KR20130140477A - 소바이러스성 설사병 바이러스의 탐지용 항체, 이를 이용한 항원 검출 방법, 및 이를 포함하는 탐지키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus)의 항원결정부위(epitope), 이를 포함하는 백신 조성물, 이를 이용하여 제조된 항체 또는 이의 단편, 상기 항체 또는 이의 단편을 포함하는 소 바이러스성 설사병 바이러스 항원 검출용 키트 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병 바이러스 항원 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 소에서 혈액내 BVDV의 감염 유무를 신속하게 측정할수 있을 뿐만 아니라 야외에서도 검사가 가능하므로 매우 유용하다. 특히 BVDV 항원에 대한 검출 키트는 혈청학적 방법을 통한 항체 감별법보다 감염 초기에 진단이 가능하므로 BVDV의 확산을 차단하는데 도움이 될 것으로 생각되며, 또한 이를 통해 소 사육농가의 경제적 이익 증대에 기여할 수 있다.

Description

소바이러스성 설사병 바이러스의 탐지용 항체, 이를 이용한 항원 검출 방법, 및 이를 포함하는 탐지키트{ANTIBODY FOR DETECTING OF BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS(BVDV), BVDV ANTIGEN DETECTING METHOD AND TEST KIT USING THEREOF}

본 발명은 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus)의 항원결정부위(epitope), 이를 포함하는 백신 조성물, 이를 이용하여 제조된 항체 또는 이의 단편, 상기 항체 또는 이의 단편을 포함하는 소 바이러스성 설사병 바이러스 항원 검출용 키트 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병 바이러스 항원 검출 방법에 관한 것이다.

BVDV(Bovine Viral Diarrhea Virus)는 플라비비리대(Flaviviridae)과의 페스티바이러스(Pestivirus)속에 속하며 돼지열병바이러스(CSFV)와 양의 보더병바이러스(BDV)등이 이 바이러스에 포함된다. BVDV는 감염된 소에서 다른 소에게 전염되거나, 임신 중 감염시기에 따라 감염 모우로부터 태어난 송아지가 지속적으로 바이러스를 배출하여 다른 소에게 전염시키는 매개체(carrier)가 될 수 있다(Nettleton et al., 1995. Bri Vet J 151:615-642). BVDV는 약 12,500개의 뉴클레오티드(nucleotide)를 갖는 양의 방향(positive-sense), 단일가닥(single-stranded) RNA로 구성되어 있으며, 하나의 전사해독틀(open reading frame, ORF)을 가지고 있다(Collett et al., 1988. Virology 63:191-199, Deng et al., 1992. Virology 191:867-879). BVDV는 5’-UTR(untranslated region)의 유전자 분석 결과에 따라 BVDV1과 BVDV2의 유전자형(genotype)으로 구분되며 BVDV1은 BVDV1a와 BVDV1b로 세분된다. 그리고 감염세포에서 세포변성효과(cytopathic effect; CPE)를 나타내는 세포변성 BVDV(cytopathic BVDV)(cp BVDV)와 CPE를 나타내지 않는 비세포변성 BVDV(non-cytopathic BVDV) (ncp BVDV)로 구분하고 있으며 대부분의 야외분리주는 ncp BVDV로 알려져 있다(Ridpath et al., 1998. Mol Cell Probes 12:101-106, Van et al., 1997. Virology 142:2049-2057).

BVDV는 전 세계적으로 산재된 소 바이러스성 설사병의 원인체로서, 설사에 의한 급성폐사 이외에도 백혈구 감소증, 소화기점막의 충혈, 궤양 형성, 호흡기 병변, 임신우의 유산 또는 사산, 면역부전등이 단독 및 복합된 형태로 나타나며, 발병시 사육농가에 엄청난 경제적 피해를 끼치고 있다.

BVDV는 증상이 다양하므로 임상증상만으로는 완전한 진단이 어렵다. 실험실 진단방법으로는 혈청학적 진단방법인 중화시험(VN), 혈청효소면역법(Ab-ELISA), 중합효소연쇄반응법(PCR)등 있다. 진단방법 중 지속감염우를 검사하기 위해서는 검사시료를 혈청 및 귀피부 조각으로 최소 3주간격으로 BVDV 항원과 항체(항체는 모체이행항체 구분)를 검출하며 항원은 2회 양성이 확인되고 항체가 없으면 지속감염우로 지속감염우로 판단하거나 귀피부 조각을 면역조직염색을 하여 진피의 염색여부로 지속감염우 여부를 판단 할 수 있다. 그러나 이러한 방법들은 조직배양을 해야하는 번거로움과 검사기간이 오래 걸리며, 분석을 위한 전문적인 지식이나 고가의 장비를 필요로 하는 문제점이 있다.

이에 본 발명은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus)에 대한 중화 항체를 만들어 내는 구조 단백질로 알려진 gp53/E2 단백질이 포함하고 있는 아미노산 서열 중 면역원성이 특히 높은 아미노산 서열을 밝혀 펩타이드를 합성하고 이에 대한 항체를 제조하여, 이를 이용하여 소에서 BVDV를 현장에서 빠르고 간편하게 진단할 수 있는 BVDV 항원 검출 키트와 이를 이용한 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 국내 소에서 분리된3가지 유형의 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus) 항원(BVDV1a, BVDV1b, BVDV2a)을 특이적으로 진단할수 있는 방법을 확립하고자 하였으며, 구체적으로 상기 3가지 유형의 BVDV가 포함하고 있는 gp53/E2(이하 ‘E2’라 함) 단백질에 대한 뉴클레오타이드 시퀀스를 확보하고, 이들 각 유형의 E2시퀀스에 공통으로 존재하는 유효 항원결정부위(epitope) 서열을 탐색하였다. 이 후 상기 서열에 의해 암호화되며 면역원성이 특히 높은 펩타이드를 합성하여 이에 대한 항체를 제작하였으며, 이를 가지고 최종적으로 BVDV신속진단키트를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다. 이에 따라, 종래의 혈청검사법이나 PCR을 대체하여 현장에서 신속하고 간편하게 소의 BVDV 를 검출 내지 진단할수 있는 방법을 제시하게 되었다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 명세서에 사용되는 '항원결정부위(epitope) 폴리펩타이드 분자'는 본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 폴리펩타이드 분자의 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus)(이하 ‘BVDV’라 함) 항원형 1형(1a형 또는 1b형) 또는 2형 단백질의 항원결정부위로서의 용도의 물질적 표현이다.

본 발명의 바람직한 일 구현예는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하여 연속적인 아미노산 10 내지 40개로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는, BVDV, 특히 BVDV의 E2 단백질의 항원결정부위(epitope)인 폴리펩타이드 분자를 제공한다.

보다 바람직하게는 상기 폴리펩타이드 분자는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 필수적으로 포함하는 것으로서, 상기 서열번호 8의 아미노산 서열만으로 이루어지거나 상기 서열의 N 말단 및/또는 C 말단에 10 내지 30개의 부가적인 아미노산 서열을 더욱 포함하여 이루어지는 것일 수 있다.

상기 항원결정부위인 폴리펩타이드 분자는 1형 또는 2형 단백질에 대한 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 세가지 유형의 소 바이러스성 설사병 바이러스, 즉, BVDV의 1a형, 1b형, 및 2a형 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항원결정부위일 수 있다.

한편, 상기 폴리펩타이드 분자는 소 바이러스성 설사병 바이러스, 바람직하게는 소 바이러스성 설사병 바이러스 항원형 1a형, 1b형, 및 2a형 모두에 공통적으로 존재하는 특이적인 유효 항원결정부위로서, 상기 3가지 BVDV 항원형 유형에 특이적인 항체를 효과적으로 생성시키므로, 상기 항원결정부위는 상기 세 가지 유형 중 어느 1종 이상의 BVDV에 대한 백신으로서도 유용하다.

이에, 본 발명의 바람직한 다른 일 구현예는 상기 항원결정부위 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus)에 대한 백신 조성물을 제공한다.

또한 본 발명의 바람직한 다른 일 구현예는 상기 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.

상기 항체는 상술한 바와 같은 폴리펩타이드 분자를 항원으로 하여 통상의 방법으로 제조된 것일 수 있으며, 예컨대 토끼 또는 마우스 등과 같이 당 분야에서 통상적으로 사용되는 동물에 주입하여 제조된 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않고 기타 당 분야에 널리 알려진 공지의 방법으로 제조된 것일 수 있다.

상기 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있으며, 또는 이들의 단편일 수 있다. 제조된 단클론 및 다클론 항체는 세 가지 유형의 BVDV를 신속하고 정확하게 확인할 수 있는 도구로써 사용이 가능하여 BVDV 진단 등에 응용이 가능한 중요한 기능을 가지고 있다.

상기 항체는 예컨대, 상술한 폴리펩타이드 분자를 주입한 마우스로부터 통상적인 방법으로 얻어진 하이브리도마 세포에 의하여 통상적인 방법으로 생산된 단클론 항체일 수 있다. 즉 (a) 상기 항원결정부위 폴리펩타이드 분자 또는 상기 항원결정부위를 발현하는 세포를 마우스 또는 토끼 등의 동물에 주입하여 면역화시키는 단계, (b) 상기 항원결정부위에 특이적인 항체를 생산하는 비장세포를 수득하는 단계, 및 (c) 상기 비장세포를 골수종세포와 융합시켜, 상기 특이적 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선별하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.

상기 항체 생산주는 생체외(in vitro)에서 배양하거나, 생체내 주입하여 항체를 분리할 수 있다. 일례로, 마우스의 복강내에 상기 항체 생산주를 삽입하고 생산되는 항체를 복수로부터 분리, 정제할 수 있다. 항체의 분리 및 정제는 배양 상층액 또는 복수를 이온교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52 등), 항 면역글로불린 칼럼 또는 프로테인 A 컬럼 등의 친화성 크로마토그래피를 이용하여 실시할 수 있다.

또는 상기 항체는 상술한 폴리펩타이드 분자를 항원으로 하여 실험 동물에 통상의 방법으로 면역 주사하여 생산된 다클론 항체일 수 있다.

이에 본 발명의 바람직한 또 다른 일 구현예는 상기 항체 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus) 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, ‘치료’란 증상의 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장, 기타 다른 이로운 치료 결과를 모두 포함하는 의미로 사용된다.

상기 BVDV 감염 예방 및/또는 치료용 조성물, 및 백신 조성물은 통상적인 경로, 예컨대, 혈관(정맥) 내 투여, 피하 투여, 복막 투여 등으로 투여 가능하지만 이에 제한되는 것은 아니며, 통상적으로 정해진 용량으로 투여 가능하다. 또한 상기 조성물들은 통상적으로 사용되는 부형제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 조성물의 투여 경로, 투여량, 첨가제 등은 관련 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 결정할 수 있는 사항이다.

한편, 상기와 같이 얻어진 항체는 BVDV 항원형 1a형, 1b형, 및 2a형에 공통적으로 존재하는 특이적인 항원결정부위를 인식하므로, 이를 이용하여 BVDV 항원을 검출할 수 있다.

따라서, 본 발명의 바람직한 다른 일 구현예는 상기 항체 또는 이의 단편을 포함하는 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus) 항원 검출용 키트를 제공한다. 상기 키트는 바람직하게는 상기 항체 또는 이의 단편이 검사선으로서 흡착된 멤브레인을 포함하는 것일 수 있다.

또한 본 발명의 바람직한 다른 일 구현예는 상기 키트를 사용하여 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus) 항원을 검출하는 방법을 제공한다.

항체를 이용한 검출법은 분자생물학적 분석법의 한계를 극복하고 빠르고 간편하며 상대적으로 낮은 수준의 정도 관리가 필요한 검출법이라고 할 수 있다. 항체를 사용하여 새로운 BVDV 진단기법을 개발하기 위해서는 민감하고 특이적인 단클론 및 다클론 항체가 반드시 필요하며 기반이라고 할 수 있다. 그러므로 다양한 유형의 BVDV와 반응하는 항체를 개발하는 것이 면역학적 분석방법의 핵심이다. 나아가 이러한 BVDV와 반응하는 특이적인 단클론 및 다클론 항체의 개발은 진단법뿐 만이 아니라 바이러스의 전사, 복제 등의 연구에 사용될 수 있는 중요한 연구재료로 사용이 가능하다.

상기 키트는 바람직하게는 포함된 항체 또는 이의 단편과, 이에 적용될 검체 중의 항원(항원결정부위)과의 항원-항체반응을 이용하여 BVDV를 탐지하는 면역키트일 수 있으며, 또한 바람직하게는 효소면역 측정법 키트(ELISA), 블롯팅 키트(Blotting), 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트 또는 면역 스트립 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 키트는 추가로 상기 항체와 검체 내 항원간 혼성화되는 반응을 탐지하기 위한 검출 시약을 포함할 수 있으며, 검출시약은 검사하고자 하는 표적물질(analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지 시약(labeled reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성 성분이 구비된다.

상기 표지 시약 즉, 표지된 검출시약은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있는 것을 사용할 수 있으며, 상기 표지는 예컨대 촉매, 효소(예를 들어, 포스파타제, 퍼옥시다제 등, 보다 구체적인 예로는 효소 기질과 결합하여 함께 사용되는 염기성 포스퍼타제와 양고추 퍼옥시다제 등), 효소기질(예를 들어, 니트로블루테트라졸리움, 3,5',5,5'-테트라니트로벤지딘, 4-메톡시1나프톨, 4클로로1나프톨, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트, 화학발광 효소기질로는 디옥세탄, 및 유도페와 이들의 유사체), 형광화합물(예를 들면, 플로우레세인(fluorescein), 피코빌리프로틴(phycobiliprotein), 로다민(rhodamine)등과 이들 유도체 및 유사체), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color Indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color Indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

대조시약에 포함될 수 있는 표지 시약은 위 검출시약에서의 표지를 동일하게 적용할 수 있다.

보조적 특이결합부재의 예로는 특별한 한정을 요하는 것은 아니나, 예를 들면, 아비딘, 바이오틴, FITC, 항FITC 항체, 마우스 면역 글로불린, 항 마우스 면역 글로불린항체에서 선택되는 1종이 될 수 있다.

본 발명에서 검체는 바람직하게는 진단 대상 동물의 체액 또는 분비물이 될 수 있으며, 예컨대 소의 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 조직액 등, 또는 체외로 분비되는 분비물인 소변, 눈물, 침, 젖, 구토물, 및 분변 등을 포함하고 바람직하게는 혈액이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따른 검출 키트의 예로서, 편의상 하나의 분석 스트립을 내장하고 있는 진단키트의 분해 사시도를 나타낸 도 1의 면역분석장치(1)를 기준으로 하여 본 발명의 일 구현예에 따른 진단키트 및 분석 스트립의 구조를 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 기재된 사항들 외에도 본 발명자들의 등록특허 제10-1069818호(면역분석장치)를 참조할 수 있다.

본 발명의 검출 키트는 바람직하게는 검체를 점적하여 전개시키기 위한 검체 패드(5); 골드 입자에 접합되어 상기 검체 내 존재하는 BVDV 항원과 일차 항원-항체 반응을 수행하기 위한 BVDV 항체-골드 컨쥬게이트가 흡착된 컨쥬게이션 패드(6); 이차 항원-항체 반응을 수행하여 검출 결과를 나타내기 위한 부분으로서 상기 BVDV에 대한 항체, 즉 BVDV 감염시 가장 높은 수준의 중화 항체를 생성하는 E2 항원, 바람직하게는 본 발명의 E2 항원결정부위인 폴리펩타이드 분자에 대한 항체, 바람직하게는 다클론 항체가 고정된 검사선(7)을 갖는 멤브레인(9); 및 검체 전개액을 흡수하는 흡수 패드(10)를 포함하여 이루어진 분석 스트립(2)을 하나 이상 포함하는 면역 스트립 형태일 수 있으며, 상기 분석 스트립은 바람직하게는 단변의 폭과 장변의 길이를 갖는 형태일 수 있다.

상기 일차 항원-항체 반응을 수행하기 위한 BVDV 항체는 특별히 제한되지 않고 다양한 공지의 항체를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 세 가지 BVDV 항원형 중 어느 1종에 대한 단클론 항체를 사용할 수 있다.

상기 멤브레인은 바람직하게는 검사선 외에도, 키트의 정상동작여부를 판단하고 검사선과의 비교를 통해 질병 분석의 기준이 되기 위한 대조선(8)을 또한 포함할 수 있다. 대조선으로는 BVDV와 교차 반응이 없는 것이라면 특별한 제한되지 않고 사용 가능하며 예컨대 항-마우스 IgG 항체가 대조선으로서 추가적으로 함유될 수 있다.

상기 분석 스트립의 제조에 사용할 수 있는 멤브레인은 통상의 진단 스트립의 재료로 사용되는 것들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체에서 선택되는 1종이 될 수 있다.

또한 바람직하게는 상기 키트는 상기 분석 스트립의 일면을 지지하는 하부 케이스(3); 및 상기 하부 케이스에 결합되어 상기 분석 스트립의 다른 일면을 덮으며, 상기 검체 패드에 대응하여 형성되는 검체 투입구(11)와, 상기 멤브레인에 대응하여 형성되어 검사선과 대조선의 반응 결과를 관찰하기 위한 결과 표시창(12) 및 상기 흡수 패드에 대응하는 문자 표시구를 포함하는 상부 케이스(4)를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

한편, 분석 스트립(2)은 검체 패드(5), 컨쥬게이션 패드(금 접합체 처리 패드)(6), 멤브레인(9), 및 흡수패드(10)가 각각 중첩되어 결합된 형태, 즉 컨쥬게이션 패드 및 상기 컨쥬게이션 패드 상부에 검체 패드를 중첩하여 스트립(strip) 형태의 멤브레인의 한쪽 끝 상부에 덮고 반대 쪽 끝 상부에는 흡수 패드를 덮고, 멤브레인의 하부에는 지지용 라미네이션 접착카드(Backing plate)를 부착하여 제조될 수 있다. 상기 컨쥬게이션 패드(6)는 또한 대조선에서의 반응을 나타내기 위해 마우스 IgG가 흡착된 골드입자를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일 구현예에 따른 BVDV 항원 검출 방법은 검체 샘플, 즉 소의 혈액, 혈장, 혈청, 림프액, 조직액, 소변, 눈물, 침, 젖, 구토물, 또는 분변 내, BVDV 항원, 바람직하게는 BVDV 항원형 1a형, 1b형, 및 2a형으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 검출하는 것일 수 있다.

상기 방법은 샌드위치법(sandwich assay) 또는 경쟁법 (competition assay)을 모두 포함하며, 바람직하게는 컨쥬게이션 패드 내 BVDV 항체, 바람직하게는 단클론항체-골드 컨쥬게이트를 고정하고, 동물의 혈청으로부터 얻은 검체를 상기 컨쥬게이션 패드 내 항체와 1차 항원-항체 반응을 시킨 후에, 다시 검사선에서 본 발명의 일 구현예에 따른 항체와 2차 항원-항체 반응을 시키는 방법에 의하여 수행되는 것일 수 있다.

바람직하게는 (1) 검체를 분석 스트립의 점적영역에 일정량 투입하는 단계; (2) 소정의 표지가 구비된 항체-골드 컨쥬게이트와 상기 검체 중의 분석물과 1차 항원-항체반응을 시켜 복합체를 형성하는 단계; (3) 상기 복합체를 멤브레인에 전개하는 단계; 및 (4) 상기 멤브레인 상의 소정 영역에 상술한 본 발명의 일 구현예에 따른 폴리펩타이드 분자로부터 면역반응을 통해 얻어질 수 있는 항체 또는 합텐 중에서 선택되는 적어도 하나 이상과 2차 항원-항체 반응을 수행하여 이에 따른 외관 변화를 관찰함으로써 검체 내 BVDV 항원의 유무를 판단하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 키트를 사용하여 BVDV 항원을 검출하는 원리를 도 1, 도 7 및 도 8을 참조하여 개략적으로 설명하면 다음과 같다.

면역분석장치(1)의 검체 투입구(11)에 진단 대상동물로부터 얻은 검체(예컨대 전혈, 혈청, 혈장 등의 혈액)를 적당량(예컨대, 40㎕ (1 drop)) 넣고, 검체 전개용액을 추가적으로 적하(40㎕ (1 drop))한다.

점적 후, 상기 검체 샘플은 BVDV 항체(E2 항체)-골드 콘쥬게이트가 흡착된 콘쥬게이션 패드(6)에서 일차 항원-항체 반응후 모세관 현상에 의해서 니트로셀룰로즈 멤브레인(9)을 통하여 본 발명의 일 구현예에 따른 BVDV 항체(7)가 고착된 곳으로 이동하게 되며, 동일한 방식으로 콘쥬게이션 패드(6)에 흡착된 항 마우스 IgG-골드 콘쥬게이트 역시 니트로셀룰로스 멤브레인(9)을 통하여 흡수패드(10) 방향으로 이동하게 된다.

검체 내 BVDV 항원이 존재하면, 콘쥬게이션 패드(6) 상에서 E2 항체-골드 콘쥬게이트와 일차 항원-항체 반응후 니트로셀룰로즈 멤브레인(9)을 이동하는 과정에 본 발명의 일 구현예에 따른 항체가 고착된 검사선(7)에서 이차 항원-항체 반응을 일으키게되고, 이때 일차 항체에 감작된 골드 입자(E2 항체-골드 콘쥬게이트)에 의하여 특유의 붉은색 밴드를 나타내게 된다. 이에 따라, 소 혈액내의 항원 존재 유무에 따른 양성(항원 유) 또는 음성(항원 무)의 판정을 할 수 있다. 한편 대조선(8) 위치에는 항-마우스 IgG를 흡착시켜 마우스 IgG가 흡착된 골드입자가 검체 중의 바이러스 항원의 존재여부에 관계없이 항상 반응하여 붉은색 밴드를 나타내게 한다.

상기 전개용액은 특별히 제한되지 않고 당업계에 알려진 것을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 pH 7 내지 8의 완충용액을 사용할 수 있으며, 예컨대 pH 7.4의 인산염 완충용액(PBS), 0.5% TW-20, 50mM KCl, 300mM NaCl, 0.1% NaN₃이 혼합된 용액을 사용할 수 있다.

상기 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 검출 키트를 이용하면 소에서 혈액내 BVDV의 감염 유무를 신속하게 측정할수 있을 뿐만 아니라 야외에서도 검사가 가능하므로 매우 유용하다. 특히 BVDV 항원에 대한 검출 키트는, 혈청학적 방법을 통한 항체 감별법보다 감염 초기에 진단이 가능하므로 BVDV의 확산을 차단하는데 도움이 될 것으로 생각되며, 또한 이를 통해 소 사육농가의 경제적 이익 증대에 기여 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 BVDV 검출용 키트의 분해 사시도를 나타낸 것이다.
도 2 내지 도 4는 본 발명의 실시예 2에 따른 항체 생성 여부를 ELISA를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다(도 2: 1차 면역, 도 3: 2차 면역, 도 4: 3차 면역).
도 5는 본 발명의 실시예 2의 항체의 BVDV에 대한 특이적 반응 여부를 BVDV E2 단클론 항체 B20.24 (Jenobiotech, Korea)와 비교하여 나타낸 것이다.
도 6은 웨스턴 블롯(Western blot)을 통해 본 발명의 실시예 2의 항체 및 BVDV E2 단클론 항체 B20.24의 항원-항체 반응을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 BVDV 항원 진단 스트립의 제조예를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 8에 따라 제조된 BVDV 항원 진단 스트립의 효능을 시험한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 1에 따라 얻어진 세 가지 유형의 BVDV 항원에 공통적으로 존재하는 항원결정부위를 알아내기 위해 세 가지 유형의 E2 단백질의 아미노산 서열을 다중 정렬한 결과를 나타낸 것이다.

이하 실시예를 통해 본 발명에 따르는 BVDV항원진단시스템 및 그 제조방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: BVDV E2 에 대한 항원성을 내포하는 펩타이드 서열

국내 소에서 분리된3가지 유형의BVDV 항원(BVDV1a, BVDV1b, BVDV2a)의 각 아미노산 서열에 공통적으로 존재하는 항원부위(epitope)를 예측하여 상기 3가지 유형의 BVDV를 진단할수 있는 방법을 확립하고자, 상기 각 유형별 BVDV 항원에 존재하는 E2 구조 단백질에 대한 염기서열을 농림수산검역검사본부 바이러스과에서 제공 받았으며, 각 유형별 염기서열과 아미노산은 서열은 각각 서열번호 1 내지 3 및 서열번호 4 내지 6과 같다.

구체적으로, 각 유형별 E2 아미노산 서열에 공통적으로 존재하는 항원부위(epitope)를 예측하고자, 바이오인포메틱스 프로그램(DNAMAN version 6 (Lynnon Corporation)을 이용하여 다중 정렬(multi-alignment) 후에 Domain exclusion analysis와 Transmembrane domain search를 통하여 번역후변형(post-translational modification)에 의해 다른 구조를 형성할 가능성이 높은 부위 및 막관통영역(transmembrane domain)에 위치한 부위를 분석 하고 이를 도 9에 나타냈다. 분석 결과, 이들 alignment 서열의 C-말단에 가까이 위치하면서 또한 소수성(hydrophobicity)이 낮고 항원성(antigenicity)이 높은 펩타이드 서열을 확보할 수 있었다(서열번호 8).

실시예 2: BVDV E2 펩타이드에 대한 다클론 항체 ( poly E2 - peptiede antibody, pE2 - pep Ab ) 제조

상기 실시예 1로부터 확보된 펩타이드를 예비활성화된 BSA(pre-activated Bovine Serum Albumin) 또는 마찬가지로 예비활성화된 KLH (pre-activated Keyhole Limpet Hemocyanin)과 컨쥬게이션 시킨뒤 3회에 걸쳐 토끼(뉴질랜드화이트(New Zealand White Rabbits), 2.5~3.0 kg, 10-16 주령, 수컷)에 면역을 실시하였으며, 매회 혈청을 분리하여 효소면역측정법(ELISA, Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)을 통해 펩타이드에 대한 항체가 만들어진 것을 확인하였다(Niemi, S.M., et al. Lab. Anim. Sci., 35(6):609-612 (1985). Diano, M., et al. Analytical Biochemistry 166:224-229 (1987). Halliday, L.C., et al. Contemporary Topice, 43(1):8-13 (2004) 참조).

구체적으로, ELISA에 사용된 항원은 실시예 1로부터 확보된 펩타이드에 BSA 또는 KLH 가 컨쥬게이션된 것을 100ng/well 농도로 플레이트에 코팅(coating)하였다. 면역된 토끼로부터 얻은 혈청을 PBS로 부피 기준 1/1,000 부터 1/100,000으로 희석하여 100ul/well 농도로 상온에서 2시간 반응하였고, PBST(PBS + 0.1% Tween-20)로 5회 세척 후, 1/5000 희석한 Rabbit-IgG HRP(Goat anti-Rabbit IgG (H+L)-HRP, SURMODICS, USA)를 2차 항체로 사용하여 1시간 반응시켰다. PBST 7회 세척 후 플레이트상에 항원과 결합한 항체를 검출하기 위해, TMB substrate (BioFX, SurModics, USA)로 10분간 상온에서 반응시킨 후, 5N HCl을 well 당 20 ul로 투여하여 반응을 종료시킨 후에 ELISA reader(Sunrise, TECAN)를 이용하여 450nm로 측정하여 반응성을 관찰하였다. ELISA 를 통해 관찰한 결과, 도 2 내지 4에 나타난 바와 같이, 펩타이드로 면역한 토끼와 면역하지 않은 토끼에서 각각 혈청을 채취해서 면역항원으로 사용한 펩타이드와 ELISA 반응을 시켰을 때, 면역한 토끼에서 항원에 대한 항체의 반응값(OD)이 혈청의 희석정도에 따라 0.5-1.5배까지 차이가 남을 알 수 있어 펩타이드 항원에 반응성을 보이는 항체가 생성 된 것을 확인할 수 있었다. 이처럼 항체 생성을 확인한 후, 토끼를 마취하고 전혈을 채혈하여 37℃에서 30분 내지 60분간 정치시키면서 혈액 세포들이 응고되어 혈병을 형성하면, 이를 제거한 후 혈청을 확보하였다. 준비된 혈청은 4℃, 10000g, 10분간 원심분리 후 상층액을 취하여 면역친화성 크로마토그래피 (immunoaffinity chromatogarphy) 법을 사용하여 상층액으로부터 항체를 정제하였다. 즉, 상층액을 비드의 5배 부피의 인산화염(PBS)으로 평형화(Equilibrate)된 단백질(Protein) A가 콘쥬게이션 되어있는 아가로스 비드(peptron) 컬럼(empty column, Pierce)에 로드하고, 5층 용적(bed volumn)의 인산화염(PBS)로 컬럼을 세척한 후에, 0.1M Glycine, pH 3.0의 버퍼용액으로 다클론항체를 용출하였다. 용출된 다클론항체는 중화를 위해 다시 1/10 부피의 1M Tris, pH 8.0을 가하였다. 최종적으로 순수한 다클론항체를 분리한 다음 인산화염 완충액(PBS)에 투석하여 항체를 분리 및 정제하였다. 정제된 항체 (pE2-pep Ab)는 PBS 버퍼에 투석후 0.02% NaN₃를 첨가하여 냉장고에 보관하였다.

실시예 3: IFA 및 western blot 을 통한 E2 다클론 항체의 BVDV 에 특이적 반응 확인

실시예 2로부터 제작된 항체 (pE2-pep Ab)가 BVDV에 특이적으로 반응하는지 확인 하기 위하여 간접 면역형광 항체기술(Indirect immunofluorescent antibody technique:IFA)로 확인하였다. BVDV 국내분리주 type 1a(농림수산검역검사본부) 를 배양세포 포화정도가 70% 인 MDBK (Madin-Darby Kindney: ATCC CCL22) 세포주에 접종하여, CO₂ 인큐베이터(37℃)에서 3일간 배양한 후 PBS 버퍼(pH7.2)로 세포를 2회 세척하였다.

세척한 세포를 아세톤/PBS (90:10)(v/v)로 10분간 실온에서 고정시켰다. 고정된 세포에 실시예2로부터 제작된 항체 (pE2-pep Ab) 및 비교를 위해 BVDV E2 (gp53) 단클론 항체(Monoclonal Antibody) B20.24 (Jenobiotech, Korea)를 각각 반응액으로 올린 다음 실온에서 1시간 반응 및 PBS 4회 세척 후 anti-rabbit IgG FITC (플루오로세인 이소티오시아네이트, surmodics)를 제공된 제조서에 따라 부피 기준으로 1:1000 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.

반응 후 PBS 버퍼로 5분씩 3회 세척한 후 형광현미경(IX51 Inverted microscope, OLYMPUS)을 사용하여 BVDV감염 세포와 그렇지 않은 세포에서 제작된 항체가 바이러스에 대해 특이적으로 반응 하는 지를 확인 하였다 (도 5참조). 도 5에 나타난 바와 같이, FA (florescent antibody) 테스트 결과 실시예 및 비교예의 두 항체 모두가 국내분리주 BVDV Type 1a 가 감염된 세포에서 형광반응을 나타냈다. 이를 통해 두 항체가 모두 BVDV에 대한 특이 항원과 항체 반응을 하는 것을 확인할 수 있었다.

추가적으로, BVDV가 감염된 세포와 감염되지 않은 세포들로부터 확보한 total cell lysate를 가지고 웨스턴 블롯을 수행 하였다. 항체로는 IFA에서 사용한 바와 같은 두종의 항체를 1:5000 (v/v) 희석하여 사용하였으며, 이차 항체는 단클론(비교예의 항체)일 경우 anti-mouse HRP(Goat anti-Mouse IgG, (H+L)-HRP, SURMODICS, USA)를 1:1000(v/v), 다클론(실시예 2의 항체)일 경우 anti-rabbit HRP(Goat anti-Rabbit IgG (H+L)-HRP, SURMODICS, USA)를 1:2000(v/v) 희석하여 사용하였다. 발색을 위한 기질로는 DAB(Diaminobenzidine tetrahydrochloride)를 사용하였다. 사용방법은 제조사의 사용서를 참조하였다 (D5905, Sigma).

그 결과, 도 6에서 나타나듯이 실험예 2의 항체의 경우 국내분리주 BVDV Type 1a 가 감염된 total cell lysate에 대해 48 kDa과 63 kDa 사이에서 반응성이 있는 밴드가 뚜렷하게 나타남을 확인할 수 있었던 반면, BVDV E2 (gp53) 단클론 항체(Monoclonal Antibody) B20.24 (Jenobiotech, Korea)의 경우 다클론 항체보다 민감도가 약한것으로 확인되었다. 한편, 대조군으로 사용된 바이러스가 감염되지 않은 total cell lysate에서는 두 항체 모두 실험군에서 보이는 특정 밴드가 나타나지 않았다.

이처럼, IFA 및 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과 상기 실시예 2의 다클론항체 및 B20.24 단클론항체 모두 BVDV에 대해 특이적인 항체임을 확인할 수 있었다.

실시예 4: BVDV E2 다클론 항체가 고착된 니트로셀룰로즈 멤브레인 스트립 제조

실시예 2에 따라 제조된 BVDV 항체를 1내지 4mg/ml 농도로 맞추어 완충액(0.1% trehalose, 10mM PB)에 혼합하여 검사선으로 사용하고, 대조선은 염소 항-마우스 이뮤노글로블린 G(Goat anti-mouse IgG) (Arista Biologicals Inc.) 를 사용하였다. 상기 검사선의 재조합 항체 및 대조선의 대조 용액은 디스펜싱 기구(KINAMETICS, USA)를 사용하여 니트로 셀룰로오스 막(MDI, India)에 분사하였다. 이후 낮은 습도의 실험실 에서 밤새 건조하거나 적어도 5시간 이상 팬에서 건조시켰다. 상기 제조된 막의 플레이트는 건조제와 함께 밀봉된 컨테이너 또는 낮은 습도의 실험실에서 보관하였다.

실시예 5: BVDV E2 단클론 항체( Monoclonal antibody )-금( Gold ) 콘쥬게이트의 제조

BVDV E2 단클론항체(anti-BVDV E2 Monoclonal Antibody, Genobiotech, Korea)를 최종 농도가 4 내지 20ug/ml가 되도록 교반하면서 금 용액에 한 방울씩 첨가한 후, 이 용액을 다시 15분간 교반하였다. 그 후, 금 입자 부유 물에 10% BSA 용액 (Sigma) 을 첨가하였다. 다시 15 분간 교반한 후, 결합된 금 용액을 원심 분리(6000g, 15분)하여, 결합되지 않은 E2 단클론항체를 제거하기 위해서 상등액은 버리고, 결합된 금 용액 펠렛에, 펠렛 용량의 3배의 1% BSA가 첨가된 5mM 소디움 보레이트(Sodium Tetraborate, pH7.2)(Sigma)을 첨가한 후 상기 펠렛을 재부유 하였다. 상기 부유물을 다시 원심 분리(6000g, 15분)하고, 최종 펠렛을 1배의 1% BSA가 첨가된 5mM 소디움 테트라보레이트(Sigma) 에 스펙트로포토메타 530nm에서 흡광도가 10±1이 되게 조정하여 제조하였다.

대조선을 위한 금 접합체를 준비하기 위해 아리스타(Arista, USA)사에서 구입한 마우스 IgG는 최종 농도가 4 내지 20ug/ml가 되도록 교반하면서 금 용액에 한 방울씩 첨가한 후, 이 용액을 다시 15분간 교반하였다. 그후, 금 입자 부유 물에 10%의 BSA 용액을 첨가하였다. 다시 15분간 교반한 후, 결합된 금용액을 원심분리(6000g, 15분)하여, 결합되지 않은 마우스 IgG를 제거하기 위해서 상등액은 버리고, 결합된 금 용액 펠렛에, 펠렛용량의 3배의 1% BSA가 첨가된 5mM 소디움보레이트 (pH7.2)을 첨가한 후 상기 펠렛을 재부유 하였다. 상기 부유물을 다시 원심분리(6000g, 15분)하고, 최종 펠렛을 1배의 1% BSA가 첨가된 5mM 소디움보레이트(pH7.2)에 스펙트로포토메타 530nm에서 흡광도가 10±1이 되게 조정하여 제조하였다.

실시예 6: 금 접합체 처리 패드의 준비

상기 실시예 5에서 제조된 금 접합체는 1 에서 5% 트레할로스(Trehalose)를 첨가하여 다음과 같이 제조하였다. 0.5 x 20 cm 유리섬유에 BVDV E2 단클론항체-금접합체가 최종농도 0.5 내지 2.5 OD(Optical Density)가 되도록 맞춰주고, 여기에 마우스 IgG-금 접합체가 최종농도 0.5 OD가 되게 혼합하여 고르게 흡착시켰다. 이후 낮은 습도의 실험실에서 밤새 건조하거나 적어도 5시간 이상 팬에서 건조시켰다. 상기 제조된 콘쥬게이트 패드는 건조제와 함께 밀봉된 컨테이너 또는 낮은 습도의 실험실에서 보관하였다.

그 외 흡습패드 및 검체패드는 반응용액이 잘 흡수될 수 있도록 건조하여 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조하였다.

실시예 7: 디바이스 조립

상기에서 제조된 각각의 멤브레인 및 패드들을 오른쪽부터 검체패드, 골드패드(금 접합체 처리 패드), 니트로셀룰로오스 멤브레인, 마지막으로 흡습패드를 각각 중첩되게 결합하고 면역분석장치(디바이스)에 크기에 맞는 스트립 크기로 절단하였다. 이렇게 절단된 스트립을 최종적으로 면역분석장치의 하판에 넣고 상판을 덮어 진단용 키트를 제조하였고(도 1 및 도7), 면역분석장치와 검체 전개액 (PBS/0.5%, Tween-20, 50mM KCl, 300 mM NaCl, 0.1% NaN₃)을 최종 제품으로 구성되도록 하였다.

실시예 8: BVDV 항원 진단 스트립의 효능 시험

실시예 7의 방법에 따라 제작된 키트를 이용하여 검사하였다. 스트립의 효능 시험에 사용된 검체는 불활화된 BVDV 국내분리주 type 1a(농림수산검역검사본부) 로서 상기 제작된 키트에 반응시킨 뒤 10분 경과후 반응성을 육안을 통해 확인하였다 (도 8). 그 결과, 음성 검체에서는 검사선에 반응성이 나타나지 않았으나, 양성 검체인 BVDV에 대해서는 검사선에 반응성을 보였다. 따라서 본 발명에 따른 키트를 사용하여 BVDV 항원 검출법이 가능한 것을 확인할 수 있다.

<도 1의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
1. 면역분석장치 2. 분석스트립
3. 하부 케이스 4. 상부 케이스
5. 검체 패드 6. 컨쥬게이션 패드
7. 검사선 8. 대조선
9. 멤브레인 10. 흡수 패드
11. 검체 투입구 12. 결과 표시창

<110> VETALL CO.,LTD. <120> ANTIBODY FOR DETECTING OF BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS(BVDV), BVDV ANTIGEN DETECTING METHOD AND TEST KIT USING THEREOF <130> DPP20122575KR <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of BVDV 1a E2 <400> 1 cacctggaat gcaaacctga atactcatat gccatagcta agagtgacag aattggccca 60 ctaggagctg aaggccttac cactgtttgg aaggattact cacatgaaat gacattggaa 120 gacacaatgg ttatagcttg gtgtaaagat ggtaagtttg tacaccttgc aaggtgcacc 180 agagaaacta gatatcttgc agttttgcat tcaagagcct tgccgaccag tgtagtattt 240 gagaaacttt tcgaggggct aaggcaagag gaaacaattg aaatggatga caactttgaa 300 tttgcgctct gcccatgcga tgccaaaccc atagtaagag ggaagttcaa tacaacactg 360 ctgaacggac cagccttcca ggtggtatgt cccataggat ggactgggac tgtgagctgt 420 atgttagcta atagagatac cctagacaca gtagtagtac ggacatatag gaggtccaga 480 ccattccctt ataggcaagg ctgtattacc caaaaaactt tgggagagga tctctatgac 540 tgtattcttg gaggaaactg gacttgtgtg actggggatc aactaaaata cacaggaggc 600 cttattgaat cctgcaagtg gtgtggtttc aaattccaaa aagatgaggg actaccacac 660 taccccatcg gcaagtgtag gttaaaaaac gagactggct acagacttgt agatgacacc 720 tcttgcaaca gagaaggtgt ggccattgtg ccacacgggc aggtaaagtg taagatagga 780 gacacaattg tacaggttat agctcttgac accagacttg ggcctatgcc ttgcaagcca 840 tatgagatca tatcaagtga gggacctgtt gaaaagacgg cctgcacctt caactacacg 900 aaaacattga aaaataaata ttttgagccc agagatagtt acttccagca atacatgtta 960 aaaggagaat atcaatactg gtttgacctg gaggtcactg accatcatcg ggattacttc 1020 gccgagtcca tattagtggt ggtggtagcc ctcctgggtg gtagatacgt gctttggctg 1080 ctggtcacat acatggtttt atcagaacaa aaggccttag gg 1122 <210> 2 <211> 1122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of BVDV 1b E2 <400> 2 tacccagact gcaaacccga cttttcatac gccatagcca aaaatgatga gattggccca 60 cttggagcta caggcctcac cactcagtgg tacgaatact cagatggaat gcggctgcag 120 gactcaacag ttgaagtttg gtgtaaagat ggaaagttca gatatctaac caaatgtgag 180 agggaagcca gatatctggc tattctacac acgagagcct tgccaacatc 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290 295 300 Asn Lys Tyr Phe Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu 305 310 315 320 Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Glu Val Thr Asp His His 325 330 335 Arg Asp Tyr Phe Ala Glu Ser Ile Leu Val Val Val Val Ala Leu Leu 340 345 350 Gly Gly Arg Tyr Val Leu Trp Leu Leu Val Thr Tyr Met Val Leu Ser 355 360 365 Glu Gln Lys Ala Leu Gly 370 <210> 5 <211> 374 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of BVDV 1b E2 <400> 5 Tyr Pro Asp Cys Lys Pro Asp Phe Ser Tyr Ala Ile Ala Lys Asn Asp 1 5 10 15 Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Thr Gly Leu Thr Thr Gln Trp Tyr Glu 20 25 30 Tyr Ser Asp Gly Met Arg Leu Gln Asp Ser Thr Val Glu Val Trp Cys 35 40 45 Lys Asp Gly Lys Phe Arg Tyr Leu Thr Lys Cys Glu Arg Glu Ala Arg 50 55 60 Tyr Leu Ala Ile Leu His Thr Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Glu Phe 65 70 75 80 Lys Lys Ile Leu Asn Gly Lys Glu Gln Glu Asp Ile Val Glu Met Glu 85 90 95 Asp Asn Phe Glu Phe Gly Leu Cys Pro Cys Asp Ala Arg Pro Leu Val 100 105 110 Lys Gly Lys Phe Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Pro Ala Phe Gln Met 115 120 125 Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Thr Val Ser Cys Ile Leu Ala Asn 130 135 140 Lys Asp Thr Leu Ala Thr Ile Val Val Arg Thr Tyr Lys Arg Val Arg 145 150 155 160 Pro Phe Pro Tyr Arg Gln Tyr Cys Val Thr Gln Lys Thr Ile Gly Glu 165 170 175 Asp Leu His Asp Cys Ala Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Pro Gly 180 185 190 Asp Gln Leu Arg Tyr Val Ala Gly Pro Val Glu Ser Cys Lys Trp Cys 195 200 205 Gly Tyr Lys Phe Phe Lys Ser Glu Asp Leu Pro His Phe Pro Ile Gly 210 215 220 Lys Cys Arg Leu Lys Asn Glu Ser Gly Tyr Arg Leu Val Asp Glu Thr 225 230 235 240 Pro Cys Asn Arg Asp Gly Val Ala Ile Val Pro Ser Gly Leu Val Lys 245 250 255 Cys Lys Ile Gly Asp Thr Val Val Gln Val Ile Ala Met Asp Ser Lys 260 265 270 Leu Gly Pro Met Pro Cys Lys Pro Tyr Glu Ile Ile Pro Ser Glu Gly 275 280 285 Pro Val Glu Lys Thr Ala Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Arg Thr Leu Glu 290 295 300 Asn Lys Tyr Phe Glu Pro Arg Asp Asn Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu 305 310 315 320 Lys Gly Gly Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Glu Ile Thr Asp His His 325 330 335 Arg Asp Tyr Phe Ala Glu Ser Leu Leu Val Ile Val Val Ala Leu Leu 340 345 350 Gly Gly Arg Tyr Val Leu Trp Leu Leu Val Thr Tyr Met Val Leu Ser 355 360 365 Glu Gln Met Ala Ser Gly 370 <210> 6 <211> 372 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of BVDV 2a E2 <400> 6 Phe Pro Glu Cys Lys Gly Gly Phe Gln Tyr Ala Ile Ser Lys Asp Arg 1 5 10 15 Lys Met Gly Leu Leu Gly Pro Glu Ser Leu Thr Thr Thr Trp His Leu 20 25 30 Pro Thr Gln Lys Ile Val Asp Ser Met Val Gln Val Trp Cys Glu Gly 35 40 45 Lys Asn Leu Lys Ile Leu Lys Thr Cys Thr Lys Glu Glu Arg Tyr Leu 50 55 60 Val Ala Val His Glu Arg Ala Leu Ser Thr Ser Ala Glu Phe Met Gln 65 70 75 80 Ile Ser Glu Gly Thr Arg Gly Leu Glu Val Ile Asp Met Pro Asp Asp 85 90 95 Phe Glu Phe Gly Leu Cys Pro Cys Asp Ser Lys Pro Val Ile Lys Gly 100 105 110 Lys Phe Asn Ala Ser Leu Leu Asn Gly Pro Ala Phe Gln Met Val Cys 115 120 125 Pro Gln Gly Trp Thr Gly Arg Ile Glu Cys Thr Leu Val Asn Gln Asp 130 135 140 Thr Leu Asp Thr Thr Val Ile Arg Thr Tyr Ile Arg Thr Thr Pro Phe 145 150 155 160 Gln Arg Arg Lys Trp Cys Thr Tyr Glu Lys Ile Ile Gly Glu Asp Ile 165 170 175 His Glu Cys Val Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Ile Thr Gly Asp His 180 185 190 Ser Arg Leu Lys Asp Gly Pro Ile Lys Lys Cys Lys Trp Cys Gly Tyr 195 200 205 Asp Phe Phe Asn Ser Glu Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys 210 215 220 Met Leu Ile Asn Glu Gly Gly Tyr Arg Tyr Val Asp Asp Thr Ser Cys 225 230 235 240 Asp Arg Gly Gly Val Ala Ile Val Pro Thr Gly Thr Val Lys Cys Arg 245 250 255 Ile Gly Asn Val Thr Val Gln Val Ile Ala Thr Asn Asn Asn Leu Gly 260 265 270 Pro Met Pro Cys Ser Pro Ala Glu Val Ile Ala Ser Glu Gly Pro Val 275 280 285 Glu Lys Thr Ala Cys Thr Phe Asn Tyr Ser Arg Thr Leu Pro Asn Lys 290 295 300 Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Arg Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly 305 310 315 320 Glu Trp Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Ser Val Asp His His Lys Asp 325 330 335 Tyr Phe Ser Glu Phe Ile Ile Ile Ala Val Val Ala Leu Leu Gly Gly 340 345 350 Lys Tyr Val Leu Trp Leu Leu Ile Thr Tyr Thr Ile Leu Ser Glu Gln 355 360 365 Met Ala Met Gly 370 <210> 7 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> common epitope sequence of E2 <400> 7 Met Pro Cys Lys Pro Tyr Glu Ile Ile Ser Ser Glu Gly Pro Val Glu 1 5 10 15 Lys Thr Ala Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys Thr Leu Lys Asn Lys Tyr 20 25 30 Phe Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe 35 40 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> common epitope sequence of E2 <400> 8 Ser Glu Gly Pro Val Glu Lys Thr Ala Cys 1 5 10

Claims (11)

1. 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하여 연속적인 아미노산 10 내지 40개로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는,
   소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus) E2 단백질의 항원결정부위(epitope)인 폴리펩타이드 분자.
   
2. 제1항에 있어서, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는, 폴리펩타이드 분자.
   
3. 제1항에 있어서, 소 바이러스성 설사병 바이러스 항원형 1a형, 1b형 및 2a형 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 항원결정부위인 폴리펩타이드 분자.
   
4. 제1항의 항원결정부위 폴리펩타이드 분자, 상기 폴리펩타이드 분자를 코딩하는 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus)에 대한 백신 조성물.
   
5. 제1항의 폴리펩타이드 분자를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 단편.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체인, 항체 또는 이의 단편.
   
7. 제5항의 항체 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus) 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
   
8. 제5항의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus) 항원 검출용 키트.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 키트는 상기 항체 또는 이의 단편이 검사선으로서 흡착된 멤브레인을 포함하는 것인, 키트.
   
10. 제8항의 키트를 사용하여 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus) 항원을 검출하는 방법.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 방법은
    소의 혈액, 혈장, 혈청, 림프액, 조직액, 소변, 눈물, 침, 젖, 구토물, 또는 분변 내 소 바이러스성 설사병 바이러스(BVDV, Bovine Viral Diarrhea Virus) 항원형 1a형, 1b형, 및 2a형으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 검출하는 것인 방법.
    

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