CN114150020A - 基于化学发光免疫分析法的vzv感染诊断检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于化学发光免疫分析法的VZV感染诊断检测试剂盒。自动化化学发光免疫检测技术可以检测水痘‑带状疱疹病毒特定抗体,例如免疫球蛋白同种型G、A和M(IgG、IgA和IgM),从而诊断与水痘‑带状疱疹病毒感染相关的疾病。本发明的试剂盒同样适用于筛选各种疑似与VZV感染相关的疾病或症状的受试者。
Description
技术领域
本发明属于医学和临床生物技术领域,具体涉及诊断装置和方法,并特别涉及化学发光免疫分析技术和易于检测和/或监测水痘-带状疱疹病毒特异性免疫球蛋白IgG、IgA和IgM存在的试剂盒及方法。
背景技术
水痘-带状疱疹病毒(VZV),被称为人类疱疹病毒-3型(HHV-3),其和单纯疱疹病毒(HSV)均属于α-疱疹病毒科亚科。VZV是一种双链DNA(125kb)病毒,由直径120nm的二十面体衣壳组成,且被脂质包膜包围。此病毒可导致儿童、青少年和年轻人的水痘疾病或水痘,被治愈后病毒仍可潜伏在人体中。直到成年或老年时,潜伏病毒可复发导致带状疱疹。水痘在成年人中发病率较低,但在孕妇和免疫功能低下的成年人中很常见,这些人都是高危人群。
虽然VZV属于具有轻度症状的疾病,但其相关疾病致病率高,可能危及生命,这主要与长期病毒性神经毒性有关,包括智力发育障碍、水痘病例中水痘脑膜脑炎和感染后脑病以及血管炎(神经系统综合征)、带状疱疹病例中无疹性带状疱疹和带状疱疹后神经痛(难以治疗)。目前,早期的VZV诊断方法较为缺乏,导致治疗延迟,最终导致死亡,特别是在VZV感染率极高的温带地区,特别发生在新生儿、老年人、器官移植接受者和免疫功能低下的人群中。
如今,VZV疫苗接种使得原发性水痘-带状疱疹病毒感染(Pr-VZV-In)的发病率显著下降,尤其是在实施疫苗接种计划且执行良好的国家(两剂)。这使得住院治疗减少,而实验室的常规生物诊断更重要。在这些国家中,如果有评估IgG、IgA和/或IgM的VZV生物测试,则已经重新规定,更多地要求已经暴露于VZV的孕妇、手术或器官移植前的危重患者、免疫功能低下的人和接种前和接种后的人,包括医院从业者评估IgG、IgA和/或IgM,以便在免疫接种计划评估的独特背景下评估其免疫力。常规的VZV诊断与疫苗评估一样重要。事实上,许多报告假设,水痘特异性疫苗的实施将伴随疫苗后水痘带状疱疹(Ps-VZV)或带状疱疹的病例增加,这表明在带状疱疹疫苗接种中,在常规流行病学监测中使用抗体检测测试引起了人们极大的兴趣。在许多其他国家,例如中国和挪威,抗VZV的疫苗项目尚未实施,或VZV疫苗接种覆盖范围不均匀,快速的病例诊断至关重要。在这些国家中报道水痘感染病例,尤其是报道发生在学校、机构、医疗中心或医院等公共地区的水痘感染病例,将防止迅速传染给易感人群(孕妇、新生儿、免疫功能低下人群),从而防止他们进展为感染并发症,更重要的是较为容易控制疫情爆发,因为诊断延迟可能是致命的。此外,鉴于实施疫苗接种计划,或扩大现有疫苗接种计划的覆盖范围的目的,对接种疫苗前免疫力的评估是疫苗接种成功实施的关键。因此,非常需要对VZV感染的免疫学诊断。
在已经建立和未实施抗VZV疫苗项目的国家都需要通过IgG、IgA和IgM抗体(或免疫)评估诊断VZV感染。常规生物诊断已经变得具有挑战性,因为目前在实验室使用的诊断测试的敏感性和特异性都是有限的。目前,市场上缺乏高度灵敏的免疫诊断测试,或没有广泛使用,甚至更多未被批准用于临床使用。实际上在过去的十年里,已经开发了一些具有可变敏感度的生物诊断检测,用于检测VZV特异性IgG,以及程度较小的IgA、IgM或多克隆抗体,但其中大部分免疫球蛋白型抗体检测敏感性较低,包括直接荧光抗体(DFA)(60%-80%)和基于免疫荧光分析(IFA)以及酶免疫分析(EIA)的Tzanck涂片诊断试剂盒(42%-90%)。使用病毒培养分析的VZV检测导致高毒性和污染,影响诊断结果,假阴性较为常见(46%敏感性)。此外,这些生物诊断方法通常是劳动密集型和耗时的,需要细致的标本收集和高度训练有素的技术人员。那些具有高检测敏感性和特异性(分别约97.8%和96.8%)的检测方法,包括基于糖蛋白的酶联免疫吸附测定(gpELISA)或水痘带状疱疹糖蛋白IgG酶免疫测定与参考时间分辨荧光免疫测定(VZV TRFIA),VZV IgG糖蛋白测定,用于检测血清VZVIgG(Merck gpEIA),但并不广泛或商业使用。
尽管分子诊断(包括从囊泡液培养物和拭子样品中分离的DNA病毒)和核酸检测(PCR)是在VZV诊断中最灵敏的,但仍需在VZV流行病学监测过程中进行抗体评估(因为囊泡皮疹并不会在感染的任何时间都出现,因此可能影响PCR结果)和疫苗接种控制的有效性。此外,基于临床表现的主要诊断方法并不是100%可靠的,因为有许多其他疱疹疾病,包括HSV,也同样存在相似症状。综上所述,迫切需要高敏感性和特异性的商业分布广泛的测试用于常规VZV诊断。因此,近期高敏感性的诊断技术更引人注目。
基于化学发光免疫测定(CLIA)的方法来诊断血清/血浆病毒抗原特异性免疫球蛋白,包括IgG、IgA和IgM,已经取得了更好的诊断性能。目前,因其动态范围广、定量表达结果敏感性和特异性高、自动化、能够使用不同样品测试板等特点,化学发光技术已得到广泛应用。因此,这些特性使CLIA成为临床实验室中进行疾病诊断的最先进技术。有趣的是,在当前SARS-CoV-2的常规诊断背景下,我们和其他人员开发出了基于CLIA的可商用的方法,用于诊断和监测COVID-19,并取得了令人满意的成绩。鉴于此,本发明对于诊断VZV感染和相关疾病非常有益。特别是,我们在本发明中开发了基于化学发光免疫测定(CLIA)的诊断试剂盒,能够高敏感性和特异性的从血清和/或血浆中检测VZV特异性IgG、IgA和IgM。
发明内容
为提供具有高敏感性、特异性的水痘-带状疱疹病毒检测试剂盒,本发明提供以下技术方案:
一方面,本发明提供获得水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的方法,其包括:
(a)构建携带编码水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的基因的重组质粒,任选地所述水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
(b)将步骤(a)获得的重组质粒转化到DH10bac细菌中获得重组杆状病毒;
(c)用步骤(b)获得的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E,任选地,还包括将培养后的病毒感染草地贪夜蛾Hi5细胞进行扩大培养的步骤;
(d)纯化水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E。
在一些实施方案中,纯化水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的方法选自膜过滤、透析、第一镍柱纯化、TEV蛋白酶消化、第二镍柱纯化、凝胶过滤层析和超离心浓缩。
在一些实施方案中,通过膜过滤、透析、第一镍柱纯化、TEV蛋白酶消化、第二镍柱纯化、凝胶过滤层析和超离心浓缩纯化水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E。
另一方面,本发明提供水痘-带状疱疹病毒检测试剂盒,其包括根据上述方法获得的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E。
另一方面,本发明提供水痘-带状疱疹病毒特异性抗体检测试剂盒,其包括根据上述方法获得的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E。
在一些实施方案中,所述检测试剂盒包括生物素化试剂,所述生物素化试剂用于生物素化根据上述方法获得的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E。
在一些实施方案中,所述检测试剂盒还包括抗人IgA、IgG或IgM抗体。
在一些实施方案中,所述检测试剂盒还包括化学发光化合物,所述化学发光化合物选自鲁米诺衍生物、吖啶酯、胶体金和荧光微球。
在一些实施方案中,所述检测试剂盒还包括用于固定生物素化的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的磁珠。
在一些实施方案中,所述检测试剂盒还包括牛血清白蛋白,用于饱和水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E,任选地,所述牛血清白蛋白的浓度为2%(按重量计)。
在一些实施方案中,所述检测试剂盒还包括硫酸,用于终止反应。
另一方面,本发明提供根据上述方法获得的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E在制备水痘-带状疱疹病毒检测试剂盒或水痘-带状疱疹病毒特异性抗体检测试剂盒中的用途。
另一方面,本发明提供上述的水痘-带状疱疹病毒检测试剂盒或水痘-带状疱疹病毒特异性抗体检测试剂盒在制备水痘-带状疱疹病毒中和抗体产品中的用途。
另一方面,本发明提供诊断水痘-带状疱疹病毒的方法,所述方法包括利用上述检测试剂盒检测受试者血液中IgG、IgA和IgM的表达水平。
有益效果
本发明提供基于化学发光免疫分析法的水痘-带状疱疹病毒感染诊断检测试剂盒,可以对水痘-带状疱疹病毒进行高敏感性和特异性的检测,降低假阴性和假阳性的出现。在本发明中,如果不把中间数值样本计入阳性,则本发明的试剂盒检测敏感性在90%以上,特异性在97%以上,总体一致性在96%以上。
附图说明
图1示出构建pI-SUMOstat-His-gE的示意图。VZV-gE序列帽端为多面体启动子(Pph)、信号肽序列(GP67)、his-SUMOstar-标签和TEV消化位点。VZV-gE特异性引物用小粉红色三角形表示;pI-SUMOstar特异性引物用小橙色三角形表示。
图2示出VZV-gE蛋白的凝胶色谱纯化。
图3示出通过SEC柱高度纯化的VZV-gE(≈57.6kDa)的SDS-PAGE分析。
图4示出基于CLIA方法的VZV-gE特异性IgG(图4A)、IgA(图4B)和IgM(图4C)检测。随机选择29例患者样品,并进行2倍连续稀释8次(从1/20开始),使用自动CLIA评估纯化的VZV-gE蛋白检测IgG和IgM抗体的能力。利用GraphPad Prism 5对所有患者的相对光单位(RLU)进行变换和拟合。阴性对照为黑色曲线,基于ELISA的可疑患者为粉紫色,阳性患者为红色。RLU:相对光单元。
图5示出VZV-gE特异性IgG、IgA和IgM检测试剂盒的诊断特性。从42个ELISA阳性样品中获得检测针对VZV-gE蛋白的抗IgG抗体的接受者操作特征曲线(ROC)分析,不管可疑患者样品如何。
图6示出患者队列中VZV-gE特异性IgG、IgA和IgM检测结果和抗体水平。高阳性(来自21个患者的42个样品)和可疑(来自8个患者的20个样品)患者中特异性VZV血清抗体水平分析显示不同水平的IgG(A)、IgA(B)和IgM(C)抗体滴度,由相对光单位(RLU)定义。每个分布中的黑条表示平均值,分别与平均值的标准误差(SEM)相关。虚线表示截止值(IgG[A]>23450,IgA[B]>78662和IgM[B]>89634)。RLU:相对光单元。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明作进一步的详细说明。
实施例1样品选取及处理
1.样品选取
为实现本发明的目的,需要两种类型的样品,包括实验组样品与对照样品。实验组样品是指疑似感染VZV的患者的样品,最好是呈现VZV感染明显症状的患者,更优选是基于ELISA或PCR分析确诊阳性诊断结果的患者的样品。对照样品是指未感染VZV的患者的样品,优选是未接种任何VZV疫苗的健康人群。采样需有每个患者的同意协议,并应根据伦理惯例进行研究。
2.样品处理
本发明使用人临床样品,优选人血液样品进行,且已经获得了伦理委员会的批准。血液样品从患者和对照人群的前臂穿刺获得,放入EDTA或肝素盐(或肝素)真空管中。采用Ficoll(密度:1.077)的密度梯度分离法通过离心处理血液样品分离血清和血浆。在采集的总血液沉淀至少1小时后,可通过沉淀法获得血清和血浆分离物。分离的血清和血浆可以长期保存在-20℃下,但优选储存在-80℃。
实施例2表达重组His-SUMOstar-VZV-gE蛋白的杆状病毒表达系统的构建
1.构建携带VZV-gE序列的重组转化载体
为实现本发明的目的,获得编码VZV的VZV-gE成熟细胞外区域的基因序列,使用以下正向和反向引物获得登陆号MH709377.1(SEQ ID NO:1)的VZV-gE细胞外结构域;5’-ATTTCCAAGGTTCTTCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATC-3’(SEQ ID NO:2)和5’-GACAAGCTTGGTACTTAATATCGTAGAAGTGGTGACGTTCCGGG-3’(SEQ ID NO:3)。同时,组氨酸标签修饰的转化载体pI-SUMOsec-Star-His通过以下引物线性化(正向:5’CTTCTACGATATTAAGTACCAAGCTTGTCGAGAAGTACTAGAGG3’(SEQ ID NO:4)和反向:5’TATCGCAAGACGGAAGAACCTTGGAAATAAAGATTCTCGCTGCC3’(SEQ ID NO:5)),所述引物包含重叠VZV-gE 5’和3’端序列的序列。每个PCR混合物都含有0.5mM的每种引物和0.2mM的每种dNTP(脱氧核苷酸三磷酸)。对于PCR扩增,模板最初在98℃变性5min,然后扩增30个循环,变性(98℃15秒)、退火(68℃15秒)和延长(72℃1.5或5分钟),之后72℃延长10分钟。根据Gibson组装方法,纯化的目标基因PCR产物和线性载体PCR产物在50℃下连接1小时后,转化DH5α。紧接着通过PCR和DNA测序证实pI-SUMO-Star-His-gE已成功构建。图1示出了pI-SUMO-Star-His-gE构建体的图谱。
2.获得重组杆粒
将上述转化载体经DH10Bac大肠杆菌转入重组VZV-gE杆粒,纯化后转染Sf9昆虫细胞,根据Invitrogen公司的bac-to-bac方法(杆状病毒表达载体系统-BEVS)转化Sf9昆虫细胞。对于本发明,使用1-2ng纯化的重组转化载体构建体(pI-SUMO-Star-His-gE)转化100μL的DH10Bac细胞。37℃孵育48小时后,用含有卡那霉素(50μg/mL)、四环素(10μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)、X-gal(100μg/mL)和IPTG(40μg/mL)的蓝-白培养皿筛选阳性菌落(白色菌落)。挑选单个较大的白色菌落并在新蓝白选择培养皿上重新划线培养,并在37℃孵育48小时。一旦在选择板上确认了白色菌落,就用如下制备的缓冲液1、2、3分离纯化VZV-gE重组杆粒:缓冲液1(15mM Tris(8.0)、10mM EDTA、100μg/ml RNase A);缓冲液2(0.2N NaOH,1%SDS)和缓冲液3(3M醋酸钾,pH 5.5)。分离纯化重组杆粒后,使用克隆引物SEQ ID NO:2-3或M13引物,或两者进行PCR和DNA测序验证。对于每次PCR验证,配制50μL的反应溶液,其中包含0.2mM dNTP,0.25mM的正向和反向引物和1×PCR缓冲液中的1个单位DNA聚合酶。使用的M13的正向和反向引物序列如下:5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’(SEQ ID NO:6)和5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’(SEQ ID NO:7)。对于在PCR验证程序,模板最初在94℃变性约5分钟,然后扩增25个循环变性,(94℃45秒)、退火(55℃45秒)和延长(68℃90秒),最终68℃延长10分钟。
3.产生重组杆状病毒
一旦产生杆粒,就用于感染昆虫细胞以产生表达蛋白的病毒。在本发明中,纯化的VZV-gE重组杆粒用于昆虫细胞培养基中(感染草地贪夜蛾(Sf9)昆虫细胞。重组杆粒转染Sf9细胞根据Invitrogen公司的bac-to-bac BEVS方法进行。转染后的细胞需要在27℃无菌培养箱中孵育3-5天,通过离心(1500rpm 20分钟)收集重组VZV-gE杆状病毒并保持在4℃。第一批病毒会从P0扩增到P4,然后对P4病毒原液进行滴定实现大规模最佳蛋白表达。
实施例3VZV-gE蛋白的表达和纯化
1.重组His-SUMOstar-VZV-gE蛋白表达
当处于最佳表达条件时,用滴度为1/500的P4病毒原液感染每毫升2×106草地贪夜蛾(Trichoplusia ni)(High Five,Hi5)细胞,并在27℃的自旋摇床中孵育。培养基中不含有血清,只含青霉素和链霉素(PS)作为抗生素。大约3至4天后停止细胞培养,通过离心培养物(高速运转30分钟)(转速是5000g)收集表达的重组蛋白,从而进行之后的蛋白纯化。
2.纯化重组VZV-gE蛋白
重组VZV-gE蛋白的纯化步骤包括膜过滤、透析、第一镍柱纯化、TEV蛋白酶消化结合透析、第二镍柱纯化、凝胶过滤层析和超离心浓缩。
a.膜过滤和透析
感染后三到四天,在5000g下离心细胞培养物20分钟,收集含有表达蛋白的上清液,加入蛋白酶抑制剂。然后通过0.2μm滤膜过滤,并使用透滤膜(Vivaflow 50/200,5kDa)浓缩滤液。过滤过程需要在冰上进行。然后使用14kDa透析膜在冷凝胶过滤缓冲液(GFB:250mm氯化钠,20mm Tris-HCl,pH8.0)中且在4℃透析过夜。
b.第一镍离子(Ni2+)-螯合柱纯化
透析后,透析液被加入预处理的镍离子(Ni2+)-螯合物柱。加入前,先用3倍柱体积(CV)无菌去离子蒸馏水(ddH2O)清洗螯合柱,并用5倍柱体积的低离子强度Ni2+柱结合缓冲液(缓冲液NB:250mM氯化钠,14mM咪唑,20mmTris-HCl,pH 8.0)平衡螯合柱。在将透析液加入柱后,用50mL缓冲液NB洗涤柱,再在FPLC快速液相色谱仪(GE生命科学AKTA FPLC)上用一个100mL从0-100%的高离子强度Ni2+柱洗脱缓冲液(缓冲液EB:250mM NaCl,400mM咪唑,20mM Tris-HCl,pH 8.0),流速为2.5mL/min进行洗脱。每个峰值对应的洗脱组分进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(如图2和图3所示)。
c.TEV蛋白酶消化和第二次透析
收集重组VZV-gE蛋白对应的洗脱组分并汇集在一起,进行TEV蛋白酶消化去除SUMOstar标记。在2mM DTT、1mM EDTA和2mg/mL TEV蛋白酶存在下进行重组蛋白消化反应。消化反应与透析在4℃同时进行,并加入GFB缓冲液,以交换缓冲液并去除DTT和EDTA。然后透析液进行第二个洗脱镍柱,从而将VZV-gE与SUMOstar标签分离。
d.第二镍离子(Ni2+)-螯合柱纯化
根据体积将透析液加入特定回路(50-150mL),用缓冲液NB注入预处理后的Ni2+螯合柱中。VZV-gE蛋白会被收集在含有10%的缓冲液EB的洗涤床中。收集纯化的VZV-gE蛋白对应的洗脱组分,汇集在一起,并用30kDa浓缩管,例如超离心过滤器(Millipore,Billerica,MA)浓缩。
e.凝胶过滤层析和超离心浓缩
用30kDa浓缩管,例如Ultra离心过滤装置(Millipore,Billerica,MA)将上述从第二Ni2+螯合柱获得的VZV-gE蛋白的EB缓冲液交换为HBS缓冲液(250mM NaCl,20mM HEPES,pH 8.0)。用三倍管体积的EB缓冲液通过浓缩柱来交换缓冲液。将5mL浓缩的VZV-gE蛋白加入预处理的Superdex-200 75TM柱(GE Healthcare)上。在层析之前,用2倍柱体积的ddH2O洗涤Superdex-200 75TM柱,并且用2倍柱体积的HBS缓冲液平衡预处理Superdex-200 75TM柱。用HBS以1mL/min的流速洗脱VZV-gE蛋白。收集紫外峰值对应的洗脱体积,汇集在一起,使用Ultra离心过滤装置(Millipore,Billerica,MA)浓缩。然后用ScanDrop(德国耶拿)对浓缩蛋白进行如下定量:
蛋白质浓度=OD280×10/蛋白质吸光度;Abs=1.474
所有层析步骤均使用FPLC系统在4℃下进行,该系统可以是或prime plus(GE Healthcare)设备。洗脱曲线的数据点以ASCII文件的形式从连接计算机的设备中导出,并使用GraphPad Prism 5重新绘制。
f.SDS-PAGE VZV-gE蛋白表征
在每个纯化步骤中,样品等分,与1×SDS染料缓冲液混合(50mM Tris-HCl,2%SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油,1%巯基乙醇),煮沸2~5分钟。通过电泳凝胶(10%聚丙烯酰胺)迁移后,考马斯蓝染色,并通过煮沸去除染色后,用灯箱显示蛋白条带,用集成相机拍照保存(图3)。纯化后的VZV-gE蛋白在液氮中快速冷冻,并在-80℃保存,用于后续实验。具体来说,纯化的蛋白被用于开发基于化学发光免疫分析法(CLIA)的诊断试剂盒。
实施例4酶联免疫吸附试验(ELISA)
1.在本研究中,使用改良过的ELISA(Abcam ab108781、ab108782和ab108783)用于检测VZV感染,并对本研究中的所有患者样品进行检测。这个测试将作为确认这些患者是否呈VZV阳性的标准。具体来说,用纯化的100μL磷酸盐缓冲液(PBS)中的0.2μg/mL gE蛋白在4℃包被96孔微升酶联免疫吸附试验板过夜(≥15h)。每孔用260μL PBS稀释的5%脱脂牛奶(PBSM)室温封闭2小时,用260μL补充有0.1%吐温-20的PBS(PBST)洗涤3次后,在每个样品中加入4倍连续稀释的血浆和血清,并在温和(≤100转/分钟)自旋轨道摇床中室温下孵育1小时。用PBST洗涤3次后,向每个孔中加入100μL 1:5000稀释的HRP抗人IgG抗体,在定轨摇床上室温孵育1小时。最终,用PBST洗涤4次后,加入100μL TMB(Beyotime)进行显色反应,室温下避光保持5-8分钟,用50μL的H2SO4(1M)终止显色反应。用酶标仪在OD450读取荧光值。每个ELISA样品重复3次,用GraphPad Prism 5软件作图。通过测定稀释1/100的OD450来评估患者的结果。当OD450≥1时为阳性,当OD450在0.1和0.2之间时为可疑,当OD450<0.1时为阴性。考虑到背景,从每个样品结果的OD值中扣除未加血清的空白样品的OD值。
实施例5VZV诊断试剂盒开发
1.生物素化
利用VZV-gE蛋白开发VZV特异性IgG、IgA、IgM免疫诊断试剂盒。在本发明中,使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin,No-Weigh Format kit(Thermo Fisher)按照制造商的说明书对纯化的VZV-gE蛋白进行生物素化。简单地说,使用稀释到2mL HBS缓冲液中的1至10mg VZV-gE纯化蛋白。任选地,在纯化后使用Ultra离心过滤装置(Millipore,Billerica,MA)将缓冲液HBS更换为缓冲液PBS。无论是缓冲液HBS还是PBS,生物素化蛋白的方案/方法都是相同的。对于每个生物素化反应,在室温下,向预热的小管中加入150μL的ddH2O制备10mM的生物素试剂溶液。每管试剂一次需用完。从制造商提供的配方中得到准确的10mM生物素试剂溶液与所需量的VZV-gE蛋白混合。生物素化反应在4℃下过夜进行。之后,使用30kDa浓缩管,例如Ultra离心过滤装置(Millipore,Billerica,MA)除去多余的生物素。使用缓冲液PBS或HBS清洗过量的未反应生物素得到最终体积约0.5-1mL的生物素化的VZV-gE蛋白。通过常规酶联免疫吸附分析(ELISA)的初步测试来评估生物素蛋白标记是否成功。
2.生物素化评估(ELISA)
进行ELISA,评估生物素标记VZV-gE蛋白是否成功。用生物素化的VZV-gE蛋白包被96孔微升的ELISA板。将100微升1:5000稀释后的HRP缀合的链霉亲和素加入预先用PBST清洗过的封闭标记蛋白中,在温和的定轨摇床中孵育1小时。之后,当用PBST洗涤4次后,加入100μL的TMB(Beyotime)进行显色反应,并室温下避光保持5-8分钟。最后加入50μL的H2SO4(1M)从而终止反应,再用酶标仪在OD450读取荧光值。
3.磁珠固定
根据制造商的说明书,使用Invitrogen DynabeadsTM MyOneTMs StreptavidinC1试剂盒(Thermo Fisher)将生物素标记的VZV-gE蛋白固定在磁珠上。固定方案之后略有修改以优化效果。简单地说,将40μg的生物素化蛋白固定在1mg的磁珠上,而不是根据制造商所提供的每mg磁珠固定20μg蛋白。反应在4℃下过夜或在室温下振荡至少1小时,然后用PBS稀释10-20次。
为了避免与非特异性免疫复合物形成相关的背景噪音,我们使用了多种封闭缓冲液。但当没有特异性免疫复合物形成时,在本发明中,优选使用牛血清白蛋白(BSA)来饱和抗原底物和游离金属珠。在本发明中,使用2%的BSA开发检测试剂盒。
4.抗人抗体免疫球蛋白(Ig)同种型G、A和M
为了对抗VZV-gE抗体和VZV-gE蛋白形成的免疫复合物进行特异性检测和定量,每个开发的试剂盒分别使用抗人抗体IgG、IgA和IgM。这些第二抗体与吖啶酯(一种化学发光发色团)结合,当形成免疫复合物时,特别是当VZV-gE特异性IgG、IgA或IgM被VZV-gE蛋白捕获时,吖啶酯可以发光。本试剂盒包含了VZV-gE特异性IgG、IgA和IgM用于CLIA的所有组成部分,且被称为VZV-gE-IgG、VZV-gE-IgA和VZV-gE-IgM诊断试剂盒。
5.化学发光信号收集和数据分析(图4和图5)
检测到的在背景信号上的化学发光信号计算为相对光单位(RLU)。RLU的测量采用全自动化学发光免疫分析仪Kaeser 1000(康润生物科技,中国广州)进行。
首先,对所有阳性患者和健康患者的血清/血浆进行两倍连续稀释(从1:400开始稀释),以评估VZV-gE-IgG、VZV-gE-IgA和VZV-gE-IgM诊断试剂盒的准确度和适当的稀释度。其次,进一步进行CLIA检测,确定VZV-gE-IgG、VZV-gE-IgA、VZV-gE-IgM诊断试剂盒的检测特性。
6.统计分析(图4、5、6和表1)
采用MedCalc软件进行受试者工作特征(ROC)的分析,从而确定VZV-gE-IgG、VZV-gE-IgA、VZV-gE-IgM检测试剂盒的最佳截止值(诊断标准)并评价其诊断特征,在本发明中,IgG的截止值为23450,敏感性为95.2%,特异性为100%;IgA的截止值为78662,敏感性为95.2%,特异性为98.0%;IgM的截止值为89634,敏感性为97.6%,特异性为98.9%。因此,VZV-gE特异性IgG、IgA、IgM检测试剂盒的特异性和敏感性根据以下公式确定。
-特异性(%)=100×[真阴性数/(真阴性数+假阳性数)];
-敏感性(%)=100×[真阳性数/(真阳性数+假阴性数)]。
-总体一致性(%)=(真阴性数+真阳性数)/总测试数。
使用Mann-Whitney检验评估原发性水痘和带状疱疹感染之间VZV gE特异性IgG、IgA或IgM水平的任何显著变化。采用Kruskal-Wallis方法进行方差分析(ANOVA)检验,以评估阳性、可疑和阴性三个独立组之间的抗体水平的差异。p值小于0.05表示具有统计学显著性差异。所有上述分析都集成到GraphPad Prism5软件中,并通过GraphPad Prism5软件进行计算。
图6说明几乎所有可疑患者的IgG水平相关RLU值都低于确定的截止值(<23450),尽管与阴性对照显著不同(p<0.001)(图6A),而可疑患者RLU-相关IgA水平为阴性,低于确定的截止值(图6B)。然而,VZV gE特异性IgM检测试剂盒显示,与来自ELISA的最可疑结果相反,几乎所有可疑样品都被归类为IgM检测的真阳性(图6C)。总的来说,与ELISA相比,这些诊断试剂盒可以检测较低的免疫球蛋白浓度。这些结果表明,基于CLIA的诊断试剂盒在诊断水痘-带状疱疹方面优于ELISA诊断测试,尤其是组合使用时。
表1每种VZV-gE特异性IgM、IgA和IgG试剂及其组合对诊断水痘-带状疱疹病毒感染的敏感性、特异性和总体一致性。
表1.
如果把那些中间数值的样本当成阳性样本用*表示,如果不把这些中间数值样本计入阳性用#表示。真阴性就是发明人找的阴性对照,真阳性就是发明人依据临床指标收集到的患者样本,假阳性就是阴性对照中测出来的阳性,假阴性是在患者样本中测出来的阴性。
序列表
SEQ ID NO:1VZV糖蛋白E的核苷酸序列
TCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATCGATGAAGACAAACTGGATACAAACTCCGTATATGAGCCTTACTACCATTCAGATCATGCGGAGTCTTCATGGGTAAATCGGGGAGAGTCTTCGCGAAAAGCGTACGATCATAACTCACCTTATATATGGCCACGTAATGATTATGATGGATTTTTAGAGAACGCACACGAACACCATGGGGTGTATAATCAGGGCCGTGGTATCGATAGCGGGGAACGGTTAATGCAACCCACACAAATGTCTGCACAGGAGGATCTTGGGGACGATACGGGCATCCACGTTATCCCTACGTTAAACGGCGATGACAGACATAAAATTGTAAATGTGGACCAACGTCAATACGGTGACGTGTTTAAAGGAGATCTTAATCCAAAACCCCAAGGCCAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGGAAGAAAATCACCCGTTTACTTTACGCGCACCGATTCAGCGGATTTATGGAGTCCGGTACACCGAGACTTGGAGCTTTTTGCCGTCATTAACCTGTACGGGAGACGCAGCGCCCGCCATCCAGCATATATGTTTAAAACATACAACATGCTTTCAAGACGTGGTGGTGGATGTGGATTGCGCGGAAAATACTAAAGAGGATCAGTTGGCCGAAATCAGTTACCGTTTTCAAGGTAAGAAGGAAGCGGACCAACCGTGGATTGTTGTAAACACGAGCACACTGTTTGATGAACTCGAATTAGACCCCCCCGAGATTGAACCGGGTGTCTTGAAAGTACTTCGGACAGAAAAACAATACTTGGGTGTGTACATTTGGAACATGCGCGGCTCCGATGGTACGTCTACCTACGCCACGTTTTTGGTCACCTGGAAAGGGGATGAAAAAACAAGAAACCCTACGCCCGCAGTAACTCCTCAACCAAGAGGGGCTGAGTTTCATATGTGGAATTACCACTCGCATGTATTTTCAGTTGGTGATACGTTTAGCTTGGCAATGCATCTTCAGTATAAGATACATGAAGCGCCATTTGATTTGCTGTTAGAGTGGTTGTATGTCCCCATCGATCCTACATGTCAACCAATGCGGTTATATTCTACGTGTTTGTATCATCCCAACGCACCCCAATGCCTCTCTCATATGAATTCCGGTTGTACATTTACCTCGCCACATTTAGCCCAGCGTGTTGCAAGCACAGTGTATCAAAATTGTGAACATGCAGATAACTACACCGCATATTGTCTGGGAATATCTCATATGGAGCCTAGCTTTGGTCTAATCTTACACGACGGGGGCACCACGTTAAAGTTTGTAGATACACCCGAGAGTTTGTCGGGATTATACGTTTTTGTGGTGTATTTTAACGGGCATGTTGAAGCCGTAGCATACACTGTTGTATCCACAGTAGATCATTTTGTAAACGCAATTGAAGAGCGTGGATTTCCGCCAACGGCCGGTCAGCCACCGGCGACTACTAAACCCAAGGAAATTACCCCCGTAAACCCCGGAACGTCACCACTTCTACGATAT
SEQ ID NO:2 VZV-gE细胞外结构域正向引物
5’-ATTTCCAAGGTTCTTCCGTCTTGCGATACGATGATTTTCACATC-3’
SEQ ID NO:3 VZV-gE细胞外结构域反向引物
5’-GACAAGCTTGGTACTTAATATCGTAGAAGTGGTGACGTTCCGGG-3’
SEQ ID NO:4组氨酸标签修饰的转化载体pI-SUMOsec-Star-His正向引物
5’CTTCTACGATATTAAGTACCAAGCTTGTCGAGAAGTACTAGAGG3’
SEQ ID NO:5组氨酸标签修饰的转化载体pI-SUMOsec-Star-His反向引物
5’
TATCGCAAGACGGAAGAACCTTGGAAATAAAGATTCTCGCTGCC3’
SEQ ID NO:6M13的正向引物
5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’
SEQ ID NO:7M13的反向引物
5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.基于化学发光免疫分析法的VZV感染诊断检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E,获得水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的方法包括:
(a)构建携带编码水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的基因的重组质粒,任选地所述水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
(b)将步骤(a)获得的重组质粒转化到DH10bac细菌中获得重组杆状病毒;
(c)用步骤(b)获得的重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E,任选地,还包括将培养后的病毒感染草地贪夜蛾Hi5细胞进行扩大培养的步骤;
(d)通过膜过滤、透析、第一镍柱纯化、TEV蛋白酶消化、第二镍柱纯化、凝胶过滤层析和超离心浓缩纯化水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E。
2.根据权利要求1所述的基于化学发光免疫分析法的VZV感染诊断检测试剂盒,其包括生物素化试剂,所述生物素化试剂用于生物素化所述水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E。
3.根据权利要求1或2所述的基于化学发光免疫分析法的VZV感染诊断检测试剂盒,其还包括抗人IgA、IgG或IgM抗体。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的基于化学发光免疫分析法的VZV感染诊断检测试剂盒,其还包括化学发光化合物,所述化学发光化合物选自鲁米诺衍生物、吖啶酯、胶体金和荧光微球。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的基于化学发光免疫分析法的VZV感染诊断检测试剂盒,其还包括用于固定生物素化的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的磁珠。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的基于化学发光免疫分析法的VZV感染诊断检测试剂盒,其还包括牛血清白蛋白,用于饱和水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E,任选地,所述牛血清白蛋白的浓度为2%(按重量计)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的基于化学发光免疫分析法的VZV感染诊断检测试剂盒,其还包括硫酸,用于终止反应。
8.水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E在制备基于化学发光免疫分析法的VZV感染诊断检测试剂盒中的用途。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的基于化学发光免疫分析法的VZV感染诊断检测试剂盒在制备水痘-带状疱疹病毒中和抗体产品中的用途。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN116041488A (zh) * | 2022-08-19 | 2023-05-02 | 成都华任康生物科技有限公司 | 检测重组水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)的单克隆抗体及其应用 |
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