CN113484522B - SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学检测试剂领域，具体而言，涉及一种SARS‑CoV‑2中和抗体检测试剂盒及其制备方法。该制备方法包括将ACE2胞外域所包被的固相载体、与标签蛋白偶联的RBD、与酶缀合的抗所述标签蛋白的检测抗体封装为试剂盒；所述ACE2胞外域在pH＝6.8～7.4的条件下包被所述固相载体。本发明所提供的试剂盒灵敏度高，制备简单，线性范围好，检测准确。

Description

SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学检测试剂领域，具体而言，涉及一种SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
2019新型冠状病毒，被世界卫生组织命名为“2019-nCoV”，后被国际病毒分类委员会命名为“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)”。SARS-CoV-2为圆形或椭圆形的β属新型冠状病毒，呼吸道飞沫传播和接触传播是其主要传播途径。人群普遍易感，潜伏期一般3～7天，潜伏期内存在传染性。SARS-CoV-2感染或疫苗免疫后引发免疫反应，包括在血液中产生结合抗体，其中中和抗体可以阻断病毒的细胞浸润和复制。对于抑制及消除新冠传播的重要途径。
SARS-CoV-2疫苗，灭活病毒疫苗、腺病毒疫苗、RNA疫苗、重组蛋白疫苗，人群中疫苗保护有效率在70％～95％，少部分人群在疫苗接种后，依然感染患者。疫苗二针免疫后中和抗体水平随免疫时间有下降趋势。康复患者及疫苗免疫后不能完全排除在此感染的风险。中和抗体水平检测对间检测人群免疫后抗体水平动态变化具有重要价值。
中和抗体检测采用野病毒中和菌斑减少试验(PRNT)，需要在BSL3级试验室中进行。检测通量低，过程繁杂，对操作要求高。IgG/IgM免疫层析或酶联免疫检测试剂一方面因灵敏度低不能实现体内极低含量中和抗体水平检测，另一方面，结合抗体滴度水平与中和抗体滴度并不是成比例关系，不能反应中和抗体真实的滴度。
因此，需要一种简单、快速高灵敏度中和抗体检测试剂，实现疫苗接种后中和抗体滴度检测，动态监控中和抗体水平，为人群免疫提供精准指导。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒的制备方法，包括将ACE2胞外域所包被的固相载体、与标签蛋白偶联的RBD、与酶缀合的抗所述标签蛋白的检测抗体封装为试剂盒；
所述ACE2胞外域在pH＝6.8～7.4的条件下包被所述固相载体；
所述ACE2胞外域的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。
所述RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。
可选的，如上所述的方法，所述试剂盒还含有质控抗体、所述酶的反应底物及终止试剂、包被有检测反应无关蛋白的固相载体、阴性对照、阳性对照以及洗涤缓冲液中的一种或多种。
可选的，如上所述的方法，所述质控抗体包含氨基酸序列依次如SEQ ID NO:3～5所示的重链互补决定区H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，以及氨基酸序列依次如SEQ ID NO:6～8所示的轻链互补决定区L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3。
可选的，如上所述的方法，所述质控抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10所示。
可选的，如上所述的方法，所述反应无关蛋白为BSA。
可选的，如上所述的方法，所述阴性对照为5％～15％的FBS溶液。
可选的，如上所述的方法，所述阳性对照为抗所述RBD的抗体。
可选的，如上所述的方法，所述标签蛋白选自His、Fc、myc、Flag、HA、SUMO、GFP、GST、Dsb、FkpA中的任一种。
可选的，如上所述的方法，所述酶选自辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。
可选的，如上所述的方法，所述固相载体是塑料、微粒或膜载体。
根据本发明的第二方面，涉及如上所述方法制备得到的SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒。
本发明的有益效果为：
本发明所提供的试剂盒灵敏度高，制备简单，线性范围好，检测准确。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中参考值范围ROC曲线；
图2为本发明一个实施例中ELISA log-中和试验log回归分析。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明涉及一种SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒的制备方法，包括将ACE2胞外域所包被的固相载体、与标签蛋白偶联的RBD、与酶缀合的抗所述标签蛋白的检测抗体封装为试剂盒；
所述ACE2胞外域在pH＝6.8～7.4的条件下包被所述固相载体；
所述ACE2胞外域的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。
所述RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。
本发明所涉及的组分，例如ACE2胞外域、RBD的氨基酸序列还可以与选自各自的氨基酸序列具有至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性或至少约99％同一性的序列，优选保留各自的功能，000例如对于ACE2胞外域、RBD，其具有特异性结合形成ACE2胞外域-RBD复合体的功能。
“实质上相似”氨基酸序列还可以为仅包括保守区中的保守氨基酸置换。例如给定的氨基酸序列与参比序列共有至少85％、更优选至少90％和甚至更优选至少95％的同一性。此外，总的来说，仅描述或编码其中在保守区中作出仅保守置换的蛋白的序列实质上相似。优选地，实质上相似的序列亦保留多肽的独特活性。通常视为保守置换的置换是在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的彼此置换、羟基残基Ser和Thr的互换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的置换、碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香残基Phe、Tyr间的置换。
在一些实施方式中，pH＝6.8～7.4的条件由缓冲组分提供，例如磷酸盐缓冲液。
在一些实施方式中，所述试剂盒还含有质控抗体、所述酶的反应底物及终止试剂、包被有检测反应无关蛋白的固相载体、阴性对照、阳性对照以及洗涤缓冲液中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述质控抗体为人和动物的嵌合抗体。动物可以为鼠(小鼠、大鼠)、兔、绵羊、山羊、马、鸡、牛、犬等。
在本发明中，“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)、人源化(humanized)抗体以及人抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将动物源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻动物源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌动物源性特异性单抗的杂交瘤，然后从动物杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将动物可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。
术语“互补性决定区”或“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，如Kabat等人所定义(Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest,5thEd"US Department of Health and Human Services,NIH,1991,和后来的版本)。本申请采用Kabat编号系统对CDR进行定义。有三种重链CDR和三种轻链CDR。此处，取决于情况，术语“CDR”和“CDRs”用于指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。在另一具体实施方式中，CDR区或CDR是指IMGT定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区。
在一些实施方式中，所述质控抗体包含氨基酸序列依次如SEQ ID NO:3～5所示的重链互补决定区H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，以及氨基酸序列依次如SEQ ID NO:6～8所示的轻链互补决定区L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3。
在一些实施方式中，所述质控抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10所示。
质控抗体的变体也在本发明范围内，例如各自与本发明所述的各个CDR、或可变区VL和/或VH序列具有至少70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或高于99％同一性的序列。在一些情况下，抗体的变体至少包括上述6个CDR；在一些情况下，质控抗体或其抗原结合片段的变体至少包括一个重链和一个轻链，而在其他情况下，变体形式含有两个相同的轻链和两个相同的重链(或其子部分)。
在一些实施方式中，所述反应无关蛋白为BSA。
在一些实施方式中，所述阴性对照为5％～15％的FBS溶液，例如7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％。
在一些实施方式中，所述阳性对照为抗所述RBD的抗体。
在一些实施方式中，所述标签蛋白选自His、Fc、myc、Flag、HA、SUMO、GFP、GST、Dsb、FkpA中的任一种。
可选的，Fc片段的氨基酸序列为SEQ ID NO:11所示。
在一些实施方式中，所述酶选自辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。
在一些实施方式中，所述固相载体是塑料、微粒或膜载体；所述塑料可以是聚苯乙烯；微粒可以是磁微粒；所述膜载体可以是硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜。
在一些实施方式中，所述固相载体选自试管、EP管、多孔板、层析柱、微量反应板凹孔。
在本发明中，术语“微粒”可以为球体、近球体、立方体、多面体或不规则形状。微球的直径优选为10nm～1mm，例如100nm、500nm、1μm、10μm、100μm、500μm；优选为400nm～10μm。
微粒优选为磁微粒，其成分中含有磁性物质。磁性物质可以为金属(金属单质或合金)、非金属，或金属与非金属所形成的复合物。金属例如铁、铝镍钴金属等；非金属例如铁氧体非金属(优选为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子)；金属与非金属所形成的复合物例如钕铁硼橡胶磁复合材料。
多孔板优选为酶标板，其含有的孔位可以为8、16、32、48、64、96或更多。
本发明还涉及如上所述方法制备得到的SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒。
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品(例如，包装或容器)。试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
部分组分可以溶液、干粉(优选以冻干形式)保存。例如以一种或多种所谓的冻干珠的形式实现。冻干珠通常可以被理解为是指在制造后(在所述制造后物质通常作为粉末存在)被压制成球形的冻干物。适合冻干的组分例如酶、抗体或与标签蛋白偶联的RBD。
本发明还涉及一种检测SARS-CoV-2中和抗体的方法，所述方法包括：
a)获取待检测样本；
b)将所述待检测样本与所述与标签蛋白偶联的RBD共孵育，清洗后与所述ACE2胞外域所包被的固相载体共孵育，再加入所述检测抗体，并根据所述检测抗体上缀合的酶确认中和抗体的存在和/或含量。
在某些实施方案中，生物样品是体液。体液可以是从受试者身体的任何地方(例如外周部位)分离出来的液体，包括但不限于，例如血液、血浆、血清、尿液、痰液、脊髓液、脑脊液、胸腔积液、乳头抽吸液、淋巴液、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的液体、泪液、唾液、乳汁、来自淋巴系统的液体、精液、脑脊液、器官内系统液体、腹水、肿瘤囊肿液、羊水及其组合。例如，体液是尿液、血清或脑脊液。检测SARS-CoV-2所用的样本优选为受试者的上呼吸道标本(如咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子等)、下呼吸道标本(如呼吸道吸取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、深咳痰液等)、眼结膜拭子、粪便标本、肛拭子、抗凝血和血清标本等。临床标本应尽量采集病例发病早期的呼吸道标本(尤其是下呼吸道标本)和发病7天内急性期血清以及发病后第3～4周的恢复期血清。
上述用途的受试者可以指患者或怀疑携带有SARS-CoV-2的动物，特别是哺乳动物，例如蝙蝠、果子狸；优选为灵长类动物，更优选为人。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1RBD中和抗体制备
杂交瘤细胞株制备：以293T细胞重组表达的RBD His蛋白以弗氏完全佐剂背部皮下免疫BALB/c小鼠，每只25μg。利用弗氏不完全佐剂进行二免、三免。三免断尾采血，血清效价达到1:64万，50μg RBD蛋白腹腔加强免疫，3天后取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5:1比例进行PEG1450融合。细胞上清效价直接法包被RBD蛋白(0.1μg/mL)，5倍稀释，羊抗鼠HRP二抗检测，OD450大于1阳性杂交瘤细胞进行3次亚克隆筛选，最终得到识别RBD蛋白的杂交瘤细胞株。
中和抗体筛选：直接法包被RBD蛋白(0.1μg/mL)，加入抗体孵育1小时，加入1：1000稀释的ACE2-HRP(星宝生物HRP标记试剂盒)，依据IC50确定最优中和抗体R7。经抗体亚型鉴定试剂盒(洛阳佰奥通)鉴定抗体亚型为IgG1,κ轻链。
小鼠IgG通用引物测定抗体可变区序列，重链HCDR1：GYSFTGYF，HCDR2：INPYTGDT，HCDR3：GRRDY。轻链LCDR1：QSVDYNGISS，LCDR2：AAS，LCDR3：QQTIEDP。根据KAbbt分析，将人IgG1重链恒定区、轻链恒定区替换，制作嵌合抗体HR7，作为中和抗体检测质控品。
实施例2ACE2蛋白包被方式建立
人ACE2蛋白胞外区为18-740氨基酸，在细胞膜表面结合新冠病毒SARS-CoV-2刺突蛋白RBD结构域。ACE2胞外域氨基酸N端氨基酸裂隙构象，与RBD蛋白结合中有重要作用，含有6个糖基化位点，等电点pI5.41，属于酸性蛋白。pH7.0中性溶液中，不考虑糖链所带负电荷，含有-20电荷，在pH9.6以上缓冲液中，有-52电荷。其中，ACE2胞外区N端(18-400)等电点4.8，C端(401～740)等电点5.8，pH中性条件，N端携带-25电荷，C端5.8电荷。较高的负电荷一方面不利于在微孔板表面充分吸附，包被后容易脱落，导致微孔板ACE2孔间反应活性存在差异，适度降低N端表面电荷量有利于增加ACE2蛋白包被密度。另一方面通诱导ACE2蛋白与微孔板接触的空间构象定向，使ACE2蛋白N端远离微孔板表面，维持正确构象，提升其与RBD蛋白的稳定性与亲合力。
利用碳酸盐缓冲液(pH 9.6、pH9.0)、Tris缓冲液(pH8.6、pH8.0)、磷酸盐缓冲液(pH7.4、6.8),配置2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.078μg/mL浓度ACE2溶液，每孔100μL，4℃16小时包被。微孔板用200μL 5％BSA溶液37℃封闭2小时。加入50ng RBD-HRP溶液反应30min,TMB底物显色，测定OD450吸光值。在pH6.8～7.4包被，ACE2低浓度时，具有良好的反应活性。
Figure BDA0003099520440000081
实施例3RBD蛋白及信号检测方法
新冠病毒SARS-CoV-2病毒刺突蛋白以三聚体形式与细胞ACE2结合侵入细胞，核心结构域RBD(319～541氨基酸)对与ACE2蛋白亲和力起重要作用，RBD蛋白突变可以显著改变病毒与ACE2的亲和力，如变株B.1.617N501Y导致病毒传染能力大幅提升。RBD蛋白保持正确构象对中和抗体识别识别非常重要。筛选RBD-His、RBD-mFc重组蛋白直接标记HRP(星宝生物标记)进行检测，通过抗标签Tag酶标抗体(His抗体-HRP、羊抗鼠Fcγ-HRP)进行检测。RBD使用3ng/mL浓度进行检测。
结果显示，通过抗标签Tag抗体间接进行检测，具有较高灵敏度，优于在RBD重组蛋白直接标记方法。HRP直接标记RBD蛋白因无法精准控制HRP偶联氨基酸，导致影响中和抗体与RBD抗体的结合。
Figure BDA0003099520440000091
实施例4试剂体系建立与检测方法
试剂盒制备流程：微孔反应板A按照每孔200μL体积加入5％BSA溶液，8℃封闭16小时，真空干燥30分钟，加入干燥剂于铝箔袋中密封保存。微孔反应板B按照每孔100μL体积加入1.5μg/mL ACE2-His蛋白溶液(293T细胞重组表达)，包被液为7.2PB缓冲液。4℃包被16小时。200μL酶标板稳定剂，37℃封闭2小时，干燥间(25℃、<30％湿度)干燥16小时，加入干燥剂于铝箔袋中密封保存。RBD-Tag蛋白用5％FBS、0.15％Tween-20、0.05％p300 HEPES缓冲液(pH7.0)配置2ng/mL工作液。羊抗鼠IgG抗体按照1:4偶联HRP(星宝生物)，10kD超滤管超滤。酶标抗体用3％BSA、0.15％Tween-20、0.05％p300、3％蔗糖HEPES缓冲液(pH7.0)按照1:10000比例配置成酶标工作液。TMB底物液Thermo，2M H2SO4作为终止液。25xPBST(pH7.4)为洗涤液母液，使用时稀释25倍。嵌合抗HR7 10％FBS溶液作为阳性质控品。10％FBS溶液配置阴性对照。阳性质控品6000U/mL用阴性对照基质按照1:3比例稀释，配置2000、666、222、74、25U/mL校准品，阴性质控品为0U/mL。
组份 主要组成成分
1.微孔反应板A BSA封板
2.微孔反应板B 已包被ACE2蛋白
3.RBD溶液 重组RBD-Tag蛋白
4.酶标抗体 羊抗鼠Fc酶标复合物溶液
5.阳性对照 重组RBD抗体溶液
6.阴性对照 10％FBS溶液
7.洗涤浓缩液 25×的PBST储备液
8.TMB底物溶液 四甲基联苯胺、过氧化脲溶液
9.终止液 2M硫酸
10.封膜 非渗透性软膜
反应模式一：两步法，RBD与样本预反应，然后与ACE2(2μg/mL)微孔板反应。微孔反应板A中加入20μL样本或校准品，同时每孔加入100μL RBD-Tag蛋白溶液，封板膜膜密封，37℃孵育30min。取100μL反应液转入微孔反应B板，37℃孵育30分钟。若样本存在中和抗体，则RBD-中和抗体复合物阻断RBD与ACE2蛋白结合。反之游离RBD-Tag蛋白与ACE2蛋白反应。孵育结束后，甩净微孔反应板B中液体，洗涤液洗涤3次，加入100μL酶标抗体37℃孵育30min。洗涤3次，每孔加入100μL TMB底物液，37℃避光孵育15min。加入100μL终止液，酶标仪读数测量波长450nm，读取各孔OD值。样本中和抗体通过公式：抑制率＝(1-样本OD/阴性质控)×100％进行计算。
反应模式二：一步法，RBD与样本、ACE2蛋白同步反应。微孔反应板B中加入16μL样本或校准品，同时每孔加入84μL RBD-Tag蛋白溶液，封板膜密封，37℃孵育30min。其他同一步法反应体系。
两步法检测IC50为146U/mL，一步法检测IC50 936U/mL，两步法检测中和抗体灵敏度优于一步法检测模式。
Figure BDA0003099520440000101
Figure BDA0003099520440000111
实施例5参考值范围的确立
按照试剂盒检测流程，检测2020收集健康人血清样本784例，检测疫苗接种后样本573例，复孔检测。根据约登指数方法分析，当参考值CUTOFF 34％，阴性符合率为99.2％(778/784)，阳性符合率为83.6％(479/573)，曲线下面积AUC 0.95(图1)。
Figure BDA0003099520440000112
根据疫苗接种时间统计接种采样时间与中和抗体滴度之间的关系。接种一针后，中和抗体阳性率46.7％；接种疫苗二针1～60天内，中和抗体阳性率89.3％；接种疫苗二针61～120天样本，中和抗体阳性率89.9％；接种疫苗二针大于≥121天，中和抗体阳性率75.6％，随时间推移，中和抗体阳性检出率有下降趋势。
免疫时间(天) 例数(N) 阳性(>34％) 中和抗体检出率
一针(7～14) 15 7 46.7％
二针后1～60 224 200 89.3％
二针后61～120 69 62 89.9％
二针后≥121 205 155 75.6％
实施例6中和抗体ELISA与真病毒试验中和试验比较
选择100例野病毒中和试验(微量细胞病变法CPE)测定样本，PRNT50抗体滴度(中国生物北京所)，倍比稀释。样本倍比稀释进行检测，按照34％抑制率，最大稀释比例作为样本中和抗体滴度。酶联免疫中和抗体滴度与PRNT50中和抗体进行相关回归分析，结果如图2所示。Pearson product-moment correlation coefficient分析中和抗体浓度(ELISA，log10)与噬斑减少中和试验(PRNT，log10转换)，ELISAlog C＝-0.1889+1.556log(PRNT)，r＝0.737，呈现高度正相关。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 上海捷诺生物科技有限公司
<120> SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒及其制备方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 722
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 1
Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn His
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn Tyr
20 25 30
Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala Gly
35 40 45
Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln Met
50 55 60
Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu Gln
65 70 75 80
Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser Lys
85 90 95
Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr Gly
100 105 110
Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu Pro
115 120 125
Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg Leu
130 135 140
Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg Pro
145 150 155 160
Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala Asn
165 170 175
His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asn
180 185 190
Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp Val
195 200 205
Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His Ala
210 215 220
Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser Pro
225 230 235 240
Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg Phe
245 250 255
Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro Asn
260 265 270
Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln Arg
275 280 285
Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro Asn
290 295 300
Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly Asn
305 310 315 320
Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys Gly
325 330 335
Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe Leu
340 345 350
Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala
355 360 365
Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His Glu
370 375 380
Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His Leu
385 390 395 400
Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu Thr
405 410 415
Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr Leu
420 425 430
Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys Gly
435 440 445
Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys Arg
450 455 460
Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr Cys
465 470 475 480
Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile Arg
485 490 495
Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu Cys
500 505 510
Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser Asn
515 520 525
Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly Lys
530 535 540
Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys Asn
545 550 555 560
Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr Trp
565 570 575
Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp Trp
580 585 590
Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu Lys Ser
595 600 605
Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met Tyr Leu
610 615 620
Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu Lys Val
625 630 635 640
Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val Ala Asn
645 650 655
Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro Lys Asn
660 665 670
Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile Arg Met
675 680 685
Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn Ser Leu
690 695 700
Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln Pro Pro
705 710 715 720
Val Ser
<210> 2
<211> 224
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 2
Ala Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
1 5 10 15
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
20 25 30
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
35 40 45
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
50 55 60
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
85 90 95
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
100 105 110
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
115 120 125
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
130 135 140
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
145 150 155 160
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
165 170 175
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
180 185 190
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
195 200 205
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 3
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Phe
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 4
Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Asp Thr
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 5
Gly Arg Arg Asp Tyr
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 6
Gln Ser Val Asp Tyr Asn Gly Ile Ser Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 7
Ala Ala Ser
1
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 8
Gln Gln Thr Ile Glu Asp Pro
1 5
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 9
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Thr Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ala Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Gly Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 10
<211> 120
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 10
Asp Ile Val Ile Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Phe Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asn
20 25 30
Gly Ile Ser Ser Val His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ile
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
115 120
<210> 11
<211> 227
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 11
Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu
1 5 10 15
Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr
20 25 30
Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys
35 40 45
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val
50 55 60
His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
65 70 75 80
Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu
145 150 155 160
Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro
165 170 175
Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val
180 185 190
Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu
195 200 205
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225

Claims (9)

1.一种SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒的制备方法，包括将ACE2胞外域所包被的固相载体、与标签蛋白偶联的RBD、与酶缀合的抗所述标签蛋白的检测抗体、质控抗体封装为试剂盒；
所述ACE2胞外域在pH＝6.8～7.4的条件下包被所述固相载体；
所述ACE2胞外域的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示；
所述RBD的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示；
所述质控抗体包含氨基酸序列依次如SEQ ID NO:3～5所示的重链互补决定区H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，以及氨基酸序列依次如SEQ ID NO:6～8所示的轻链互补决定区L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
所述标签蛋白选自Fc。
2.根据权利要求1所述的方法，所述试剂盒还含有所述酶的反应底物及终止试剂、包被有检测反应无关蛋白的固相载体、阴性对照、阳性对照以及洗涤缓冲液中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的方法，所述质控抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9所示，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10所示。
4.根据权利要求2所述的方法，所述反应无关蛋白为BSA。
5.根据权利要求2所述的方法，所述阴性对照为5％～15％的FBS溶液。
6.根据权利要求2所述的方法，所述阳性对照为抗所述RBD的抗体。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，所述酶选自辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。
8.根据权利要求1～6任一项所述的方法，所述固相载体是塑料、微粒或膜载体。
9.权利要求1～8任一项所述方法制备得到的SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒。
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