CN102427823A - 因子viii变体及使用方法 - Google Patents
因子viii变体及使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102427823A CN102427823A CN2010800214104A CN201080021410A CN102427823A CN 102427823 A CN102427823 A CN 102427823A CN 2010800214104 A CN2010800214104 A CN 2010800214104A CN 201080021410 A CN201080021410 A CN 201080021410A CN 102427823 A CN102427823 A CN 102427823A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- factor
- control agent
- adjusting control
- hinge
- district
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 title abstract description 133
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 title abstract description 129
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 title abstract description 129
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 claims abstract description 160
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 148
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 114
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 108
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 108
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 81
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 357
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 356
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 352
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 126
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 73
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 70
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 68
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 68
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 47
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 45
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 claims description 32
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 27
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 claims description 22
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 claims description 21
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 claims description 21
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 18
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 16
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 10
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 6
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 claims description 5
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 claims description 5
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 abstract description 6
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 abstract description 6
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 abstract description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 134
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 107
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 57
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 53
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 52
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 50
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 33
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 33
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 33
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 30
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 30
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 28
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 28
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 24
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 23
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 20
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 20
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 16
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 16
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 16
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 16
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 14
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 14
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 14
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 12
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 10
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 9
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 8
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 8
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 6
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102100030563 Coagulation factor XI Human genes 0.000 description 5
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 5
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 5
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 4
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 4
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 4
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 4
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 229940099816 human factor vii Drugs 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 4
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 3
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000053227 Themus Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 2
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 2
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 2
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 2
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 2
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 2
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 230000000157 blood function Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 2
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 2
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000006623 intrinsic pathway Effects 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical group C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000393496 Electra Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 108010029144 Factor IIa Proteins 0.000 description 1
- 108010074105 Factor Va Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000012671 Gastrointestinal haemorrhages Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710094503 Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100124346 Photorhabdus laumondii subsp. laumondii (strain DSM 15139 / CIP 105565 / TT01) hisCD gene Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000608575 Vespertilio Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000013096 assay test Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- -1 carrier Proteins 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010002 chemokinesis Effects 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000013213 extrapolation Methods 0.000 description 1
- 230000006624 extrinsic pathway Effects 0.000 description 1
- 108010073651 fibrinmonomer Proteins 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002607 hemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 101150113423 hisD gene Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000000088 lip Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013213 metal-organic polyhedra Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000012011 method of payment Methods 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229940081857 plasma protein fraction Drugs 0.000 description 1
- 108010058237 plasma protein fraction Proteins 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000010458 rotten stone Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
公开了一种包含因子VIII的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体，其中调控剂的氨基酸序列存在于B域中，或用调控剂的氨基酸序列替换B域的一些或所有氨基酸序列。还公开了编码发明性融合蛋白和融合异二聚体的核酸，也公开了用于生成融合蛋白和融合异二聚体、药物组合物的方法及用发明性融合分子治疗凝固缺陷的方法。
Description
本申请要求2009年3月24日提交的美国临时申请流水号61/162,986的权益；通过提及而将其内容完整收入本文。
发明领域
本发明涉及变体因子VIII(FVIII)蛋白。本发明还涉及编码变体FVIII蛋白的核酸及用于鉴定此类核酸的方法。本发明涉及生成和使用所述变体FVIII蛋白的方法。
发明背景
血液凝固通过接触激活途径(以前称为内源性途径)或组织因子途径(以前称为外源性途径)来发生，由此某些血液蛋白质在蛋白水解激活级联中相互作用以最终将可溶性血纤蛋白原转化成不溶性血纤蛋白。这些血纤蛋白丝交联以形成凝块的支架；在没有血纤蛋白形成的情况中，不能发生凝固。
接触激活途径由数个步骤组成：(1)因子XII的蛋白水解激活；(2)激活的因子XII切割因子XI以将其激活；(3)激活的因子XI切割因子IX，由此将其激活；(4)激活的因子IX与激活的FVIII相互作用以切割并激活因子X；(5)激活的因子X结合膜表面上激活的因子V，该复合物以蛋白水解方式切割凝血酶原以形成凝血酶；(6)凝血酶以蛋白水解方式切割血纤蛋白原以形成血纤蛋白；(7)血纤蛋白单体装配成原纤维，其然后被因子XIII来交联。
组织因子途径由下列步骤组成：(1)在血管破裂后，因子VII结合组织因子，即存在于血管系统外部的组织中的脂蛋白；(2)通过蛋白水解切割将因子VII激活成因子VIIa；及(3)因子VIIa-组织因子复合物切割并激活因子X。此后，组织因子途径与接触激活途径相同，即两种途径共享上文所描述的最后三个步骤。
FVIII的生物合成、胞内加工、和分泌及其随后在血浆中被激活的机制是本领域中公知的(参见例如Lenting等，Blood 92：3983-3996，1998；Thompson，Seminars in Hemostasis 29：11-22，2003；Graw等，Nature Reviews：Genetics6：489-501，2005)。人FVIII最初以2351个氨基酸(SEQ ID NO：1)的单链多肽翻译，其中前19个氨基酸限定被ER内的信号肽酶除去的信号肽。如此，成熟的人FVIII由2332个氨基酸组成，具有域结构A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2(图1A)。FVIII被糖基化，并在分泌前通过B域羧基端附近(Arg-1648，在B-a3连接处)的切割来胞内加工，并且在B域内，主要在Arg-1313后可变切割，以生成90-210kDa重链和80kDa轻链(图1B)。此后，FVIII以异二聚体糖蛋白分泌，所述糖蛋白由单一重链和单一轻链组成。
血浆糖蛋白FVIII在血液中以与von Willebrand因子(vWf)紧密且非共价结合的无活性前体形式循环。通过用凝血酶或因子Xa在三个Arg-Ser肽键处，即在Arg-372、Arg-740、和Arg 1689后切割来以蛋白水解方式激活FVIII，所述切割将其与vWf解离，并在级联中激活其促凝血功能。所得的异三聚体变为FVIIIa(图1C)。
在其活性形式(即FVIIIa)中，FVIII在血液凝固的接触激活途径中发挥因子X激活酶复合物的辅因子的功能，而且其在血友病A患者中是降低的或非功能性的。FVIII活性的降低水平与疾病的严重程度成正比。如此，具有FVIII缺陷或具有针对FVIII的抗体的人罹患不受控制的内部出血，其可以引起一批重度症状，除非他们用FVIII治疗。症状范围为关节中的炎症反应到早期死亡。实际上，FVIII的经典定义是存在于正常血浆中的改正源自患有血友病A的个体的血浆中的凝固缺陷的物质。因为vWf是功能性FVIII的一种至关重要的构件，所以vWf缺陷也可以引起表型血友病A。在这些病例中，FVIII在血浆中的循环半衰期以如下的程度降低，使得它不再能在血液凝固中执行其特殊的功能。目前的血友病A治疗包括通过施用血浆源或重组FVIII来替换缺少的蛋白质。
抑制FVIII活性的抗体(“抑制剂”或“抑制性抗体”)的形成是血友病A患者管理中的一项严重的并发症。自身抗体在占响应FVIII的治疗性输注的血友病A患者的约20％中形成。在形成抑制剂的先前未治疗的血友病A患者中，抑制剂通常在治疗的一年内形成。另外，使FVIII失活的自身抗体偶而在先前具有正常的FVIII水平的个体中形成。若抑制剂效价足够低，则患者可以通过提高FVIII剂量来管理。然而，抑制剂效价经常如此之高以致于它不能被FVIII压倒。一种备选的策略是使用因子IX复合物制备物或重组人因子VIIa来绕过正常止血过程中对FVIII的需要。另外，因此猪FVIII通常具有实质上小于人FVIII的与抑制剂的反应性，所以可以使用部分纯化的猪FVIII制备物。已经形成针对人FVIII的抑制性抗体的许多患者已经用猪FVIII成功得到治疗，而且已经耐受此类治疗达一段较长的时间。然而，施用猪FVIII不是完整的解决办法，因为抑制剂可以在一次或多次输注后针对猪FVIII形成。如此，重组人FVIII或部分纯化的猪FVIII的使用尚未解决所有问题。
在抑制性抗体外，还出现了如下的问题，其在于FVIII在静脉内施用时具有相对较短的循环半衰期(在人中为13小时)，因此需要频繁的输注，这引起患者剂量给药顺应性的困难。如此，用于每周剂量给药或甚至每月剂量给药的更长效的FVIII是未满足的医学需要(Dargaud等，Expert Opinion onBiological Therapy 7：651-663，2007)。更长的保护会通过延长FVIII半衰期来实现。正在探索许多FVIII生物工程方法，其目的在于产生持续较长一段时间的保护(Baru等，Thromb.Haemost.93：1061-1068，2005；Pipe，J.Thromb.Haemost.3：1692-1701，2005；Saenko等，Haemophilia 12(增刊3)：42-51，2006)。
本发明涉及FVIII变体，其表明经修饰的活性和/或经修饰的药动学特性(例如，较长的循环半衰期)。举例而言，FVIII变体可以是融合物或异二聚体(heterodimer)蛋白，其中在FVIII蛋白的B域部分中插入氨基酸序列(例如调控剂(modulator))或者用此氨基酸序列替换B域或B域的一部分。此插入/替换氨基酸序列不破坏FVIII的翻译后加工，并且此FVIII变体具有作为凝固因子的活性。可以使用这些FVIII变体来治疗血友病A，并且可以由于例如循环半衰期较长而导致不太频繁的施用。通过需要不太频繁的剂量给药，本发明的FVIII变体可以改善患者顺从性，并且降低患者由于施用FVIII而形成对FVIII的免疫响应的概率。
发明概述
本发明涉及FVIII融合蛋白及其表达产物(在本文中又称为FVIII融合异二聚体)。本发明进一步涉及杂合FVIII融合异二聚体和多聚体FVIII融合异二聚体。在一个实施方案中，FVIII融合异二聚体包含FVIII蛋白或多肽和氨基酸序列(在本文中称为调控剂)。在另一个实施方案中，将调控剂序列插入FVIII B域中。在又一个实施方案中，至少将B域的一部分缺失，并用调控剂序列替换。
本发明还涉及编码FVIII融合异二聚体的核酸序列。在一个实施方案中，核酸序列编码包含FVIII蛋白的FVIII融合异二聚体，其中调控剂序列存在于B域中或者用调控剂序列替换B域的一些或所有氨基酸序列。可以在表达盒中可操作连接编码FVIII融合异二聚体的核酸序列。本发明还包括制备FVIII融合异二聚体的方法。例如，将编码FVIII融合异二聚体的表达盒(若还不是表达载体的一部分的话)引入表达载体中，随后导入适合于FVIII融合异二聚体的重组生成的宿主细胞中。所生成的融合异二聚体具有体外和体内FVIII活性，而且可以例如展现出延长的体内循环半衰期。
在本发明的又一个实施方案中，FVIII融合异二聚体包含与SEQ ID NO：1、3、或5之任一项的氨基酸20-764对应的第一氨基酸序列；与SEQ ID NO：1、3、或5之任一项的氨基酸1656-2351对应的第二氨基酸序列；和调控剂序列，其中(1)所述调控剂序列在其氨基端共价附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且在其羧基端共价附接于所述第二氨基酸的氨基端，或(2)所述调控剂序列在其氨基端共价附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且所述调控剂氨基酸序列不共价附接于所述第二氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，核酸序列编码FVIII融合异二聚体，其中所述FVIII融合异二聚体包含与SEQ ID NO：1、3、或5之任一项的氨基酸20-764对应的第一氨基酸序列；与SEQ ID NO：1、3、或5之任一项的氨基酸1656-2351对应的第二氨基酸序列；和调控剂序列，其中所述调控剂序列在其氨基端共价附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且在其羧基端共价附接于所述第二氨基酸的氨基端。另外，本发明还涉及生成融合异二聚体的载体、宿主细胞、方法及治疗凝固缺陷的方法。
附图简述
图1A显示了全长人FVIII的结构，其从N端到C端含有下列域：S(信号肽)、A1、a1、A2、a2、B、a3、A3、C1、和C2。图1B显示了异二聚体人因子VIII的重链和轻链的结构。由于B域内的可变蛋白水解切割，重链的大小有所变化。图1C显示了活性人FVIII(即FVIIIa)的亚基的结构。
图2显示了实施例部分中所描述的本发明的因子VIII融合异二聚体的三个例示性实施方案。三个实施方案表示为“BDDFc+铰链”、“BDDFc-铰链”、和“BDDFc”(其任选地可以包含异源肽标签以便于分离)。三个例示性的实施方案在其形成二聚体(经由其Fc部分)或蛋白质聚集体的能力方面及在其对FcRn的结合亲和力方面不同。
图3描绘了依照实施例1和2生成的因子VIII融合蛋白的结构域。具体地，将鼠Fc区(具有或没有铰链)插入B域缺失型(BDD)因子VIII蛋白的特定位点(在N-745与S-1637之间)中以替换B域的缺失部分。标示鼠Fc区的N端和C端侧的非缺失B域部分的氨基酸序列。
图4显示了依照实施例5生成的单顺反子BDD.mFc单体构建体。
图5显示了通过活性测定法来鉴定高表达克隆。通过FVIII aPPT凝固测定法来筛选表达BDDFc+铰链的HKB11稳定细胞系。克隆(4、8、12、18、27、和33)显示范围为500-3500mlU/mL的高凝固活性。
图6显示了通过ELISA测定法来鉴定高表达克隆。通过抗-FVIII捕捉ELISA来筛选表达BDDFc+铰链的HKB11稳定细胞系。三个克隆(克隆8、18、和27)以约1ug/mL表达BDDFc+铰链融合物。
图7显示了BDDFc+铰链融合蛋白的蛋白质纯化的结构。在还原性凝胶中，BDDFc+铰链解析为80-kDa轻链(L)、115-kDa重链(H)、和195-kDa未加工的单链(U)(第8道)。在非还原性凝胶中，在80-、115-、195-kDa条带(第8道)外，BDDFc+铰链产生390-kDa条带(二聚体)。
图8表明回收血友病A(Hem A)小鼠中的BDDFc-铰链(“FVIII-Fc”)和BDD-FVIII。9只HemA小鼠接受含有5％清蛋白的配制缓冲液中的50μg/kg(400IU/kg)(●)BDDFc-铰链。其它HemA小鼠接受200IU/kg(□)BDD-FVIII，即衍生BDDFc-铰链的因子VIII变体。与BDD-FVIII的衰变曲线相比，BDDFc-铰链显示具有快速的分布相的两相衰变。BDDFc-铰链的beta相半衰期在50μg/kg时是11.9小时，其相对于未修饰的BDD-FVIII(对于其，beta相半衰期是6.03小时)改善约2倍。
图9A显示了在Western印迹分析中以115kDa条带检测出的BDDFc+铰链的BDD-Fc嵌合链。将来自瞬时转染子(trans)和稳定集合(sp)两者的样品浓缩5倍，然后在还原条件下在10％NuPAGE
凝胶上运行。道：1)分子量标志物；2)作为标准品的纯化的BDD蛋白；3-5)来自分别用pSK207载体、pSK207BDD、和pSK207BDDFc+铰链瞬时转染的HKB11细胞的浓缩的条件化培养基；7-9)来自分别用pSK207载体、pSK207BDD、pSK207BDDFc+铰链稳定转染的HKB11细胞的稳定集合的浓缩的条件化培养基。用缀合有HRP的抗小鼠IgG(H+L)探查印迹。以195kDa条带检测出未加工的单链形式的BDDFc+铰链(“scBDD-Fc”)，而异二聚体形式的BDDFc+铰链包含因子VIII重链和Fc的115kDa嵌合物(“重链Fc”)。异二聚体BDDFc+铰链的轻链没有出现条带，因为它不被缀合有HRP的抗小鼠IgG结合。图9B显示了在Western印迹分析中以80kDa条带检测出的BDDFc轻链。将蛋白质样品在还原条件下在10％NuPAGE凝胶上运行。道：1)分子量标志物；2)作为标准品的纯化的BDD蛋白；3-5)来自分别用pSK207载体、pSK207BDD、和pSK207BDDFc+铰链瞬时转染的HKB11细胞的浓缩的条件化培养基。用FVIII轻链特异性抗体探查印迹。
图10显示了因子VIII活性测定法的结果。将来自用pSK207BDDFc+铰链(“Fc+铰链sup”)和pSK207BDDFc-铰链(“Fc-铰链sup”)瞬时转染的HKB11细胞的条件化培养基收集，并在Coatest测定法及aPPT凝固测定法两者中测试FVIII活性。作为对照，在转染及活性测定法中使用载体pSK207和pSK207BDD(“BDD sup”)，其编码未修饰的因子VIII蛋白。
图11显示了因子VIII融合异二聚体的因子VIII活性。将来自HKB11细胞[(BDDFc+铰链瞬时转染子(Tr)和稳定集合(Sp)]的条件化培养基加载到用兔-抗-小鼠Fc抗体预先包被的96孔板上。在于室温温育2小时后，用PBS/Tween
-20/BSA将平板清洗三次以除去非特异性结合，之后进行Coatest
测定法。
图12表明BDDFc+铰链形成二聚体，并且BDDFc-铰链是单体。使用来自用pSK207BDDFc+铰链或pSK207BDDFc-铰链表达载体转染的HKB 11细胞的5倍浓缩的条件化培养基来实施Western印迹分析。将样品在还原和非还原条件下在4-12％NuPAGE
凝胶上运行。用兔单克隆抗-FVIII轻链抗体(Epitomics，Burlingame，CA)，接着用缀合有HRP的抗兔IgG二抗探查印迹。分别以170-kDa和195-kDa条带检测出未加工的单链BDD和BDDFc。道：BDD：纯化的BDD蛋白；+H：BDDFc+铰链；-H：BDDFc-铰链；及V：单独的pSK207载体。
图13显示了测量BDDFc+铰链和BDDFc-铰链(“BDDFc-H”)(其掺入小鼠FcRn结合表位)结合固定化的小鼠FcRn的能力的BiacoreTM研究的结果。BDDFc+铰链(“BDDFc+H”)、BDDFc-铰链(“BDDFc-H”)、BDD、和全长重组因子VIII(FVIII)。在BDD或全长因子VIII的情况中没有看到可检出的结合。BDDFc+铰链和BDDFc-铰链融合蛋白以nM亲和力显示对mFcRn的强结合。
图14显示了测量BDDFc+铰链和BDDFc-铰链结合固定化的人vonWillebrand因子(vWF)的能力的BiacoreTM研究的结果。通过胺偶联来将小鼠FcRn固定化到CM-5芯片上。BDDFc+铰链(“BDDFc+H”)、BDDFc-铰链(“BDDFc-H”)、BDD、和全长重组因子VIII(FVIII)对vWF显示亚纳摩尔亲和力。
图15显示了BDDFc-铰链在HemA小鼠的尾静脉横断出血模型中是有效的。为了测定BDDFc-铰链在治疗体内出血中是否为功能性的，经由尾静脉给HemA小鼠注射BDDFc-铰链、BDD-FVIII、或媒介物对照，48小时后横断(transection)一个侧尾静脉(lateral tail vein)。与仅10％在损伤后存活24小时的媒介物-对照组(▲)相比，12个IU/kg(●)和60个IU/kg(■)BDDFc-铰链分别实现25％和80％存活。FVIII-Fc-铰链的功效评估为与BDD-FVIII(其在40IU/kg(◆)时导致60％存活)的功效相当。
发明详述
应当理解的是，本发明不限于所描述的具体方法、方案、细胞系、动物种或属、构建体、和试剂，并且因此可以有所变化。还应当理解的是，本文中所使用的术语是仅为了描绘具体的实施方案，而且并不意图限制本发明的范围，其仅会被所附权利要求书限制。
必须注意到，如本文中和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确规定，单数形式“一个”、“一种”、和“所述”包括复数提及物。如此，例如，提及“蛋白质”指提及一个/种或多个/种蛋白质，包括本领域技术人员已知的其等同物等。
除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然可以在本发明的实践或测试中使用与本文中所描述的那些方法、装置、和材料相似或等同的任何方法、装置、和材料，但是现在描述优选的方法、装置和材料。
在此为了描述和公开而将本文中所提及的所有出版物和专利收入本文，例如，可结合目前所描述的发明使用的出版物中所描述的构建体和方法。上文所讨论的和遍及整个文本的出版物仅提供用于本申请的申请日前的其公开内容。本文中的任何文字都不应解释为承认本发明没有资格早于凭借在先发明的所述公开。
如本文中所使用的，下文描述了多个术语。
“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物。除非明确限制，该术语涵盖含有与参照核酸具有相似结合特性，并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢的天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另有指明，特定的核酸序列还明确涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。简并密码子取代可以通过生成用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代一个或多个选定的(或所有)密码子的第三位的序列来实现。根据上下文，该术语核酸与基因、cDNA、和由基因编码的mRNA可互换使用。
“源自基因的核酸”指基因或其亚序列最终已经为其合成充当模板的核酸。如此，mRNA、自mRNA逆转录的cDNA、自所述cDNA转录的RNA、自cDNA扩增的DNA、自扩增的DNA转录的RNA等源自基因。并且此类衍生产物的检测指示样品中的初始基因和/或基因转录物的存在和/或丰度。
核酸序列在将其放入与另一核酸序列的功能关系中时是“可操作连接的”或“可操作插入的”。例如，启动子或增强子可以与编码序列可操作连接。可操作连接的核酸序列可以是连续的和/或连接两个蛋白质编码区。一些核酸序列可以是可操作连接的但不是连续的。核酸序列的连接可以通过在限制性位点处的连接来实现。若不存在此类位点，则可以依照常规的实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
具有生物学活性的第一多肽在将其放入与第二多肽的功能关系时与具有生物学活性的第二多肽“可操作连接”，从而第一多肽和第二多肽两者至少保留最低水平的生物活性。在多肽的上下文中，可操作连接不必暗示第一和第二多肽是连续的。如本领域技术人员领会的，可以通过纳入肽接头来便于生物学活性的维持。
多肽、核酸、或其它组分在它与其通常关联的组分(其它肽、多肽、蛋白质(包括复合物，例如聚合酶和核糖体，其可以伴随天然的序列)、核酸、细胞、合成的试剂、细胞污染物、细胞组分等)，例如诸如与其通常在其最初来源的细胞中关联的其它组分部分或完全分开时是“分离的”。多肽、核酸、或其它组分在它自其天然环境的其它组分部分或完全回收或分离，使得它是各组分的组合物、混合物、或集合中存在的主要种类(即，按摩尔计，它比组合物中的任何其它个别种类更丰富)时是分离的。在一些情况中，制备物由超过约60％、70％或75％，通常超过约80％，或超过约90％的分离的种类组成。
“基本上纯的”核酸(例如RNA或DNA)、多肽、蛋白质、或组合物也指其中目标种类(例如核酸或多肽)包含存在于组合物中的所有大分子种类的至少约50、60、70、80、90、或95％(按重量计)。目标种类也可以以实质同质性纯化(通过常规的检测方法不能在组合物中检出污染物种类)，其中组合物基本上由单一大分子种类的衍生物组成。
术语“纯化的”一般指核酸、多肽、或蛋白质是至少约50％纯的、60％纯的、70％纯的、75％纯的、85％纯的、和99％纯的。
术语“重组”在提及例如细胞、多核苷酸、载体、蛋白质、或多肽使用时通常指细胞、多核苷酸、或载体已经通过导入异源(或外来)核酸或改变天然的核酸进行过修饰，或者蛋白质或多肽已经通过引入异源氨基酸进行过修饰，或者细胞源自如此修饰的细胞。重组细胞表达不可在天然(非重组)形式的细胞中找到的核酸序列或者表达在其它情况中会异常表达、表达不足、或根本不表达的天然核酸序列。术语“重组”在提及细胞使用时指明细胞复制异源核酸，或者表达由异源核酸编码的多肽。重组细胞可以含有在天然(非重组)形式的细胞内找不到的编码序列。重组细胞还可以含有在天然形式的细胞中找到的编码序列，其中通过人工手段将编码序列修饰并再导入细胞中。该术语还涵盖含有对于细胞而言内源的在不从细胞取出核酸的情况中进行过修饰的核酸的细胞；此类修饰包括那些通过基因替换、位点特异性突变、重组、及相关技术获得的。
术语“重组生成的”指通常通过化学合成手段、核酸区段的递归(recursive)序列重组或其它核苷酸多样性产生方法(诸如例如改组)、或核酸的分离的区段的操作，例如通过本领域普通技术人员已知的遗传工程技术来实现的人工重组。“重组表达的”通常指用于在体外生成重组核酸，并将重组核酸转移到可以将其表达或增殖的体内、体外、或离体细胞中的技术。
“重组表达盒”或仅“表达盒”意指用能够在与此类序列相容的宿主中实现编码结构蛋白的核酸的表达的核酸元件重组或合成生成的核酸构建体。表达盒必须包括要转录的核酸(例如，编码期望的多肽的核酸)和启动子。如本文中所描述的，也可以使用在实现表达中必需的或有帮助的其它构件。例如，表达盒还可以包含编码指导表达的蛋白质从宿主细胞分泌的分选信号(例如信号肽或分泌前导序列)的核苷酸序列。转录终止信号、增强子、和影响基因表达的其它核酸序列也可以包含在表达盒中。出于本发明的目的，“包含因子VIII融合基因的表达盒”指示由表达盒表达的期望的蛋白质是“因子VIII融合蛋白”，如该术语在下文进一步定义的。
根据上下文，术语“载体”可以指克隆载体、表达载体、或这两者。术语载体和术语“质粒”可互换使用。
术语“表达载体”或“表达质粒”指可以将表达盒导入宿主细胞中，从而转化宿主并促进导入的序列表达(例如转录和翻译)的媒介物。
术语“表达”指容许或引起基因或DNA序列中的信息变得明显，例如通过激活相应基因或DNA序列的转录和翻译中涉及的细胞功能来生成蛋白质。DNA序列在细胞中或由细胞表达以形成“表达产物”诸如蛋白质。表达产物自身例如所得的蛋白质也可以说成“表达的”。表达产物可以表征为胞内、胞外、或分泌的。
“氨基酸修饰”指预定的氨基酸序列的氨基酸序列的变化。例示性的修饰包括氨基酸取代、插入和/或缺失。
“氨基酸插入”指将至少一个氨基酸掺入预定的氨基酸序列中。插入可以由插入的一个或两个氨基酸残基或更大的插入物组成。插入的残基可以是天然存在的或非天然存在的，如上文所公开的。
“氨基酸缺失”指从预定的氨基酸序列除去至少一个氨基酸残基。
“氨基酸取代”指将预定氨基酸序列中的至少一个存在的氨基酸残基用另一个不同的“替换”氨基酸残基替换。替换残基可以是“天然存活的氨基酸残基”(即，由遗传密码编码的)，并且选自下组：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。本文中的氨基酸取代的定义还涵盖用一个或多个非天然存在的氨基酸残基的取代。“非天然存在的氨基酸残基”指与上文所列的那些天然存在的氨基酸残基不同的残基，其能够共价结合多肽链中的相邻氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的例子包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸、和其它氨基酸残基类似物诸如那些记载于Ellman等(Meth.Enzym.202：301-336，1991)的。为了生成此类非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等(Science 244：182，1989)及Ellman等，1991的规程。简言之，这些规程涉及用非天然存在的氨基酸残基化学激活抑制型tRNA，接着进行RNA的体外转录和翻译。最后，本领域技术人员应当认可，可以在一个步骤中，或者在两个步骤中(例如通过氨基酸缺失，接着是氨基酸插入或者反之亦然)来实现例如蛋白质区域的氨基酸取代。
规定的多肽或蛋白质的“变体”包含由于如本文中所定义的至少一处“氨基酸修饰”而与规定的多肽或蛋白质的氨基酸序列不同的氨基酸序列。“变体”包括展现出期望的活性的多肽或蛋白质的片段，诸如IgG的Fc区中结合FcRn，由此在与凝固因子偶联时改善循环半衰期的片段。
“融合多肽”指包含未发现在相同多肽中天然存在的至少两个离散的肽部分的多肽。
“融合蛋白”指包含至少一种融合多肽的蛋白质。如此，多亚基蛋白质称为融合蛋白，即使仅其亚基之一是融合多肽。
术语“FVIII”、“因子VIII”、或“因子VIII蛋白”意图涵盖拥有因子VIII的生物学活性的野生型因子VIII蛋白，包括功能性等位变体，或其任何衍生物、变体、或类似物。出于此定义的目的，“因子VIII的生物学活性”指其参与血液凝固的内源性途径的能力。一般而言，可以使用商品化因子VIII测定法(Coatest
diaPharma
West Chester，Ohio)或本领域中的其它测定法通过参照源自血浆的因子VIII标准品来测定此生物学活性。
在提及因子VIII域的情况中，使用“域”来表示本领域技术人员已知的因子VIII的合适的区域。就人因子VIII而言，图1中显示了不同因子VIII域的氨基酸编号。
“因子VIII融合基因”指编码如下文进一步定义的“因子VIII融合蛋白”，而且可以通过将编码调控剂的核酸在因子VIII蛋白编码序列内与B域编码部分对应的位置处可操作插入编码因子VIII蛋白的核酸中来生成的非天然存在的核酸构建体。举例而言，至少可以将B域编码序列的一部分缺失，并用编码调控剂的核酸替换。如本领域技术人员应当领会的，“可操作插入”仅意图涵盖编码调控剂的核酸的那些插入，其生成编码调控剂的核酸的一部分和在编码调控剂的核酸的上游和下游的编码因子VIII的一部分的核酸均在适当的读码框中的核酸构建体。因子VIII融合基因可以进一步包含编码肽接头或多聚化序列的其它核酸序列。最后，出于上述定义的目的，“基因”并不意图暗示存在在其它情况中会是实现转录、翻译、或适当的翻译后加工所需要的任何核酸序列(即启动子、增强子、信号肽、分泌前导序列等)。
“因子VIII融合蛋白”指通过因子VIII融合基因的转录和翻译生成，但是其尚未经历翻译后加工的全长多肽。在翻译后加工过程中，因子VIII融合蛋白转化成“因子VIII融合异二聚体”，如下文所定义的。
“因子VIII融合异二聚体”指具有因子VIII的生物学活性，并且由于因子VIII融合基因的转录和翻译，及由此生成的因子VIII融合蛋白的翻译后修饰(包括蛋白水解加工)而生成的异二聚体蛋白质。如此，因子VIII融合异二聚体与发现在血浆中循环的异二聚体形式的野生型因子VIII类似(即包含重链和轻链)。本发明的因子VIII融合异二聚体与其来源的异二聚体形式的因子VIII蛋白的不同之处可以在于其由例如“经修饰的重链”(即包含调控剂，而且还可以具有B域的至少一部分的缺失的因子VIII重链)组成。与衍生融合异二聚体的因子VIII蛋白相比，本发明的因子VIII融合异二聚体可以展现出例如，延长的循环半衰期。“因子VIII融合异二聚体”还可以涵盖“多聚体”和“杂合”因子VIII融合异二聚体，如下文进一步定义的。
“多聚体因子VIII融合异二聚体”指包含至少两个因子VIII融合异二聚体的蛋白质。若存在于第一因子VIII融合异二聚体中的调控剂的氨基酸、肽、或多肽部分能够介导与存在于第二因子VIII融合异二聚体中的调控剂的同源或异源部分的非共价或共价关联，则可以出现多聚体因子VIII融合异二聚体。例如，IgG的Fc部分的铰链区能够介导两个因子VIII融合异二聚体间的共价关联，不管因子VIII融合异二聚体是否具有相同的氨基酸序列(在该情况中，多聚体因子VIII融合异二聚体可以称为“同-多聚体因子VIII融合异二聚体”)或不同氨基酸序列(在该情况中，多聚体因子VIII融合异二聚体可以称为“异-多聚体因子VIII融合异二聚体”)。若在编码调控剂的核酸外，因子VIII融合基因包含可操作连接的编码氨基酸、肽、或多肽的核酸，则也可以出现多聚体因子VIII融合异二聚体，所述氨基酸、肽、或多肽能够介导与同源氨基酸、肽、或多肽(下文称为“同-多聚化序列”)或异源肽或多肽(下文称为“异-多聚化序列”)的非共价或共价关联。熟练技术人员应当领会，在第一因子VIII融合基因仅含有异-多聚化序列时，可以需要独特的第二因子VIII融合基因来生成多聚体因子VIII融合异二聚体。例如，熟练技术人员会认可，为了利用美国专利No.5,807,706中所描述的“凸出-进入-空穴”方法，会需要两种因子VIII融合基因。关于多聚体因子VIII融合异二聚体的重组生成，熟练技术人员应当领会，同-多聚体形式可以通过单一重组宿主细胞生成，而异-多聚体形式可以通过在单一宿主细胞内的共表达或在多个宿主细胞中分开表达(在相同或不同细胞培养系统中)来生成。虽然并不意图受限于目前已知的方法，但是下列非限制性参考文献中教导的用于生成多聚体多肽的通用方法可以进行改编以用于生成多聚体因子VIII融合异二聚体：美国专利申请公开文本No.2007/0287170；美国专利No.7,183,076中所披露的“多聚化域”方法，例如那些采用免疫球蛋白模块的；使用Fos和Jun亮氨酸拉链，如美国专利No.5,932,448中所采用的；及美国专利No.6,833,441中所采用的“异二聚体化序列”方法。
“杂合因子VIII融合异二聚体”指仅包含与至少一个其它多肽共价或非共价关联的单一因子VIII融合异二聚体的本发明的任何重组蛋白。熟练技术人员应当领会，在调控剂能够形成二聚体或多聚体(例如免疫球蛋白的二聚Fc区)的情况中，有可能生成多聚体因子VIII融合异二聚体(如上文所定义的)。然而，熟练技术人员应当认可，不是多聚体半衰期调控剂的每个多肽都需要以因子VIII融合蛋白表达。例如，在使用Fc区作为调控剂的情况中，可以将仅编码Fc区(或与亲和标签或非因子VIII肽、蛋白质或蛋白质片段可操作连接的Fc区)的表达盒导入包含含有因子VIII融合基因的表达盒的相同或不同宿主细胞中。熟练技术人员还应当领会，即使在调控剂不能形成二聚体或多聚体时，也可以设计杂合因子VIII融合异二聚体。具体地，同-或异二聚体序列可以位于因子VIII融合基因内，在编码调控剂的核酸的5’(表达时关系为N-端)或3’(即，表达时关系为C-端)。
术语“调控剂”指在插入或取代到蛋白质(例如因子VIII)中时修饰例如蛋白质的活性和/或药动学特性的任何多肽、蛋白质、蛋白质片段、或其变体(其由一个或多个多肽亚基组成)。举例而言，与其来源的蛋白质相比，“半衰期调控剂”可以延长或缩短蛋白质(例如因子VIII融合异二聚体、杂合因子VIII融合异二聚体、或由于所述插入或取代而生成的多聚体因子VIII融合异二聚体)的循环半衰期。半衰期调控剂可以例如将蛋白质(例如因子VIII融合异二聚体、杂合因子VIII融合异二聚体、或多聚体因子VIII融合异二聚体)的循环半衰期延长至少10％、至少20％、至少30％或至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少100％。在一个实施方案中，与其来源的因子VIII蛋白相比，半衰期调控剂可以将因子VIII融合异二聚体、杂合因子VIII融合异二聚体、或多聚体因子VIII融合异二聚体的循环半衰期延长至少约2倍，并且在又一些实施方案中，将循环半衰期延长至少约2.5倍、至少约3倍，或更多。在另一个实施方案中，半衰期调控剂不包括因子VIII蛋白的任何内源元件，诸如但不限于B域。
如本文中所使用的，术语“循环半衰期”、“血浆半衰期”、“血清半衰期”、或“t[1/2]”在对患者施用肽药物的上下文中可以定义为药物在患者中的血浆浓度降低一半所需要的时间。根据多种清除机制、再分布、和本领域中公知的其它机制，可以有超过一个与肽药物有关的半衰期。通常，alpha和beta半衰期定义为使得alpha相与再分布有关，而beta相与清除有关。然而，在很大程度上局限于血流的蛋白质药物的情况中，可以有至少两个清除半衰期。出于本发明的目的，可以通过在施用后适当选定的时间点时测量血浆蛋白质水平(使用例如抗原ELISA来进行)，或者通过在适当选定的时间点时测量凝结剂活性(使用例如Coatest测定法来进行)来计算beta半衰期。关于半衰期的进一步解释可以参见Pharmaceutical Biotechnology(1997，DFA Crommelin和RD Sindelar编，Harwood Publishers，Amsterdam，第101页-第120页)。
因子VIII融合基因的构建
本发明的一个方面涉及因子VIII融合基因。因子VIII融合基因可以是RNA或DNA。如先前所述，因子VIII融合基因是编码因子VIII融合蛋白的核酸分子。因子VIII融合基因源自因子VIII编码序列、编码调控剂的核酸、和任选地编码同或异-多聚化序列的核酸，其与编码调控剂的核酸不同。虽然在下文进一步详述了因子VIII融合基因的这些构件，但是熟练技术人员应当领会，可以使用公知的规程从编码这些离散的构件的核酸合成因子VIII融合基因的构建。可以在本发明中得到应用的多种方法记载于Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第3版(Maniatis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，2001)，及Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley &Sons)。
编码因子VIII的核酸的选择
本发明的重组因子VIII融合蛋白和异二聚体可以通过修饰核酸来制备，所述核酸编码野生型因子VIII、可以存在并从一个个体到另一个发生的因子VIII的天然等位变体、嵌合因子VIII(例如人/猪)、或已经在其它方面进行过修饰，但仍保留促凝血功能的变体因子VIII，诸如已经进行过修饰以影响野生型因子VIII或因子VIIIa蛋白的特性，诸如糖基化位点和样式、抗原性、比活性、循环半衰期、蛋白质分泌、对因子IXa和/或因子X的亲和力、改变的因子VIII-失活切割位点、激活的因子VIIIa形式的稳定性、免疫原性、保存期等的变体。可以依照本发明修饰的合适的突变体因子VIII序列可以包括具有与野生型因子VIII有关的促凝固功能的任何先前已知的或后来鉴定的变体因子VIII序列。
可以依照本发明修饰的合适的野生型因子VIII可以来自多种动物，包括但不限于哺乳动物诸如人(参见例如GenBank登录号AAA52484(氨基酸)(SEQ ID NO：1)和K01740(核苷酸)(SEQ ID NO：2)、GenBank登录号AAA52485(氨基酸)(SEQ ID NO：3)和M14113(核苷酸)(SEQ ID NO：4)、和GenBank登录号AAA52420(氨基酸)(SEQ ID NO：5))；大鼠(参见例如GenBank登录号AAQ21580(氨基酸)和AY362193(核苷酸))；小鼠(参见例如GenBank登录号AAA37385(氨基酸)和L05573(核苷酸))；犬(参见例如GenBank登录号AAB87412(氨基酸)和AF016234(核苷酸))；蝙蝠(参见例如GenBank登录号ACC68917(氨基酸)和DP000725(核苷酸))；鸡(参见例如GenBank登录号AAO33367(氨基酸)和AF465272(核苷酸))；黑猩猩(参见例如GenBank登录号XP_529212(氨基酸)和XM_529212(核苷酸))；猪(参见例如GenBank登录号NP_999332(氨基酸)和NM_214167(核苷酸))；兔(参见例如GenBank登录号ACA42556(氨基酸)和EU447260(核苷酸))；猫、猴、豚鼠、猩猩、母牛、马、绵羊、山羊、或其它哺乳动物物种。来自人、猪、鼠和犬的序列还经由血友病A突变、结构、测试和来源网址(或HAMSTeRS)(其进一步提供了人、猪、鼠、和犬因子VIII蛋白的比对)以电子形式可获得。如本领域技术人员应当领会，哺乳动物因子VIII蛋白间的保守和同源性是公知的。
可以依照本发明修饰的合适的突变体因子VIII的一个非限制性例子是B域缺失型因子VIII(BDD因子VIII)，其特征在于具有含有天然存在的人FVIII的B域的几乎14个氨基酸(SFSQNPPVLKRHQR，SEQ ID NO：6)的缺失的氨基酸序列。(Lind等，Eur.J.Biochem.232：19-27，1995)。此BDD因子VIII具有氨基酸序列SEQ ID NO：7。
可以依照本发明修饰的合适的突变体因子VIII的另一个非限制性例子是嵌合人/动物因子VIII，其含有作为负责人因子VIII的抗原性的人氨基酸残基的取代的一个或多个动物氨基酸残基(参见例如美国专利No.5,364,771；5,663,060；及5,888,974)。例如，动物(例如猪)残基取代可以包括但不限于下列一处或多处：R484A、R488G、P485A、L486S、Y487L、Y487A、S488A、S488L、R489A、R489S、R490G、L491S、P492L、P492A、K493A、G494S、V495A、K496M、H497L、L498S、K499M、D500A、F501A、P502L、1503M、L504M、P505A、G506A、E507G、1508M、1508A、M2199I、F2200L、L2252F、V2223A、K2227E、和/或L2251(参见例如美国专利No.5,859,204和6,770,744及美国专利申请公开文本No.2003/0166536)。
可以依照本发明修饰的合适的突变体因子VIII的另一个非限制性例子是特征在于由于融合的A2和A3域引起的激活的因子VIII的稳定性更大的因子VIII。例如，可以如下修饰因子VIII，即取代第664位和第1826位的半胱氨酸残基，产生包括共价连接A2和A3域的Cys664-Cys1826二硫化物键的突变体因子VIII(Gale等，J.Thromb.Haemost.1：1966-1971，2003)。
可以依照本发明修饰的合适的突变体因子VIII的别的非限制性例子是具有改变的失活切割位点的因子VIII(参见例如Amano等，Thromb.Haemost.79：557-63，1998；Thornburg等，Blood 102：299，2003)。可以使用这些变化来降低突变体因子VIII对切割酶的易感性，所述切割酶通常使野生型因子VIII失活。
可以依照本发明修饰的合适的突变体因子VIII的另一个非限制性例子是具有增强的对因子IXa(参见例如Fay等，J.Biol.Chem.269：20522-20527，1994)；Bajaj等，J.Biol.Chem.276：16302-16309，2001；及Lenting等，J.Biol.Chem.271：1935-1940，1996)和/或因子X(参见例如Lapan等，J.Biol.Chem.272：2082-2088，1997)的亲和力的因子VIII。
可以依照本发明修饰的合适的突变体因子VIII的另一个非限制性例子是修饰为增强因子VIII的分泌的因子VIII(参见例如Swaroop等，J.Biol.Chem.272：24121-24124，1997)。
可以依照本发明修饰的合适的突变体因子VIII的别的非限制性例子是具有延长的循环半衰期的因子VIII。这些突变体因子VIII蛋白可以表征为具有但不限于降低的与硫酸乙酰肝素的相互作用(Sarafanov等，J.Biol.Chem.276：11970-11979，2001)和/或降低的与低密度脂蛋白受体相关蛋白(“LRP”)的相互作用(参见例如WO 00/28021；WO 00/71714；Saenko等，J.Biol.Chem.274：37685-37692，1999；及Lenting等，J.Biol.Chem.274：23734-23739，1999)。
可以依照本发明修饰的合适的突变体因子VIII的另一个非限制性例子是由修饰为编码在已知的、现有的表位内的氨基酸以生成天冬酰胺残基处的糖基化识别序列的核苷酸序列编码的经修饰的因子VIII(参见例如美国专利No.6,759,216)。此例子的突变体因子VIII在提供经修饰的因子VIII中可以是有用的，所述经修饰的因子VIII逃脱现有抑制性抗体的检测(低抗原性因子VIII)，而且其降低形成抑制性抗体的概率(低免疫原性因子VIII)。在一个实施方案中，可以依照本发明修饰的此类突变体因子VIII是突变成具有N连接的糖基化的共有氨基酸序列的因子VIII。此类共有序列的例子是N-X-S/T，其中N是天冬酰胺，X是任何氨基酸，且S/T代表丝氨酸或苏氨酸(参见例如美国专利No.6,759,216)。
可以依照本发明修饰的合适的突变体因子VIII的另一个非限制性例子是具有多处突变的促凝固活性因子VIII(参见例如美国专利No.6,838,437和美国专利申请公开文本No.2004/0092442)。此实施方案的一个例子涉及突变体因子VIII，其已经修饰为(i)缺失von Willebrand因子结合位点，(ii)添加Arg 740处的突变，并(iii)在A2-和A3-域间添加氨基酸序列间隔物，其中氨基酸间隔物具有足够的长度，从而在激活后，促凝血活性因子VIII蛋白变为异二聚体(参见例如美国专利申请公开文本No.2004/0092442；Pittman等，PNAS85：2429-2433，1988：披露了Arg740处的切割对生成辅因子活性不是至关重要的)。
可以依照本发明修饰的合适的突变体因子VIII的另一个非限制性例子是由具有一个或多个位置中插入的截短的因子IX内含子1的核苷酸序列编码的突变体因子VIII(参见例如美国专利No.6,800,461和6,780,614)。可以使用此突变体因子VIII来产生体外及在供基因疗法用的转移载体中的重组因子VIII的更大的产量(参见例如美国专利No.6,800,461)。在此实施方案的一个例子中，突变体因子VIII可以由如下的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列具有两个位置中插入的截短的因子IX内含子1，而且具有适合于在造血细胞系中以及在血小板中驱动表达的启动子(参见例如美国专利No.6,780,614)。
可以依照本发明修饰的合适的突变体因子VIII的别的非限制性例子是展现出抑制性抗体的抑制降低的突变体因子VIII(参见例如美国专利No.5,859,204；6,180,371；6,458,563；和7,122,634)。
可以依照本发明修饰的合适的突变体因子VIII的另一个非限制性例子是如下的突变体因子VIII，其在A2域中具有一处或多处氨基酸取代，该取代具有提高因子VIII的半衰期和/或比活性的效果(参见例如美国专利No.7,211,559)。
可以依照本发明修饰的合适的突变体因子VIII的别的非限制性例子是展现出升高的比活性的突变体因子VIII(参见例如美国专利申请公开文本No.2007/0265199)。
可以依照本发明修饰的合适的突变体因子VIII的另一个非限制性例子是已经在预定的位点处被一个或多个生物相容性聚合物共价结合的FVIII突变蛋白质(参见例如美国专利申请公开文本No.2006/0115876)。
编码调控剂的核酸的选择
本发明的因子VIII融合基因包括编码调控剂的核酸。例如，多种蛋白质(和编码它们的核酸)是本领域中已知的，其在与治疗性蛋白质融合时与未融合的治疗性蛋白质相比具有延长血清半衰期的效果。可以潜在地使用编码这些参考文献中教导的任何调控剂的核酸来构建本发明的因子VIII融合基因。选择可以例如潜在地延长因子VIII融合异二聚体的循环半衰期(与其来源的因子VIII蛋白相比)的候选调控剂的考虑因素包括：(1)调控剂的循环半衰期应当大于为修饰选定的因子VIII蛋白的循环半衰期；及(2)融合蛋白的免疫原性。关于第二项考虑因素，可以优选使用天然表达的或源自在意图用因子VIII融合异二聚体治疗的群体(例如人)中天然表达的蛋白质的调控剂。例如，调控剂天然存在于意图要治疗的群体的血清中(例如，使用人Fc区，其中人是意图的治疗群体)。
在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白恒定区可以作为调控剂使用。因而，在构建本发明的因子VIII融合基因中使用的调控剂编码核酸序列可以是编码免疫球蛋白(Ig)的Fc区或其片段和/或变体的多核苷酸，和编码FcRn结合肽或其变体的多核苷酸。在一个实施方案中，所使用的核酸编码调控剂，其是自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgD、或IgM、或小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、或IgM获得的免疫球蛋白的Fc区或其片段和/或变体。在另一个实施方案中，所使用的核酸编码调控剂，其是人或小鼠IgG的Fc区、具有非功能性铰链(通过所述铰链区中的半胱氨酸残基的取代或缺失来得到)的人或小鼠IgG的Fc区的变体、或人或小鼠IgG的Fc区的非铰链部分。在别的实施方案中，所使用的核酸编码调控剂，其是小鼠IgG1或人IgG1的Fc区、或人IgG1或小鼠IgG1的Fc区的非铰链部分。在又一个实施方案中，所使用的核酸编码调控剂，其是人IgG1的Fc区、具有非功能性铰链(通过半胱氨酸残基的取代或缺失来得到)的人IgG1的变体Fc区、或人IgG1的Fc区的非铰链部分。
对于免疫球蛋白的Fc区的片段，编码调控剂的核酸可以至少编码Fc区中限定被新生儿Fc受体(FcRn)结合的表位的氨基酸区段，而且可以进一步编码与Fc区的铰链部分对应的区段。或者，编码调控剂的核酸可以至少编码FcRn结合肽。不受限制，合适的FcRn结合肽的例子包括序列PKNSSMISNTP(SEQID NO：24)，而且可以进一步包含选自下组的序列：HQSLGTQ(SEQ IDNO：25)、HQNLSDGK(SEQ ID NO：26)、HQNISDGK(SEQ ID NO：27)、或VISSHLGQ(SEQ ID NO：28)(参见例如美国专利No.5,739,277)。
在本发明的一个实施方案中，调控剂可以由如下的核酸序列编码，所述核酸序列编码与SEQ ID NO：9(人IgG1的Fc区)、SEQ ID NO：11(人IgG2的Fc区)、SEQ ID NO：13(人IgG3的Fc区)、SEQ ID NO：15(人IgG4的Fc区)、SEQID NO：29(小鼠IgG1的Fc区)、SEQ ID NO：17(人IgG1的Fc区的非铰链部分)、SEQ ID NO：19(人IgG2的Fc区的非铰链部分)、SEQ ID NO：21(人IgG3的Fc区的非铰链部分)、SEQ ID NO：23(人IgG4的Fc区的非铰链部分)、或SEQ IDNO：30(小鼠IgG1的Fc区的非铰链部分)相同或共享至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％氨基酸同一性的氨基酸序列。编码上述之一的核酸的具体例子包括SEQ ID NO：8(人IgG1的Fc区)、SEQ ID NO：10(人IgG2的Fc区)、SEQ ID NO：12(人IgG3的Fc区)、SEQID NO：14(人IgG4的Fc区)、SEQ ID NO：47(小鼠IgG1的Fc区)、SEQ ID NO：16(人IgG1的Fc区的非铰链部分)、SEQ ID NO：18(人IgG2的Fc区的非铰链部分)、SEQ ID NO：20(人IgG3的Fc区的非铰链部分)、SEQ ID NO：22(人IgG4的Fc区的非铰链部分)、和SEQ ID NO：48(小鼠IgG1的Fc区的非铰链部分)。
用于鉴定编码调控剂的核酸的方法
可以通过使用本文中所描述的方法来将其它多肽或蛋白质鉴定为合适的调控剂。候选调控剂(例如，可以潜在地用于创建因子VIII融合基因和因子VIII融合蛋白的多肽)包括那些已经显示出通过与治疗性蛋白质融合来延长非因子VIII治疗性蛋白质或肽的血清半衰期的肽和蛋白质。例如，一种用于鉴定因子VIII蛋白的调控剂的方法是检查包含调控剂的因子VIII融合异二聚体在血友病A动物模型诸如血友病A(HemA)小鼠中的药动学。
编码调控剂的核酸的插入位点
本发明的因子VIII融合基因包括编码调控剂的核酸。可以将编码调控剂的核酸插入因子VIII基因的B域部分内。例如，可以在插入编码调控剂的核酸前或后，至少缺失编码因子VIII基因的B域的核酸的一部分(例如至少缺失编码N-745至S-1637的B域部分的因子VIII基因的一部分)。或者，可以使用位点特异性重组来同时插入编码调控剂的核酸并缺失B域区编码核酸的一部分。用于实现插入、缺失、和位点特异性重组的重组方法是本领域中公知的。
在一个实施方案中，因子VIII融合基因包含编码因子VIII融合蛋白的核酸序列，其中因子VIII融合蛋白包含因子VIII蛋白，其中调控剂的氨基酸序列存在于B域中，或者用调控剂的氨基酸序列替换B域的一些或所有氨基酸序列。在第二个实施方案中，因子VIII融合基因包含编码因子VIII融合蛋白的核酸序列，所述因子VIII融合蛋白包含与SEQ ID NOS：1或5之任一项的氨基酸20-764对应的第一氨基酸序列、与SEQ ID NOS：1或5之任一项的氨基酸1656-2351对应的第二氨基酸序列、和调控剂氨基酸序列，其中半衰期调控剂氨基酸序列在其氨基端共价附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且在其羧基端共价附接于所述第二氨基酸的氨基端。
在分泌前，B域在Arg1648(即，B-a3连接)处切割，并且在B域中，主要在Arg1313后可变切割(参见例如Thompson，Semin.Thromb.Hemost.29：11-22，2003)。如此，熟练技术人员应当认可，对于B域区中的插入、缺失和/或取代，应当维持存在于B-a3域连接处的切割位点以将因子VIII融合蛋白适当翻译后加工成因子VIII融合异二聚体。同样地，对于在B域区中的插入，应当将编码调控剂的核酸在编码B域的核酸内在编码Arg1313的核酸5’的位点处插入；或者，可以将B域内的切割位点(除B-a3连接处的切割位点外)突变以阻止在因子VIII融合蛋白的翻译后加工过程中调控剂从N端(重链)部分的切割(并且因此分离)。
已知a2-B域连接处的切割对于产生因子VIII的辅因子活性不是至关重要的(Pittman等，PNAS 85：2429-2433，1988)。在人因子VIII中，a2-B域连接存在于Arg740处。本发明的因子VIII融合基因包括编码在a2-B域连接处经历切割的因子VIII融合蛋白的基因及编码在a2-B域连接处具有阻止切割的氨基酸修饰的因子VIII融合蛋白的基因。举例而言，可以将a2-B域连接切割位点完整保留，因为在激活本发明的因子VIII融合异二聚体后在此连接处的切割导致形成与在激活衍生因子VIII融合异二聚体的因子VIII蛋白后生成的因子VIIIa蛋白相同的因子VIIIa蛋白(并且因此具有与其相同的生物学活性)。
本领域技术人员应当领会，若因子VIII融合异二聚体中在a2-B域连接处的切割程度或速率小于在其来源的因子VIII蛋白中看到的，则最有可能是由于调控剂的位阻。如此，可以期望包括在a2-B域连接与半衰期调控剂之间的肽接头(即间隔物)形成中的额外氨基酸诸如肽接头DDDDK(SEQ ID NO：49)和GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：50)。
编码同-或异-多聚化序列的核酸的选择和插入位点
任选地，本发明的因子VIII融合基因包括与编码调控剂的核酸不同的编码同-或异-多聚化序列的核酸。可以期望纳入编码同-或异-多聚化序列的核酸以在第一因子VIII融合异二聚体中采用的调控剂不能介导与存在于第二因子VIII融合异二聚体中的调控剂的同源或异源部分的非共价或共价关联时生成多聚因子VIII融合异二聚体。或者，可以期望纳入编码同-或异-多聚化序列的核酸以在第一因子VIII融合异二聚体中采用的调控剂由单一多肽组成时生成杂合因子VIII融合异二聚体。
如本领域技术人员应当领会，会通过所利用的特定多聚化方法来规定编码同-或异-多聚化序列的核酸的选择。可以将下列非限制性参考文献中教导的用于生成多聚体多肽的通用方法中所采用的编码同-或异-多聚化序列的核酸序列掺入本发明的因子VIII融合基因中：美国专利申请公开文本No.2007/0287170；美国专利No.7,183,076中所披露的“多聚化域”方法，例如那些采用免疫球蛋白模块的；使用Fos和Jun亮氨酸拉链，如美国专利No.5,932,448中所采用的；及美国专利No.6,833,441中所采用的“异二聚体化序列”方法；及美国专利No.5,807,706中所描述的“凸出-进入-空穴”方法。
熟练技术人员应当领会，可以需要独特的第二因子VIII融合基因以在第一因子VIII融合基因仅含有异-多聚化序列时生成多聚体因子VIII融合异二聚体或杂合因子VIII融合异二聚体。例如，熟练技术人员应当认可，为了利用美国专利No.5,807,706中所描述的“凸出-进入-空穴”方法，会需要两种因子VIII融合基因，其各自包含独特的异-多聚化序列。
熟练技术人员应当认可，因子VIII融合基因内编码同-或异-多聚化序列的核酸可以位于因子VIII融合基因内在调控剂的5’(表达时关系为N-端)或3’(即，表达时关系为C-端)，只要其位置不干扰在其它情况中是因子VIII融合异二聚体形成所需要的转录、翻译、或翻译后修饰。可以至少将编码多聚化序列的核酸，如编码调控剂的核酸插入编码B域的因子VIII基因区域的一部分内或替换编码B域的因子VIII基因区域的一部分。
表达盒和表达载体
本发明的又一方面涉及包含因子VIII融合基因的表达盒或表达载体。对于包含因子VIII融合基因的表达盒的重组生成，将因子VIII融合基因分离，并与启动子可操作连接。任选地，可以将因子VIII融合基因与转录终止信号、编码信号肽的核酸、或其它影响基因表达或翻译后加工的核酸序列(例如常规定位的限制性位点、增强子、分泌前导序列等)进一步可操作连接。若表达盒的期望的构件(与因子VIII融合基因不同)已经包含在可复制的克隆载体或表达载体内，则仅需要通过本领域中公知的重组技术将因子VIII融合基因在合适的位置中可操作插入。许多克隆载体是商品化的，而且一般包括下列一种或多种：信号序列、复制起点、增强子元件、启动子、转录终止序列、和一种或多种选择基因或标志物。许多表达载体也是商品化的，并且可以使用本领域中公知的方法和试剂来实现因子VIII融合基因的插入(参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Press，NY(1989)；Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，New York，N.Y.：John Wiley & Sons(1989)。表达载体的选择会取决于优选的转化技术和供转化用的靶宿主。
可用于本发明的表达载体包括但不限于染色体、附加体、和病毒来源的载体，例如源自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件(bacteriophages，yeast episomes)、病毒诸如杆状病毒、乳多泡病毒、痘苗病毒、腺病毒、鸡痘病毒、伪狂犬病病毒(baculoviruses，papova viruses，vacciniaviruses，adenoviruses，fowl pox viruses，pseudorabies viruses)和逆转录病毒的载体，和源自其组合的载体，诸如粘粒和噬菌粒。适合于在动物细胞中重组表达的病毒载体是本领域中公知的(参见例如美国专利No.5,871,986和6,448,046)。
适合于实施本发明的载体包括但不限于下列病毒载体诸如lambda载体系统gt11、gtWES.tB、Charon 4、和质粒载体诸如pCMV、pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV 40、pBluescript II SK+/-或KS+/-(Stratagene，LaJoIIa，CA)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(Studier等，Methods Enzymol.185：60-89，1990)、及其任何衍生物。合适于在细菌中使用的载体包括pQE70、pQE60、和pQE-9(Qiagen，Valencia，CA)；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、和pNH46A(Stratagene，LaJoIIa，CA)；pcDNA3(Invitrogen，Carlsbad，CA)；和pGEX、ptrxfus、ptrc99a、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、和pRIT5。合适的真核载体是pWLNEO、PSV2CAT、pOG44、pXT1、pBK、和pSG(Stratagene，LaJoIIa，CA)；和pSVK3、pBPV、pMSG、和pSVL。其它合适的载体会是熟练技术人员容易显而易见的。
使用包含编码合适的标志物的基因的表达载体，所述标志物赋予可选择表型，诸如药物抗性、营养营养缺陷型、对细胞毒剂的抗性或表面蛋白的表达。可以使用的选择标志基因的例子包括neo、gpt、dhfr、ada、pac(嘌呤霉素)、hyg、和hisD。
可以通过本领域中公知的重组技术来容易地测定因子VIII融合基因的成功连接(或插入载体中)(例如使用常规的规程来分离并测序或者使用能够特异性结合连接位点的寡核苷酸探针)。
宿主细胞
本发明的又一方面涉及包含因子VIII融合基因的宿主细胞。因子VIII融合基因可以存在于克隆载体、表达载体内，或者在宿主细胞基因组中整合。在一个实施方案中，宿主细胞以稳定的质粒或以对宿主细胞基因组的稳定插入或整合形式含有DNA分子形式的必需的核酸构建体。在另一个实施方案中，宿主细胞可以含有表达系统中的DNA分子。
在一个实施方案中，将本发明的因子VIII融合基因以有义方向掺入合适的载体中，从而将可读框适当定向以在选定的启动子的控制下表达编码的蛋白质。这牵涉将合适的调节元件纳入表达载体中。这些可以包括例如，载体的非翻译区、有用的启动子、和5’和3’非翻译区，其与宿主细胞蛋白质相互作用以实施转录和翻译。此类元件在其强度和特异性方面可以有所变化。根据所利用的载体系统和宿主，可以使用许多合适的转录和翻译元件，包括组成性和诱导型启动子。组成性启动子是在生物体的整个发育和生命中指导基因表达的启动子。诱导型启动子是能够响应诱导物而直接或间接激活一种或多种DNA序列或基因转录的启动子。在没有诱导物的情况中，不会转录DNA序列或基因。
本发明的表达载体还可以包含与编码选定的蛋白质的DNA分子可操作连接的可操作的3’调节区，其选自那些能够提供正确转录终止和在选定的宿主细胞中表达的mRNA的多腺苷酸化的调节区。
为了在宿主细胞中重组生成因子VIII融合异二聚体，可以将因子VIII融合基因掺入宿主细胞中。可以使用本领域中公知的重组技术经由例如转化、转导、接合、转移(mobilization)、或电穿孔来将克隆载体、表达载体和质粒导入细胞中。
宿主细胞可以包括但不限于哺乳动物细胞、细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞(例如Sf9细胞)、真菌细胞、酵母细胞(例如酵母(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、植物细胞(例如拟南芥属(Arabidopsis)或烟草细胞)、或藻细胞。适合于实施本发明的哺乳动物细胞包括但不限于COS(例如ATCC No.CRL 1650或1651)、幼仑鼠肾(“BHK”)(例如ATCC No.CRL6281)、中国仓鼠卵巢(“CHO”)(ATCC No.CCL 61)、HeLa(例如ATCC No.CCL 2)、293(ATCC No.1573)、NSO骨髓瘤、CHOP、NS-1、和HKB11(参见例如美国专利No.6,136,599)。
适合于在哺乳动物细胞中指导表达的表达载体一般包含启动子及本领域中已知的其它转录和翻译控制序列。常见的启动子包括SV40、MMTV、金属硫蛋白-1、腺病毒Ela、CMV、立即早期、免疫球蛋白重链启动子和增强子、和RSV-LTR。本领域技术人员可以基于其作为启动子的强度来容易地选择合适的哺乳动物启动子。或者，在期望特定蛋白质的表达或阻抑时，可以为了控制而采用诱导型启动子。本领域技术人员可以容易地从本领域中已知的启动子选择合适的诱导型哺乳动物启动子。
不论为了本发明的因子VIII融合异二聚体的重组生成而选择的宿主细胞，可以通过用更常见的密码子替换因子VIII融合基因中的不常见密码子来实现蛋白质表达的升高(参见例如美国专利No.6,924,365)。熟练技术人员应当领会，决定特定的因子VIII融合基因密码子是否“不常见”或“常见”取决于为重组生成而选择的宿主细胞的特定密码子选择。
因子VIII融合蛋白和异二聚体的生成
鉴于本文中所讨论的重组技术，本发明的另一方面涉及生成本发明的因子VIII融合异二聚体的方法。此方法牵涉在宿主细胞表达因子VIII融合蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞。在因子VIII融合蛋白的翻译后修饰后，然后可以将重组因子VIII融合异二聚体纯化并分离。本发明的一个方面是用于生成因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体的方法，包括(a)提供经编码因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体的表达载体转化的宿主细胞；(b)培养细胞；并(c)分离因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体。在又一个实施方案中，宿主细胞可以是哺乳动物细胞，并且调控剂的氨基酸序列可以是糖基化的。
关于多聚体因子VIII融合异二聚体的重组生成，熟练技术人员应当领会，同-多聚体形式可以通过单一重组宿主细胞生成，而异-多聚体形式可以通过在单一宿主细胞内的共表达或在多个宿主细胞中分开表达(在相同或不同细胞培养系统中)来生成。与异-多聚体形式相似，熟练技术人员应当领会，杂合因子VIII融合异二聚体可以通过在单一宿主细胞内的共表达或在多个宿主细胞中分开表达(在相同或不同细胞培养系统中)来生成。在利用不同培养系统的情况中，可以将来自每种培养物的重组蛋白质产物分离，然后使用本领域中公知的标准技术来再结合。对于多聚体因子VIII融合异二聚体和杂合因子VIII融合异二聚体的重组生成，可以选择能够以期望的方式装配多聚体或杂合因子VIII融合异二聚体的链的宿主细胞。
作为共表达不同基因的备选，可以生成编码所有需要的多肽链的单顺反子基因。关于可以如何设计此类基因的具体例子，参见下文实施例5。
可以以基本上纯的形式生成重组因子VIII融合异二聚体。可以使用本领域中公知的方法来纯化并鉴定纯化的因子VIII融合异二聚体。
药物组合物
本发明的另一方面涉及包含因子VIII融合异二聚体和药学可接受载体的药物组合物。药学可接受载体是可以添加至活性成分以帮助配制或稳定化制备物，而且不对患者引起显著不利的毒物学效果的物质。此类载体的例子是本领域技术人员公知的，并且包括水、糖诸如麦芽糖或蔗糖、清蛋白、盐诸如氯化钠等。其它载体记载于例如E.W.Martin的Remington’s PharmaceuticalSciences。此类组合物会含有有效量的至少一种因子VIII融合异二聚体。
药学可接受载体包括无菌水溶液或分散体和和供即时制备无菌可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域中已知的。优选地，组合物配制用于胃肠外注射。组合物可以配制为溶液、微乳、脂质体、或其它适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、及液态聚乙二醇等)、及其合适的混合物。组合物可以包含等张剂，例如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇、或氯化钠。因子VIII的药物组合物的例子披露于例如美国专利No.5,047,249；5,656,289；5,665,700；5,690,954；5,733,873；5,919,766；5,925,739；6,835,372；及7,087,723。
可以如下制备无菌可注射溶液，即根据需要在具有上文所列举的一种成分或成分组合的合适溶剂中掺入需要量的活性化合物，接着无菌微滤。一般而言，通过将活性化合物掺入无菌媒介中来制备分散体，所述无菌媒介含有基础分散介质及需要的其它成分。在供制备无菌可注射溶液用的无菌粉剂的情况中，制备方法包括自其先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何其它想要成分的粉末的真空干燥和冷冻干燥(冻干)。
治疗方法
本发明的另一方面涉及一种治疗遗传性和获得性凝固缺陷诸如血友病(例如血友病A)的方法。此方法牵涉对展现出血友病A的患者施用有效量的本发明的因子VIII融合异二聚体(包括杂合或多聚体形式)，由此患者在血管损伤后展现出有效的血液凝固。因子VIII融合异二聚体的合适的有效量包括但不限于约10-约50个国际单位/kg体重。患者可以是任何哺乳动物(例如人)。
可以静脉内、皮下、或肌肉内施用本发明的因子VIII融合异二聚体。某些调控剂可以容许口服施用。
可以使用本发明的因子VIII融合异二聚体来在具有和没有抑制性抗体的血友病患者中及在由于形成抑制性抗体而患有获得性因子VIII缺陷的患者中治疗由于因子VIII缺陷所致的不受控制的出血(例如动脉内、颅内、或胃肠出血)的方法。在一个实施方案中，依照输注人或动物因子VIII使用的相同规程来将单独的或药物组合物形式(即与稳定剂、投递媒介、和/或载体组合)的因子VIII融合异二聚体静脉内输注到患者中。
或者/另外，可以通过施用包含因子VIII融合基因表达构建体的病毒载体诸如腺伴随病毒(参见例如Gnatenko等，Br.J.Haematol.104：27-36，1999)，或者通过移植遗传工程化改造成生成因子VIII融合异二聚体的细胞通常经由植入含有此类细胞的装置来施用因子VIII融合异二聚体。此类移植可以牵涉使用重组皮肤成纤维细胞(参见例如Roth等，New Engl.J.Med.344：1735-1742，2001)；骨髓基质细胞(参见例如美国专利No.6,991,787)、或造血祖宿主细胞(参见例如美国专利No.7,198,950)。适合于在血友病A基因疗法(使用编码因子VIII的核酸进行)的病毒载体及其在基因疗法中的用途是本领域中已知的(参见例如美国专利No.6,200,560；6,544,771；6,649,375；6,697,669；6,773,709；6,797,505；6,808,905；6,818,439；6,897,045；6,939,862；7,198,950；及7,238,346)。
应当对需要此类治疗的患者施用的因子VIII融合异二聚体的治疗剂量会随因子VIII缺陷的严重程度而有所变化。一般而言，与每名患者的出血事件的严重程度和持续时间一致地在频率、持续时间、和单位上调节剂量水平。因此，因子VIII融合异二聚体可以以足以对患者投递治疗有效量的蛋白质以使出血停止的量包含在药学可接受载体、投递媒介、或稳定剂中，如通过标准的凝固测定法所测量的。
通常，要经由施用因子VIII融合异二聚体在患者中达到的期望的血浆因子VIII活性水平范围为正常水平的30-100％。在一个实施方案中，可以以范围为约5至约50个单位/kg体重、范围为约10至约50个单位/kg体重的剂量，并且以约20至约40个单位/kg体重的剂量静脉内给予治疗性因子VIII融合异二聚体的施用；时间间隔频率范围可以为8至24小时(在严重受累的血友病患者中)；并且按天计的治疗持续时间范围可以是1-10天或者直至解决出血事件或者因子VIII融合异二聚体的施用可以是预防性的(参见例如Roberts等，第1453页-第1474页，第1460页，于Hematology，Williams，W.J.等编(1990))。与在用人或血浆来源因子VIII治疗中一样，可以通过一阶段因子VIII凝固测定法来限定输注的治疗性重组因子VIII的量，并且在选定的情况中，可以通过测量输注后的患者血浆中的因子VIII来测定体内回收。应当理解，对于任何特定的患者，应当依照个体需要和施用或监督组合物的施用的人的专业判断随时间调节特定的剂量方案，并且本文中所列的浓度范围仅是例示性的，并且不意图限制所要求保护的因子VIII融合异二聚体的范围或实施。
根据需要，治疗可以采用单次施用或在延长的一段时间里的周期性或连续施用的形式，或者可以为了预防性目的而施用治疗。
与其来源的因子VIII蛋白相比，本发明的因子VIII融合异二聚体展现出延长的循环半衰期。具有更大的循环半衰期的因子VIII蛋白可用于治疗血友病，因为会需要不太频繁的剂量给药以改正患者的因子VIII缺陷。此施用简易性的升高可以改善治疗方案的患者顺从性，并且由此降低凝固病症的症状。还有，因为施用较少的抗原，预期降低的施用频率降低形成对因子VIII的免疫应答的可能性。
上述公开内容一般描述了本发明。可以通过参考以下实施例来获得更完整的理解，所述实施例仅为了例示而并不意图限制本发明的范围而提供。
实施例
为了本发明可以得到更好的理解，列出了以下实施例。这些实施例仅为了例示，而不应以任何方式解释为限制本发明的范围。通过提及而完整收录本文中所提及的所有出版物。
实施例1
以下实施例描述了使用编码因子VIII B域缺陷型(BDD)蛋白的核酸和编码鼠Fc区(称为“mFc+铰链”)的核酸来构建包含因子VIII融合基因(称为“BDDmFc+铰链”)的哺乳动物表达载体(称为“pM110”或“pSK207BDDFc+铰链”)。BDDmFc+铰链的重组表达导致因子VIII融合异二聚体(称为“BDDFc+铰链”)的生成，如图2中所显示的。由于存在功能性免疫球蛋白铰链区，BDDFc+铰链的两个分子经由二硫化物键合来共价结合以形成多聚体因子VIII融合异二聚体。此型式的优点是二聚体Fc导致融合蛋白对FcRn的高亲和力结合，导致循环半衰期延长。
使用位点定向诱变试剂盒来突变质粒pSK207，其含有以PmeI和NheI位点为边界的因子VIII B域缺陷型(BDD)基因(称作“pSK207BDD”)。使用诱变引物CES16(5’-caatgccattgaacctaggagcttctcccagaacccaccagtccttaagcgccatcaacggg-3’)(SEQ IDNO：34)和CES17(5’-cccgttgatggcgcttaaggactggtgggttctgggagaagctcctaggttcaatggcattg-3’)(SEQ IDNO：35)来将两个限制性位点(在bp 4490处的AvrII和在bp 4520处的AflII)引入分子中。使用诱变寡聚物CES 18(5’-cagtggtcattacactcaagaacatggcttccca tcc-3’)(SEQ ID NO：36)和CES19(5’-ggatgggaagccatgttcttgag tgtaatgaccactg-3’)(SEQID NO：37)来消除bp2537处的AflII位点。所得的质粒称作pM109。这些诱变事件均是沉默的，未对BDD导致氨基酸变化。作为鼠Fc区的来源，使用含有针对人表皮生长因子受体的全长鼠IgG1抗体的质粒pGT234。使用引物CES 36(5’-agcttcctaggagcttctcccagaacgtgcccagggattg tggttg-3’)(SEQ ID NO：38)和CES39(5’-agctacttaaggactggtgggttctgggatttaccaggagagtgggagag-3’)(SEQ ID NO：39)用pGT234作为模板来PCR扩增鼠Fc+铰链部分。将所得的片段用AflII/AvrII消化，并克隆到经AflII/AvrII消化的pM109中以生成质粒pM117。为了恢复bp2537处的初始AflII位点，在pM117中插入pSK207+BDD的NheI/BglII片段以替换其等同区，从而生成质粒pM115，其含有bp2537处的AflII位点。将pM115的BDD.mFc+铰链基因(包含在5077bp NheI/PmeI片段内)克隆到表达载体pSS207的PmeI/NheI位点中以生成质粒pM110或pSK207BDDFc+铰链。pSK207BDDFc+铰链的因子VIII融合基因构件(即BDDmFc+铰链)具有核酸序列SEQ.ID NO：31。由BDDmFc+铰链所编码的蛋白质具有图3中所显示的结构域(其中小鼠Fc标示mFc+铰链的位置)和SEQ.ID NO：32的氨基酸序列。
实施例2
以下实施例描述了使用编码因子VIII B域缺失型(BDD)蛋白的核酸和几乎编码鼠Fc区的铰链部分(称为“mFc-铰链”)的核酸来构建包含因子VIII融合基因(称为“BDDmFc-铰链”)的哺乳动物表达载体(称为“pM118”或“pSS207BDDFc-铰链”)。BDDmFc-铰链的重组表达导致因子VIII融合异二聚体(称为“BDDFc-铰链”)的生成，如图2中所显示的。由BDDmFc-铰链编码的蛋白质具有图3中所显示的结构域(其中“小鼠Fc”标示mFc-铰链的位置)和SEQ.ID NO：33的氨基酸序列。由于缺乏功能性免疫球蛋白铰链区，BDDFc-铰链不形成多聚体因子VIII融合异二聚体。此型式的缺点是非二聚化的Fc区具有降低的FcRn结合亲和力。
BDDmFc-铰链的构建与BDDmFc+铰链的上述构建非常相似。使用PCR引物CES 37(5’-agcttcctaggagcttctccca gaacgtcccagaagtatcatctgtc-3’)(SEQ IDNO：40)和CES39(SEQ ID NO：39)来从质粒pGT234 PCR扩增mFc-铰链区，将其用AvrII/AflII消化，并克隆到经AvrII/AflII消化的pM109质粒中。所得的质粒称作pM114(又称作“pSK207.BDD.mFc-铰链”)。然后，将含有BDD.mFc-铰链基因的pM114的NheI/PmeI片段克隆到表达载体pSS207中以生成质粒pM118(即pS S207BDDFc-铰链)。
实施例3
以下实施例描述了构建质粒(称作“pM130”)以表达在其氨基端末端具有Flag标签的鼠Fc区(称作“mFc+铰链”)。在同一宿主细胞中共表达此质粒与pSS207BDDFc+铰链生成BDDFc+铰链二聚体、mFc+铰链二聚体、和BDDFc+铰链和mFc+铰链的异二聚体的混合物。纳入Flag标签便于在序贯分离步骤中使用抗Flag抗体和抗因子VIII抗体通过亲和层析来分离异二聚体(称为“BDDFc”)，如图2中所显示的。然而，本领域技术人员应当领会，即使没有提供肽标签，会有可能使用本领域中公知的技术，例如大小排阻层析来分离异二聚体形式。
使用pM110作为模板，使用引物CES49(5’-atatgatatcgcggccgccgccaccatggtgttgcagacccaggtcttcatttctctgttgctctggatctctggtgcctacggggactacaaagacgatgacgacaaggtgcccagggattgtggttg-3’)(SEQ ID NO：41)和CES 50(5’-ttcgatctcgagtcatttaccaggagagtgggagagg-3’)(SEQ ID NO：42)来PCR扩增在其5’(氨基端)末端具有Flag标签的鼠Fc区(具有铰链)。将此片段用NotI/XhoI消化，并连接到经NotI/XhoI消化的表达载体pAGE16，以生成质粒pM119(即pAGE16.mFc+铰链.Flag)。随后，将含有mFc+铰链.Flag区的pM119的HindIII/XhoI片段亚克隆到经HindIII/XhoI消化的表达质粒pEAK flCMV W/GFP中，并称作pM130。
实施例4
以下实施例描述了使用编码因子VIII B域缺失型(BDD)蛋白的核酸和编码IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的人Fc区之任一、或IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的人Fc区的非铰链部分之任一的核酸来构建因子VIII融合基因(称为“BDD.人Fc”)。举例而言，可以通过将源自IgG1 Fc的227个氨基酸残基或214个氨基酸残基插入因子FVIII的特定位点(例如在N-745和S-1637之间)以模拟B域来生成小鼠因子VIII融合异二聚体。
BDD.人Fc(来自IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗体)表达载体的构建遵循与BDD-鼠Fc表达构建体的上述策略相同的策略。将pM109质粒用AvrII/AflII消化，并将以AvrII/AflII为边界的Fc+铰链和Fc-铰链插入相应的位点中。然后，将所得的质粒(其具有pSK主链)用NheI和PmeI消化，并将BDDFc片段连接到pSS207以创建稳定的细胞克隆。类似地，构建pCEP4.人Fc单体质粒。
例示性的人IgG Fc区核酸编码序列包括SEQ ID NO：8(人IgG1的Fc区)、SEQ ID NO：10(人IgG2的Fc区)、SEQ ID NO：12(人IgG3的Fc区)、和SEQ IDNO：14(人IgG4的Fc区)。或者，可以使用编码与SEQ ID NO：9(人IgG1的Fc区)、SEQ ID NO：11(人IgG2的Fc区)、SEQ ID NO：13(人IgG3的Fc区)、和SEQID NO：15(人IgG4的Fc区)相同的氨基酸序列(或具有至少90％同一性的氨基酸序列)的核酸序列。例示性非铰链部分人IgG Fc区核酸编码序列包括SEQID NO：16(人IgG1的Fc区的非铰链部分)、SEQ ID NO：18(人IgG2的Fc区的非铰链部分)、SEQ ID NO：20(人IgG3的Fc区的非铰链部分)、和SEQ ID NO：22(人IgG4的Fc区的非铰链部分)。或者，可以使用编码与SEQ ID NO：17(人IgG1的Fc区的非铰链部分)、SEQ ID NO：19(人IgG2的Fc区的非铰链部分)、SEQ ID NO：21(人IgG3的Fc区的非铰链部分)、和SEQ ID NO：23(人IgG4的Fc区的非铰链部分)相同的氨基酸序列(或具有至少90％同一性的氨基酸序列)的核酸序列。
实施例5
以下实施例描述了编码杂合因子VIII融合异二聚体的单顺反子因子VIII融合基因的构建。翻译的因子VIII融合蛋白含有替换全长FVIII的B域的两个串联的mFc+铰链区。
如下构建表达质粒：使用pM117(pSK207+BDD.mFc+铰链)作为模板，用两组寡聚物的PCR来进行：第一组是CES36/CES51，其创建以AvrII(CES36：5’-agcttcctaggagcttctcccagaacgtgcccagggattgtggttg-3’)(SEQ ID NO：30)和SacII(CES51：5’-cagttgccgcgggctttaccaggagagtgggagagg-3’)(SEQ ID NO：35)为边界的mFc片段，而第二组引物是CES52/CES39，其创建以SacII(CES52：5’-ttcgcccgcggcaagagagactacaaagacgatgacgacaaggtgcccagggattgtggttg-3’)(SEQ IDNO：35)和AflII(CES39：5’-agctacttaaggactggtgggttctgggatttaccaggagagtgggagag-3’)(SEQ ID NO：31)为边界的mFc片段。在适当消化并连接时，这两个所得的PCR片段给出单顺反子BDD基因，其按次序含有A1、a1、A2、a2域、B域的前5个N端氨基酸、然后是mFc+铰链区、弗林蛋白酶(furin)共有序列(KARGKR(SEQ ID NO：36)，其中第一个赖氨酸(K)是Fc区的末端)、Flag标签(DYKDDDDK)(SEQ IDNO：37)、mFc+铰链、B域的最后12个C端氨基酸、和最后FVIII的a3、A3、C1和C2域(图4)。为了构建上述单体基因，将两个PCR片段用AvrII/SacII或SacII/AflII消化，并经由三重连接，将其克隆入经AvrII/AflII消化的pM109(pSK207.BDD)中。将成功的克隆测序，然后将一个从(pM109的)pSK207主链经由NheI/PmeI克隆到表达载体，即经NheI/PmeI消化的pSK207。在蛋白质的合成和分泌期间，最初在Flag-mFc区上游的弗林蛋白酶位点处及刚好在a3上游的蛋白酶位点处切割分子。分子会以成熟的FVIII二聚体(其中用mFc替换B域)循环，所述成熟的FVIII二聚体具有经由Fc-Fc二硫化物相互作用与FVIII分子的mFc区结合的Flag mFc分子(BDDFc)，如图2中所显示的。使用本领域技术人员已知的方法来自存在于上清液中的任何同二聚体产物分离异二聚体产物。
实施例6
以下实施例描述了可用于瞬时转染哺乳动物宿主细胞及其细胞培养的通用规程。将HKB11细胞在轨道摇动器(100-125rpm)上在5％CO2培养箱中于37℃在无蛋白质培养基中以悬浮培养物培养，并以0.25-1.5x 106个细胞/mL的密度维持。通过以1,000rpm离心5分钟来收集供转染用的HKB11细胞，然后将其在FreeStyleTM 293表达培养基(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)中以1.1x 106个细胞/mL重悬。将细胞在6孔板中接种(4.6mL/孔)，并在轨道旋转仪(125rpm)上在37℃CO2培养箱中温育。对于每个孔，将5μg质粒DNA与0.2ml Opti-MEM
I培养基(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)混合。对于每个孔，将7μl 293FectinTM试剂(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)与0.2ml.Opti-MEM
I培养基温和地混合，并于室温温育5分钟。将稀释的293FectinTM添加至稀释的DNA溶液，温和地混合，于室温温育20-30分钟，然后添加至已经用5x 106个(4.6mL)HKB11细胞接种的每孔。然后，将细胞在轨道旋转仪(125rpm)上在CO2培养箱中于37℃温育3天，之后通过以1000rpm离心5分钟来使细胞沉淀，然后收集上清液，并于-80℃贮存。
实施例7
以下实施例描述了可用于通过Western印迹来验证因子VIII融合异二聚体的重组生成的通用规程。将细胞培养物上清液通过Centricon
(MilliporeCorporation，Billerica，MA)来浓缩10倍(此时不使用二抗来探查)或使用纯的(此时使用二抗来探查)。将50μl上清液与20μl具有DTT(还原性)或没有DTT(非还原性)的4x SDS-PAGE上样染料混合，于95℃加热5分钟，然后加载到10％NuPAGE
凝胶(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)上(在还原性条件下)或到4-20％NuPAGE
凝胶(Bis-Tris-MOPs)上(在非还原性条件下)。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜。在用5％乳/PBS封闭60分钟后，将膜与针对小鼠IgG(H+L)的经辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔多克隆抗体或缀合有HRP的抗因子VIII C域抗体一起温育。还有，可以使用抗人因子VIII兔单克隆抗体(Epitomics，CA)来检测因子VIII的轻链。然后，将膜与抗兔IgG-HRP二抗于室温一起温育60分钟。在用PBS/0.1％Tween
-20(聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯)清洗印迹后，使用化学发光底物(ECL)(Pierce，Rockford，IL)及暴露于x-射线胶片来检测来自HRP的信号。
实施例8
以下实施例描述了可用于通过ELISA来测量细胞培养物上清液中的因子VIII抗原浓度的通用规程。将细胞培养物上清液在PBS/BSA/Tween
-20缓冲液中稀释以达到标准曲线范围内的信号。例如，可以使用在PBS/BSA/Tween
-20中稀释的纯化的因子VIII BDD蛋白(比活性9,700个IU/mg)来创建100ng/mL-0.2ng/mL的标准曲线。将稀释的样品和标准品添加至用多克隆抗因子VIII捕捉抗体C2预包被的ELISA板。在添加生物素化的C2作为检测抗体后，将平板于室温温育1小时，广泛清洗，然后使用TMB底物(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)来显现，如由试剂盒制造商(Pierce，Rockford，IL)所描述的。可以使用SpectraMax
读板仪(Spectra Max
340pc，MolecularDevices，Sunnyvale，CA)以450nM测量信号。将标准曲线拟合至四参数模型，并从曲线外推未知物的数值。
作为上述规程(其对完整的因子VIII融合异二聚体不是特异的)的备选，使用利用抗因子VIII抗体作为捕捉抗体(或检测抗体)和对半衰期调控剂特异性的抗体作为检测抗体(或捕捉抗体)的ELISA测定法。
实施例9
以下实施例描述了可用于以96孔格式使用商业生色测定试剂盒(Coatest
SP4 FVIII，Chromogenix，Lexington，MA)来测量细胞培养物上清液和纯化的级分中的因子VIII融合异二聚体的活性的通用规程。将一式三份样品在试剂盒测定缓冲液(50mM Tris，pH 7.3，10mg/L ciprofloxin和1.0％BSA)中稀释至25μl，并添加至各孔。然后，将50μL磷脂、因子IXa、因子X溶液添加至每孔，并于37℃在水平摇动器上温育4分钟。将25μl CaCl2溶液(25mM)立即添加至各孔，并以相同的方式温育10分钟。添加生色底物溶液(50μL/孔)，并如前述那样将平板温育10分钟，之后通过添加25μl 20％乙酸来使颜色显现停止。在96孔读板仪(SpectraMax
340pc，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上以405nm吸光度测量个别的孔。相对于范围为在与未知物相同的缓冲液中稀释的500-0.5mlU/mL纯化的因子VIII B域缺失型(BDD)标准品定量因子VIII活性，并将其拟合至四参数模型。从Coates和因子VIII ELISA的结果计算比活性(IU/mg FVIII)。
实施例10
以下实施例描述了可用于使用aPTT测定法来测量细胞培养物上清液和纯化的级分中的因子VIII融合异二聚体的凝固活性的通用规程。可以使用因子VIII缺陷的人血浆中的aPTT测定法通过ElectraTM 1800C自动化凝固分析仪(Beckman Coulter Inc.，Fullerton，CA)来测定因子VIII凝固活性。简言之，通过仪器创建凝固稀释剂中的上清液样品的三个稀释物，然后将100μl与100μl因子VIII缺陷的血浆和100μl自动化aPTT试剂(兔脑磷脂和微粉化硅土，bioMerieux，Inc.，Durham，NC)混合。在添加100μl 25mM CaCl2溶液后，记录凝块形成前时间。使用在ELISA测定法中用作标准品的相同的纯化的因子VIII BDD的系列稀释来对每次运行产生标准曲线。标准曲线是线性的，具有0.95或更好的相关系数，并用于测定未知样品的因子VIII活性。
实施例11
以下实施例描述了使用实施例1和2中所描述的载体进行的细胞系的稳定转染和创建。使用293FectinTM试剂用质粒DNA、pSK207BDDFc+铰链、或pSK207BDDFc-铰链转染HKB11细胞，如实施例6中所描述的。将经转染的细胞以多个稀释(1∶100；1∶1000；1∶10,000)分成100-mm培养皿，并在补充有5％FBS和200μg/mL潮霉素(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)的DMEM-F12培养基中维持约2周。将个别的单集落挑出，并使用无菌克隆盘(Scienceware
Bel-Art Products，Pequannock，NJ)来将其转移到6孔板中。将超过50个用pSK207BDDFc+铰链转染的HKB11细胞克隆建立并储存。如图5中所显示通过因子VIII活性测定法(上文所描述的Coatest
和aPTT测定法)，如图6中所显示通过因子VIII ELISA(上文所描述的)，及通过生长测定法来对这些克隆筛选因子VIII融合异二聚体的高表达。图6中显示了具有最高表达水平的6个细胞系。BDDFc+铰链的最高克隆，即克隆8在粘附培养时表达约1μg/mL融合蛋白。来自克隆8条件化培养基的BDDFc+铰链的比活性是约5,000-8,000个IU/mg，这与其来源的BDD因子VIII蛋白相当。使用相似的稳定转染和选择规程，BDDFc-铰链的克隆(克隆t)测定为在粘附培养时表达约1μg/mL融合蛋白。
实施例12
以下实施例描述了使用10L WAVE生物反应器TM(GE Healthcare，Piscataway，NJ)来放大稳定转化子的蛋白质表达。将克隆8和克隆t细胞在补充有5％FBS和200μg/mL潮霉素的DMEM-F12培养基中维持。将细胞每3天以1∶4从T75分到T225烧瓶。对于细胞适应，将来自12个T225烧瓶的约10亿个细胞转移到2L或3L-Erlenmyer烧瓶中无血清的补充有2.5％FBS的1L悬浮培养基中。2天后，将细胞扩充到补充有1.25％FBS的无血清悬浮培养基中。然后，将细胞转移到补充有5％人血浆蛋白质溶液(HPPS)的无血清悬浮培养基中。将约100-150亿个细胞以约1百万/ml的密度在10L WAVE生物反应器TM袋中在培养基中接种。3天后，细胞密度已经达到5-6百万/mL，并收获条件化培养基。首先，通过用Contifuge
Stratos(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)以6,000rpm且以150mL/分钟的流速(如由蠕动泵控制的)的连续离心来将粗培养基澄清以除去细胞碎片。将澄清的培养基与Triton
X-100(聚乙二醇叔-辛基苯基醚)(多至0.05％)混合，并通过在10kDa Pellicon切向流膜(Millipore，Billerica，MA)上的超滤来将其浓缩约10倍。将蔗糖添加至浓缩物至1％，之后于-80℃冷冻。纯化前的重组生成的因子VIII融合异二聚体的比活性测定为对于由克隆8生成的BDDFc+铰链为10,629个IU/mg，及由克隆t所生成的BDDFc-铰链为11,122个IU/mg。
实施例13
以下实施例描述了从克隆8的放大培养物纯化因子VIII融合异二聚体。使用抗因子VIII单克隆抗体亲和柱(C7F7)，接着用阴离子交换Q-SepharoseTM柱(GE Healthcare，Piscataway，NJ)来从HKB 11细胞条件化培养基纯化因子VIIIBDDFc+铰链。总回收率接近30％。将来自10L WAVE生物反应器TM袋的冷冻浓缩物融化，并使用AKTATM纯化仪系统(Amersham Pharmacia，Uppsala，SW)以1mL/分钟加载到免疫亲和柱上，然后用缓冲液(20mM咪唑、0.01M CaCl2、0.5M NaCl、0.01％Tween
-80(聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)，pH 7.0)洗柱。用含有1.0M CaCl2的缓冲液洗脱结合的因子VIII BDDFc+铰链。通过Coatest
测定法来对级分测定因子VIII活性，并将活性级分合并，在HiTrapTM26/10脱盐柱G25M(Amersham Biosciences，Uppsala，SW)上缓冲液更换成离子交换上样缓冲液(20mM咪唑、10mM CaCl2、200mM NaCl、0.01％Tween
-80，pH 7.0)。将蛋白质加载到1ml HiTrapTM Q HP柱(AmershamBiosciences，Uppsala，SW)上，并用NaCl梯度(200mM-1000mM)洗脱。通过Coatest
测定法来对级分测定因子VIII活性，并合并峰级分。测定蛋白质浓度和比活性。最好的级分(即，图7的第8道中的级分5)的纯度是约80％，如通过SDS-PAGE和SimplyBlueTM染色(Invitrogen，Carlsbad，CA)所评估的。纯化的融合蛋白含有Fc域，因为它们在Western印迹分析中通过抗Fc抗体检出。纯化的材料的比活性是约10,000个IU/mg。此比活性与因子VIII BDD(其衍生BDDFc+铰链)非常相当，这提示了BDDFc+铰链是完全活性的。
实施例14
以下实施例描述了对重组生成的因子VIII融合异二聚体的内毒素测试。使用动力学生色鲎阿米巴状细胞溶胞物测定法(Endosafe
试剂盒)以0.005个EU/mL的灵敏度测定纯化的蛋白质溶液的内毒素水平。发现BDDFc+铰链中的内毒素水平是1.3-2.0个EU/mL，其刚好在5个EU/剂下。
实施例15
以下实施例描述了使用纯化的BDDFc+铰链、纯化的BDDFc-铰链、和衍生这些因子VIII融合异二聚体的因子VIII蛋白(“BDD-FVIII”)进行的正常小鼠中的药动学研究。以50μg/kg体重给正常的C57雄性小鼠静脉内注射单剂BDD和融合蛋白(BDDFc+铰链或BDDFc-铰链)。在注射后的t＝0、0.083、0.5、2、4、6、8、24、28、32、48、和72小时时收集血液样品(每个时间点5只小鼠)。对于药动学分析，测定血液样品中的蛋白质水平(通过抗原ELISA)和凝固活性(通过Coatest
测定法)两者。表1中报告了结果。
表1
BDDFc+铰链和BDDFc-铰链的beta半衰期在正常小鼠中与BDD-FVIII相似。
实施例16
以下实施例描述了使用纯化的BDDFc-铰链和衍生BDDFc-铰链的因子VIII蛋白(“BDD-FVIII”)进行的在血友病A动物模型(HemA小鼠)中的药动学研究。与BDD-FVIII相比，结果指明BDDFc-铰链在Hem A小鼠中具有显著延长的beta相半衰期。
以在含有5％清蛋白的配制剂缓冲液中的1.25μg/小鼠(50μg/kg)经由尾静脉(i.v.)给HemA小鼠注射BDDFc-铰链(FVIII-Fc，9只小鼠)。其它HemA小鼠接受200个IU/kg BDD-FVIII；即衍生BDDFc-铰链的因子VIII变体。经由眶后在1、24、48、66、72、90、120、和148小时时自接受BDDFc-铰链的交替小鼠(3只小鼠/时间点)，及在1、4、8、16、24、和32小时时自接受BDD-FVIII的交替小鼠(5只小鼠/时间点)在柠檬酸盐中收集血液。使用Coatest
SP FVIII试剂盒(Instrumentation Laboratory Company，Lexington，MA)来测量血浆FVIII活性。通过稀疏取样和WinNonlin
(Pharsight，Mountain View，CA)中的非隔室模型来评估beta相半衰期。对于Coatest测定法，使用BDD-FVIII来产生标准曲线。简言之，将相同血浆基质中的样品、标准品、阳性、和阴性对照(各25μl)一式两份添加至96孔板。添加FIXa、FX、和磷脂溶液的混合物(50μl)，并于37℃温育5分钟。然后，添加25μl CaCl2溶液，并于37℃温育5分钟，接着添加50μl底物，并于37℃温育约5分钟，直至颜色以适当的强度显现。添加停止溶液(25μl)，并在读板仪(Spectra Max250，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上以OD 405nm读取平板。使用SoftMax
Pro 4.8(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)来计算结果，如图8中所显示的。呈现的结果是在每个时间点时对于BDD-FVIII来自5只小鼠，及对于FVIII-Fc来自3只小鼠的均值±SD。
与BDD-FVIII的衰变曲线相比，BDDFc-铰链显示具有快速的分布相的两相衰变(图8)。BDDFc-铰链的beta相半衰期在50μg/kg时是11.9小时，其相对于未修饰的BDD-FVIII(其中beta相半衰期是6.03小时)改善约2倍。可以有如下的可能性，即一些因子VIII融合异二聚体不可使用非血友病A动物模型中的药动学研究来分析。
实施例17
以下实施例描述了对作为上文所描述的因子VIII融合基因的表达产物的重组因子VIII融合异二聚体的体外研究。将哺乳动物表达载体pSS207BDDFc+铰链和pSS207BDDFc-铰链瞬时转染到HKB11细胞中，并在转染后72小时收集条件化培养基，如上文所描述的。如图9A中所显示的，在还原性条件下对浓缩的上清液的Western印迹分析显示了，BDDFc+铰链因子VIII融合异二聚体最初以约195kDa因子VIII融合蛋白表达，如以抗Fc抗体所检出的(第5道)，其翻译后加工成115-kDa重链，如以抗Fc抗体所检出的(第5道)；及如在图9B中所显示的，80-kDa轻链，如以因子VIII轻链特异性抗体所检出的(第5道)。对于比较，纯化的BDD蛋白和来自用pSK207或pSK207BDD(包含衍生编码BDDFc+铰链的因子VIII融合基因的B域缺失型因子VIII基因的表达载体)瞬时转染的HKB11细胞的条件化培养基不与抗Fc抗体起反应(图9A)，并使用因子VIII轻链抗体，纯化的BDD蛋白或来自用pSK207BDD瞬时转染的HKB11细胞的条件化培养基鉴定出预期的80kDa轻链(图9B)。相反，在来自用pSK207瞬时转染的HKB11细胞的条件化培养基中没有检测到轻链(图9B)。这些结果指明将Fc区插入缺陷型B域区中不影响翻译后修饰，这是因为编码BDDFc+铰链的因子VIII融合基因仍保留B-a3域连接处的功能性切割位点，预期轻链的分子量不会变化。
通过Coatest
测定法及通过aPPT凝固测定法来在来自pSK207BDD(对照)、pSK207BDDFc+铰链、和pSK207BDDFc-铰链转染子的条件化培养基中检测因子VIII活性(图10)。在来自pSK207转染子的条件化培养基中没有检测到因子VIII活性。BDDFc融合蛋白(即，BDDFc+铰链和BDDFc-铰链)两者的活性范围与BDD相当。数据提示了，与其来源的BDD因子VIII蛋白相比，所使用的Fc区对特定位点的插入不影响因子VIII融合异二聚体的翻译后加工或生物学活性。
固相Coatest
测定法，其中将自用pSK207BDDFc+铰链或pSK207BDD瞬时转染的HKB11细胞收集的条件化培养基添加至用兔-抗小鼠Fc抗体(Pierce，Rockford，IL)预包被的96孔板，以捕捉因子VIII融合异二聚体。BDDFc+铰链融合蛋白仅会结合平板，并洗掉其来源的因子VIII BDD蛋白。然后，对固定化于孔的BDDFc+铰链直接实施Coatest
测定法，并且图11显示了BDDFc+铰链在此测定法中是有活性的。
使用来自用pSK207BDDFc+铰链或pSK207BDDFc-铰链表达载体瞬时转染的HKB11细胞的5倍浓缩的条件化培养基来实施分析。将样品在4-12％NuPAGE
凝胶上在还原性和非还原性条件下分离。用兔单克隆抗FVIII轻链抗体(Epitomics，Burlingame，CA)，接着用缀合有HRP的抗兔IgG二抗探查印迹。结果指明BDDFc+铰链形成二聚体(即，多聚体因子VIII融合异二聚体)，而BDDFc-铰链是单体(图12)。在用pSK207BDDFc+铰链稳定转化的细胞的情况中看到相似的结果。
实施例18
以下实施例描述了使用BiacoreTM系统实施的功能性研究以测定FcRn结合表位是否在掺入因子VIII融合异二聚体中时保留其结合FnRn的能力。对于在BiacoreTM测试中的使用，将重组小鼠FcRn(mFcRn)蛋白在CHO-K1细胞中表达，并通过小鼠IgG-亲和层析来纯化。通过胺偶联来将小鼠FcRn固定化到CM-5芯片上。将两种因子VIII异二聚体(BDDFc+铰链和BDDFc-铰链)、BDD(衍生BDDFc+铰链和BDDFc-铰链的因子VIII蛋白)、和全长重组因子VIII以多个浓度(例如1.5、3、6、12、25、和50nM)在芯片表面上通过。检测出BDDFc±铰链因子VIII融合异二聚体对固定化的mFcRn的结合(图13)。对BDDFc+铰链(“BDDFc+H”)计算结合亲和力(KD＝2.48nM)，并且BDDFc-铰链(“BDDFc-H”)与BDDFc+铰链的结合亲和力(KD＝3.75nM)相似。在BDD(“BDD”)或全长重组因子VIII(“FVIII”)的情况中没有看到可检出的结合。
结果指明BDDFc+铰链和BDDFc-铰链因子VIII融合异二聚体以nM亲和力展现出对mFcRn的强结合。相反，BDD和全长重组FVIII都不能结合mFcRn，这是预期的，因为它们不含FcRn结合表位。鉴于使用HemA小鼠实施的药动学研究，结果提示BDDFc+铰链和BDDFc-铰链含有以高亲和力结合mFcRn的功能性FcRn结合表位，导致延长的beta相体内半衰期。
实施例19
在循环中，FVIII主要结合von Willebrand因子(vWF)作为稳定的复合物。在被凝血酶(因子IIa)激活后，FVIII从复合物解离以与凝固级联相互作用。激活的FVIII在该过程中被蛋白水解失活(最主要通过激活的蛋白C和因子IXa)，并从血流中快速清除。以下实施例描述了使用BiacoreTM系统实施的功能性研究以测定因子VIII蛋白在掺入因子VIII融合异二聚体中时是否保留其结合von Willebrand因子(vWF)的能力。
通过胺偶联来将人vWF固定化于CM-5芯片上。两种因子VIII异二聚体(BDDFc+铰链和BDDFc-铰链)、BDD(衍生BDDFc+铰链和BDDFc-铰链的因子VIII蛋白)、和全长重组因子VIII以多个浓度(例如1、2、4、8、16、和25nM)在芯片表面上通过。BDD(“BDD”)和全长重组因子VIII(FVIII)两者都能够以亚纳摩尔亲和力(0.53-0.657nM)结合人vWF，而且还检测出BDDFc+铰链(“BDDFc+H”)或BDDFc-铰链(“BDDFc-H”)对vWF的结合(图14)。BDDFc+铰链和BDDFc-铰链的结合亲和力(KD)分别计算为0.465nM和0.908nM。数据显示了，因子VIII融合异二聚体BDDFc+铰链和BDDFc-铰链对vWF具有亚纳摩尔亲和力，并且使用免疫球蛋白Fc区作为调控剂不阻断BDD对vWF的结合特性。
实施例20
以下实施例表明，BDDFc-交联在HemA小鼠的尾静脉横断出血模型中是有效的。经由尾静脉给HemA小鼠(8-10周，约25g)注射最后一剂12或60个IU/kg的100μl在含有5％清蛋白的配制剂缓冲液中的BDDFc-铰链、或40个IU/kg的100μl在含有5％清蛋白的配制剂缓冲液中的BDD-FVIII、或单独的配制剂缓冲液(媒介物)(20只小鼠/处理组)，48小时之后横断一个侧尾静脉。将小鼠麻醉(用氯胺酮/甲苯噻嗪)(Ketamine/Xylazine)，并在静脉直径为约2.7mm的位置处横断一个侧尾静脉。然后，将尾部用预加热至37℃的盐水漂洗，直至凝固，并记录出血时间。然后，将小鼠转移到在加热垫上面具有纸衬垫的个别笼中，并每小时观察，持续前9小时，然后在损伤后24小时时观察。记录再出血的事件。在GraphPad Prism
4中实施统计学分析，并在图15中报告了结果。
与媒介物-对照组(其中仅10％在损伤后存活24小时)相比，12个IU/kg和60个IU/kg的BDDFc-铰链分别达到25％和80％存活。FVIII-Fc-铰链的功效评估为与BDD-FVIII的功效相当(comparable)，其导致在40个IU/kg(40IU/kg)时的60％存活。相对于媒介物对照，所有处理导致存活曲线的显著改善(对数秩检验的2尾p＜0.05)(2-tailed p＜0.05by Log-Rank test)。
通过提及而将上述说明书中所提及的所有出版物和专利收入本文。本发明所描述的方法的各种修饰和变型在不偏离本发明范围和精神的前提下对于本领域技术人员会是显而易见的。
虽然本发明已经结合具体的实施方案进行了描述，但是应当理解如要求保护的发明不应过度受限于此类具体的实施方案。实际上，对于生物化学领域或相关领域技术人员显而易见的上文所描述的用于实施本发明的模式的各种修饰意图在所附权利要求书的范围内。本领域技术人员会认可，或者仅使用常规的实验便能够确定本文中所描述的发明的具体的实施方案的许多等同方案。此类等同方式意图被所附权利要求书所涵盖。
Claims (45)
1.一种包含因子VIII蛋白或多肽的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体，其中调控剂的氨基酸序列存在于B域中，或者用调控剂的氨基酸序列替换B域的一些或所有氨基酸序列。
2.权利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体，其中所述调控剂是半衰期调控剂。
3.权利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体，其中所述调控剂的氨基酸是糖基化的。
4.权利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体，其中所述调控剂是免疫球蛋白的Fc区或其变体，或FcRn结合肽或其变体。
5.权利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体，其中所述调控剂是自人IgG、IgE、IgD或IgM或其变体、或小鼠IgG、IgA、IgM获得的免疫球蛋白的Fc区或其变体。
6.权利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体，其中所述因子VIII蛋白或多肽缺失一些或整个所述B域。
7.权利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体，其包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-764相同的第一氨基酸序列、与SEQ ID NO：1的氨基酸1656-2351相同的第二氨基酸序列和调控剂氨基酸序列，其中(1)所述调控剂氨基酸序列在其氨基端共价附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且在其羧基端共价附接于所述第二氨基酸的氨基端或(2)所述调控剂氨基酸序列在其氨基端共价附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且所述调控剂氨基酸序列不共价附接于所述第二氨基酸序列。
8.权利要求6的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体，其中所述调控剂是免疫球蛋白的Fc区或其变体，或FcRn结合肽或其变体。
9.权利要求6的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体，其中所述调控剂是自人IgG、IgE、IgD或IgM、或小鼠IgG、IgA、IgM获得的免疫球蛋白的Fc区或其变体。
10.编码因子VIII融合蛋白的核酸，其中所述因子VIII融合蛋白包含因子VIII蛋白，其中调控剂的氨基酸序列存在于B域中，或者用调控剂的氨基酸序列替换B域的一些或所有氨基酸序列。
11.权利要求10的核酸，其中所述调控剂是免疫球蛋白的Fc区或其变体，或FcRn结合肽或其变体。
12.权利要求10的核酸，其中所述调控剂是自人IgG、IgE、IgD或IgM、或小鼠IgG、IgA、IgM获得的免疫球蛋白的Fc区或其变体。
13.权利要求10的核酸，其中所述因子VIII蛋白缺失一些或整个B域。
14.权利要求10的核酸，其中所述因子VIII融合蛋白包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-764相同的第一氨基酸序列、与SEQ ID NO：1的氨基酸1656-2351相同的第二氨基酸序列和调控剂氨基酸序列，其中所述调控剂氨基酸序列在其氨基端共价附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且在其羧基端共价附接于所述第二氨基酸的氨基端。
15.权利要求14的核酸，其中所述调控剂是免疫球蛋白的Fc区或其变体，或FcRn结合肽或其变体。
16.权利要求15的核酸，其中所述调控剂是自人IgG、IgE、IgD或IgM、或小鼠IgG、IgA、IgM获得的免疫球蛋白的Fc区或其变体。
17.包含权利要求10的核酸的载体。
18.包含权利要求10的核酸的宿主细胞。
19.用于生成权利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体的方法，包括(a)提供经编码因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体的表达载体转化的宿主细胞；(b)培养该细胞；并(c)分离所述因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体。
20.权利要求19的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，且所述调控剂的氨基酸序列是糖基化的。
21.权利要求19的方法，其中所述调控剂是免疫球蛋白的Fc区或其变体，或FcRn结合肽或其变体。
22.权利要求19的方法，其中所述因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体包含与SEQ ID NO：1的氨基酸20-764相同的第一氨基酸序列、与SEQ IDNO：1的氨基酸1656-2351相同的第二氨基酸序列和调控剂氨基酸序列，其中(1)所述调控剂氨基酸序列在其氨基端共价附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且在其羧基端共价附接于所述第二氨基酸的氨基端或(2)所述调控剂氨基酸序列在其氨基端共价附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且所述调控剂氨基酸序列不共价附接于所述第二氨基酸序列。
23.药物组合物，其包含权利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体和药学可接受载体。
24.治疗遗传性和获得性凝固缺陷的方法，包括对有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求23的药物组合物。
25.权利要求24的方法，其中所述遗传性和获得性凝固缺陷是血友病A。
26.权利要求5的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体，其中所述调控剂是人或小鼠IgG的Fc区、具有非功能性铰链(通过所述铰链区中的半胱氨酸残基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc区变体、或人或小鼠IgG的Fc区的非铰链部分。
27.权利要求26的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体，其中所述调控剂具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、11、13、15、29、17、19、21、23、30，和与SEQ ID NO：9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一项具有至少95％氨基酸同一性的序列。
28.权利要求9的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体，其中所述调控剂是人或小鼠IgG的Fc区、具有非功能性铰链(通过所述铰链区中的半胱氨酸残基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc区变体、或人或小鼠IgG的Fc区的非铰链部分。
29.权利要求28的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体，其中所述调控剂具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、11、13、15、29、17、19、21、23、30，和与SEQ ID NO：9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一项具有至少95％氨基酸同一性的序列。
30.权利要求12的核酸，其中所述调控剂是人或小鼠IgG的Fc区、具有非功能性铰链(通过所述铰链区中的半胱氨酸残基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc区变体、或人或小鼠IgG的Fc区的非铰链部分。
31.权利要求30的核酸，其中所述调控剂具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、11、13、15、29、17、19、21、23、30，和与SEQ ID NO：9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一项具有至少95％氨基酸同一性的序列。
32.权利要求16的核酸，其中所述调控剂是人或小鼠IgG的Fc区、具有非功能性铰链(通过所述铰链区中的半胱氨酸残基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc区变体、或人或小鼠IgG的Fc区的非铰链部分。
33.权利要求32的核酸，其中所述调控剂具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、11、13、15、29、17、19、21、23、30，和与SEQ ID NO：9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一项具有至少95％氨基酸同一性的序列。
34.包含权利要求31的核酸的载体。
35.包含权利要求31的核酸的宿主细胞。
36.包含权利要求33的核酸的载体。
37.包含权利要求33的核酸的宿主细胞。
38.权利要求21的方法，其中所述调控剂是人或小鼠IgG的Fc区、具有非功能性铰链(通过所述铰链区中的半胱氨酸残基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc区变体、或人或小鼠IgG的Fc区的非铰链部分。
39.权利要求38的方法，其中所述调控剂具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、11、13、15、29、17、19、21、23、30，和与SEQ ID NO：9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一项具有至少95％氨基酸同一性的序列。
40.权利要求21的方法，其中所述调控剂是人或小鼠IgG的Fc区、具有非功能性铰链(通过所述铰链区中的半胱氨酸残基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc区变体、或人或小鼠IgG的Fc区的非铰链部分。
41.权利要求22的方法，其中所述调控剂是人或小鼠IgG的Fc区、具有非功能性铰链(通过所述铰链区中的半胱氨酸残基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc区的变体、或人或小鼠IgG的Fc区的非铰链部分。
42.权利要求40的方法，其中所述调控剂具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：9、11、13、15、29、17、19、21、23、30，和与SEQ ID NO：9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一项具有至少95％氨基酸同一性的序列。权利要求20的方法，其中所述调控剂是人或小鼠IgG的Fc区、具有非功能性铰链(通过所述铰链区中的半胱氨酸残基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc区的变体、或人或小鼠IgG的Fc区的非铰链部分。
43.权利要求3-8中任一项的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合异二聚体，其中所述调控剂是半衰期调控剂。
44.权利要求10的核酸，其中所述调控剂是半衰期调控剂。
45.权利要求19的方法，其中所述调控剂是半衰期调控剂。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16298609P | 2009-03-24 | 2009-03-24 | |
| US61/162,986 | 2009-03-24 | ||
| PCT/US2010/028529 WO2010111414A1 (en) | 2009-03-24 | 2010-03-24 | Factor viii variants and methods of use |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102427823A true CN102427823A (zh) | 2012-04-25 |
Family
ID=42781481
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010800214104A Pending CN102427823A (zh) | 2009-03-24 | 2010-03-24 | 因子viii变体及使用方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20120142593A1 (zh) |
| EP (1) | EP2411024A4 (zh) |
| JP (1) | JP5739865B2 (zh) |
| CN (1) | CN102427823A (zh) |
| CA (1) | CA2756197A1 (zh) |
| WO (1) | WO2010111414A1 (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111440820A (zh) * | 2019-04-02 | 2020-07-24 | 庄亚(北京)生物科技有限公司 | 血管性血友病因子片段和八因子的共表达载体 |
| CN112119158A (zh) * | 2018-04-12 | 2020-12-22 | 生物测试股份公司 | 去免疫化的因子viii分子以及包含其的药物组合物 |
| CN113484522A (zh) * | 2021-06-03 | 2021-10-08 | 上海捷诺生物科技有限公司 | SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒及其制备方法 |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011028229A1 (en) | 2009-08-24 | 2011-03-10 | Amunix Operating Inc. | Coagulation factor ix compositions and methods of making and using same |
| EP2498804A4 (en) * | 2009-11-13 | 2013-05-08 | Puget Sound Blood Ct | FACTOR VIII IMMUNOGENICITY T LYMPHOCYTE T EPOXY VARIANTS |
| EP4382170A2 (en) * | 2009-12-06 | 2024-06-12 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof |
| SG191186A1 (en) * | 2010-12-15 | 2013-07-31 | Baxter Int | Eluate collection using conductivity gradient |
| US9394353B2 (en) | 2011-10-18 | 2016-07-19 | Csl Limited | Method for improving the stability of purified factor VIII after reconstitution |
| EA038705B1 (ru) | 2012-01-12 | 2021-10-07 | Биовератив Терапьютикс Инк. | Способы снижения иммуногенности фактора свёртывания крови viii у пациентов, получающих лечение фактором viii |
| LT2804623T (lt) * | 2012-01-12 | 2019-12-10 | Bioverativ Therapeutics Inc | Chimeriniai viii faktoriaus polipeptidai ir jų panaudojimas |
| RS63870B1 (sr) * | 2012-02-15 | 2023-01-31 | Bioverativ Therapeutics Inc | Sastavi faktora viii i postupci za pravljenje i upotrebu istih |
| HUE043537T2 (hu) | 2012-02-15 | 2019-08-28 | Bioverativ Therapeutics Inc | Rekombináns VIII faktor fehérjék |
| GB201210357D0 (en) * | 2012-06-12 | 2012-07-25 | Ucl Business Plc | Factor VIII sequences |
| EP2912058A1 (en) * | 2012-10-23 | 2015-09-02 | The Board of Regents of The University of Texas System | Antibodies with engineered igg fc domains |
| US20160060324A1 (en) * | 2013-04-22 | 2016-03-03 | James C. Paulson | Methods and Compositions for Treating Bleeding Disorders |
| EP3013358A4 (en) * | 2013-06-28 | 2017-03-22 | Biogen MA Inc. | Thrombin cleavable linker with xten and its uses thereof |
| US10548953B2 (en) | 2013-08-14 | 2020-02-04 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof |
| CN116731201A (zh) | 2014-01-10 | 2023-09-12 | 比奥贝拉蒂治疗公司 | 因子viii嵌合蛋白及其用途 |
| WO2015148454A1 (en) * | 2014-03-28 | 2015-10-01 | Asklepios Biopharmaceutical, Inc. | Optimized and modified factor viii genes for gene therapy |
| MX2017010117A (es) * | 2015-02-06 | 2018-05-17 | Univ North Carolina Chapel Hill | Casetes optimizados de expresión del gen humano del factor viii de coagulación y su uso. |
| EP3331608A4 (en) | 2015-08-03 | 2019-05-01 | Bioverativ Therapeutics Inc. | FUSION XI FUSION PROTEINS AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME |
| DK3458085T3 (da) * | 2016-05-20 | 2023-01-30 | Octapharma Ag | Glykosyleret vwf-fusionsproteiner med forbedret farmakokinetik |
| CN114989307B (zh) * | 2022-05-11 | 2023-08-01 | 华兰生物工程股份有限公司 | 一种重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白及制备方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5004803A (en) * | 1988-11-14 | 1991-04-02 | Genetics Institute, Inc. | Production of procoagulant proteins |
| US6251632B1 (en) * | 1997-03-06 | 2001-06-26 | Queen's University At Kingston | Canine factor VIII gene, protein and methods of use |
| US20050147618A1 (en) * | 2003-05-06 | 2005-07-07 | Rivera Daniel S. | Clotting factor-Fc chimeric proteins to treat hemophilia |
| CN1852736A (zh) * | 2003-05-06 | 2006-10-25 | 辛托尼克斯药品公司 | 免疫球蛋白嵌合单体－二聚体杂合体 |
| US20080071063A1 (en) * | 2006-02-03 | 2008-03-20 | Medimmune, Inc. | Protein Formulations |
| WO2008077616A1 (en) * | 2006-12-22 | 2008-07-03 | Csl Behring Gmbh | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5739277A (en) * | 1995-04-14 | 1998-04-14 | Genentech Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
| US6878811B1 (en) * | 1998-04-23 | 2005-04-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Substance with antithrombotic activity and method for detecting glycokallidin |
| US6358703B1 (en) * | 1998-12-10 | 2002-03-19 | Bayer Corporation | Expression system for factor VIII |
| KR100940380B1 (ko) * | 1999-01-15 | 2010-02-02 | 제넨테크, 인크. | 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체 |
| US7737260B2 (en) * | 2003-11-13 | 2010-06-15 | Hanmi Pharm. Co., Ltd | Protein complex using an immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof |
| WO2004006962A2 (en) * | 2002-07-12 | 2004-01-22 | Novo Nordisk A/S | A tissue factor binding immunoconjugate comprising factor viia |
| WO2005007809A2 (en) * | 2003-05-30 | 2005-01-27 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Antibodies and fusion proteins that include engineered constant regions |
| EP2371856B1 (en) * | 2004-11-12 | 2022-05-18 | Bayer HealthCare LLC | Site-directed modification of FVIII |
| GB0614780D0 (en) * | 2006-07-25 | 2006-09-06 | Ucb Sa | Biological products |
| JP2010536341A (ja) * | 2007-08-15 | 2010-12-02 | アムニクス， インコーポレイテッド | 生物学的に活性なポリペプチドの特性を改変するための組成物および方法 |
-
2010
- 2010-03-24 JP JP2012502213A patent/JP5739865B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-03-24 CA CA2756197A patent/CA2756197A1/en not_active Abandoned
- 2010-03-24 WO PCT/US2010/028529 patent/WO2010111414A1/en active Application Filing
- 2010-03-24 US US13/260,564 patent/US20120142593A1/en not_active Abandoned
- 2010-03-24 CN CN2010800214104A patent/CN102427823A/zh active Pending
- 2010-03-24 EP EP10756807A patent/EP2411024A4/en not_active Withdrawn
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5004803A (en) * | 1988-11-14 | 1991-04-02 | Genetics Institute, Inc. | Production of procoagulant proteins |
| US6251632B1 (en) * | 1997-03-06 | 2001-06-26 | Queen's University At Kingston | Canine factor VIII gene, protein and methods of use |
| US20050147618A1 (en) * | 2003-05-06 | 2005-07-07 | Rivera Daniel S. | Clotting factor-Fc chimeric proteins to treat hemophilia |
| CN1852736A (zh) * | 2003-05-06 | 2006-10-25 | 辛托尼克斯药品公司 | 免疫球蛋白嵌合单体－二聚体杂合体 |
| US20070172928A1 (en) * | 2003-05-06 | 2007-07-26 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
| US20080071063A1 (en) * | 2006-02-03 | 2008-03-20 | Medimmune, Inc. | Protein Formulations |
| WO2008077616A1 (en) * | 2006-12-22 | 2008-07-03 | Csl Behring Gmbh | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112119158A (zh) * | 2018-04-12 | 2020-12-22 | 生物测试股份公司 | 去免疫化的因子viii分子以及包含其的药物组合物 |
| CN111440820A (zh) * | 2019-04-02 | 2020-07-24 | 庄亚(北京)生物科技有限公司 | 血管性血友病因子片段和八因子的共表达载体 |
| CN111440820B (zh) * | 2019-04-02 | 2021-02-05 | 庄亚(北京)生物科技有限公司 | 血管性血友病因子片段和八因子的共表达载体 |
| CN113484522A (zh) * | 2021-06-03 | 2021-10-08 | 上海捷诺生物科技有限公司 | SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒及其制备方法 |
| CN113484522B (zh) * | 2021-06-03 | 2022-05-10 | 上海捷诺生物科技有限公司 | SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2012522490A (ja) | 2012-09-27 |
| WO2010111414A1 (en) | 2010-09-30 |
| EP2411024A4 (en) | 2013-02-27 |
| EP2411024A1 (en) | 2012-02-01 |
| CA2756197A1 (en) | 2010-09-30 |
| JP5739865B2 (ja) | 2015-06-24 |
| US20120142593A1 (en) | 2012-06-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102427823A (zh) | 因子viii变体及使用方法 | |
| JP2022000471A (ja) | ＸＴＥＮおよびｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子タンパク質を有する第ＶＩＩＩ因子の複合体、および、その使用 | |
| US9458223B2 (en) | Von willebrand factor variants having improved factor VIII binding affinity | |
| RU2722374C1 (ru) | Высокогликозилированный слитый белок на основе фактора свертывания крови человека viii, способ его получения и его применение | |
| EP2870250B2 (en) | Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof | |
| JP6676551B2 (ja) | 改変フォンウィルブランド因子 | |
| CN102076855A (zh) | 具有延长的体内半衰期的因子viii，冯·维勒布兰德因子或它们的复合物 | |
| CN108472337A (zh) | 因子ix融合蛋白以及其制备和使用方法 | |
| CN106456718A (zh) | 因子viii嵌合蛋白及其用途 | |
| TW201839011A (zh) | 嵌合因子ｖｉｉｉ多肽及其用途 | |
| JP6755318B2 (ja) | 突然変異フォン・ヴィレブランド因子 | |
| EP3858865A9 (en) | Fusion protein of mutated single-chain human coagulation factor viii, preparation method therefor, and use thereof | |
| AU2017267047B2 (en) | Glycosylated VWF fusion proteins with improved pharmacokinetics | |
| RU2782212C2 (ru) | Гликозилированные слитые белки vwf с улучшенной фармакокинетикой | |
| JP2022540402A (ja) | 改善されたｆｉｘ融合タンパク質、コンジュゲート及びその使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120425 |