인은 폴리펩티드 서열로서, 5개 내지 200개의 아미노산 간의 폴리-글리 (poly-gly) 서열과 같은 서열이다. 바람직한 링커는 흔히 가요성 아미노 산 하부-서열이 사용된다. 이러한 가요성 링커에 대해서는 당업자에게 공지된다. 예를 들어, 폴리 (에틸렌 글리콜)는 상업적으로 이용 가능하다 (예를 들어 Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Ala.에 의하여 공급된다). 또한, 검출 모이어티는 예를 들어 효소 또는 플루오로포어와의 결합에 의하여, 시그널-생성 화합물에 직접 활용될 수도 있다.
표지 물질의 존재는 검사에 의하여 검출될 수도 있고, 또는 특정 프루브 또는 프루브의 조합을 모니터링하는 검출기에 의하여 검출될 수도 있다. 전형적인 검출기에는 분광기, 광튜브 및 광다이오드, 현미경, 섬광 계측기, 카메라, 필름 등과 같은 것 및 이들의 조합이 포함될 수 있다. 적합한 검출기의 다양한 예들은 당업자에게 공지된 방법으로 다양한 상업적 방법으로 구할 수 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 바람직한 표지 물질은 방사능이 없으며 복잡한 장비를 이용하지 않고도 용이하게 검출되는 것이 바람직하다. 표지 물질은 육안 검사 시에 즉시 구별될 수 있는 시간적 시그널을 발산하거나 형광 검출에 나타나는 시그널을 발산하는 것이 바람직하다. 바람직한 표지 물질들의 예를 들면, 1) 화학적 발광물질 (홍당무 과산화효소 및/또는 알칼리 인산화효소를 분해 산물로서 양자를 생성하는 기질과 함께 사용), 2) 색 변화 (면역 반응 작용에 의하여 유색 석출물을 생성하는 콜로이드 골드), 3) 형광물 (예를 들어, 플루오레신 및 다른 형광 태그를 이용하여) 등이 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 콜로이드 골드가 표지 물질로 사용되고, 이 표지 물질은 결합 모이어티 (항체 또는 항원)에 직접 결합된다). 골드가 표지 물질로 사용되면, 표지 시약-피분석물 복합체를 포획 시약과 함께 사용하면 적색의 침전물이 발생된다. 당업자에 의하여 이해될 수 있는 바와 같이, 복합체가 포획 지역에 고정된 포획 시약과 반응한 결과로 발생되는 물질의 색은 사용되는 표지 물질에 따라서 달라질 수 있다.
본 발명의 바람직한 분석법 포맷에서, 포획 및 색 포획 시약은 고체 기판 상에 고정된다. 당업자에게 공지되고 본 발명과 함께 사용되기에 적합한 고체 지지 체는 매우 다양하게 존재한다. 예를 들어, 고체 지지체는 구슬일 수 있고, 막 (예를 들어 니트로세룰로스과 같은), 마이크로타이터 웰 (예를 들어, PVC 또는 폴리스티렌과 같은), 스트링, 플라스틱, 스트립, 또는 항체가 부착되거나 고정될 수 있는 모든 표면이 본 발명에 사용될 수 있다. 또한, 천연일 수도 있고 인조물질일 수도 있는 다양한 유기 및 무기 중합체가 고체 표면의 물질로서 채택될 수 있다. 예시되는 중합체에는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리 (4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 레이온, 나일론, 폴리 (비닐 부틸레이트), 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF), 실리콘, 폴리포름알데히드, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 니트로셀룰로오스 등이 있다. 채택될 수 있는 다른 물질에는, 종이, 유리, 세라믹, 금속, 메탈로이드, 반도체 물질, 시멘트 또는 이와 같은 것들이 포함된다. 또한, 단백질, 리포폴리사카라이드, 실리케이트, 아가로즈 및 폴리아크릴아미드와 같은 겔을 형성하는 물질들 (예를 들어 겔라틴과 같은)이 사용될 수 있다. 덱스트란 및 폴리알킬린 글리콜과 같이 몇 가지의 수용성 상태를 형성하는 중합체, 또는 포스포리피드 또는 긴사슬 알킬 암모늄 염 (12 내지 24개의 탄소 원자를 가지는)과 같은 계면활성제가 역시 사용될 수 있다.
여러 종류의 화합물을 다양한 표면에 결합하는 방법은 공지되어 있으며 다양한 문헌에 상세히 예시된다. 예를 들어, IMMOBILIZED ENZYMES, Ichiro Chibata, Halsted Press, New York, 1978, 및 Cuatrecasas, 1970을 참조하는데, 이 문헌들은 본 명세서에 원용에 의하여 포함되어진다. 포획 및 제어 시약들은 공유결합으로 결합될 수도 있고 또는 비특이성 결합을 통해 비공유 결합으로 부착될 수 있다. 만일, 화합물 및 표면 간의 공유 결합이 바람직하다면, 표면은 일반적으로 다기능 화합물이거나 다기능 화합물이 될 수 있다. 표면 상에 존재하며 결합을 위하여 사용되는 기능기들에는 카르복시산, 알데히드, 아미노기, 시안기, 에틸렌기, 히드록시기, 메르캅토기 및 이와 같은 것들이 있다. 공유 결합에 부가하여, 분석 화합물을 비공유적으로 결합하기 위한 다양한 방법들이 사용될 수도 있다. 전형적으로, 비공유적 결합은 화합물을 표면에 비특이적 흡하는 것이다. 전형적으로, 표면은 표지 분석 화합물의 비특이적 결합을 방지하기 위한 제2 화합물에 의하여 차폐된다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 포획 및 제어 시약은 니트로셀룰로오스 막 상에 비특이적으로 흡수되고 차폐 버퍼 (0.5% BSA; PBS 내의 4% 수크로오스)에 의하여 차폐되는데, 이는 실시예 3에 설명된 바와 같다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 분석법은 예를 들어 질 트리코모나스의 AP65와 같은 트리코모나스에 특이한 면역원을 검출한다. 포획 및 표지 시약의 결합 모이어티는 면역원의 에피토프들에 반하여, 또는 실질적으로 반하는 방향으로 성장된 항체들이다. 또한, 분석법은 내부 제어부 또는 외부 제어부로 동작할 수 있는 제어 시약을 더 포함한다. 내부 제어부은 포획 및 표지 시약의 항체의 생장에 사용된 종과 상이한 종으로부터 잠재적으로 획득된 항-항체를 포함할 수 있는데, 즉, 만일 표지 시약 및 포획 시약이 토끼으로부터 추출된 것이라면, 제어 지역에 투입되는 항체는 염소 항-생쥐류 IgG, 염소 항-생쥐류 IgG, 돼지 항-생쥐류 IgG 등일 수 있다. 이러한 항체의 생성에 대해서는 후술된다. 외부 제어부는 트리코 모나스으로부터 항원으로서, 세포 정제, 조 추출물, 또는 표지 시약 및 포획 시약이 결합될 재조합 단백질로부터 유도된 항원으로 구성될 수 있다.
항체는 모노클론 항체이거나 플리클론 항체일 수 있으나, 모노클론 항체인 것이 바람직하다. 단일 사슬 항체 및 항체의 단편들 역시 결합 모이어티로서 유용하게 사용될 수 있다. 그러므로, 본 명세서에 사용된 "항체"라는 용어는, 단일 사슬 항원 및 전체 항원 또는 재조합 DNA 방법을 이용하여 합성된 항원들의 조작에 의하여 생성된 항체 단편을 포함한다.
본 발명의 분석법에 사용되는 항체는 종래 기술에 의한 항체 양성 기술에 의하여 획득될 수 있다. 참조 문헌의 예로는, Harlow 및 Land, eds., ANTIBODIES; A LABORATORY MANUAL, Coldspring Harbor Laboratory, Coldspring, N.Y. 가 포함된다. 항체를 준비하는데 적합한 접종제 (inoculant)에는 자연 단백질, 재조합 단백질, 기생 생물의 조 막 제제 또는 조 제제가 포함된다. 적합한 항체는, 수성 및 이온화 및 비이온화 계면 활성제 버퍼 (detergent buffer) 조건 하에서 면역학적 반응성을 가져야 한다.
폴리클론 항체가, 예를 들어 Harboe 및 Inglid, Scand. J. Immun. 2 (Suppl. 1), p. 161-164, (1973)의 문헌에 설명되어 있는 대로 준비될 수 있다. 특히, 폴리클론 항체가 다양한 숙주 동물들 중 어떤 것에 프로인트 (Freund)의 불완전 또는 완전 항원보강제 (adjuvant)와 같은 적합한 보강제 내에 포함된 전술된 바와 같은 접종제를 접종함으로써 획득될 수 있는데, 이러한 동물에는 토끼, 쥐, 생쥐, 염소, 양, 및 이와 같은 것들이 있지만 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다. 접종 후 에 한번 또는 그 이상의 부스터 접종이 적합한 시간 간격 (예를 들어 한 두 주에서 한달 까지의 간격)으로 실행될 수 있다. 동물들의 혈액은 정기적으로 (예를 들어 수 주 단위로) 채취되고, 채취된 혈액으로부터 항체가 혈청으로부터 분리되도록 처리된다.
바람직하게는, 모노클론 항체는 하이브리도마 세포주를 이용함으로써 생성될 수 있는데, 이러한 예시는 Kohler and Milstein, Nature 256, 1975, p. 495 에 기재되어 있거나, 미국 특허 번호 제4,707,442호로서 Alderete에게 허여된 특허에 기술되어 있다. P3/X63-Ag 8, P3/NSI/1-Ag 4-1, Sp2/10-Ag14 및 S194/5.XXO.BUT.1. 과 같은 수 개의 골수종 (myeloma) 세포주가 융합된 융합 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. 전형적인 융합 과정에서, 특정 항원에 대해 면역 처리된 동물로부터 추출된 이자 림포사이트가 골수종 세포와 융합된다. 그러면, 결과적으로 발생되는 하이브리도마는 일련의 개별 배양 튜브들 또는 마이크로타이터 플레이트 웰 내에서 분산되어 원하는 항체를 생성하는 배양체를 스크리닝한다. 양성 배약체는 더 희석화되어 단일 세포 (클론)으로부터 발생되는 콜로니들을 획득한다. 클론들은 다시 원하는 항체를 생성하기 위하여 스크리닝된다. 모노클론 항체를 생성하는데 이용되는 하이브리도마 세포들은 시험관 내 (in vitro)에서 배양되거나 동물의 체강 내에서 생장할 수 있다. 모노클론 항체들은 배양된 하이브리도마 세포들의 상청액으로부터 또는 복로부터, 원심분리법, 투석법, 크로마토그래피 또는 이들의 결합과 같은 종래 기술을 이용하여 분리되고 정재될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 결합 항체들은 질 트리코모나스의 아드 헤진 단백질 AP65에 반하여 생장되고 DM116 및 C55 세포주에 의하여 생성된다. 이러한 항-아드헤진 단일클론항체 및 다른 것들은 텍사스 주의 산 안토니오 주에 있는 텍사스 건강 과학 센터 대학의 하이브라도마 기탁 기관 내에 기탁되었다. 이러한 항체들은 전술된 바와 같은 참조 문헌들로서, 본 명세서에 참조되어 통합되는 문헌에 개시된 바와 같은 두 가지 일반 방법 중 하나를 이용하여, 높은 확률 및 예측 가능성으로써 생성될 수 있다.
첫 번째 일반 방법에서, 쥐와 같은 동물들에게 질 트리코모나스의 전 세포 또는 막 단백질이 주입된다 (예를 들어, Alderete, 1986을 참조한다). 쥐로부터의 항체 생성 세포들은 죽지 않도록 방사처리되고 방사처리된 세포에 의하여 생성된 단일클론항체들은, 예를 들어 배양액 내에서 질 트리코모나스와 반응하도록 스크리닝된다. 그러면, 단일클론항체들은 다시 스크리닝되어 하나 또는 그 이상의 아드헤진 단백질에 대한 반응성을 갖는다. 동일한 아드헤진 단백질의 상이한 에피토프들과 상호작용하는 두 개의 맙들을 식별하기 위하여, 단백질은 예를 들어 10 내지 25개의 아미노산 잔기를 가지는 개별 중첩 단편들로 분주되고, 이러한 단편들은 다시 스크리닝되어, 전술된 바와 같이 상이한 개별 아드헤진 단편과 면역 반응하는 것으로 식별된 두 개 또는 그 이상의 단일클론항체들을 튜잉 (thew)하는 면역 반응성을 가질 수 있다. 또는, 동일한 아드헤진 단백질의 상이한 에피토프에 결합되는 단일클론항체들의 테스트 쌍에 표준 경쟁적 결합 연구가 채택될 수도 있다.
다른 일반 방법에서, 아드헤진 단백질 또는 단백질 단편들은 예를 들어 질 트리코모나스 아드헤진 코딩 서열의 재조합 표현에 의하여 준비된다. 이것은, 사 전 인용된 미국 특허번호 제5,922,563호에서와 같다. 그러면, 고립된 아드헤진 단백질 (들) 또는 단백질 단편 (들)이 하이브리도마 세포주를 생성하기 위한 면역원 (예를 들어 생쥐 내의 면역원)으로서 직접 사용된다. 그러면, 세포주에 의하여 생성된 단일클론항체들은 아드헤진 단백질에 대한 면역 반응성을 가지는 항체를 위해 스크리닝된다. 그러면, 전술된 바와 같은 방법들 중 한 가지가 채택되어 아드헤진 단백질의 상이한 에피토프와 면역학적 반응성을 가지는 두 개 또는 그 이상의 단일클론항체들을 식별한다.
아드헤진 항체는 여러 경우에 다양한 서로 다른 방법을 이용하여 생성되어 왔다. 예를 들어, 항-AP65 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주는, 생쥐에게 트리코모나스 유기물 전체, 트리코모나스 막 제제, 정제된 원 AP65, 리콤비넌트 AP65 및 포름알데히드 및 글루테르알데히드-고정된 트리코모나스 유기체 전체, 프로인트 (Freund)의 보강제내에 사용되는 보강제, 아크릴아미드 (겔 정제 단백질의 경우) 및 AP65에 융합된 키메라 단백질의 비-AP65 모이어티에 대한 접종을 수행함으로써 생성될 수 있다. 세포주를 생성하는 면역학적 반응성을 가지는 항체의 전체 수율은 하이브리도마 융합에 의하여 생성된 전체 세포주의 5 내지 10%에 달하는데, 이러한 수율은 다른 비-아드헤진 항체 세포주의 전형적인 수율과 일치하는 것이다.
표지 시약 및 포획 시약의 결합 모이어티는 트리코모나스 아드헤진 단백질로서, 예를 들어, 질 트리코모나스, AP65, AP51, AP33, AP23 아드헤진 단백질 및 이들의 면역학적 활성을 가지는 단편과 같은 질 트리코모나스 아드헤진 단백질이며, 특히, AP65 아드헤진 단백질 또는 그것의 면역학적 단편이다. 본 발명의 분석법에 서 사용되기 위하여, 트리코모나스 아드헤진 단백질은 원상태 그대로이거나, 화학적으로 합성되거나 재조합 생성될 수 있고, 분자 전체이거나 그 단편일 수 있다. 일 실시예에서, 아드헤진 단백질은 재조합 수단을 이용하여 준비된다. 적어도 하나의 면역학적 반응성의 데이터를 포함하는 재조합 면역원을 준비하는 방법은 당업자에게 공지되었으며, 미국 특허 번호 제5,876,985호 및 제5,922,563호에 기술되는데, 이 명세서들은 본 명세서에서 원용되어 포함되어진다. 간략히 설명하면, 재조합 면역원은, 항원을 인코딩하는 유전자 또는 유전자들을 포함하는 발현 벡터를 이용함으로써 준비될 수 있다. 인코딩 유전자는, 목표 트리코모나스의 cDNA 표현 라이브러리로부터 선택될 수 있는데, 그 라이브러리를 관심 대상인 항원의 단순 제제에 대하여 생장된 폴리클론 항체를 이용하여 스크리닝함으로써 선택될 수 있다. 그러면, 관심 대상인 항원을 표현하는 그런 표현 플라스미드로부터의 cDNA 삽입물이 서브클로닝되고 서열 분석된다. 면역원 군의 상이한 구성원, 또는 수 개의 관련없는 면역원들을 인코딩하는 항원을 코딩하는 삽입물은 풀링되고, 발현 벡터 내에 클로닝되어 대장균 또는 다른 적합한 숙주 세포들을 형질 전환하는데 사용된다. 다양한 질 트리코모나스 아드헤진 단백질을 위한 예시적인 코딩 서열은 사전 인용된 미국 특허들에 제시된다. 항원이 질 트리코모나스의 AP65 아드헤진 단백질군인 본 발명의 일 실시예에서, 재조합 항원은 보존된 에피토프를 가지는 거의 동일한 6개의 AP65 아드헤진 유전자들의 카세트로부터 표현된다. 결과적으로 발생되는 리콤비넌트 항원은 보존성이 높으며 항체를 생장시키는데 있어서 안정적이다. 그러나, 다수의 상이한 유전자들 및 유전자 단편들이 표현 카세트에 포함되어 조결합 항원 혼합물을 생성할 수 있으며, 이러한 동작을 위하여 적합한 유전자들 및 유전자 단편들의 선택은 당업자에게 공지된 범위 안에 있는 것이라는 것이 이해되어야 한다.
모 아드헤진 단백질 또는 원 아드헤진 단백질의 바람직한 면역학적 반응성을 가지는 면역학적 단편을 선택하기 위하여, 단백질은 단편화될 수 있는데, 예를 들어 단백질 분해물을 이용하여 단편화될 수 있으며, 원 단백질에 대한 항체의 결합을 위한 단편화 테스트일 수 있다. 결합된 단편의 제한된 N-말단 또는 C-말단 아미노산 분석법이 관심 대상인 결합 단편을 식별하는데 사용될 수 있다. 또는, 재조합 표현 설정에서는, 아드헤진 코딩 서열은 종래 기술에 의한 수단에 의하여 단편화되어 그 길이에 있어서 약 25개 내지 300개의 아미노산을 가지는 아드헤진 단편을 코딩할 수 있는 단편을 형성할 수 있다. 이렇게 인코딩된 단편은 종래 기술에 따라 표준 표현 시스템 (예를 들어, gt10 또는 gt11 표현 시스템)에서 표지 항-아드헤진 항체를 선택함으로써 분석될 수 있다.
3. 건식 스트립 분석 키트
본 발명에 따른 키트는, 이전에 건식-스트립 측면 흐름 (lateral flow) 분석법 키트라고 언급된 바 있는데, 생물 샘플 내에 존재하는 트리코모나스 피분석물 (아드헤진 단백질 또는 항-트리코모나스 항체)의 검출을 위한 "원 스텝" 측면 흐름 분석법을 제공한다. 전술된 바와 같이, 본 발명에 의한 키트는 일반적으로 흐름 경로에 따른 샘플 용액의 모세혈관 흐름을 허용하는 물질로 이루어진 메트릭스를 포함한다. 이러한 메트릭스는 샘플-적용 지역, 반응 지역, 검출 지역, 및 선택적 으로는 제어 포획 지역을 정의한다.
본 분석 장치의 메트릭스는 전형적으로 비흡수성 (non-bibulous) 측면 흐름을 허용하는 다공성 물질이다. "비흡수성 측면 흐름"이라는 용어는, 액체의 용해되거나 분산된 모든 성분이 실질적으로 동일한 속도로써 유체 흐름이 진행되고, 막 전체를 통해 상대적으로 편중되지 않는 유체 흐름이 수행되는 유체 흐름을 의미하는데, 이것은 예를 들어 하나 또는 그 이상의 성분들을 흡수 하거나 흡착하는 성질을 가지는 물질 내에서 발생될 수 있는 하나 또는 그 이상의 성분들의 편향된 진행 보류가 발생되는 경우와는 상반되는 것이다.
전형적인 비흡수성 메트릭스 물질은 유리 섬유 필터 페이퍼이다. 폴리술폰 미세다공성막, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트막, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 아세테이트, 비닐 아세테이트 및 피닐 클로라이드의 중합체, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 타일론, 오론 (orlon), 폴리에스테르, 폴리스티렌 등과 같은 것들 또는 이들의 합성물과 같은 다른 비흡수성 막들이 사용될 수도 있다. 원하는 매체 성질 및 유속을 가지는 메트릭스 물질을 선택하는 것은 당업자에게 공지된 기술에 일반적으로 포함되는 것이다.
메트릭스의 크기 및 모양은 중요한 것이 아니며 변경될 수 있다. 일반적으로, 메트릭스는 사각형이며 흐름 경로는 축성 (axial)이다. 일반적으로, 다공성 메트릭스는 일반적으로 물이 침투할 수 없는 고체 지지체에 의하여 지지된다. 또한, 메트릭스는 전형적으로 플라스틱 또는 유사한 방수성 물질로 만들어진 하우징 또는 컨테이너 내에 포함되거나, 부분적으로 포함될 수 있다.
흡수 지역 (absorbent zone)이 일반적으로 본 발명의 장치에 포함된다. 흡수 지역은 포획 지역으로부터 하향하여 위치된다. 흡수 지역은 장치의 메트릭스로부터 초과 샘플 및 결합되지 않은 표지 물질을 제거함으로써 흐름 경로에 바람직한 모세관 흐름이 유지되도록 하기 위한 수단이다. 일반적으로, 흡수 지역은 필터 페이퍼, 유리 섬유 필터, 또는 이와 같은 흡수제를 포함한다.
유체 샘플은 전형적으로, 질경부로부터 추출된 면봉채취 샘플 또는 질로부터 추출된 면봉채취 샘플이거나, 소변, 혈청, 또는 타액인데, 이 유체 샘플은 샘플 수납 지역에 있는 메트릭스에 적용된다. 준비된 샘플이 검출 지역을 통과하여 흐를 때, 만일 그 샘플 내에 피분석물이 존재한다면 표지 시약은 목표 피분석물에 결합하여 표지 시약-피분석물 복합체를 형성한다. 샘플이 포획 지역 내로 흘러들어가면, 표지 목표 피분석물은 고정된 면역글로불린에 의하여 결합됨으로써 표지 물질을 포획 지역 내에 보존한다. 샘플이 제어 지역으로 흘러 들어가면, 그 샘플 유체 내에 함께 운반된 초과 표지 시약은 제어 시약에 의하여 결합됨으로써 복합체가 되지 않은 표지 물질을 제어 지역 내에 보존한다.
가시성 표지 물질의 농도는 시각적인 방법을 이용하거나, 광학 검출 장치들을 이용함으로써 측정될 수 있다. 포획 지역 내에 표지 물질들이 잔류한다는 것은 샘플 내에 목표 피분석물이 존재한다는 것을 의미한다. 제어 지역 내에 표지 물질이 잔류한다는 것은 충분한 양의 유체가 표지 지역 및 포획 지역을 통과했으며, 표지 시약이 저장, 버퍼 합성물 및 샘플 합성물 등에 의하여 변성되거나 열화되지 않은 상태로서, 그 분석법이 유효하다는 것을 나타낸다.
또한, 농축된 표지 물질의 육안으로 확인할 수 있는 정도는 환자 샘플 내의 피분석물의 농도 또는 역가 (희석화)와 상호 관련될 수 있다. 농축된 표지 물질의 육안으로 확인할 수 있는 정도 및 피분석물 농도 간의 상관 관계는 육안으로 확인되는 농도를 참조 표준과 비교함으로써 확인될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 장치에 의하여 피분석물 수준이 결정될 수 있다.
도 1 및 도 2는 테스트 스트립 (10)을 포함하는데, 이것은 본 발명에 따른 장치의 일 실시예에서 본 발명에 의한 분석 방법을 실행하는데 유용한다. 테스트 스트립 (10)은 확장된 다공성 메트릭스 (12)로서, 고체 지지체 (13)에 의하여 지지되며 각각 상향 말단부 및 하향 말단부 (14, 15)를 가지는 메트릭스 (12)를 포함한다. 다공성 물질인 패드 (16)는 메트릭스 (12)의 상향 부분 상에 실장된다. 이 패드는 샘플-적재 지역 또는 샘플-수납 지역 또는 지역 (17)로서, 아드헤진 펩타이드를 포함하는 샘플이 스트립에 적용되는 지역을 포함하고, 또한 샘플-적재 지역 하부에는 반응 영역 또는 지역 (20)으로서 이동성 리포터 표지 항-아드헤진 항체를 포함하는 반응 지역을 포함한다.
도 2에 도시된 바와 같이, 패드 (16)는 메트릭스 (12)의 상부 표면에 부착되고, 그것을 통하여 모세관 흐름과 통신한다. 그러므로, 샘플-적용 패드에 적용된 샘플 유체는 패드 (16)로 흘러 들어가고, 패드 (16)를 통과하여 반응 영역으로 흘러 들어간다. 여기서, 샘플 유체는 이동성 항체를 용액 내에 방출하도록 야기하고, 그 항체가 샘플 아드헤진과 반응함으로써 패드 및 연결 메트릭스를 통과하는 모세관 흐름을 통하여 패드로부터 메트릭스 (12) 내로 이동할 수 있다.
또한, 메트릭스 (12)는 포획 시약의 스트립이 투입되어 있는 검출 지역 (22) 및 제어 시약이 투입되어 있는 제어 지역 (24)을 포함한다. 도 2에 예시된 실시예에서, 포획 시약 및 표지 시약은 확장된 메트릭스 (12)를 가로지르는 스트립 형태로써 투입된다. 그러나, 포획 시약 및 표지 시약은 다른 어떠한 적합한 포맷으로도 투입될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
메트릭스 (12)의 하향 말단부를 커버링하는 것은 흡수제 패드 (absorbent pad, 28)이다. 흡수제 패드 (28)를 커버링하는 테입이 테스트 스트립을 쥘 수 있는 표면 또는 핸들을 제공한다. 패드 (28)의 목적은 흡수제 저장소 (absorbent reservoir)로 동작함으로써 적용 지역으로부터 검출 및 제어 지역으로 샘플 유체를 지속적으로 유도하기 위한 것이다.
메트릭스 (12)는 샘플이 샘플 수납 지역 (17)에 수납되어 모세관 현상을 통하여 테스트 스트립 (10)의 가로축을 따라 흘러가도록 하는 유리 섬유 여과지를 포함한다. 전술된 바와 같은 비흡수성의 메트릭스 물질과 같은 다른 다공성 물질 역시 사용될 수 있다. 고체 서포트 (13)는 니트로셀룰로오스 막으로 형성된다. 페이퍼, 나일론 막, 유리, 플라스틱, 금속 및 이와 같은 것들과 같은 다른 적합한 매체들도 사용될 수 있다.
본 발명의 특정한 일 실시예에서, 테스트 스트립 (10)은 질 트리코모나스 피분석물의 아드헤진 단백질 AP65의 검출을 하도록 설계되며, 검출 지역은 골드 접합된 토끼 항-AP65 IgG를 이용한 줄무니를 가지고, 포획 지역은 항-AP65 IgG에 의한 줄무니를 가진다. 테스트 스트립 (10)을 생성하기 위한 예시적 단계들은 예 1 내 지 예 6에 설명된다.
테스트 스트립 (10)은 하우징 내에 보관됨으로써 스트립의 핸들링을 용이하게 할 수 있다. 도 3 및 도 4는 하우징 (52) 내에 봉함된 테스트립을 포함하는 테스트 스트립 카세트 (50)를 예시한다. 하우징 (52)은 분석을 수행하는 사람이 용이하게 잡을 수 있도록 설계된다. 하우징 (52)은 각 상부 및 하부 지역 (54 및 56)을 포함한다. 하부 지역 (56)은 내부에 테스트 스트립 (10)을 수납하기 위한 웰 (well, 58)을 포함한다. 상부 지역 (56)은 두 개의 윈도우들 (60 및 62)을 포함한다. 윈도우 (60)는 유체 샘플을 수납하도록 정합된다. 윈도우 (62)는 분석 결과를 확인하기 위하여 제공되는 것이다. 상부 부분 (54) 내에는 웰 (58) 상에 정렬되어 테스트 스트립을 웰 내에 유지시키기 (anchoring) 위한 페그 (peg, 64)가 제공된다. 두 개의 지역들은 상호 정렬되며 하부 지역 (56) 내의 개구부 (68)와 같이 상응하는 개구부에 위치하는, 상부 지역 (54) 내에 삽입되는 핀 (66)과 같은 모서리 핀들에 의하여 고정된다.
하우징 (52)은 적당한 강도를 가지는 모든 방수성 물질들로서, 즉, 모든 플라스틱 물질로서 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스틸렌과 같은 플라스틱 물질로 만들 수 있다. 만일 플라스틱 물질이 사용된다면, 하우징 (52)은 종래 기술에 의한 몰딩 기법을 이용하여 생산될 수 있다.
카세트 (50)는 우선 하부 지역 (56) 내의 웰 (58)에 테스트 스트립 (10)을 위치시킴으로써 용이하게 조립될 수 있다. 그러면, 상부 지역 (54)이 하부 지역에 반대되도록 위치되고, 윈도우 (60)는 샘플-적재 지역 (17)과 함께 정렬되고, 윈도 우 (62)는 검출 (포획) 및 제어 지역들 (22, 24)과 함께 정렬되며, 페그 (64)는 흡수제 패드 (28)와 함께 접촉되도록 배치된다. 그러면, 상부 및 하부 지역들이 결합 핀들 및 개구부를 통하여 상호 결합된다.
본 발명에 의한 키트는 전술된 바와 같이 단일 분석 스트립을 포함할 수도 있고, 복수 개의 테스트 스트립을 포함할 수도 있다. 복수 개의 스트립들은 중복 테스팅 또는 상이한 트리코모나스 종, 분리주 (isolate) 또는 약제 저항성 마커의 존재 또는 비존재를 테스트하기 위하여 제공될 수 있거나, 다른 성관계에 의하여 전염되는 질병 (STD) (예를 들어 클라미디아와 같은) 또는 다른 질염 유발 인자 (예를 들어, 칸디다 효모 (Candida yeast) 및 가르덴네렐라 박테리아 (gardenerella bacteria)의 패널을 테스트하기 위하여 설계될 수도 있고, 또는 여러 개의 동물성 트리코모나스 종을 검출할 수 있는 다중 장치일 수도 있다. 본 발명에 의한 키트는 샘플 추출 도구로서, 예를 들어 자궁경관내 샘플을 획득하기 위한 살균 면화 면봉 (cotton swab)과 같은 도구 및 샘플 여과 및 농축 장치들을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 의한 키트는 예를 들어 샘플을 중화하기 위하거나 트리코모나스 항원을 용액에 추출/용해시키기 위한 버퍼와 같은 샘플 제제 용액 (sample preparation solution)을 포함할 수 있다. 또한, 분석법을 실행하는데 유용하게 사용될 수 있는 다른 물질들이 본 발명에 의한 키트에 포함될 수도 있는데, 예를 들어, 테스트관, 전달 피펫 등과 같은 것이 포함될 수 있다. 포함되는 장치 및 시료는 수행되는 테스트의 종류에 의존하여 변하며 일반적으로 이러한 것들은 당업자에게는 공지된 것이다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 키트는 질 트리코모나스의 검출을 위한 것이다. 이 장치는 금접합된 항체 DM116으로써 검출 지역 내의 아드헤진 단백질의 AP65 군에 대하여 생장된 항체 DM116을 포함하며, DM116에 의하여 결합된 것과 이격되고 포획 지역 내에 고정되는 AP65 에피토프에 특이하게 결합하는 C55 항체 또는 그 단편을 포함한다. 본 발명의 바람직한 다른 실시예에서, 이 키트는 약 4.0 내지 약 9.0의 pH 값을 가지는 버퍼 용액을 포함한다. 이러한 버퍼는 이중 정제된 물 내의 약 0.5%의 트리톤 (Triton) X-100 및 0.1%의 BSA를 포함하는 샘플 용해성 버퍼인 것이 바람직하다. 일반적으로, 장치, 용해 시약, 용기 및 샘플 채취 기구들은 함께 제공되고, 면역 분석 키트에 대한 종래 기술에 의한 여러 종류의 포장으로서, 예를 들어 박스, 가방, 실린더, 수축성 랩 카드 등과 같은 포장들도 제공된다. 선택적으로, 본 발명에 의한 키트는 본 발명에 의한 방법의 단계들을 설명하는 설명서를 더 포함할 수 있다. 인산염 (phosphate), 트리스 (Tris) 또는 트리톤 X-100, BSA 및 정제된 물을 포함하는 pH 약 4.0 내지 약 9.0을 가지는 버퍼와 같은 다수의 수용성 버퍼 용액들이 분석을 위한 생물학적 샘플을 준비하는데 사용될 수 있다. 적합한 버퍼를 선택하는 기술은 당업자에게 공지되어 있는 것이다.
소변이 생물학적 샘플인 경우, 이 샘플은 원변 (native urine), 원변의 분획화된 일부, 또는 예를 들어 농축된 형태 또는 희석된 형태에서 수행된 여과법과 같은 방법으로 다른식으로 처리된 원변일 수 있다. 소변 테스트 샘플을 단일 스텝으로 여과 및 테스트하는 최적 장치는 테스트 및 제어 항체들을 위한 지지 매체로서 동작하는 필터 기판을 포함한다. 항원 또는 항원/표지 항체 복합체는 유체가 필터 기판을 통과할 때 유체와 적합한다. 이러한 유체 흐름을 이용한 진단 장치들은 당업자에게 공지된 것이며, 이러한 방법은 본 발명에 의한 방법과 일치한다. 다수의 버퍼 용액이 원변을 희석화하는데 사용될 수 있는데, 약 4.0 내지 약 9.0의 pH 값을 가지는 X-100 또는 인산염 버퍼가 사용되는 것이 바람직하다. 원변의 용액 일부 및 미립자 분획이 분리되어 분석될 수 있다. 원변의 두 부분들은 당업계에 공지된 방법으로써, 침전법, 원심 분리법, 또는 여과법과 같은 고체-유체 분리 방법 중 어떤 것을 이용하여도 분리될 수 있으며, 유체 및 미립자들은 분리되어 채집된다. 다음으로, 미립자들은 예를 들어 트리톤 X-100 버퍼 용액과 같은 버퍼 내에 재현탁되어 관심 대상인 피분석물 단백질을 용해하거나 추출할 수 있다. 그러면, 그 현탁액이 분석되어 피분석물이 존재하는지 검사된다. 분리된 소변의 유체 부분도 유사하게 분석되거나 분석 작업 이전에 사전 처리될 수 있다. 사전 처리 작업에는 농도를 높이는 작업, 희석화, 또는 중화 작용이 포함될 수 있다.
질 면봉채취 샘플이 생물학적 샘플인 다른 실시에에서, 면봉 내에 포함된 생물학적 유체는 우선 용해되어 버퍼 용액 내에 추출된다. 예시적인 추출 과정은 실시예 4에 기술된다. 바람직한 버퍼에는 0.5%의 트리톤 X-100, 0.1%의 BSA, 및 이중 정제된 물을 포함한다. 약 4.0 내지 약 9.0의 pH 값을 가지는 인산염 버퍼 용액과 같은 다른 버퍼 용액이 사용될 수도 있다.
그러면, 준비된 액체 샘플 (소변 또는 면봉채취 샘플)이 본 발명에 의한 장치 중 하나에 적용되는데, 이 장치의 예를 들면 도 1 및 도 3에 도시된 테스트 스트립 (10) 또는 테스트 카세트 (50)일 수 있다. 만일 테스트 스트립 (10)이 사용 된다면, 그 스트립은 샘플 액체를 끌어올릴 수 있는 딥스틱 (dipstick)으로서 사용될 수 있다. 만일 테스트 카세트 (50)가 사용된다면, 샘플 액체는 피펫을 이용하여 전달되어 샘플 수납 윈도우 (60) 내에 투하될 수 있다. 수납된 액체는 모세 혈관에 의하여 검출 지역, 포획 지역 및 제어 지역을 향하여 다공성 메트릭스를 따라서 흘러간다. 테스트의 결과는 포획 지역 및 제어 지역 내에 포획된 표지 물질들로부터 직접적으도 판독될 수 있다. 착색된 (표지 물질이 콜로이드 골드일 경우에는 붉은색) 라인이 포획 지역 및 제어 지역에 나타나면 트리코모나스 감염에 대한 양성 결과를 나타내는 것이다. 제어 지역에만 착색된 라인이 나타나면 음성 결과가 나왔다는 것을 나타내며 그 테스트는 무효라는 것을 나타낸다. 아무 라인도 나타나지 않으면 그 테스트가 무효임을 나타낸다.
전술된 바로부터, 본 발명의 다양한 목적 및 특징들이 어떻게 만족되는지 이해될 것이다. 본 발명에 의한 분석법은 단순하고, 신속하며, 병원 또는 집에서도 용이하게 사용되도록 조정된다. 본 발명의 중요한 일 특징에 따르면, 본 발명에 따른 분석법은 매우 높은 민감도를 가지며, 질 트리코모나스에 감염된 환자들 중 거의 모두를 양성이라고 판정한다 (실시예 4 및 실시예 5를 참고한다). 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 본 발명에 의한 분석법의 일 실시예의 동작 특성은 복합 참고 표준 샘플 집합 (composite reference standard sample set, CRS)으로부터 결정될 수 있다. 이러한 샘플의 집합은 질염 증상을 나타내는 206 명의 환자들로부터 채취된 질 시료의 집합이다. 이러한 시료들은 습식 마운트 현미경법 및 본 발명에 의한 장치에 의하여 질 트리코모나스가 존재하는지 여부에 대해서 테스트되 었다. 두 분석법 간에 불일치가 발생하면 배양법 (상표명 In-pouch-Tv 배양법, BioMed, Inc, San Jose, CA)을 이용하여 어떤 것이 옳은지 결정되었다.
본 발명에 의한 테스트 장치 내에 구현된 분석법은 습식 마운트 방법으로 양성으로 판명된 모든 환자들 (75명) 전부를 식별하였으며, 습식 마운트 방법에 의하여 음성으로 판명된 환자들 (배양법으로 확증된 결과 131명 중 28명) 중 21%의 환자들 역시 질 트리코모나스에 감염된 것으로 판명하였다는 것이 예시된다. 본 발명에 의한 분석법의 민감도는 거의 100%인 것으로 보고된다. 본 발명의 전 특이성은 약 98%인 것으로 보고된다. 검출 프로토콜을 이용할 경우, 이렇게 높은 민감도 및 특이성을 가지는 성능은 본 출원에서 보고되기 이전에는 종래 기술에서는 예측되지 못한 것이다. 그 결과는 실시예 5에 상세히 제공된다.
더 나아가, 본 발명에 따른 분석법의 장점 및 특징은 체액 샘플로서 소변을 채택한다는 것으로써, 이에 의하여 편리하며 개인적인 샘플 채취가 가능해 지고, 남성 및 여성 모두에 대해 분석법이 적용될 수 있다는 것이다. 유사하게, 본 분석법의 면역학적 반응성을 가지는 시약은 팹 스메어 (pap smear) 테스트 또는 팹 스메어 테스트로부터의 잔액으로부터도 용이하게 적용될 수 있다는 것으로써, 그럼으로써 본 발명에 의한 분석법은 팹 스메어의 일부로서 일반적으로 수행되는 하나 또는 그 이상의 다른 분석법에 포함될 수 있다. 더 나아가, 본 분석법의 면역학적 반응성을 가지는 시약들은 샘플이 막 또는 필터 기판을 통과하여 흐르는, 플로우 스루 (flow through) 타입의 테스트들과 같은 다른 고속 테스트 포맷에도 적용될 수 있다.
후술되는 예들은 본 발명의 특징적 측면들을 설명함으로써 본 발명을 예시하고, 샘플 내의 트리코모나스 존재를 식별하고 테스트하기 위하여 사용될 수 있는 방법들에 대한 설명도 제공하며, 당업자들이 본 발명을 이해하고 실시하는 것을 보조하기 위하여 제공된다. 이러한 예들은 본 발명을 어떠한 방법으로든 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1
모노클론 항체의 정제
항-트리코모나스 모노클론 항체 (Mab)들이 Alderete에게 허여된 미국 특허번호 제4,707,442호에 설명된 바와 같은 방법으로 준비되었다. 모노클론 항-트리코모나스 항체 (Mab)들은 단백질 A-세파로즈 크로마토그래피 (protein A-Sepharose chromatography)를 이용하여 배양 상청액 또는 복수 중 하나로부터 정제되었다 (Goding, J Immunol Meth (1976) 42:17) (Pharmacia LKB). 적합한 하이브리도마로부터 생성된 복수 유체가 1.5M 글리신 및 약 8.9의 pH 값으로 조절된 3M NaCl을 포함하는 결합 버퍼를 이용하여 1:12 희석화되었다. DM116 모노클론 항-트리코모나스 항체 (Mab) 복수들은 상온에서 밤샘 결합에 의하여 투석되도록 처리되었다. 투석된 모노클론 항-트리코모나스 항체 (Mab) 복수들은 0.5 mL/분의 속도에서 결합 버퍼에 의하여 단백질 A-세파로즈 CL-4B 친화성 겔 크로마토그래피 칼럼으로부터 용출되었다. 용출 과정은 280nm에서의 각 샘플의 흡광도를 결정함에 의하여 모니터링되었고, 크로마토그래피 칼럼은 흡광도가 0.001 O.D. 이하가 될 때까지 세척되었다. 다음으로, IgG가 약 pH 4.0으로 조절된 0.1M 구연산 버퍼를 이용하여 기둥 으로부터 분리되었다. 면역글로불린의 분리는 280nm에서의 각 샘플의 흡광도를 결정함에 의하여 모니터링되었다.
실시예 2
모노클론 항체 골드 접합체의 준비
100mL의 초정수를 포함하는 플라스크가 약 80도 내지 85도까지 가열되었다. 그 후, 부드럽게 저어줌과 동시에, 1 mL의 1% AuCl (2x0.5 mL) 및 1.75mL의 1% 구연산 나트륨 (2x0.5 및 그 이후 0.75 mL의 부분 표본들)이 연속적으로 고온의 물에 추가되었다. 용액은 다시 80도 내지 85도로, 약한 황색으로부터 자주빛을 띤 검정색 (purplish black) 이후 체리 와인 (cherry wine) 색까지 색이 변할 때까지 가열된다.
유리관 내에서, 새로이 준비된 100mN의 탄산염 200마이크로 리터 (100mM)가 전술된 바와 같이 준비된 10mL의 1:1.75 골드 용액에 첨가되었다. 용액은 3초간 교반되었다. 그 이후, 300 마이크로리터의 DM116 IgG (1m/mL)가 첨가되고, 그 용액이 다시 3초간 교반되었다. 시험관은 상온에서 30분간 배양되었고, 3초간 교반하면서 100마이크로 리터의 접합체 차폐 용액이 첨가되고, 30분간 8000rpm에서 원심분리되었다. 강제 정지 장치를 사용하지 않은채 원심 분리기가 완전히 정지하도록 한다. 접합체 차폐 용액은 약 25mM의 인산 칼륨 (pH 7.4 내지 7.6), 약 5%의 소혈청 알부민 및 약 0.10%의 수크로즈를 포함한다. 상청액은 흡인제거 되어 약 300 마이크로 리터의 잔류 체적이 남도록 한다. 다음으로, 농축된 접합체가 새로운 용기에 전달되고, 그 체적이 결정되었다. 농축된 접합체는 접합체 재현탁 용액 을 첨가함으로써 10X 농도로 희석된다. 접합체 재현탁 용액은 25mM의 인산 칼륨 (pH 7.4 내지 7.6), 약 1%의 소혈청 알부민 및 약 0.10%의 수크로즈를 포함한다. 첨가되어야 할 접합체 재현탁 용액의 양은 골드 용액의 전 체적을 (10-새로운 용기에 전달된 농축 접합체의 체적)의 결과로 나누어 결정되었다. 모노클론 항체 골드 접합체는 사용될 때까지 바람직하게는 약 2도 내지 8도의 온도에서 냉장고 내에 보관될 수 있다.
실시예 3
분석 건식 스트립의 준비
A. 건식 스트립에 고정된 항체를 첨가
1 mg/mL의 토끼 항-질 트리코모나스 IgG가 밤새도록 상온에서 pH 9.6 값을 가지는 50 mM 탄산-중탄산 버퍼를 포함하는 코팅 버퍼에 대하여 투석되었다. 그러면, IgG들은 X-Y-Z 분배 플랫폼 (pispensing platform) (BIO.DOT INC.) 상에 적재되고, 기계는 1 마이크로리터/cm의 유체를 니트로셀룰로오스 막 상에 전달하도록 프로그램되었다. 그러면, 이 막은 약 3시간 동안 상온으로부터 37도 까지의 온도에서 건조되었다. 그 이후, 차폐 버퍼 (0.5% BSA, PBS 내의 4% 수크로즈)가 막 상에 분사되고, 이 막이 상온에서 밤새도록 건조되었다. 막은 수분이 없는 환경에서 약 2도 내지 8도에서 저장되었다.
B. 반응 지역에 골드 접합체 DM116 항체를 적용
유리섬유 필터 페이퍼가 골드 패드 전처리 버퍼내에 담가지는데, 이 버퍼는 0.5% (w/v) 폴리 알코올; 0.71% (w/v) 인산 이나트륨; 0.1% (v/v); 트리톤 X-100; 0.5% BSA (w/v); DDW; pH 7.4를 포함한다). 유리섬유 필터 페이퍼는 약 3시간 동안 40도 내지 50도의 오븐 내에서 건조되거나 밤새도록 공냉식으로 건조되었다. 그러면, 골드 컨주게이트 DM116은 처리된 유리섬유 필터 페이퍼 상에 적용되었고, 그 이후 상온에서 밤새도록 건조되거나 패드가 건조될 때까지 37도의 오픈 내에서 건조되었다. 패드는 수분이 없는 환경에서 약 2도 내지 8도의 온도로 저장되었다.
C. 테스트 스트립의 조립
A 단계에서 준비된 항체 코팅된 니트로셀룰로오스 막 상에 Whatman/Gelman 필터 페이퍼 (2.5cm x 30.0cm)의 스트립이 적재되어, 두 가지 물질이 상부에 1 mm 만큼 중첩되도록 하였다. 그러면, B 단계에서 준비된 골드 접합체 패드가 하부에 1 mm 만큼 중첩되도록 적재되었다. 골드 접합체 패드의 하부 1 mm는 제2 Whatman/Gelman 필터 페이퍼에 의하여 덧씌워졌다. 이 어셈블리가 점성 플라스틱 테이프 층을 덮음으로써 제자리에 보관된다. 그러면, 이 어셈블 리가 약 2 mm 너비를 가지는 미세 스트립들로 절단되고, 수분이 없는 환경에서 약 2도 내지 8도의 온도에서 보관되었다.
실시예 4
테스트 동작 및 그 결과
본 발명에 의한 테스트 스트립을 이용한 테스트 동작은 다음과 같이 수행된다.
1. 멸균 면화 면봉 (cotton swab)을 이용하여 환자의 질부 (vaginal tract)로부터 채취된 테스트 샘플들을 수집한다. 시료를 채취한 직후 가능한 빨리 면봉 을 처리한다. 그러나, 본 발명에 의한 분석법은 반드시 살아있는 유기체가 아니어도 적용될 수 있으므로, 면봉채취 샘플은 저장되고, 건조된 형태로 이동될 수 있다. 또한, 면봉채취 샘플은 추출 및 테스트 이전에 24시간 까지 약 2도 내지 8도의 온도에서 저장될 수 있다. 또는 면봉채취 샘플이 추출되고, 추출된 시료가 24시간 까지 약 2도 내지 8도의 온도에서 저장될 수 있다.
2. 면봉채취 샘플을 약 1 mL의 샘플 용해 버퍼 내에 담근다. 여기서 샘플 용해 버퍼는 0.5% 트리톤 X-100; 0.1% BSA; DDW로 구성된다. 면봉채취 샘플을 적어도 10번 이상 콘테이너의 측면에 대해서 힘을 줘서 회전시킴으로써 용액을 교반한다 (면봉이 용액 내에 잠겨 있는 동안 실시한다). 시료가 용액 내에 활발히 추출되면 테스트 결과가 획득된다. 다시 교반하기 전 1분 동안 면봉이 샘플 버퍼 내에 완전히 젖도록 잠기도록 한다. 용액을 시험관의 측면에 대고 압력을 가하고 회전시킴으로써, 면봉을 제거하는 동안에 가능한 한 많은 유체를 표현한다. 면봉을 버린다.
3. 실시예 7에서 준비된 딥스틱 (dipstick) 테스트 스트립을 혼합물 샘플 용액의 작은 병 (vial) 내에 삽입한다.
4. 10분 후에 결과를 판독한다 (어떤 양성 반응은 더 일찍 나타날 수도 있다). 만일 10분 후에도 테스트 결과가 여전히 음성인 것으로 나타난다면, 테스트 결과를 확인하기 전에 모든 배경색이 흩어져 없어지도록 다시 10 분 간 대기하는 것이 필요하다.
5. 적색 라인 (비록 색체가 균일하지 않더라도)이 나타나면 유효한 결과인 것으로 판단된다. 만일 중성 또는 높은 양성을 가지는 시료의 경우에는, 테스트 선분 뒤에 몇 개의 적색선이 보일 수 있다. 테스트 라인 및 제어 라인이 육안 구별되는 한, 그 결과는 유효하다. 결과는 다음과 같이 해석된다.
● 2개의 선분 발생 - 양성이다. 적색의 테스트 라인 및 적색 제어 라인이 나타나면, 트리코모나스 항원의 검출 결과 양성이라는 것을 나타낸다. 적색 라인은 색의 모든 쉐이드 (shade)일 수 있다는 점에 유의한다.
● 선분 1개 발생 - 음성이다. 적색 제어 라인이 발생하고 적색 테스트 라인에는 발생하지 않으면, 음성 결과를 나타낼 확률이 높다.
● 선분이 나타나지 않는다 - 테스트가 무효이다. 만일 적색 제어 라인이 나타나지 않거나 배경색이 적색 제어 라인의 판독을 불가능하게 한다면, 그 결과는 무효이다.
본 발명에 따른 분석법의 성능 특성은 복합 참고 표준 샘플 집합 (composite reference standard sample set, CRS)으로부터 결정될 수 있다. 이러한 샘플의 집합은 질염 증상을 나타내는 206 명의 환자들로부터 채취된 질 시료의 집합이다. 이러한 시료들은 습식 마운트 현미경법 및 본 발명에 의한 장치에 의하여 트리코모나스가 존재하는지 여부에 대해서 테스트되었다. 두 분석법 간에 불일치가 발생하면 배양법 (상표명 In-pouch-Tv 배양법, BioMed, Inc, San Jose, CA 사에 의하여 생산)을 이용하여 어떤 것이 옳은지 결정되었다. Alonzo 및 Pepe (1999)를 참조한다.
복합 참고 표준의 206개의 모든 샘플 가운데서, 습식 마운트법에 의하여 75 개가 양성으로 식별되고 131개는 음성으로 식별된다. 본 발명에 의한 장치는, 습식 마운트법에 의하여 양성으로 판단되었던 75개의 샘플들은 양성으로 식별하고, 습식 마운트법에 의하여 음성으로 판단되었던 101개의 샘플들은 음성으로 판단한다. 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 장치는, 습식 마운트법에 의하여 음성으로 판단된 잔여 샘플들을 질 트리코모나스가 존재하는 양성으로 식별하였다.
습식 마운트법 및 본 발명에 의한 장치 간의 불일치를 검증하기 위하여 배양법에 의하여 마운트법에 의하여 음성으로 판단된 131개의 샘플을 더 분석하였다. 습식 마운트법에 의하여 음성으로 판단되고 본 발명에 의한 분석법에 의하여 양성으로 판단된 30개의 샘플들 중 28개의 샘플들이 배양법에 의하여 양성으로 판단되고 2개가 음성으로 판단되는 것이 밝혀졌다. 또한, 습식 마운트법 및 본 발명에 의한 분석법 모두에 의하여 음성으로 판단된 101개의 샘플들은 배양법에 의하여도 역시 음성으로 판단된다는 것이 밝혀졌다. 이러한 결과는 다음 [표 1]에 정리된다.
| N=206 |
습식 마운트 (WM) |
|
| (+) | (-) | |
| XenoStrip-TvTM (+) |
75 |
30 |
| XenoStrip-TvTM (-) |
0 |
101 |
| 습식 마운트 (WM)에서 음성 샘플의 결정 (n=131) |
||
| 배양법 (c) (+) |
배양법 (c) (-) |
|
| XenoStrip-TvTM (+) |
28 |
2 |
| XenoStrip-TvTM (-) |
0 |
101 |
습식 마운트 현미경법에 대한 본 발명에 의한 분석법의 성능 비교는 다음과 같이 결정된다.
XenoStrip-TvTM의 민감도 = X (+)WM (+) + X (+)WM (-)C (+)/X (+)WM (+) + X (+)WM (-)C (+) + X (-)WM (+) + X (-)WM (-)C (+)
=75+28/75+28+0+0
=103-103
=100.0% (C1 100%-100%)
XenoStrip-TvTM의 특이성 = X (-)WM (-)C (-) / X (-)WM (-)C (-) + X (+)WM (-)C (-)
=101/101+2
=101/103
=98.1% (C1 95.4%-100%)
NPV XenoStrip-TvTM = X (-)WM (-)C (-)/X (-)WM (-)C (-) + X (-)WM (+) + X (-)WM (-)C (+)
=101/101+0+0
=101/101
1.000 (C1 1.000-1.000)
PPV XenoStrip-TvTM = X (+)WM (+) + X (+)WM (-)C (+) / X (+)WM (+) + X (+)WM (-)C (+) + X (+)WM (-)C (-)
=75+28/75+28+2
=103/105
=0.981 (C1 0.955-1.000)
본 발명에 의한 분석법에 사용된 항체 시약은 정상 질 플로라, 다른 성관계에 의하여 전염되는 병원체 (질 가르덴네렐라 (Gardenerella vaginalis 및 칸드디종 (Candid species)를 포함하는), 및 감염되지 않는 일반 개체로부터 채취된 비뇨생식기 샘플과는 반응하지 않는 것으로 알려졌다.
본 발명에 의한 항체 장치는 10개체 내지 1000개체 정도로부터 추출된 질 면봉채취에서 유도된 물질 내에 존재하는 용해성 항원을 검출했는데, 이러한 농도는 환자의 배설물에서 기대되는 것보다 낮은 농도이다.
습식 마운트 현미경법을 이용한 분석 결과는 배양법과 비교되고, 이러한 방법들의 성능은 각각 습식 마운트법에 대한 배양법의 성능을 나타내는 표 2 및 배양법에 대한 습식 마운트법의 성능을 나타내는 표 3에 목록화되었다.
| N=206 |
배양법 |
|
| (+) | (-) | |
| 습식 마운트 (WM) (+) | 66 | 28 |
| 습식 마운트 (WM) (-) | 28 | 103 |
| 습식 마운트법 대 배양법 성능 |
||
| 민감도 | 70.2% | |
| 특이성 (specificity) | 95.4% | |
| N=206 |
배양법 |
|
| (+) | (-) | |
| 배양법 (c) (+) | 66 | 28 |
| 습식 마운트 (WM) (-) | 28 | 103 |
| 배양법 대 습식 마운트법 성능 |
||
| 민감도 | 88.0% | |
| 특이성 | 78.6% | |
표 4는 본 발명에 따른 분석법의 성능을 배양법 및 습식 마운트 현미경법과 비교한다.
| N=206 |
민감도 |
특이성 |
PPV |
NPV |
정확도 |
| 배양법 | 88.0% | 78.6% | 0.702 | 0.920 | 82.0% |
| 습식 마운트법 | 70.2% | 92.0% | 0.880 | 0.786 | 82.0% |
| XenoStrip-TvTM 법 | 100.0% | 98.1% | 0.981 | 1.000 | 99.0% |
|
XenoStrip-Tv TM 법의 수치는 CRS이다. 습식 마운트법에 대한 배양법, 및 배양법에 대한 습식 마운트법 |
|||||
실시예 5: 추가 시험
본 발명에 의한 분석법 및 장치의 평가는 3곳의 내과 사무실에서 수행되었다. 각 장소에서의 테스트는 광범위한 교육적 배경을 가지고 있는 인력에 의하여 수행되었다. 각 장소에서는 음성 샘플들 (3), 낮은 양성 샘플들 (3), 중간 양성인 샘플들 (3) 및 높은 양성 샘플들 (3)의 무작위로 코드화된 패널을 테스트했다. 획득된 테스트 결과는 기대한 결과와 100% 일치했다.
본 발명의 바람직한 실시예가 예시되고 설명되었으나, 본 발명의 사상 및 기술적 범위를 벗어나지 않은 채 다양한 변화를 실시예에 가하는 것이 가능하다는 것이 이해될 것이다.
본 발명은 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 신속하고, 민감하고, 정확한 진단 테스트를 제공하므로, 효과적인 진단 및 치료가 가능하도록 한다. 본 발명에 의한 진단 테스트는, 샘플이 살아있는 유기체를 포함하는지 여부에 관계없이, 트리코모나스를 포함한다고 의심되는 다양한 샘플의 사용에 적합하고, 특히, 소변 (남성 및 여성 모두에 적용하기 위한)과 질 면봉채취 샘플 (vaginal swab sample)에서 의 검출이 모두 가능하게 하는 것은 물론, 감염된 개인들에게 높은 신뢰성있는 결과로서, 예를 들면 양성 결과를 높은 신뢰도로 제공하여야 한다.
Claims (25)
- 인간 개체 내의 질 트리코모나스(Trichomonas vaginalis) 감염 검출 방법으로서, 상기 방법은a) 개체가 질 트리코모나스에 감염되었을 경우 항원/항체 복합체가 형성되는 조건 하에서, 건식-스트립(dry-strip)의 첫 번째 말단부에 있는 샘플 적용 지역에 상기 개체의 감염 부위로부터의 샘플을 적용하는 단계로서, 상기 샘플은 모세 현상에 의해 상기 건식-스트립을 따라 두 번째 말단부로 이동함으로써 질 트리코모나스 아드헤진 단백질 에피토프에 대해 특이성이 있는 비고정 표지 단일클론 항체를 포함하는 반응 지역을 먼저 통과하고 그런 다음 질 트리코모나스 아드헤진 에피토프에 대해 특이성이 있는 고정 단일클론 항체를 포함하는 검출 지역을 통과하고, 상기 비고정 표지 단일클론 항체와 상기 고정 단일클론 항체는 상기 샘플의 적용 전에 상기 스트립 상에 존재하고 상기 비고정 표지 단일클론 항체와 상기 고정 단일클론 항체는 동일한 질 트리코모나스 아드헤진 단백질에 있는 서로 다른 에피토프에 대해 특이성이 있는 단계; 및b) 상기 복합체의 존재를 검출함으로써, 상기 복합체의 존재는 상기 개체 내의 질 트리코모나스 감염을 검출하는 단계를 포함하는 것인, 인간 개체 내의 질 트리코모나스 감염 검출 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비고정 표지 단일클론 항체와 상기 고정 단일클론 항체 각각은 AP65 아드헤진 단백질, AP51 아드헤진 단백질, AP33 아드헤진 단백질, 및 AP23 아드헤진 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 아드헤진 단백질의 에피토프에 대해 특이성이 있는 것인, 인간 개체 내의 질 트리코모나스 감염 검출 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비고정 표지 단일클론 항체는 하이브리도마 세포 주 DM116에 의해 생성되는 것인, 인간 개체 내의 질 트리코모나스 감염 검출 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 고정 단일클론 항체는 하이브리도마 세포 주 C55에 의해 생성되는 것인, 인간 개체 내의 질 트리코모나스 감염 검출 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 여성 개체로부터 추출한 질 면봉채취 샘플(vaginal swab sample)에서의 80% 이상의 신뢰도 및 남성 또는 여성 개체로부터 추출한 소변 샘플에서 40% 이상의 신뢰도로 질 샘플로부터 질 트리코모나스 감염을 검출하는데 효과적인 것인, 인간 개체 내의 질 트리코모나스 감염 검출 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플은 팹 스메어(pap smear)인 것인, 인간 개체 내의 질 트리코모나스 감염 검출 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플은 소변인 것인, 인간 개체 내의 질 트리코모나스 감염 검출 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플은 질 면봉채취 샘플인 것인, 인간 개체 내의 질 트리코모나스 감염 검출 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플은 자궁경부목관 면봉채취 샘플인 것인, 인간 개체 내의 질 트리코모나스 감염 검출 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 개체는 남성인 것인, 인간 개체 내의 질 트리코모나스 감염 검출 방법.
- 인간 개체 내의 질 트리코모나스 감염 검출용 키트로서, 스트립 상에 적용된 유체를 상기 스트립 내에서 모세 현상에 의해 위킹(wicking)할 수 있으며, 상향(첫 번째 말단부)에서 하향(두 번째 말단부) 방향으로 하기의 순서로1) 샘플-적용 지역,2) 반응 지역, 및3) 검출 지역을 포함하는 건식-스트립을 포함하고,상기 반응 지역은 이동성 아드헤진 단백질/항체 복합체를 형성하는데 효과적인, 질 트리코모나스 아드헤진 단백질의 에피토프에 대해 특이성이 있는 비고정 표지 단일클론 항체를 포함하고 상기 검출 지역은 상기 복합체 내의 질 트리코모나스 아드헤진 단백질의 에피토프에 대해 특이성이 있는 고정 단일클론 항체를 포함하고, 상기 비고정 표지 단일클론 항체와 상기 고정 단일클론 항체는 샘플의 적용 전에 상기 스트립 상에 존재하고, 상기 비고정 표지 단일클론 항체와 상기 고정 단일클론 항체는 동일한 질 트리코모나스 아드헤진 단백질에 있는 서로 다른 에피토프에 대해 특이성이 있고, 감염 부위로부터의 샘플을 상기 첫 번째 말단부에 있는 상기 샘플-적용 지역에 적용한 후에,(i) 샘플은 상기 스트립 상에서 하향 방향으로 상기 반응 지역으로 이동하고,(ii) 상기 샘플 내의 아드헤진 단백질은 상기 반응 지역에 이미 존재하는 상기 비고정 표지 단일클론 항체와 반응하여, 이동성 표지 아드헤진 단백질/항체 복합체를 형성하고,(iii) 상기 이동성 표지 아드헤진 단백질/항체 복합체는 상기 두 번째 말단부에 있는 상기 검출 지역을 향해 이동하고,(iv) 상기 이동성 표지 아드헤진 단백질/항체 복합체는 상기 검출 지역에 이미 존재하는 고정 단일클론 항체와 결합하여, 상기 복합체를 상기 검출 지역에 고정화시키는 것인, 인간 개체 내의 질 트리코모나스 감염 검출용 키트.
- 제11항에 있어서, 상기 비고정 표지 단일클론 항체 및 상기 고정 단일클론 항체 각각은 AP65 아드헤진 단백질, AP51 아드헤진 단백질, AP33 아드헤진 단백질, 및 AP23 아드헤진 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 아드헤진 단백질의 에피토프에 대해 특이성이 있는 것인, 인간 개체 내의 질 트리코모나스 감염 검출용 키트.
- 제11항에 있어서, 상기 비고정 표지 단일클론 항체는 하이브리도마 세포주 DM116에 의해 생성되는 것인, 인간 개체 내의 질 트리코모나스 감염 검출용 키트.
- 제11항에 있어서, 상기 고정 단일클론 항체는 하이브리도마 세포주 C55에 의해 생성되는 것인, 인간 개체 내의 질 트리코모나스 감염 검출용 키트.
- 인간 개체로부터 추출한 소변 샘플에서 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 방법으로서,a) 개체가 질 트리코모나스에 감염되었을 경우 항원/항체 복합체가 형성되는 조건 하에서, 질 트리코모나스 아드헤진 단백질에 대해 특이성이 있는 제1 항체와 상기 샘플을 접촉시키는 단계; 및b) 질 트리코모나스 아드헤진 단백질에 대한 제2 항체와, 상기 (a)의 샘플을 접촉시켜, 상기 항원/항체 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것인, 인간 개체로부터 추출한 소변 샘플에서 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체는 AP65 아드헤진 단백질, AP51 아드헤진 단백질, AP33 아드헤진 단백질, 및 AP23 아드헤진 단백질, 및 그들의 면역학적 반응성을 가지는 단편들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아드헤진 단백질에 대해 특이성이 있는 것인, 인간 개체로부터 추출한 소변 샘플에서 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 아드헤진 단백질은 AP65 아드헤진 단백질인 것인, 인간 개체로부터 추출한 소변 샘플에서 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 제1 항체는 항-AP65 항체인 것인, 인간 개체로부터 추출한 소변 샘플에서 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 제1 항체 및 제2 항체는 하이브리도마 세포 주 DM116에 의해 생성된 항체 및 하이브리도마 세포 주 C55에 의해 생성된 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 인간 개체로부터 추출한 소변 샘플에서 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 제1 항체는 검출가능하도록 표지된 것인, 인간 개체로부터 추출한 소변 샘플에서 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 제2 항체는 검출가능하도록 표지된 것인, 인간 개체로부터 추출한 소변 샘플에서 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 제1 항체는 폴리클론 항체이고 상기 제2 항체는 단일클론 항체인 것인, 인간 개체로부터 추출한 소변 샘플에서 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 제1 항체는 단일클론 항체이고 상기 제2 항체는 폴리클론 항체인 것인, 인간 개체로부터 추출한 소변 샘플에서 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 제1 항체는 폴리클론 항체이고 상기 제2 항체는 폴리클론 항체인 것인, 인간 개체로부터 추출한 소변 샘플에서 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 제1 항체는 단일클론 항체이고 상기 제2 항체는 단일클론 항체인 것인, 인간 개체로부터 추출한 소변 샘플에서 질 트리코모나스 감염을 검출하기 위한 방법.
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