TWI532838B - 蓖麻子毒素融合瘤細胞株、其單株抗體、及包含該單株抗體的免疫檢測試劑及套組 - Google Patents

Description

蓖麻子毒素融合瘤細胞株、其單株抗體、及包含該單株抗體的免疫檢測試劑及套組

本發明提供一種可產生一融合瘤細胞株、一單株抗體以及包含該單株抗體之免疫檢測試劑及套組，其特徵在於該單株抗體係為抗蓖麻子毒素之單株抗體。

蓖麻子毒素(Ricin)是從一種稱為蓖麻的植物所萃取出來的毒素，又稱蓖麻毒蛋白。此種毒素對人類的平均致死量為0.2毫克，但也有一些文獻的數據較高。此毒素能抑制蛋白質合成過程，進而對生物體造成傷害。此外相關研究顯示，只需8顆蓖麻種子的毒素可對一名成人產生致命毒性。

蓖麻毒蛋白為一種異源二聚體糖蛋白，包含兩條具有不同胺基酸序列的蛋白質鏈，分別重約32kDA及34kDA，兩蛋白質鏈之間以雙硫鍵相連。

兩條蛋白質鏈如為以下所述：A鏈(A chain；EC 3.2.2.22)含有267個胺基酸，為一種N-糖苷水解酶，此鏈會切斷28S rRNA上的一個共價鍵，使一個腺嘌呤遭移除。由於28S rRNA是組成核糖體的主要物質，而核糖體又是合成蛋白質所需，因此當rRNA遭破壞時，會使蛋白質的合成受到抑制；B鏈(B chain；EC 3.2.2.22)為一種凝集素，其第4個 殘基和A鏈之間以雙硫鍵結合。此鏈可與細胞膜上的半乳糖殘基或甘露糖殘基結合，協助A鏈通過細胞膜，進入細胞並發生作用。

蓖麻子毒素為免疫毒素(immunotoxins)之一，且為強毒性的生物性毒素，此類蛋白質可和細胞膜上特定分子結合。可經由呼吸、口服、傷口感染等路徑造成人類中毒，推估經由呼吸或注射之路徑約1-10ug/kg體重的劑量即可造成死亡，中毒症狀則依接觸量與接觸方式而有所不同。吸入蓖麻毒者可能在8小時後才會產生中毒症狀，首先出現呼吸窘迫、發燒、咳嗽、噁心與胸悶，之後大量出汗並造成肺水腫，最後可能在低血壓及呼吸衰竭中身亡。吞嚥者則可能在6小時內出現症狀，其中包括帶血嘔吐與腹瀉，並使中毒者脫水，幾天後可能因為器官衰竭而死亡，若是中毒者在3到5天之後仍未死亡，則通常會康復。在第一次世界大戰期間，美國軍方萃取蓖麻子毒素並運用在軍事用途，包含使用蓖麻子毒素為原料之毒氣或是將蓖麻子毒素包覆於彈藥外殼。此外，蘇聯在冷戰時期亦曾使用蓖麻子毒素作為生化武器。

目前蓖麻子毒素已被美國疾病控制及預防中心列為B級之生物武器，且由於中毒後需要一段時間才會顯現出症狀，而且許多症狀類似其他疾病，因此當中毒者得知自己是蓖麻毒素中毒時，常已超出黃金治療期限，故對於蓖麻子毒素之單株抗體的製備及篩選，有助於建立快速蓖麻子毒素檢測技術，以避免錯失蓖麻子毒素中毒之黃金治療期。

因此，本發明期望可提供一種蓖麻子毒素的融合瘤、單株抗體及其檢測套組/方法，此檢測套組/方法可快速檢測是否蓖麻子中毒。

本發明提供一種融合瘤細胞株，並於中華民國103年6月17日寄存於財團法人食品工業研究所，其寄存編 號為BCRC960487，該融合瘤細胞株係由一親代細胞與一骨髓瘤細胞株融合而製成，該親代細胞係由將蓖麻子毒素做為抗原免疫至小鼠，並將小鼠之一脾臟細胞取出而得，且該融合瘤細胞株可產生一單株抗體能夠專一性辨識該蓖麻子毒素之A鏈。

本發明亦提供一種單株抗體，且能夠專一性辨識一蓖麻毒素之A鏈，其係具有如SEQ ID NO.1之蛋白序列，並對其他類似蓖麻子毒素無交叉反應，例如：雞母珠毒素。

本發明又提供一免疫檢測試劑、一免疫檢測套組，其係利用酵素連結免疫吸附分析法檢測待測檢體中的一待測抗原，其特徵在於該免疫檢測套組中含有本發明單株抗體，其可專一性辨識一蓖麻子毒素之A鏈，其係具有如SEQ ID NO.1之蛋白序列，前述免疫檢測套組進一步包含一偵測抗體及一訊號產生物質；該偵測抗體及該訊號產生物質係透過各種方式結合，在較佳地實施例中，其係透過共軛結合；前述訊號產生物質係包含，但不限於：放射性標記物、磷光標記物、冷光標記物、螢光標記物及酵素，於較佳實施例中，該冷光標記物係為一化學冷光標記物或一生物冷光標記物；前述酵素係包含，但不限於：過氧化氫酶(Hydrogen Peroxidase)、辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase，簡稱HRP)、鹼性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，簡稱AP)以及Beta-半乳糖苷酸酶(Beta-galactosidase)，於較佳實施例中，其係辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase，簡稱HRP)；前述免疫檢測套組進一步包含一受質，該受質可與該酵素反應而發生呈色反應。本發明免疫檢測套組包含習知之各種物質，包含，但不限於：磷酸鹽緩衝溶液、Tween20緩衝溶液、阻隔試劑，如牛血清白蛋白、酪蛋白、動物明膠、微孔盤、雜交膜、試紙等。

較佳地，前述小鼠係為一BALB/c品系小鼠。

較佳地，前述骨髓瘤細胞株係來自FO骨髓瘤細 胞株(CRL-1646細胞株)。

1‧‧‧硬體支持物

10‧‧‧樣品墊(sample pad)

20‧‧‧共軛墊(conjugated pad)

30‧‧‧抗體塗布膜(antibody coated membrane)

40‧‧‧吸水墊(Absorption pad)

50‧‧‧單株抗體A(其可辨識蓖麻子毒素之A鏈)

60‧‧‧抗體B(其可辨識蓖麻子毒素)

70‧‧‧扁平塑膠外殼

71‧‧‧判讀區視窗

72‧‧‧檢體視窗

80‧‧‧辣根過氧化物酶(HRP)

90‧‧‧蓖麻子毒素

100‧‧‧側向層析器(lateral-flow strip)

200‧‧‧固相吸附層

第1圖係為利用側向層析器，以本發明單株抗體來偵測蓖麻子毒素。

第2圖係為本發明偵測蓖麻子毒素之側向層析器。

第3圖係為利用側向層析器，以本發明單株抗體來偵測不同濃度蓖麻子毒素的結果。

第4圖係為利用側向層析器，以本發明單株抗體來偵測100ng/mL的蓖麻子毒素、100ng/mL的雞母珠毒蛋白(Abrin)、100ng/mL的肉毒桿菌A型毒素、100ng/mL的肉毒桿菌B型毒素的結果。

第5圖係為利用側向層析器，以本發明單株抗體來偵測添加於牛奶、咖啡、可樂、果汁、茶中蓖麻毒素的結果。

第6圖係為利用免疫檢測法(ELISA)，以本發明單株抗體來偵測蓖麻子毒素的示意圖。

第7圖係為利用免疫檢測法(ELISA)，以本發明單株抗體來偵測1~1000ng/mL的蓖麻子毒素、1~1000ng/mL的雞母珠毒蛋白(Abrin)、1~1000ng/mL的肉毒桿菌A型毒素、1~1000ng/mL的肉毒桿菌B型毒素的結果。

本由於本發明係揭露一種融合瘤細胞株、其單株抗體及其利用前述單株抗體所製作之免疫試劑其套組，其中 所利用之免疫學原理、細胞培養、染色及蛋白質偵測等相關技術，已為相關技術領域具有通常知識者所能明瞭，故以下文中之說明，不再做完整描述。

本發明所提供之抗蓖麻子毒素之單株抗體蓖麻子毒素單株抗體、以及可產生抗蓖麻子毒素單株抗體的融合瘤細胞株、以及蓖麻子毒素之免疫檢測試劑及套組，具體實施例如下。

1、蓖麻子毒素之製備：本發明以蓖麻子毒素做為抗原，其製備方式如下：

(a)取200g脫殼之蓖麻豆(castor bean)以5%醋酸浸泡一夜，再以果汁機將其打碎，離心後除去殘渣得到上清液。

(b)將步驟(a)上清液加入硫酸胺至60%濃度，得沉澱蛋白質，而後離心，得到沉澱物。

(c)以磷酸鹽緩衝溶液加入(b)步驟沉澱物中，使其完全溶解，溶解後的蛋白質再以磷酸鹽緩衝溶液透析。

(d)以sepharose 6B(5 x 24cm)層析管柱先以磷酸鹽緩衝溶液先平衡。再將步驟(c)透析後的蛋白質注入sepharose 6B層析管柱中，接著以1-1.5公升的磷酸鹽緩衝溶液清洗層析管柱。

(e)以含0.1M半乳糖之磷酸鹽緩衝溶液200mL，將吸附於sepharose 6B層析管柱之蛋白清洗得出。

(f)將前述步驟(e)所得出之蛋白質，利用離心濃縮管濃縮成為5mL。

(g)取sephacryl S-200(5x60cm)分子篩層析管柱先以磷酸鹽緩衝溶液先做平衡。將步驟(f)濃縮後之蛋白質注入預先平衡之sephacryl S-200層析管柱中。

(h)以磷酸鹽緩衝溶液洗滌層析管柱，而將不同吸收峰之蛋白質收集。

(i)以8% SDS-PAGE電泳，來分析步驟(h)中不同吸收峰之蛋白質純度，將主要含66KDA之蓖麻毒素，取100ug以1%福馬林-磷酸鹽溶液透析10天，製成蓖麻類毒素，做為本發明用抗原。

2、小鼠免疫與抗蓖麻子毒素單株抗體的融合瘤細胞株之製備：

(a)取3隻BALB/c小鼠，將0.2mL佛朗氏完全佐劑(Complete Freund’s adjuvants)與實施例一所製備之蓖麻子類毒素製成乳劑，以腹腔注射方式施打，每隻小鼠注射10μg蓖麻子類毒素。

(b)14天後，將0.2mL佛朗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvants)與實施例一所製備之蓖麻子類毒素製成乳劑A，以腹腔注射方式分別施打入3隻BALB/c小鼠體內。在第14天及第28天分別追加施打乳劑A並以眼窩採血方式採集老鼠血液，將老鼠血液靜置後離心以取得血清，再以ELISA檢測其抗體力價變化趨勢，當抗體力價達1：32000，追加施打實施例一所製備之10μg蓖麻子毒素，五日後進行細胞融合試驗。

(c)取前述小鼠之脾臟細胞與FO骨髓瘤細胞株(CRL-1646細胞株)進行細胞融合後，以免疫吸附試驗ELISA及西方點墨法法挑選融合瘤細胞株，得本發明融合瘤細胞株。

(d)骨髓瘤細胞培養：在小鼠預定進行融合前一週，取出先前保存在液態氮中的FO骨髓瘤細胞(Myeloma cell,CRL-1646細胞株)，進行細胞解凍。細胞保存瓶由液態氮中取出，迅速置於37℃回溫，待細胞接近完全溶解，以10ml不含血清之RPMI 1640培養液懸浮，離心800rpm，5分鐘，然後去上清液，以10ml含10%胎牛血清之RPMI 1640培養液懸浮骨瘤細胞，培養於25cm²細 胞培養瓶(25T，cell culture flask)中，置入含5% CO2之培養箱進行培養。經16-24小時後，待其長滿細胞培養瓶後繼續繼代至75T細胞培養瓶，並持續以一比一的繼代以保持細胞的生長活性。

(e)細胞融合：利用頸椎脫離法犧牲老鼠後，以酒精擦拭胸、腹部後置於無菌操作台。使用無菌器械脫去皮毛及剪開肌肉打開腹腔，取出脾臟，置於不含血清之RPMI 1640培養液之無菌培養皿，並以10mL注射器抽吸RPMI 1640培養液，並重複將RPMI 1640培養液注入小鼠脾臟，將脾臟細胞沖出。處理好的脾臟細胞離心400x g，10分鐘。棄除上清液，再重複上述動作一次，將雜質去除。將活性良好的骨髓瘤細胞自培養瓶拍下，離心400x g，10分鐘，去上清液，加入不含血清之RPMI 1640培養液懸浮，此動作共重複上述步驟兩次。取5x107之骨髓瘤細胞及處理好的小鼠脾臟細胞混合，離心800 x g，5分鐘，棄除上清液，此動作重複一次。將離心下來的細胞敲鬆，在60秒內加入1ml 50%PEG 1500，繼續搖晃60秒，接著在60秒內加入1ml含10%血清的RPMI 1640培養液，接下來的2分鐘內加入9ml含10%血清的RPMI 1640培養液，離心400 x g，5分鐘。棄除上清液，以200ml含20%血清及10%OPTI-CLONE(ICN Biomedicals)-HAT-RPMI 1640培養液懸浮融合瘤細胞，並加至96孔微量培養盤上(Microwell-plate)進行融合瘤細胞培養。

(f)融合瘤細胞的培養：經融合完成之細胞在96孔微量培養盤培養，共十盤，5-7天後視情況換液。換液時抽出80-100μL，以不超過原體積之二分之一為原則，再加入新的含有HAT及血清之RPMI 1640培養液。

(g)融合瘤之篩選：進一步進行分析融合瘤細胞是否具有對抗蓖麻子毒素的抗體產生即為融合瘤篩選(screening)。所用方法如下：酵素免疫連結吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay；ELISA)，西方墨漬反應(Western blot)。

(h)利用酵素免疫分析法(ELISA,Enzyme-linked immunosorbent assay)，來檢測具有分泌抗體能力的融合瘤細胞。首先將實施例一所得之蓖麻毒素，以coating buffer(15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,0.02% NaN3,pH 9.6)稀釋為1μg/ml後，加到96孔的ELISA免疫分析盤中(100μl/well)，放置於4℃隔夜，使蓖麻毒素可結合在ELISA免疫分析盤上。第二天以PBST(為PBS中含0.1%的Tween 20)清洗ELISA免疫分析盤三次後，加入1%的BSA(溶於PBST中)(200μl/well)，進行blocking，以覆蓋未被抗原結合之空位(37℃，1小時)。

(i)再將免疫分析盤以PBST清洗三次後，加入融合瘤細胞培養液(50μl/well為1級抗體)，於37℃反應1小時。再以PBST清洗免疫分析盤五次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標幟的2級抗體(goat anti-mouse，以1：5000稀釋於1%的脫脂牛奶中)，(50μl/well)，於37℃反應1小時。最後以PBST清洗免疫分析盤五次後，加入100μl/well呈色劑3,3,5,5-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzid ine，簡稱TMB)，於25℃中反應15分鐘。之後加入終止溶液0.16M的硫酸溶液來終止反應，以酵素免疫分析儀測定450nm(OD450)的吸光值。

(j)為了進一步分析融合瘤細胞，所分泌之抗體的專一性，並確定其可與蓖麻毒素反應，遂將經酵素免疫分析 (ELISA)，具有反應的融合瘤細胞株進行西方點墨法的分析。首先蓖麻毒素，經過十二硫酸脂鈉-多聚丙烯醯胺膠體(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質後，轉漬至硝化纖維紙(nitrocellulose paper,NC paper)上，進行西方點墨法的分析。

(k)融合瘤細胞單株化(寄存編號8C12.1)：將具有對抗蓖麻子毒素抗體的融合瘤細胞株，利用極限稀釋法進行。將具有對抗蓖麻子毒素抗體的融合瘤細胞株，取30個細胞加200ml含20%血清及融合瘤反應試劑(Roche)之HT RPMI 1640培養液，在96孔微量培養盤培養，10-14天觀察有無單株化形成。

3、抗蓖麻子毒素單株抗體之製備：

(a)將0.5mL的降植烷(pristane)打入小鼠腹腔內，七天後將5x106~1x107前述本發明融合瘤細胞(寄存編號8C12.1)打入小鼠腹腔內，約7至14天後，小鼠腹部會逐漸膨大，接著每隔2至3天收集一次腹水，每次約2mL，每隻小鼠約共可收集5-10mL之腹水。

(b)將前述收集之腹水以1500rpm離心10分鐘後，收集上清液，以0.45μm過濾器過濾，為溶液B。

(c)將protein G-sepharose以50mM pH 7.0的Tris緩衝液平衡之，然後將溶液B通入protein G-sepharose之管柱中，經5倍純化管柱體積之50mM、pH7.0的Tris緩衝液清洗，再以0.1M、pH 3.0的檸檬酸緩衝液洗滌之，收集被沖洗出之單株抗體並以1M、pH 9.0的Tris-HCl緩衝液中和其酸鹼度，並保存之，所得為本發明蓖麻子毒素單株抗體。

4、以本發明單株抗體偵測蓖麻子毒素：

利用本發明單株抗體來偵測蓖麻子毒素，其可如 第2圖所示。

(a)將捕捉能力最佳之單株抗體8C12.1與辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase，簡稱HRP)，形成溶液C。

(b)取100uL(100ng/mL)蓖麻子毒毒素與溶液C，共同加到以1% BSA磷酸鹽緩衝溶液處理過的含有本發明單株抗體，覆被(coating)於96孔盤培養皿中，並置於37℃環境下反應120分鐘。

(c)將前述(2)步驟之96孔盤培養皿(即固相載體)以含有0.05% Tween-20之pH 7.4的磷酸鹽衝溶液清洗5次，再後加入100uL呈色劑3,3,5,5-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine，簡稱TMB)於25℃中反應15分鐘。之後加入100uL終止溶液0.16M的硫酸溶液來終止反應，再吸取呈色反應上清液加至前述96孔盤中，並以ELISA讀機讀取波長450nm吸光值。

5、含抗蓖麻子毒素單株抗體之免疫檢測試劑：

本發明含有抗蓖麻子毒素單株抗體之偵測蓖麻毒素能力，可透過側向層析檢測來驗證。其如第1圖所示，在側向層析試驗器100中，在抗體塗布膜30(antibody coated membrane)上塗布單株抗體A(其可辨識蓖麻毒素之A鏈)，並將膠體金粒子(colloid gold particles)與抗蓖麻子毒素單株/多株抗體結合後，加至共軛墊20(conjugated pad)區域。

上述處理過的側向層析試驗器100取五個，在樣品墊(sample pad)10上分別加入濃度為磷酸鹽緩衝溶液(不含蓖麻子毒素，做為對照組)、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL，液體會往吸水墊40(absorption pad)移動，觀察其偵測結果，其結果如第3圖所示。其中C區為對照條紋，T區則為樣本中的蓖麻子毒素與本發明單株抗體結合而顯示出的條紋。隨著蓖麻子毒素濃度越高，T區的條紋越深，顯示本發明單株抗體可專一性辨識蓖麻子毒素。

同樣地，上述處理過的側向層析試驗器100取五個，在樣品墊(sample pad)10上分別加入磷酸鹽緩衝溶液(做為對照組)、100ng/mL的蓖麻子毒素、100ng/mL的雞母珠毒蛋白(Abrin)、100ng/mL的肉毒桿菌A型毒素、100ng/mL的肉毒桿菌B型毒素，其結果如第4圖所示，結果顯示只有蓖麻子毒素做為樣品在T區有條紋出現，顯示出本發明單株抗體可專一性辨識蓖麻子毒素。

接著，同樣地，取上述處理過的側向層析試驗器100取五個，在樣品墊(sample pad)10上分別加入摻有蓖麻子毒素100ng/mL的牛奶、100ng/mL的咖啡、100ng/mL的可樂、100ng/mL的果汁、100ng/mL的茶，其結果如第5圖所示，結果顯示出牛奶、咖啡、可樂、果汁、茶皆可被偵測到添加的蓖麻子毒素，而其中又以咖啡呈色反應最強。

6、含抗蓖麻子毒素單株抗體之免疫檢測試劑：本發明含有抗蓖麻毒子素單株抗體之免疫檢測試劑，可檢測待測樣本中的蓖麻子毒素，於較佳實施例中，係透過三明治-免疫檢測法(Sandwich ELISA)來檢測蓖麻毒素，示意圖第6圖所示，該免疫檢測試劑含有單株抗體50，其可辨識蓖麻子毒素之A鏈(SEQ ID NO.1)，並塗布在固相載體200上做為抓住蓖麻子毒素90的物質，而可辨識蓖麻子毒素單株抗體60則與辣根過氧化物酶(HRP)80連接，其可透過辨識蓖麻子毒素來抓住蓖麻子毒素。

藉由上述ELISA來檢測1~1000ng/mL的蓖麻子毒素、1~1000ng/mL的雞母珠毒蛋白(Abrin)、1~1000ng/mL的肉毒桿菌A型毒素、1~1000ng/mL的肉毒桿菌B型毒素，並以O.D.450nm波長讀取值，其結果如第7圖所示，結果顯示，只有蓖麻子毒素可被本發明免疫檢測試劑所偵測。

此外，使用本發明檢測試劑來偵測添加於市售飲料之蓖麻子毒素，其結果如表一所示，結果顯示全脂牛奶、5%脫脂牛奶、優格、10%蜂蜜、10%可口可樂、10%燕麥、10%番茄醬、10%蔬果汁、10%葡萄汁、10%柳橙汁皆能偵測到最少1ng/mL額外添加的蓖麻子毒素。

Symbols：+++,OD.>1.0；++,OD.0.5~1.0；+,OD.0.10~0.49；-,OD.<0.1.

使用本發明檢測試劑應用於模擬之臨床檢體中，偵測正常人體及balb/c品系小鼠之蓖麻子毒素，其結果如表二所示，顯示不論取自身體正常之自願者從前臂中靜脈採血靜置之血清、正常尿液及糞便：或是小鼠從眼窩採血所得血清，正常尿液及糞便，各用磷酸緩衝液以1：10之體積比進行稀釋，加入固定濃度之蓖麻子毒素，以本檢測試劑進行偵測，結果顯示不論是小鼠或人類之十倍稀釋之血清、尿液與糞便皆不會抑制此檢測法之靈敏度(如表二所示)，而表列之臨床模擬檢體在此檢測法中皆不會產生偽陽性之結果。

Symbols：+++,OD.>1.0；++,OD.0.5~1.0；+,OD.0.10~0.49；-,OD.<0.1.

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

寄存機構：財團法人食品工業發展研究所

寄存日期：103年6月17日

寄存編號：BCRC960487

<110> 國防醫學院

<120> 蓖麻子毒素融合瘤細胞株、其單株抗體、及包含該單株抗體的免疫檢測試劑及套組

<130>

<140> TW 103131558

<141> 2014-09-12

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 310

<212> PRT

<213> Ricinus communis

<400> 1

Claims (14)

1. 一融合瘤細胞株，其寄存編號為BCRC960487，該融合瘤細胞株係由一親代細胞與一骨髓瘤細胞株融合而製成，該親代細胞係由將一蓖麻子毒素做為抗原免疫至一小鼠，並將該小鼠之一脾臟細胞取出而得，且該融合瘤細胞株可產生一單株抗體能夠專一性辨識一蓖麻毒素(Ricin)之A鏈，且對似蓖麻子毒素無交叉反應；其中該蓖麻毒素(Ricin)之A鏈之序列為SEQ ID NO.1之蛋白序列。
2. 如申請專利範圍第1項之融合瘤細胞株，該小鼠係為一BALB/c品系小鼠。
3. 如申請專利範圍第1項之融合瘤細胞株，該骨髓瘤細胞株係來自一FO小鼠骨髓瘤細胞株CRL-1646。
4. 一種蓖麻子毒素單株抗體，其特徵在於該單株抗體係由申請專利範圍第1至第3項中任一項之融合瘤細胞株所產生，且能夠專一性辨識一蓖麻毒素(Ricin)之A鏈，且對似蓖麻子毒素無交叉反應；其中該蓖麻毒素(Ricin)之A鏈之序列為SEQ ID NO.1之蛋白序列。
5. 一免疫檢測試劑，其係利用酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)檢測一待測抗原，其特徵在於該免疫檢測試劑中含有如申請專利範圍第4項之單株抗體。
6. 如申請專利範圍第5項之免疫檢測套組，進一步包含一偵測抗體及一訊號產生物質。
7. 如申請專利範圍第6項之免疫檢測套組，該偵測抗體及該訊號產生物質係透過共軛結合。
8. 如申請專利範圍第6項之免疫檢測套組，該訊號產生物質係選自下列所構成的群組之一：放射性標記物、磷光標記物、冷光標記物、螢光標記物及酵素。
9. 如申請專利範圍第8項所述之免疫檢測套組，該冷光標記物係為一化學冷光標記物或一生物冷光標記物。
10. 如申請專利範圍第8項所述之免疫檢測套組，該酵素系選自下列所構成的群組之一：過氧化氫酶(Hydrogen Peroxidase)、辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase，簡稱HRP)、鹼性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，簡稱AP)以及Beta-半乳糖苷酸酶(Beta-galactosidase)。
11. 如申請專利範圍第5項之免疫檢測套組，進一步包含一受質，該受質可與該酵素反應而發生呈色反應。
12. 一種免疫檢測方法，係利用一酵素連結免疫吸附試驗法(ELISA)進行檢測，包含有下列步驟：提供一固相載體(Solid phase carrier)；提供一單株抗體，該單株抗體具有申請專利範圍第4項所述之特徵；將該單株抗體施加(Applying)至該固相載體；提供一樣本抗原，該樣本抗原係與該單株抗體進行專一性結合並於該固相載體上形成一免疫複合物；提供一偵測試劑，該偵測試劑可操作性地與該免疫複合物進行免疫反應，並產生一訊號；以及偵測該訊號。
13. 如申請專利範圍第12項之免疫檢測方法，該樣本抗原係衍生自蓖麻子萃取之毒素蛋白。
14. 如申請專利範圍第12項之免疫檢測方法，該偵測試劑包含有一偵測抗體與一訊號產生物質。