JP2022540402A - 改善されたｆｉｘ融合タンパク質、コンジュゲート及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、延長された循環半減期を有する血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質及びそのコンジュゲート、それらを含む医薬組成物及び出血性疾患（例えば、血友病Ｂ）の治療におけるそれらの使用に関する。

Description

相互参照
本願は、２０１９年７月２日に中国特許局に出願された出願番号が２０１９１０５９１２８０．０である中国特許出願に基づく優先権を主張し、その全内容は援用により本願に組み込まれる。

本発明は、インビボでの半減期が延長された生物学的に活性なポリペプチド融合タンパク質及びそれとポリマーのコンジュゲートに関し、特にインビボでの半減期が延長された人血液凝固第ＩＸ因子、それらを含む医薬組成物及び出血性疾患（例えば、血友病B）の治療におけるそれらの使用に関する。

血友病は、一連の遺伝性出血性疾患であり、血液中のある凝固因子の欠乏に起因する重い血液凝固機能障害である。それには、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子、ＡＨＧの欠乏）と血友病Ｂ（第ＩＸ因子、ＰＴＣの欠乏）が含まれる。

血友病Ｂ（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ）は、人血液凝固第ＩＸ因子（ｈｕｍａｎ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ、ｈＦＩＸ）の欠乏によって引き起こされる重い血液凝固機能障害性疾患である。深刻な凝固機能障害疾患です。ｈＦＩＸをコードする遺伝子（ｈＦＩＸ）がヒトＸ染色体の長腕の遠位端に位置し、Ｘｑ２７．１領域に定位し、その全長が３４ｋｂであり、８つのエクソンと７つのイントロンを含み、ｃＤＮＡの全長が２８０２ｂｐであり、コーディング領域が１３８３ｂｐである。ｃＤＮＡの全長は２８０２ｂｐであり、そのコード領域は1383bpです。（Ｇｅｎｂａｎｋの登録番号：ＮＭ＿０００１３３）重症患者の第ＩＸ因子の活性は正常の１％未満であり、しばしばに発生する自発的な出血は筋肉血腫または関節変形を引き起こす。

血友病の予防や治療のための組換え製剤は、安全性を有するために、ますます医療システム及び患者に認められている。血友病Ｂは、第ＩＸ因子の製剤（現在、通常はインビトロで組換え発現された第ＩＸ因子タンパク質である）を注入して患者体内の血液凝固第ＩＸ因子を補充することは、唯一の有効な治療法であるが、ポリペプチド薬は一般に、インビボでの半減期が短く、物理的および化学的安定性が悪く、体内のさまざまなプロテアーゼによって分解されやすいなどの特性を有するために、それらの薬は通常、一日に複数回注射する必要があり、頻繁に投薬される。患者の体、心理、経済に大きな負担をかけ、患者の服薬コンプライアンスを制限する。従って、この分野で血漿サイクルを延長し、全身的薬物暴露（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｒｕｇ ｅｘｐｏｓｕｒｅ）を増加する新規医薬品が急務となっている。

発明者らは、長年にわたって研究した結果、ＰＥＧを含むコンジュゲートによってさらに修飾されることができ、ＦＩＸポリペプチドと比べて、著しく延長された循環半減期を有する、血液凝固第ＩＸ因子とＦｃとの融合タンパク質を提供することに至った。

具体的には、本発明の第１の態様は、血液凝固第ＩＸ因子の活性部位と、それに連結した半減期延長融合パートナー（ＦＰ）とを含む融合タンパク質であって、前記血液凝固第ＩＸ因子の活性部位が前記融合パートナーと直接連結され、又は第１のリンカーＬ１を介して連結され、好ましくは、前記第１のリンカーＬ１が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチドセグメントであり、より好ましくは、前記第１のリンカーＬ１が柔軟なペプチドセグメント及び／又は剛性単位を含み、前記柔軟なペプチドセグメントがグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）及び／又はスレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）を含むセグメントであり、例えば、前記柔軟なペプチドセグメントが（ＧＳ）ｍ（ＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＳ）ｏ（ＧＧＧＧＳ）ｐ（ただし、ｍ、ｎ、ｏ及びｐは、それぞれ０から５０までの整数から選択され、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０であり、好ましくは、ｍ、ｎ、ｏ及びｐは同時に０ではない。）である、血液凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の融合タンパク質を提供する。

一実施形態において、前記血液凝固第ＩＸ因子の活性部位がヒトに由来し、例えば、完全長または短縮型の人血液凝固第ＩＸ因子であり、前記完全長または短縮型の人血液凝固第ＩＸ因子が、そのＦＩＸ活性を保持している条件下で、１つ又はそれ以上のアミノ酸変異を含むことが可能であり、例えば、前記血液凝固第ＩＸ因子の活性部位が配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の同一性を有する。

別の実施形態において、剛性単位が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のプロリン（Ｐｒｏ，Ｐ）を含むペプチドセグメントであり、好ましくは、前記剛性単位は、
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡ（配列番号３）；
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号４）；
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡ（配列番号５）；
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号６）；及び
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号７）から選ばれるアミノ酸配列を含む。

好ましくは、前記第１のリンカーＬ１は、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡ（配列番号８）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号９）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡ（配列番号１０）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号１１）；及び
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号１２）から選ばれる。

別の実施形態において、前記融合パートナーが、完全長、短縮型又は変異型の免疫グロブリンＦｃセグメント、アルブミン、トランスフェリン又はＸＴＥＮであり、例えば、前記融合パートナーが、ヒトに由来し、例えば、前記Ｆｃセグメントがヒト免疫グロブリンＦｃセグメントであり、好ましくは、前記免疫グロブリンＦｃセグメントがＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインからなる群から選ばれる１つ～４つのドメインからなり、さらに好ましくは、前記免疫グロブリンＦｃセグメントがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃセグメントであり、ＩｇＧ Ｆｃセグメントであることがより好ましく、さらに好ましくは、前記ＦｃセグメントがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＦｃセグメントであり、また、前記ＩｇＧ Ｆｃセグメントが低減されたＡＤＣＣ効果及び／又はＣＤＣ効果、及び／又は高められたＦｃＲｎ受容体との結合親和性を有することがさらに好ましい。

別の実施形態において、前記融合パートナー（ＦＰ）が、さらにソルターゼ酵素認識部位を含むアミノ酸配列Ｐに直接連結され、又は、第２のリンカーＬ２を介して連結され、前記ソルターゼ酵素が、例えば、ソルターゼＡ又はソルターゼＢであり、好ましくは、前記ＰがソルターゼＡのコア認識部位であるＬＰＸＴＧ（ただし、Ｘは、任意的なアミノ酸である。）を含み、例えば、Ｐ配列がＬＰＥＴＧ、ＬＰＥＴＧＧ又はＬＰＥＴＧＧＧであり、さらに好ましくは、前記アミノ酸配列Ｐがソルターゼ酵素認識部位に連結したアフィニティタグをさらに含み、このようなアミノ酸配列Ｐは、例えば、ＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨ又はＬＰＥＴＧＧＷＳＨＰＱＦＥＫである。

別の実施形態において、前記第２のリンカーＬ２が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチドセグメントであり、より好ましくは、前記第２のリンカーＬ２がグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）及び／又はスレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）を含む柔軟なペプチドセグメントであり、例えば、（ＧＳ）ｗ（ＧＧＳ）ｘ（ＧＧＧＳ）ｙ（ＧＧＧＧＳ）ｚ（ただし、ｗ、ｘ、ｙ及びｚはそれぞれ０から５０までの整数から選択され、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０であり、好ましくは、ｗ、ｘ、ｙ及びｚは同時に０ではない。）である。

好ましくは、第２のリンカーＬ２の配列が、
ＧＧＧＧＳ（配列番号１４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５）又はＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）である。

具体的な一実施形態において、前記融合タンパク質は下記の構造を有する。
ＦＩＸ－Ｌ１－ＦＰ－Ｌ２－Ｐ
（ただし、ＦＩＸ、Ｌ１、Ｌ２、ＦＰ及びＰは実施形態６に定義されたものと同じであり、Ｌ１及びＬ２のいずれか一者又は両者が存在しなくてもよい。）

別の実施形態において、前記融合タンパク質が配列番号１８、２０、２２、２４、２６又は２８で示される配列を含み、または配列番号１９、２１、２３、２５、２７又は２９で示される核酸分子によってコードされる。

さらに、本発明は、前記の実施形態のいずれか１つの融合タンパク質をコードする核酸配列、及び前記核酸配列を含む発現ベクターを提供する。

本発明の第２の態様は、親水性ポリマー分子を第１の態様のいずれかの実施形態に係る前記融合タンパク質の末端に連結することによって形成されたコンジュゲートであって、前記コンジュゲートにおいて、１つ、２つ又はそれ以上の親水性ポリマー分子が第１の態様のいずれかの実施形態に係る融合タンパク質の末端に連結され、好ましくは、ペプチド転移反応によって前記ソルターゼ酵素認識部位に連結され、特に、前記融合タンパク質がモノマー又は二量体として存在してもよい、コンジュゲートを提供する。

一実施形態において、前記１つ、２つ又はそれ以上の親水性ポリマー分子はそれぞれ独立して多糖、及び、例えば、ポリプロピレングリコール及びポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコールから選ばれ、前記ポリアルキレングリコールは、エンドキャップされてもよく、例えば、メトキシ基のようなアルコキシ基でエンドキャップされてもよく、及び/又は、前記ポリアルキレングリコールが直鎖状又は分枝状であり、例えば、前記ポリアルキレングリコールが分枝状であり、例えば、分枝状ポリエチレングリコールであり、特に、メトキシ基でエンドキャップされた分枝状ポリエチレングリコールであり、前記ポリアルキレングリコールの分子量が１ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上、１４０ｋＤａ以上、１５０以上又は１６０ｋＤａ以上であってもよく、例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｋＤａ、又はそれらのうちのいずれか２つの値の間の値であり、好ましくは、前記親水性ポリマー分子の分子量が２０ｋＤ又は４０ｋＤである。

本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様に係る融合タンパク質をソルターゼ酵素（例えば、ソルターゼＡまたはソルターゼＢ）及び親水性ポリマー分子と接触させる工程を含む第２の態様に係るコンジュゲートを製造する方法であって、前記親水性ポリマー分子は、その一端にソルターゼ酵素によってアミド化されることが可能なアミノ基を持つ、方法を提供する。

一実施形態において、親水性ポリマー分子は、そのＮ末端に、例えば、ＧＧＧＡＡであるポリグリシンを持つ。

本発明の第４の態様は、有効量の第１の態様に記載の融合タンパク質及び／又は第２の態様に記載のコンジュゲート、及び任意選択的に薬学的に許容されるキャリアを含む、医薬組成物を提供する。

一実施形態において、前記医薬組成物は、出血性疾患を予防及び／又は治療するために用いられ、好ましくは、前記出血性疾患は、先天性又は後天性のＦＩＸ欠乏症患者における出血性疾患、及び血友病Ｂ患者における自発的な又は手術による出血から選ばれる。

別の実施形態において、前記医薬組成物が液体製剤または凍結乾燥製剤の形態になっている。

本発明の第５の態様は、出血性疾患を予防及び／又は治療するための医薬品の調製における、前記態様における融合タンパク質、コンジュゲート又は医薬組成物の使用であって、好ましくは、前記出血性疾患は、先天性又は後天性のＦＩＸ欠乏症患者における出血性疾患、及び血友病Ｂ患者における自発的な又は手術による出血から選ばれる、使用を提供する。

本発明の第６の態様は、これを必要とする対象に前記態様における融合タンパク質、コンジュゲート又は医薬組成物を投与する工程を含む、出血性疾患を予防及び／又は治療する方法であって、好ましくは、前記出血性疾患は、先天性又は後天性のＦＩＸ欠乏症患者における出血性疾患、及び血友病Ｂ患者における自発的な又は手術による出血から選ばれる、方法を提供する。

本発明の第７の態様は、前記態様における融合タンパク質、コンジュゲート又は医薬組成物、及び任意選択的に含まれる取扱説明書キットを含むキット、を提供する。

本発明の第８又は第９の態様は、それぞれ第１態様に係る融合タンパク質を含む核酸配列、及び前記核酸配列を含む発現ベクター、を提供する。

ＦＩＸ／ＰＡＣＥ（Ｆｕｒｉｎ）バイシストロン性発現ベクターの構造を示す。 ｐｃＤＮＡ３．１－Ｈｙｇ－ＶＫＧＣのプラスミドマップを示す。 精製後のＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ融合タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ａ）を示す。 精製後のＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ融合タンパク質のＳＥＣ－ＨＰＬＣ（Ｂ）検出結果を示す。 図３は、それぞれのＦＩＸ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ融合タンパク質及びＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐコンジュゲート生成物のインビトロでの活性の検出結果を示す。 図４は、コンジュゲーション反応終了後、４０ｋＤ ＰＥＧコンジュゲート生成物のＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出結果を示す。 図５は、精製・回収後のコンジュゲート生成物のＳＥＣ－ＨＰＬＣ検出結果を示す。 図６は、血友病ＢモデルマウスにおけるコンジュゲートＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧＰＫの検出結果を示し、ここで、図の下のリストには、Ｔ１／２（消失相半減期）、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ０－ｉｎｆ（曲線下面積）、ＭＲＴ（平均滞留期間）及びＣＬ（クリアランス速度）の検出値が示される。

本発明の目的、技術案、及び利点をより明らかにするため、以下、本発明について、図面を参照して実施例を挙げながら、より詳細に説明するが、述べる実施形態が本発明の実施形態の一部だげであり、すべての実施形態ではないことが明らかである。当業者が本発明における実施形態に基づき、創造的な労働なしに得た他のすべての実施形態は、本発明の保護範囲に含まれるものとする。

定義
血液凝固第ＩＸ因子は、第ＩＸ因子、第９因子又はＦＩＸとも呼ばれ、第ＶＩＩ因子、プロトロンビン、第Ｘ因子及びタンバク質Ｃと構造的な類似性を有するビタミンＫ依存性凝固因子である。

本発明における「血液凝固第ＩＸ因子の活性部位」という用語は、融合タンパク質における血液凝固第ＩＸ因子の活性を示す部分を指す。「血液凝固第ＩＸ因子」という用語は、その天然の野生型配列（野生型アミノ酸配列が配列番号１で示され、その参照野生型核酸コード配列が、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０００１３３を参照し、具体的には、配列番号２で示す。）を指す場合もあるし、その変異型、たとえば、血液凝固第ＩＸ因子の活性を保持しながら１つ又はそれ以上の（例えば２つ、３つ、４つ又は５つ）のアミノ酸で置換、欠失、または挿入した後で得られた変異体タンパク質も含む。

ＭＱＲＶＮＭＩＭＡＥＳＰＧＬＩＴＩＣＬＬＧＹＬＬＳＡＥＣＴＶＦＬＤＨＥＮＡＮＫＩＬＮＲＰＫＲＹＮＳＧＫＬＥＥＦＶＱＧＮＬＥＲＥＣＭＥＥＫＣＳＦＥＥＡＲＥＶＦＥＮＴＥＲＴＴＥＦＷＫＱＹＶＤＧＤＱＣＥＳＮＰＣＬＮＧＧＳＣＫＤＤＩＮＳＹＥＣＷＣＰＦＧＦＥＧＫＮＣＥＬＤＶＴＣＮＩＫＮＧＲＣＥＱＦＣＫＮＳＡＤＮＫＶＶＣＳＣＴＥＧＹＲＬＡＥＮＱＫＳＣＥＰＡＶＰＦＰＣＧＲＶＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴＩＬＤＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦＴＲＶＶＧＧＥＤＡＫＰＧＱＦＰＷＱＶＶＬＮＧＫＶＤＡＦＣＧＧＳＩＶＮＥＫＷＩＶＴＡＡＨＣＶＥＴＧＶＫＩＴＶＶＡＧＥＨＮＩＥＥＴＥＨＴＥＱＫＲＮＶＩＲＩＩＰＨＨＮＹＮＡＡＩＮＫＹＮＨＤＩＡＬＬＥＬＤＥＰＬＶＬＮＳＹＶＴＰＩＣＩＡＤＫＥＹＴＮＩＦＬＫＦＧＳＧＹＶＳＧＷＧＲＶＦＨＫＧＲＳＡＬＶＬＱＹＬＲＶＰＬＶＤＲＡＴＣＬＲＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨＥＧＧＲＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＨＶＴＥＶＥＧＴＳＦＬＴＧＩＩＳＷＧＥＥＣＡＭＫＧＫＹＧＩＹＴＫＶＳＲＹＶＮＷＩＫＥＫＴＫＬＴ（配列番号１）。

ＡＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＧＡＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＧＣＣＴＴＴＴＡＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＴＣＡＧＴＧＣＴＧＡＡＴＧＴＡＣＡＧＴＴＴＴＴＣＴＴＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＡＡＡＴＴＣＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＡＣＣＴＴＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＴＡＧＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＣＡＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＡＣＴＧＡＡＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＴＧＴＧＡＧＴＣＣＡＡＴＣＣＡＴＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＣＧＧＣＡＧＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＴＴＣＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＧＧＴＧＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＴＧＡＡＴＴＡＧＡＴＧＴＡＡＣＡＴＧＴＡＡＣＡＴＴＡＡＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＧＡＴＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＧＴＡＣＴＧＡＧＧＧＡＴＡＴＣＧＡＣＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＣＣＧＴＧＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＴＧＧＡＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＡＣＣＣＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＧＧＧＴＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＴＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＴＧＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＣＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＴＡＴＣＧＴＴＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＧＡＴＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＣＴＧＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＴＴＧＴＣＧＣＡＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＡＴＡＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＧＡＡＴＴＡＴＴＣＣＴＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＧＡＡＣＣＣＴＴＡＧＴＧＣＴＡＡＡＣＡＧＣＴＡＣＧＴＴＡＣＡＣＣＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＣＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＡＴＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＴＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＣＡＧＣＴＴＴＡＧＴＴＣＴＴＣＡＧＴＡＣＣＴＴＡＧＡＧＴＴＣＣＡＣＴＴＧＴＴＧＡＣＣＧＡＧＣＣＡＣＡＴＧＴＣＴＴＣＧＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＡＧＧＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＴＧＧＧＧＧＡＣＣＣＣＡＴＧＴＴＡＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＡＣＣＡＧＴＴＴＣＴＴＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＴＧＴＧＣＡＡＴＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＡＣＣＡＡＧＧＴＡＴＣＣＣＧＧＴＡＴＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＴＴＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＡＣＴＴＡＡ（配列番号２）。

一実施形態において、前記変異体タンパク質は、配列番号１の配列と少なくとも９０％同一である。別の実施形態において、前記変異体タンパク質は、例えば、配列番号１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。本明細書で使用される場合、反対の明確な指示がない限り、言及される特定の位置は、配列番号１における相応の位置を指す。

本発明は、本開示に記載される配列に限定されない。ＦＩＸ変異体は、例えば、ＵＳ５５２１０７０（１番目の位置にあるチロシンがアラニンに置き換えられている）、及びＷ０２００７／１３５１８２（ＦＩＸにおける１つ又は複数の天然アミノ酸残基がシステイン残基に置き換えられている）に開示されている。前記の参考文献は、その内容を援用により本明細書に組み込まれる。ＦＩＸの変異体は、当分野における周知なものであり、本開示の内容は、既知のもの、将来で開発されるか又は発見される変異型も含む。

融合タンパク質
「融合パートナー」、即ち、ＦＰ、Ｆｕｓｉｏｎ Ｐａｒｔｎｅｒという用語は、標的ポリペプチド（即ち、循環半減期を延長しようとするポリペプチド）と融合する別のポリペプチドを指す。前記融合パートナーは、例えば、標的ポリペプチドのインビボでの半減期を延長する機構のさまざまなメカニズムで融合タンパク質の機能特性に影響を与える可能である。

一実施形態において、融合パートナーは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と相互作用することによりインビボでのＦＩＸのクリアランスを遅らせる。一実施形態において、融合パートナーは、免疫グロブリンＦｃセグメント、アルブミン、トランスフェリン、ＸＴＥＮ又はそれらの一部である。

免疫グロブリンのFcセグメントは、体内で代謝可能な生分解性ペプチドであるため、薬剤キャリアとして使うのが安全であり、また、免疫グロブリンＦｃセグメントは、全体の免疫グロブリン分子と比べて、分子量が比較的小さいため、コンジュゲートの製造、精製及び生産が有利である。免疫グロブリンＦｃセグメントにはＦａｂ断片（そのアミノ酸配列が抗体サブクラスによって異なるため、非常に不均一である）が含まれていないため、免疫グロブリンＦｃ領域が物質の均一性を大幅に増加し、低抗原性することが期待できる。

「免疫グロブリンのＦｃセグメント」という用語は、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含有するが、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域を含有しないタンバク質を指す。また、本発明の免疫グロブリンＦｃセグメントは、天然型と実質的に同等又はそれ以上の生理学的機能を持つ限り、重鎖定常領域におけるヒンジ領域、及び／又は重鎖および軽鎖の可変領域を除く重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域１（ＣＬ１）一部または全部を含んでもよい。

いくつかの実施形態においては、本発明に係る免疫グロブリンＦｃセグメントは、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン；２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン；３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン；４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン；５）一種以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）の組み合わせ、及び６）重鎖定常領域及び軽鎖定常領域の各ドメインの二量体、を含むことができる。

また、免疫グロブリンＦｃセグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭに由来するのＦｃ領域であるか、或いはその組み合わせ又はハイブリッドによって調製されることができる。好ましくは、ＩｇＧやＩｇＭ（それらはヒト血液中に最も豊富なタンパク質の１つであるからである）に由来する。一実施形態において、ＩｇＧ抗体が比較的長い半減期を有することを考慮すると、ＩｇＧ Ｆｃドメインが好ましい。

Ｆｃセグメントは、他の機能を改善するために修飾することもでき、例えば、変異を介して、例えば補体に結合する及び／又はあるＦｃ受容体に結合する能力などの、免疫応答を誘導する能力を変更する。これは、半減期を延長するためのＦｃの用途に対して、必要ではないためである。ＩｇＧ Ｆｃセグメントにおける２３４、２３５及び２３７番目の位置での変異は通常、ＦｃγＲＩ受容体への結合を減少させ、また、ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩへの結合を減少させる恐れもあることが知られるが、それらの変異は、ＦｃＲｎ受容体への結合を変化させることがないため、依然としてエンドサイトーシス再循環経路を介して長い循環半減期を促進することができる。好ましくは、本発明に係る融合タンパク質における修飾されたＩｇＧ Ｆｃセグメントは、以下の突然変異のうちの１つ又はを含み、上記突然変異は、それぞれ、あるＦｃ受容体に対する親和力の低下（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ及びＧ２３７Ａ）及びＣ１ｑによって媒介される補体結合の低下（Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓ）をもたらす。

一実施形態において、前記血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質は、さらにソルターゼ酵素認識部位を含む断片（即ち、本発明に係る「アミノ酸配列Ｐ」）に連結される。

「ソルターゼ酵素」という用語は、ソルターゼとも呼ばれ、具体的にはソルターゼＡ及びソルターゼＢが含まれる。細菌の表面タンパク質を細胞壁に固定する機能を有することが最初に発見され、また、同定したところ、表面タンパク質の「ソーティングシグナル（ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）」がＬＰＸＴＧ配列と、疎水性配列と、多くの場合で正に帯電した残基のテールとの３つの肝要な部分で構成されていることが発見された。なお、ＬＰＸＴＧ配列は、非常に保存的であり、ソルターゼ酵素によって認識されることが可能である。その後、ソルターゼ酵素のシステイン（Ｃｙｓ）が求核性基として攻撃し、基質（例えば、表面タンパク質）のＣ末端モチーフＬＰＸＴＧのスレオニンとグリシンとの間のペプチド結合に作用してそれを切断（アシル化）させるように、そして、アシラーゼ中間体が生じる。その後、ポリペプチドを細胞壁または線毛サブユニットに共有結合して機能する（脱アシル化）。

本発明の一実施形態において、ソルターゼＡを使用してＰＥＧの部位特異的カップリングを行う。具体的な一実施形態において、ソルターゼＡのコア認識部位であるＬＰＥＴＧ、ＬＰＥＴＧＧ、ＬＰＥＴＧＧＧを使用する。別の具体的な実施形態では、認識部位の後にＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨやＬＰＥＴＧＧＷＳＨＰＱＦＥＫのような異なるアフィニティタグを添加しても良い。

別の実施形態において、本発明に係る血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質は、組換え方法によって産生され、例えば、適切な原核や真核の宿主細胞において発現し、次に、従来の技術により本発明に係る血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質を単離することを含む。例えば、まず、化学合成によって前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列を合成し、その後、前記配列を適切な発現ベクターにクローン化し、適切なプロモーターの制御下で発現することができる。あるいは、例えばＰＣＲ誘発法などの誘発法を使用して野生型血液凝固第ＩＸ因子から血液凝固第ＩＸ因子をコードする核酸配列を得、その後、前記配列及び融合タンパク質を構築するための他の要素の配列を適切な発現ベクターにクローン化し、適切なプロモーターの制御下で発現することができる。これらの技術は、完全に当業者の能力の範囲内にあるものであり、先行技術にも多くの教えがある。

適切な真核宿主細胞は、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＨｅｐＧ２などの哺乳動物の細胞がある。好ましくは、前記細胞は、本発明に係る血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質を発現するのに適した条件下で増殖させる。なお、本発明に係る血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質を産生または分離するために用いる試薬や条件に関しては、特別な制限は一切なく、当技術分野で知られているまたは市販されているシステムのいずれかを使用することができる。好適な一実施形態において、前記血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質は当分野で記載されている方法によって得られる。

血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質の製造するために使用できるさまざまな発現発現ベクターがあり、真核および原核発現ベクターから選ぶことができる。原核生物発現ベクターは、例えばｐＲＳＥＴ、ｐＥＴやｐＢＡＤなどのプラスミドを含むことができ、その中で使用できるプロモーターは、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡやａｒａＢＡＤなどを含む。真核発現ベクターは、例えば、以下のベクターが挙げられる。（ｉ）例えばｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴなどの酵母で発現するためのベクター、ここでＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１などのプロモーターを使用できる、（ｉｉ）例えばｐＭＴ、ｐＡｃ［ｄｅｌｔａ］、ｐｌＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣなどの昆虫細胞で発現するためのベクター、ここでＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐｌＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなどのプロモーターを使用できる、及び（ｉｉｉ）例えばｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなどの哺乳動物細胞で発現するためのベクター、及びワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどのウイルスシステム由来のベクター、ここでＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ－１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、βアクチンなどのプロモーターを使用できる。好適な一実施形態において、前記血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質が原核生物または真核生物の細胞系で発現され、また、コドンで最適化されたコード配列が使用される。

好適な一実施形態において、前記血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質を細胞から細胞外へ分泌することにより、分離精製するのを促進するために、前記血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質を発現する配列はプロペプチド（ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）及び／又はシグナルペプチドを含む。プロペプチドの切断効率、ＦＩＸの収量を高めるか、または、正確に処理するため、発現ベクターが改善される。具体的な一実施形態において、ＦＩＸ／ＰＡＣＥ（Ｆｕｒｉｎ）バイシストロン性発現ベクターが構築される。

別の実施形態において、前記血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質を発現する配列は、プロペプチド及び/又はシグナルペプチドを含まない。それは、細胞外へ分泌されず、細胞を溶解することより分離・精製する。

別の実施形態において、本発明に係る融合タンパク質では、血液凝固第ＩＸ因子タンパク質とＦｃセグメントとは直接接続されている。別の実施形態において、血液凝固第ＩＸ因子タンパク質とＦｃセグメントとは第１のリンカーＬ１を介して連結されている。別の実施形態において、ＦｃセグメントとＳｏｒｔａｓｅ認識配列を含むポリペプチド断片とは直接接続されている。別の実施形態において、ＦｃセグメントとＳｏｒｔａｓｅ認識配列を含む断片とは第２のリンカーＬ２を介して連結されている。

好適な実施形態では、前記第１のリンカーＬ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチドセグメントである。より好ましくは、前記第１のリンカーＬ１は、柔軟なペプチドセグメント及び／又は剛性単位を含む。ここで、前記柔軟なペプチドセグメントは、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）及び／又はスレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）を含むペプチドセグメントであり、例えば（ＧＳ）ｍ（ＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＳ）ｏ（ＧＧＧＧＳ）ｐであり、ただし、ｍ、ｎ、ｏ及びｐはそれぞれ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０などの０から５０までの整数から選択され、また、ｍ、ｎ、ｏ和ｐは、同時に０ではないことが好ましい。

前記剛性単位は、１つ又はそれ以上のプロリン（Ｐｒｏ，Ｐ）を含有するペプチドセグメントである。プロリンは、特別な環状構造を有し、ペプチド鎖構造に対する制限が強化される。本発明者らは、リンカーに剛性単位を含むと、融合タンパク質の活性を大幅に改善できること、を予期せず発見した。好ましくは、前記剛性単位は、
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡ（配列番号３）；
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号４）；
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡ（配列番号５）；
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号６）；及び
ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号７）から選ばれるアミノ酸配列を含む。

別の好適な実施形態では、前記第１のリンカーＬ１の配列は、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡ（配列番号８）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号９）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡ（配列番号１０）；
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号１１）；及び
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号１２）から選ばれる。

前記第２のリンカーＬ２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチドセグメントであり、主に、Ｆｃとソルターゼ酵素認識部位とを分離するために用いられ、ソルターゼ酵素の認識及び機能に有利である。より好ましくは、前記第２のリンカーＬ２は、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）及び／又はスレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）を含む柔軟なペプチドセグメントであり、例えば、（ＧＳ）ｗ（ＧＧＳ）ｘ（ＧＧＧＳ）ｙ（ＧＧＧＧＳ）ｚであり、ただし、ｗ、ｘ、ｙ及びｚはそれぞれ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０などの０から５０までの整数から選択され、ｗ、ｘ、ｙ及びｚは同時に０ではないことが好ましい。

好適な一実施形態において、第２のリンカーＬ２の配列は、
ＧＧＧＧＳ（配列番号１４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５）又はＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）である。

血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質のコンジュゲート
「コンジュゲート」という用語は、ポリペプチドまたはポリペプチド変異体と本明細書に記載の親水性ポリマー修飾基とを共有結合または非共有結合することにより形成される生成物を指し、ここで、親水性ポリマーとポリペプチドとは、例えば、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、や中部における適切な位置などの、任意の位置で連結することができる。

一般には、本明細書で使用される「ポリマー」という用語は、当業者によって通常に理解される意味を有し、特に明記しない限り、ポリマー自体を含み、その末端に修飾された誘導体も含む。

さらに、ポリエチレングリコールのような親水性ポリマーは、その分子量を測定する方法はたくさんがある。ポリマーは、特定の分布範囲で異なる重合度の分子で構成され、一般、平均分子量でポリマーの分子量を表し、具体的には、数平均分子量または重量平均分子量で表すことができる。ここで、数平均分子量とは、異なる分子量の各分子が占める数分率をそれに相応の分子量に掛け合わせた量の総合を指す。重量平均分子量とは、異なる分子量の各分子が占める重量分率をそれに対応する分子量に掛け合わせた量の総合を指す。ポリマーの重合度が大きく異なる場合には、数平均分子量と重量平均分子量に多少の偏差が生じる場合があるが、分布範囲が狭いポリマーでは、両者が等しくなる傾向がある。本明細書で言及される、例えば、ポリエチレングリコールなどのポリマーは、その分子量を言及する場合、重量平均分子量でもよく、数平均分子量でもよい。

本発明に係る血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質は、１つ又は複数の親水性ポリマー分子とコンジュゲートし、血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲートを形成することができる。ポリマーは、好ましくは生理学的に許容され、水溶液又は懸濁液に可溶であり、かつ、該血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲートを薬学的有効量で投与した後、哺乳動物に副作用のような悪影響を与えないポリマー、を含む。本発明において使用できるポリマーは、特に限定されない。通常、前記ポリマーは、２から約３０００の繰り返し単位を有するものが好ましい。該ポリマー基は、天然または合成ポリマーから選択することができ、その実例は、例えば、多糖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリビニルアルコールなどのポリアルキレングリコール、又はそれらの組み合わせを含むが、限定されない。好適な一実施形態において、本発明に係る血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲートにおいて、コンジュゲーション修飾のために、１つ又は複数のＰＥＧ基を使用する。

本発明においては、前記ポリマーは、特定の構造に限定されないが、線状の（例えば、アルコキシ基ＰＥＧまたは二官能性ＰＥＧ）、分岐型又はマルチアーム型（例えば、分岐型ＰＥＧまたはポリオールのコアに連結されたＰＥＧ）、樹枝状又は分解性のリンケージを有するものであることができる。また、ポリマーの内部構造は任意の数の異なるパターンで構築することができ、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互三量体、ランダム三量体、及びブロック三量体などから選ぶことができる。前記ポリマーは、さらに、ポリ（アルキレンオキサイド）ポリマー、ポリマレイン酸、ポリ（Ｄ，Ｌ－アラニン）などを含むことができる。

いくつかの実施形態では、前記ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその誘導体例えばメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。本明細書においては、特に記述がない限り、前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は末端基がヒドロキシルであるものを含み、他の基であるものともを含む。前記他の基には、これらに限定されないが、アルコキシ基、シクロアルコキシ基、シクロアルキルオキシ基、アルケニル基、アリールオキシ基、またはアラルキルオキシ基などが含まれる。これらのＰＥＧ分子タイプは、先行技術で知られており、ポリペプチド修飾において通常に使用されている。ＰＥＧの側鎖は、線状、分枝状、分岐状、又は複数のアームから構成され、また、異なるポリエチレングリコールは、異なるポリマー鎖長およびポリマー構造を有することができる。

本発明では、使用されるＰＥＧの分子量は、特に限定がないが、その分子量は、０．１から２００ｋＤａの範囲であることができ、例えば、１から１５０ｋＤａ、２から１００ｋＤａ、３から８０ｋＤａ、又は４から５０ｋＤａであり、更に、５から４０ｋＤａであることもできる。他の有用なＰＥＧ分子は、例えば、ＷＯ ０３／０４０２１１、ＵＳ ６，５６６，５０６、ＵＳ ６，８６４，３５０及びＵＳ ６，４５５，６３９に開示されるものを含む。特には、前記ＰＥＧは、一般式ＨＯ－ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）ｎ－ＣＨ_２ＣＨ_２－ＯＨで示され、ただし、ｎは、約５から４０００までの範囲にある。上記のように、本発明におけるＰＥＧは、例えば、メトキシＰＥＧ、分枝状ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧなどの他の末端基を持つＰＥＧを含む。適切な分枝状ＰＥＧは、米国特許第Ｎｏ．５，９３２，４６２の記載に従って調製することができ、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。前記分岐状ＰＥＧは、ポリマー鎖の一端の近くに分枝を有するＰＥＧを指す。ここで、分岐状ＰＥＧの主鎖は直鎖状であってもよいし、分岐状であってもよい。

当業者にとっては、ポリマー基をコンジュゲートした生物活性分子においては、前記ポリマー基分子量の増加するにつれて、該コンジュゲート分子の生物学的活性が通常徐々に減少することが知られている。また、当業者にとっては、前記ポリマー基分子量の増加するにつれて、該コンジュゲート分子の生物学的半減期及び／又は血漿半減期が徐々に延長することも知られている。

長期間にわたって安定した治療効果を提供し、投与頻度を減少して患者のコンプライアンスを改善するために、有意な血液凝固第ＩＸ因子受容体アゴニスト活性を保持する一方で、前記血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲートの生物学的半減期を可能な限り延長することが望ましい。従って、本発明は、延長された生物学的半減期及び有意な血液凝固第ＩＸ因子受容体アゴニスト活性を有する血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲートを提供する。

具体的な一実施形態において、本発明に係る血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲートにおいて、前記１つ又は複数のポリマー基（例えばＰＥＧ）の分子量が１ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上、１４０ｋＤａ以上、１５０ｋＤａ以上又は１６０ｋＤａ以上であり、例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｋＤａ、又は上記の任意の二つの値の間の値である。なお、血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲートにおけるコンジュゲートポリマー基の分子量を説明する場合、該コンジュゲートが複数のコンジュゲートポリマー基を有する場合、特に明記しない限り、計算は該コンジュゲートにおける全てのコンジュゲートポリマー基の分子量の合計である。

本発明に用いられるポリマーは、先行技術で知られており、特定の手法によって製造されたものに限定されないが、例えば、市販品として購入するか、または、当分野における既知の方法で調製するような様々な方法で入手することができる。

コンジュゲーション反応後、コンジュゲートは、適切な方法で単離することができる。適用可能な方法は、例えば、限外濾過法、透析法又はクロマトグラフィーなどの方法を含む。それは、すべて当業者の能力の範囲内である。

医薬組成物
本発明に係る血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質または血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲートは、を有する用途にを有することができ、例えば、出血性疾患を予防及び／又は治療するために使用することを有する。従って、本発明は、出血性疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、治療有効量の本発明の融合タンパク質またはコンジュゲート、及び任意選択的に薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物をさらに提供する。好ましくは、前記医薬組成物は、出血性疾患を予防及び／又は治療するために使用される。より好ましくは、ＦＩＸ先天性または後天性欠損症の患者における出血性疾患及び血友病Ｂ患者における自発的または手術による出血から選ばれる疾患に使用される。

本発明に係る融合タンパク質又はコンジュゲートの治療有效量は、投与経路、対象のタイプ及び検討中の特定の哺乳動物の体の特徴によって決まる。それらの要因及びそれらの量の関係を決めるのは、医薬分野の当業者によく知られている。その量及び投与方法は、ペプチドを対象に送達するための最適な効力を達成するように調整することができる。それより、ペプチドを被検者へ送達するが、医薬分野の当業者によく知られている体重、食事、併用薬および他の要因によって決まる。

本発明の医薬組成物は、併用療法で、即ち、一種又は複数種の他の薬剤と組み合わせて投与することができ、ここで、前記治療剤は一緒にまたは連続して投与される。幾つの別実施形態でおいて、前記他の薬剤は、一種又は複数種の本発明に係る融合タンパク質、コンジュゲート、又はその医薬組成物の投与前、投与中、又は投与後に投与することができる。

本明細書で使用される「薬学的に許容されるキャリア」、「薬学的に許容されるキャリア」又は「生理学的に許容されるキャリア」は、交換可能に使用することができ、任意及びすべての生理学的に適合性のある塩、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤や抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などのうちの一種又は複数がを含む。いくつかの実施形態においては、前記キャリアは、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例え、注射または注入による）に適する。投与経路によっては、酸、及び該治療剤を不活性化する可能性のある他の自然条件から治療剤を保護するために、特定の材料で前記治療剤をコーティングすることができる。

投与時に、本発明に係る医薬品製剤は、薬学的に許容される量で薬学的に許容される組成物に投与される。「薬学的に許容される」という用語は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨げない非毒性物質を意味する。このような製剤は、一般に、塩、バッファ、防腐剤、適合キャリア、及び任意選択で他の治療剤を含み、例えば、アジュバント、ケモカイン及びサイトカインを含む補助免疫増強剤が挙げられる。医薬品に使用される場合、前記塩は、薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩は、その薬学的に許容される塩の製造のために便利に使用でき、本発明の範囲から除外されないことに留意されたい。

必要であれば、本発明に係る血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質又は血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲートは、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせることができる。本明細書で使用される「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、ヒトなどの哺乳動物への投与に適した、一種又は複数種の適合性のある固体又は液体の充填剤、希釈剤、またはカプセル化物質を指す。「キャリア」という用語は、使いやすさのために有効成分と組み合わされた、有機または無機、天然または合成の成分を意味する。医薬組成物の成分は、所望の薬物の治療効果を著しく破壊する可能性のある相互作用がない形態でブレンドすることができる。

好ましくは、本発明に係る医薬組成物は、緩衝系を含むことができる。前記緩衝系が約３．０から約６．０のｐＨを有する酢酸塩緩衝液、または約５．０から約９．０のｐＨを有するリン酸塩緩衝液であることが好ましい。いくつかの実施形態においては、適切な緩衝剤には、酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、又はリン酸塩が含まれる。好

任意選択的に、前記薬用組成物は、例えば、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラオキシ安息香酸エステル類及びチメロサールなどの適切な防腐剤を含むこともできる。

前記薬用組成物は、単位剤形で都合よく存在することができ、医薬分野で周知の任意的な方法によって調製することができる。すべての方法は、前記活性剤を一種又は複数種の付属成分を含むキャリアと組み合わせるステップを含む。一般に、前記組成物は、前記活性化合物を液体キャリア、細かく分割された固体キャリア、又はその両方と均一かつ密接に組み合わせ、続いて必要に応じて製品を成形することにより調製される。

非経口投与に適した医薬組成物は、一種又は複数種の融合タンパク質又はコンジュゲートを含む無菌水性製剤又は非水性製剤とすることができる。いくつかの実施形態においては、前記製剤は、被検者の血液と等張である。該製剤は、既知の方法に従って適切な分散剤または湿潤剤及び沈殿防止剤を使用して調製することができる。前記無菌注射製剤は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射溶液又は懸濁液、１，３－ブタンジオール中の溶液であってもよい。使用できる許容可能なキャリア及び溶媒には、水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。また、従来、滅菌非揮発性油が溶媒または懸濁媒体として使用される。そして、合成されたモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の穏やかな非揮発性油を使用することができる。また、オレイン酸などの脂肪酸を注射製剤に使用することができる。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に適したキャリア処方は、先行技術の参考書を参照することにより得ることができる。

本発明に係る融合タンパク質又はコンジュゲートは、急速放出からそれを保護するキャリアと一緒に製造することができ、例えば、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達システムを含む放出制御製剤とする。例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの生分解性ポリマー、生体適合性ポリマーを使用できる。このような処方を調製する多くの方法は、先行技術で知られている。

本発明の医薬組成物は、注射または経時的な漸進的注入を含む、任意の従来の経路によって投与することができる。前記投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、腫瘍内、又は経皮であることができる。

本発明に係る医薬組成物は、有効量で投与される。「有効量」とは、本明細書で提供される任意の融合タンパク質またはコンジュゲートの量であり、単独で、又は、さらなる用量及び／又は他の治療剤と一緒に所望の応答を生じる。

もちろん、そのような量は、治療されている特定の疾患、前記疾患の重症度、患者個体のパラメータ（年齢、生理的状態、身長および体重などを含む）、続けた治療期間、同時に行う治療の性質（もしあれば）、具体的な投与経路及び医療従事者の知識の範囲内の同様の要因によって決まる。それらの要因が当業者によく知られており、通常の実験を行われば知られる。一般的には、各成分又はそれらの組み合わせの最大用量、即ち、合理的な医学的判断に基づく最高の安全用量を使用することが好ましい。ただし、当業者は、患者が医学的理由、心理的理由、又は基本的に他の何らかの理由のためにより低い用量又は許容用量を必要とすることを理解されることができる。

前述の方法で使用される医薬組成物は、好ましくは無菌であり、また、血糖の低下のような所望の応答を生じるために、患者への投与に適した重量単位または体積単位で有効量の融合タンパク質またはコンジュゲートを単独又は他の製剤と組み合わせて含む。

被検者に投与される融合タンパク質またはコンジュゲートの用量は、パラメーターによって、特に、使用される投与モードおよび被検者の状態に従って選択することができる。その他の要因には、必要な治療期間を含む。適用された最初の用量で被検者の応答が不十分である場合、患者に許容可能な範囲内により高い用量（または、より局所化された異なる送達経路を介して達成される効果的な更なる高用量）を適用できる。

いくつかの実施形態において、前記血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質及び／又は血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲートの用量範囲は、３０ｍｇ／ｋｇ体重／日～０．００００１ｍｇ／ｋｇ体重／日、３ｍｇ／ｋｇ／日～０．０００１ｍｇ／ｋｇ／日、又は０．３ｍｇ／ｋｇ／日～０．０１ｍｇ／ｋｇ／日であることができる。

いくつかの実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質を０．２０ｍｇ／ｍｌ～５ｍｇ／ｍｌ含み、及び／又は血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲートを４ｍｇ／ｍｌ～４０ｍｇ／ｍｌ含む。好ましくは、血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質を０．２０ｍｇ／ｍｌ～５ｍｇ／ｍｌ含み、及び／又は血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲートを４ｍｇ／ｍｌ～４０ｍｇ／ｍｌ含む。より好ましくは、血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質を０．５ｍｇ／ｍｌ～２ｍｇ／ｍｌ含み、及び／又は血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲートを１０ｍｇ／ｍｌ～２０ｍｇ／ｍｌ含む。一般的には、本発明に係る血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質又は血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲートの用量範囲は、約１０μｇ／ｋｇ患者の体重～約１００，０００μｇ／ｋｇ患者の体重であることができる。いくつかの実施形態においては、前記用量範囲は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇであることができる。幾つの別実施形態において、前記用量範囲は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇであることができる。幾つの別実施形態において、前記用量範囲は約１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ、又は１５ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇであることができる。幾つの別実施形態において、前記用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態において、前記用量は、約１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ又は６ｍｇ／ｋｇである。前記組成物は、前記用量で連続的に（例えば、連続ポンプにより）、または定期的な間隔で送達することができる。いくつかの実施形態においては、静脈内投与される場合、本発明に係る血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質又は血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲートの用量は、０．１～２０ｍｇ／ｋｇ又はその中のいずれかの値であることができる。特定の組成物を複数回に投与する場合のベスト時間間隔は、過度の実験なしに当業者によって決めることができる。提供される組成物の他の投与計画は、当業者に知られており、その用量、投与スケジュール、投与部位、投与モードなどが前記したのと異なっても構わない。一実施形態において、前記用量で静脈内投与する。別の実施形態において、薬剤投与計画は、単回静脈内投与とする。

血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質又は血液凝固第ＩＸ因子融合タンパク質コンジュゲート（例如在医薬組成物中）及び取扱説明書を含むキットも本発明の範囲内に包含する。前記キットは、また、少なくとも１つの他の薬剤を含有することができ、例えば、出血性疾患を予防及び／又は治療するための一種又は複数種の他の薬剤を含有する。別の実施形態において、キットは、１つ又は複数の容器装置や一連の容器装置（例えば、試験管、管、フラスコ、ボトル、注射器）をその中に緊密に固定するために区画化されたキャリアを含むことができる。前記キットの成分は、水性媒体中にパッケージ化するか、または凍結乾燥形態とすることができる。

本明細書で提供される組成物は、凍結乾燥形態であるか、又は水性媒体中で提供することができる。

前記被検者が脊椎動物であることが好ましく、哺乳動物であることがより好ましく、人であることが最も好ましい。但し、自家飼育動物（犬、猫など）、家畜（ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）又は実験動物（サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）といった他の動物であってもよい。

「改善された循環半減期」または「延長された循環半減期」という用語は、野生型第ＩＸ因子分子と比べ、本発明の分子が変化した循環半減期、好ましくは増加した循環半減期を有することを指す。循環半減期は、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも４５％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも１００％、より好ましくは少なくとも１２５％、より好ましくは少なくとも１５０％、より好ましくは少なくとも１７５％、より好ましくは少なくとも２００％、及び、最も好ましくは少なくとも２５０％または３００％増加する。さらにより好ましくは、前記分子の循環半減期は、少なくとも４００％、５００％、６００％、または、さらには７００％増加する。

本発明は、以下の実施例によってさらに説明するが、いかにも更なる制限として解釈されるべきではない。本出願で引用されたすべての参照文献は、（論文の参照、特許を受けた特許、公開された特許出願、および審査中の特許出願を包含する）、その全内容を参照により本明細書に明示的に組み込まれる。以下の実施例では、特に具体的な指示がない限り、使用される試薬および材料は、少なくとも分析純度または同等レベルを有する市販品である。

実施例１ 融合タンパク質ＦＩＸ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐの調製
１．発現ベクターの構築
本実施例で構築されたＦＩＸ融合タンパク質は、共通の分子構造：ＦＩＸ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ（但し、ＦＩＸはヒト由来の天然の血液凝固第ＩＸ因子を表し、その配列が配列番号１で示される）を有する。

Ｌ１は、ＦＩＸとＦｃとの間の第１のリンカーを表し、フレキシブルペプチド、またはフレキシブルペプチドと複数のプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）を基とした剛性構造で構成されるリンカーペプチドである。ここで、Ｌ１は、それぞれＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５及びＧＳで表される合計で６本の配列を使用し、それらの具体的な配列は以下の通りである。
Ｃ１：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡ （配列番号８）
Ｃ２：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号９）
Ｃ３：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡ（配列番号１０）
Ｃ４：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号１１）
Ｃ５：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号１２）
ＧＳ：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３）

Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１であり、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を低減するＮ２９７Ａ点変異（「Ｌｕｎｄ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＣＨ２ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＩｇＧ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ Ｆｃ ｇａｍｍａ Ｒ１１． Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２ Ｊａｎ；２９（１）：５３－９．」を参照）を持つ。

Ｌ２は、第２のリンカーとして、主にＦｃとソルターゼ酵素認識部位を分離するために使用される。具体的には、本実施例におけるＬ２の配列がＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号１６）である。

Ｐは、ソルターゼ酵素認識部位を含むアミノ酸配列断片であった。

本実施例で構築された各ＦＩＸ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ融合タンパク質をまとめた。

ＣＨＯ細胞で組換え発現されたＦＩＸの大半は、前駆体タンパク質として存在し、前駆体タンパク質のプロペプチド（ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）の約３０％だけ切断され、成熟したＦＩＸが形成した。成熟したＦＩＸの処理には、ＰＡＣＥ／フューリン酵素（ｆｕｒｉｎ）の関与が必要である。ここで、ＰＡＣＥ／ｆｕｒｉｎは、サブチリシン様、カルシウム依存性セリンプロペプチダーゼの一種であり、トランスゴルジ体に位置し、ＦＩＸ前駆体タンパク質におけるＲ４６のＣ末端を切断してＦＩＸ前駆体タンパク質の成熟ＦＩＸへの変換を触媒することができる。ＦＩＸの生産量及び確実に処理されることを改善するために、本実施例では、さらに図１Ａに示す構造のＦＩＸ／ＰＡＣＥ（フューリン）バイシストロン性発現ベクターを構築した。

ＦＩＸ／ＰＡＣＥ（フューリン）バイシストロン性発現ベクターの構築
ａ、ＰＡＣＥを発現する発現ベクターｐＦＲＬ－ｒＰＳの構築
ＰＡＣＥ／Ｆｕｒｉｎの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２５６０．１に参考した。まず、その１～７１５番目のアミノ酸のコード配列（配列番号１７）は、発現宿主に対してコドン最適化され、全遺伝子合成により、キャリアｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローン化した。構築したプラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ－ＳＯＬ（上海捷瑞生物工程有限公司）と名付けた。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－Ｐ－ＳＯＬをテンプレートとして使用し、プライマーＦ１及びＲ１（その配列は後文に示す）を使用してＰＣＲ増幅を行い、プロモーターＳＶ４０、ＰＡＣＥ／Ｆｕｒｉｎ遺伝子及びＰｏｌｙＡを含む遺伝子発現カセットを得、両端でのＢｇｌＩＩ制限酵素切断部位を通じてＢａｍＨＩで単一消化されたｐＦＲＬ－ＤＨＦＲベクターに連結した。陽性クローンを選択し、シークエンシングによって検証し、ベクターをｐＦＲＬ－ｒＰＳと名付けた。

Ｆ１：５’－ＴＣＡＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＧＣＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴ－３’（配列番号３０）；
Ｒ１：５’－ＴＡＴＣＣＴＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＧＡＣ Ｔ－３’（配列番号３１）

ＰＡＣＥ／Ｆｕｒｉｎの１－７１５番目のアミノ酸配列は、以下の通りである：
ＭＥＬＲＰＷＬＬＷＶＶＡＡＴＧＴＬＶＬＬＡＡＤＡＱＧＱＫＶＦＴＮＴＷＡＶＲＩＰＧＧＰＡＶＡＮＳＶＡＲＫＨＧＦＬＮＬＧＱＩＦＧＤＹＹＨＦＷＨＲＧＶＴＫＲＳＬＳＰＨＲＰＲＨＳＲＬＱＲＥＰＱＶＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲＤＶＹＱＥＰＴＤＰＫＦＰＱＱＷＹＬＳＧＶＴＱＲＤＬＮＶＫＡＡＷＡＱＧＹＴＧＨＧＩＶＶＳＩＬＤＤＧＩＥＫＮＨＰＤＬＡＧＮＹＤＰＧＡＳＦＤＶＮＤＱＤＰＤＰＱＰＲＹＴＱＭＮＤＮＲＨＧＴＲＣＡＧＥＶＡＡＶＡＮＮＧＶＣＧＶＧＶＡＹＮＡＲＩＧＧＶＲＭＬＤＧＥＶＴＤＡＶＥＡＲＳＬＧＬＮＰＮＨＩＨＩＹＳＡＳＷＧＰＥＤＤＧＫＴＶＤＧＰＡＲＬＡＥＥＡＦＦＲＧＶＳＱＧＲＧＧＬＧＳＩＦＶＷＡＳＧＮＧＧＲＥＨＤＳＣＮＣＤＧＹＴＮＳＩＹＴＬＳＩＳＳＡＴＱＦＧＮＶＰＷＹＳＥＡＣＳＳＴＬＡＴＴＹＳＳＧＮＱＮＥＫＱＩＶＴＴＤＬＲＱＫＣＴＥＳＨＴＧＴＳＡＳＡＰＬＡＡＧＩＩＡＬＴＬＥＡＮＫＮＬＴＷＲＤＭＱＨＬＶＶＱＴＳＫＰＡＨＬＮＡＮＤＷＡＴＮＧＶＧＲＫＶＳＨＳＹＧＹＧＬＬＤＡＧＡＭＶＡＬＡＱＮＷＴＴＶＡＰＱＲＫＣＩＩＤＩＬＴＥＰＫＤＩＧＫＲＬＥＶＲＫＴＶＴＡＣＬＧＥＰＮＨＩＴＲＬＥＨＡＱＡＲＬＴＬＳＹＮＲＲＧＤＬＡＩＨＬＶＳＰＭＧＴＲＳＴＬＬＡＡＲＰＨＤＹＳＡＤＧＦＮＤＷＡＦＭＴＴＨＳＷＤＥＤＰＳＧＥＷＶＬＥＩＥＮＴＳＥＡＮＮＹＧＴＬＴＫＦＴＬＶＬＹＧＴＡＰＥＧＬＰＶＰＰＥＳＳＧＣＫＴＬＴＳＳＱＡＣＶＶＣＥＥＧＦＳＬＨＱＫＳＣＶＱＨＣＰＰＧＦＡＰＱＶＬＤＴＨＹＳＴＥＮＤＶＥＴＩＲＡＳＶＣＡＰＣＨＡＳＣＡＴＣＱＧＰＡＬＴＤＣＬＳＣＰＳＨＡＳＬＤＰＶＥＱＴＣＳＲＱＳＱＳＳＲＥＳＰＰＱＱＱＰＰＲＬＰＰＥＶＥＡＧＱＲＬＲＡＧＬＬＰＳＨＬＰＥ（配列番号１７）

ｂ、各ＦＩＸ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐを発現するバイシストロン性発現ベクターの構築
ｂ１）ｐＦＲＬ－ｒＰＳ－ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ
ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐのコード核酸配列（即ちＦＩＸ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰにおけるＬ１の配列がＣ１であり、このようにする）をコドン最適化された後（アミノ酸配列は配列番号１８で示され、コドン最適化後の核酸コード配列は配列番号１９で示される）、上海捷瑞生物工程有限公司により全遺伝子合成し、また、それをＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ二重制限酵素切断部位を通じてｐＦＲＬ－ｒＰＳに連結し、ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ／Ｆｕｒｉｎを共発現するバイシストロン性発現ベクターｐＦＲＬ－ｒＰＳ－ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐを構築した。

ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐのアミノ酸配列：
ＭＱＲＶＮＭＩＭＡＥＳＰＧＬＩＴＩＣＬＬＧＹＬＬＳＡＥＣＴＶＦＬＤＨＥＮＡＮＫＩＬＮＲＰＫＲＹＮＳＧＫＬＥＥＦＶＱＧＮＬＥＲＥＣＭＥＥＫＣＳＦＥＥＡＲＥＶＦＥＮＴＥＲＴＴＥＦＷＫＱＹＶＤＧＤＱＣＥＳＮＰＣＬＮＧＧＳＣＫＤＤＩＮＳＹＥＣＷＣＰＦＧＦＥＧＫＮＣＥＬＤＶＴＣＮＩＫＮＧＲＣＥＱＦＣＫＮＳＡＤＮＫＶＶＣＳＣＴＥＧＹＲＬＡＥＮＱＫＳＣＥＰＡＶＰＦＰＣＧＲＶＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴＩＬＤＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦＴＲＶＶＧＧＥＤＡＫＰＧＱＦＰＷＱＶＶＬＮＧＫＶＤＡＦＣＧＧＳＩＶＮＥＫＷＩＶＴＡＡＨＣＶＥＴＧＶＫＩＴＶＶＡＧＥＨＮＩＥＥＴＥＨＴＥＱＫＲＮＶＩＲＩＩＰＨＨＮＹＮＡＡＩＮＫＹＮＨＤＩＡＬＬＥＬＤＥＰＬＶＬＮＳＹＶＴＰＩＣＩＡＤＫＥＹＴＮＩＦＬＫＦＧＳＧＹＶＳＧＷＧＲＶＦＨＫＧＲＳＡＬＶＬＱＹＬＲＶＰＬＶＤＲＡＴＣＬＲＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨＥＧＧＲＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＨＶＴＥＶＥＧＴＳＦＬＴＧＩＩＳＷＧＥＥＣＡＭＫＧＫＹＧＩＹＴＫＶＳＲＹＶＮＷＩＫＥＫＴＫＬＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＧ（配列番号１８）

ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐの核酸コード配列：
ＡＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＡＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＴＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＧＣＡＧＡＧＴＧＴＡＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＧＣＡＡＡＴＡＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡＴＡＧＧＣＣＴＡＡＧＣＧＣＴＡＣＡＡＴＴＣＣＧＧＡＡＡＧＣＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＴＧＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＴＡＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＡＴＡＣＴＧＡＧＣＧＣＡＣＴＡＣＴＧＡＧＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＡＴＣＡＧＴＧＣＧＡＧＴＣＣＡＡＴＣＣＡＴＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡＴＴＣＴＴＡＣＧＡＧＴＧＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＴＣＧＧＣＴＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣＡＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＧＡＴＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＧＡＡＣＡＧＣＧＣＣＧＡＴＡＡＴＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＧＴＡＧＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＧＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧＴＧＡＧＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＧＡＣＡＣＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＴＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＴＡＡＴＡＴＴＡＣＴＣＡＧＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＡＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＣＧＴＧＣＴＣＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＣＧＣＡＴＴＴＴＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＡＴＣＧＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＧＣＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＣＧＴＧＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＴＴＡＧＡＡＣＴＡＧＡＴＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＴＣＣＴＡＴＴＴＧＴＡＴＣＧＣＣＧＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＴＴＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＣＧＧＧＴＧＴＴＴＣＡＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＴＣＣＧＣＡＣＴＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＣＧＧＧＴＧＣＣＡＣＴＧＧＴＧＧＡＴＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＣＴＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴＧＴＴＴＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＴＴＣＡＣＧＡＧＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＣＡＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＣＴＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＣＡＧＧＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＴＧＧＧＧＣＧＡＡＧＡＧＴＧＣＧＣＴＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＴＡＣＧＧＣＡＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＧＧＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＧＴＣＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＴＣＡＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＡＡＴＴＧＧＴＡＴＧＴＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＡＣＧＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＴＣＴＡＣＴＴＡＣＣＧＧＧＴＣＧＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＴＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＣＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＴＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＣＧＡＴＡＧＣＧＡＣＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＧＧＣＧＧＡＴＧＡ（配列番号１９）

ｂ２） ｐＦＲＬ－ｒＰＳ－ＦＩＸ－Ｃ２－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ
ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐのコード配列をテンプレートとし、Ｃ２をプライマー５’末端に付加し、ＰＣＲによりＦｃ－Ｌ２－Ｐを増幅することで、Ｃ２－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ配列を得た。前記ＰＣＲ増幅に使用したプライマーＦ２及びＲ２配列は以下の通りである。
フォワードプライマーＦ２：５’－ＴＴＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＡＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣ－３’（配列番号３２）、
リバースプライマーＲ２：５’－ＴＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＣＣＧＣＣＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴ－３’（配列番号３３）。

続いて、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ二重制限酵素切断部位を使用して、ベクターｐＦＲＬ－ｒＰＳ－ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰにおけるＣ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ配列を増幅産物Ｃ２－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐに置き換えることで、ＦＩＸ－Ｃ２－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ／Ｆｕｒｉｎを共発現するバイシストロン性発現ベクターｐＦＲＬ－ｒＰＳ－ＦＩＸ－Ｃ２－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐを得た。

ＦＩＸ－Ｃ２－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐのアミノ酸配列：
ＭＱＲＶＮＭＩＭＡＥＳＰＧＬＩＴＩＣＬＬＧＹＬＬＳＡＥＣＴＶＦＬＤＨＥＮＡＮＫＩＬＮＲＰＫＲＹＮＳＧＫＬＥＥＦＶＱＧＮＬＥＲＥＣＭＥＥＫＣＳＦＥＥＡＲＥＶＦＥＮＴＥＲＴＴＥＦＷＫＱＹＶＤＧＤＱＣＥＳＮＰＣＬＮＧＧＳＣＫＤＤＩＮＳＹＥＣＷＣＰＦＧＦＥＧＫＮＣＥＬＤＶＴＣＮＩＫＮＧＲＣＥＱＦＣＫＮＳＡＤＮＫＶＶＣＳＣＴＥＧＹＲＬＡＥＮＱＫＳＣＥＰＡＶＰＦＰＣＧＲＶＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴＩＬＤＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦＴＲＶＶＧＧＥＤＡＫＰＧＱＦＰＷＱＶＶＬＮＧＫＶＤＡＦＣＧＧＳＩＶＮＥＫＷＩＶＴＡＡＨＣＶＥＴＧＶＫＩＴＶＶＡＧＥＨＮＩＥＥＴＥＨＴＥＱＫＲＮＶＩＲＩＩＰＨＨＮＹＮＡＡＩＮＫＹＮＨＤＩＡＬＬＥＬＤＥＰＬＶＬＮＳＹＶＴＰＩＣＩＡＤＫＥＹＴＮＩＦＬＫＦＧＳＧＹＶＳＧＷＧＲＶＦＨＫＧＲＳＡＬＶＬＱＹＬＲＶＰＬＶＤＲＡＴＣＬＲＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨＥＧＧＲＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＨＶＴＥＶＥＧＴＳＦＬＴＧＩＩＳＷＧＥＥＣＡＭＫＧＫＹＧＩＹＴＫＶＳＲＹＶＮＷＩＫＥＫＴＫＬＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＧ（配列番号２０）

ＦＩＸ－Ｃ２－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐの核酸コード配列：
ＡＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＡＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＴＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＧＣＡＧＡＧＴＧＴＡＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＧＣＡＡＡＴＡＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡＴＡＧＧＣＣＴＡＡＧＣＧＣＴＡＣＡＡＴＴＣＣＧＧＡＡＡＧＣＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＴＧＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＴＡＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＡＴＡＣＴＧＡＧＣＧＣＡＣＴＡＣＴＧＡＧＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＡＴＣＡＧＴＧＣＧＡＧＴＣＣＡＡＴＣＣＡＴＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡＴＴＣＴＴＡＣＧＡＧＴＧＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＴＣＧＧＣＴＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣＡＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＧＡＴＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＧＡＡＣＡＧＣＧＣＣＧＡＴＡＡＴＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＧＴＡＧＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＧＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧＴＧＡＧＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＧＡＣＡＣＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＴＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＴＡＡＴＡＴＴＡＣＴＣＡＧＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＡＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＣＧＴＧＣＴＣＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＣＧＣＡＴＴＴＴＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＡＴＣＧＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＧＣＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＣＧＴＧＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＴＴＡＧＡＡＣＴＡＧＡＴＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＴＣＣＴＡＴＴＴＧＴＡＴＣＧＣＣＧＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＴＴＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＣＧＧＧＴＧＴＴＴＣＡＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＴＣＣＧＣＡＣＴＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＣＧＧＧＴＧＣＣＡＣＴＧＧＴＧＧＡＴＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＣＴＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴＧＴＴＴＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＴＴＣＡＣＧＡＧＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＣＡＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＣＴＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＣＡＧＧＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＴＧＧＧＧＣＧＡＡＧＡＧＴＧＣＧＣＴＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＴＡＣＧＧＣＡＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＧＧＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＧＴＣＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＡＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＡＡＴＴＧＧＴＡＴＧＴＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＡＣＧＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＴＣＴＡＣＴＴＡＣＣＧＧＧＴＣＧＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＴＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＣＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＴＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＣＧＡＴＡＧＣＧＡＣＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＧＧＣＧＧＡＴＡＡ（配列番号２１）

ｂ３）ｐＦＲＬ－ｒＰＳ－ＦＩＸ－Ｃ３－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐの構築
ｐＦＲＬ－ｒＰＳ－ＦＩＸ－Ｃ２－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐと同様な方法でベクターを構築した。ここで、Ｃ３－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐコード配列を増幅するためのＰＣＲプライマーは、フォワードプライマーＦ３：５’－ＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣ－３’（配列番号３４）、及びＦ４：５’－ＴＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣ－３’（配列番号３５）、並びにリバースプライマーＲ３：５’－ＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＣＣＧＣＣＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧ－３’（配列番号３６）を含む。２ラウンドのＰＣＲ増幅によりＣ３－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ遺伝子を得た。

ＦＩＸ－Ｃ３－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐのアミノ酸配列：
ＭＱＲＶＮＭＩＭＡＥＳＰＧＬＩＴＩＣＬＬＧＹＬＬＳＡＥＣＴＶＦＬＤＨＥＮＡＮＫＩＬＮＲＰＫＲＹＮＳＧＫＬＥＥＦＶＱＧＮＬＥＲＥＣＭＥＥＫＣＳＦＥＥＡＲＥＶＦＥＮＴＥＲＴＴＥＦＷＫＱＹＶＤＧＤＱＣＥＳＮＰＣＬＮＧＧＳＣＫＤＤＩＮＳＹＥＣＷＣＰＦＧＦＥＧＫＮＣＥＬＤＶＴＣＮＩＫＮＧＲＣＥＱＦＣＫＮＳＡＤＮＫＶＶＣＳＣＴＥＧＹＲＬＡＥＮＱＫＳＣＥＰＡＶＰＦＰＣＧＲＶＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴＩＬＤＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦＴＲＶＶＧＧＥＤＡＫＰＧＱＦＰＷＱＶＶＬＮＧＫＶＤＡＦＣＧＧＳＩＶＮＥＫＷＩＶＴＡＡＨＣＶＥＴＧＶＫＩＴＶＶＡＧＥＨＮＩＥＥＴＥＨＴＥＱＫＲＮＶＩＲＩＩＰＨＨＮＹＮＡＡＩＮＫＹＮＨＤＩＡＬＬＥＬＤＥＰＬＶＬＮＳＹＶＴＰＩＣＩＡＤＫＥＹＴＮＩＦＬＫＦＧＳＧＹＶＳＧＷＧＲＶＦＨＫＧＲＳＡＬＶＬＱＹＬＲＶＰＬＶＤＲＡＴＣＬＲＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨＥＧＧＲＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＨＶＴＥＶＥＧＴＳＦＬＴＧＩＩＳＷＧＥＥＣＡＭＫＧＫＹＧＩＹＴＫＶＳＲＹＶＮＷＩＫＥＫＴＫＬＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＧ（配列番号２２）

ＦＩＸ－Ｃ３－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐの核酸コード配列：
ＡＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＡＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＴＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＧＣＡＧＡＧＴＧＴＡＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＧＣＡＡＡＴＡＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡＴＡＧＧＣＣＴＡＡＧＣＧＣＴＡＣＡＡＴＴＣＣＧＧＡＡＡＧＣＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＴＧＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＴＡＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＡＴＡＣＴＧＡＧＣＧＣＡＣＴＡＣＴＧＡＧＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＡＴＣＡＧＴＧＣＧＡＧＴＣＣＡＡＴＣＣＡＴＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡＴＴＣＴＴＡＣＧＡＧＴＧＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＴＣＧＧＣＴＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣＡＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＧＡＴＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＧＡＡＣＡＧＣＧＣＣＧＡＴＡＡＴＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＧＴＡＧＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＧＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧＴＧＡＧＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＧＡＣＡＣＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＴＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＴＡＡＴＡＴＴＡＣＴＣＡＧＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＡＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＣＧＴＧＣＴＣＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＣＧＣＡＴＴＴＴＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＡＴＣＧＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＧＣＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＣＧＴＧＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＴＴＡＧＡＡＣＴＡＧＡＴＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＴＣＣＴＡＴＴＴＧＴＡＴＣＧＣＣＧＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＴＴＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＣＧＧＧＴＧＴＴＴＣＡＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＴＣＣＧＣＡＣＴＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＣＧＧＧＴＧＣＣＡＣＴＧＧＴＧＧＡＴＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＣＴＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴＧＴＴＴＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＴＴＣＡＣＧＡＧＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＣＡＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＣＴＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＣＡＧＧＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＴＧＧＧＧＣＧＡＡＧＡＧＴＧＣＧＣＴＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＴＡＣＧＧＣＡＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＧＧＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＧＴＣＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＴＣＡＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＡＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＡＡＴＴＧＧＴＡＴＧＴＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＡＣＧＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＴＣＴＡＣＴＴＡＣＣＧＧＧＴＣＧＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＴＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＣＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＴＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＣＧＡＴＡＧＣＧＡＣＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＧＧＣＧＧＡＴＧＡ（配列番号２３）

ｂ４）ｐＦＲＬ－ｒＰＳ－ＦＩＸ－Ｃ４－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐの構築
ｐＦＲＬ－ｒＰＳ－ＦＩＸ－Ｃ２－Ｆｃ－Ｐと同様な方法で構築を行った。ここで、Ｃ４－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーは、フォワードプライマーＦ５：５’－ＣＣＣＴＧＴＣＡＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣ－３’（配列番号３７）、及びＦ６：５’－ＴＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＴＣＡＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣ－３’（配列番号３８）、並びにリバースプライマーＲ３を含む。２ラウンドのＰＣＲ増幅によりＣ４－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ遺伝子を得た。

ＦＩＸ－Ｃ４－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐのアミノ酸配列
ＭＱＲＶＮＭＩＭＡＥＳＰＧＬＩＴＩＣＬＬＧＹＬＬＳＡＥＣＴＶＦＬＤＨＥＮＡＮＫＩＬＮＲＰＫＲＹＮＳＧＫＬＥＥＦＶＱＧＮＬＥＲＥＣＭＥＥＫＣＳＦＥＥＡＲＥＶＦＥＮＴＥＲＴＴＥＦＷＫＱＹＶＤＧＤＱＣＥＳＮＰＣＬＮＧＧＳＣＫＤＤＩＮＳＹＥＣＷＣＰＦＧＦＥＧＫＮＣＥＬＤＶＴＣＮＩＫＮＧＲＣＥＱＦＣＫＮＳＡＤＮＫＶＶＣＳＣＴＥＧＹＲＬＡＥＮＱＫＳＣＥＰＡＶＰＦＰＣＧＲＶＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴＩＬＤＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦＴＲＶＶＧＧＥＤＡＫＰＧＱＦＰＷＱＶＶＬＮＧＫＶＤＡＦＣＧＧＳＩＶＮＥＫＷＩＶＴＡＡＨＣＶＥＴＧＶＫＩＴＶＶＡＧＥＨＮＩＥＥＴＥＨＴＥＱＫＲＮＶＩＲＩＩＰＨＨＮＹＮＡＡＩＮＫＹＮＨＤＩＡＬＬＥＬＤＥＰＬＶＬＮＳＹＶＴＰＩＣＩＡＤＫＥＹＴＮＩＦＬＫＦＧＳＧＹＶＳＧＷＧＲＶＦＨＫＧＲＳＡＬＶＬＱＹＬＲＶＰＬＶＤＲＡＴＣＬＲＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨＥＧＧＲＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＨＶＴＥＶＥＧＴＳＦＬＴＧＩＩＳＷＧＥＥＣＡＭＫＧＫＹＧＩＹＴＫＶＳＲＹＶＮＷＩＫＥＫＴＫＬＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＧ（配列番号２４）

ＦＩＸ－Ｃ４－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐの核酸コード配列
ＡＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＡＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＴＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＧＣＡＧＡＧＴＧＴＡＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＧＣＡＡＡＴＡＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡＴＡＧＧＣＣＴＡＡＧＣＧＣＴＡＣＡＡＴＴＣＣＧＧＡＡＡＧＣＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＴＧＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＴＡＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＡＴＡＣＴＧＡＧＣＧＣＡＣＴＡＣＴＧＡＧＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＡＴＣＡＧＴＧＣＧＡＧＴＣＣＡＡＴＣＣＡＴＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡＴＴＣＴＴＡＣＧＡＧＴＧＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＴＣＧＧＣＴＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣＡＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＧＡＴＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＧＡＡＣＡＧＣＧＣＣＧＡＴＡＡＴＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＧＴＡＧＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＧＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧＴＧＡＧＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＧＡＣＡＣＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＴＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＴＡＡＴＡＴＴＡＣＴＣＡＧＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＡＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＣＧＴＧＣＴＣＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＣＧＣＡＴＴＴＴＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＡＴＣＧＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＧＣＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＣＧＴＧＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＴＴＡＧＡＡＣＴＡＧＡＴＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＴＣＣＴＡＴＴＴＧＴＡＴＣＧＣＣＧＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＴＴＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＣＧＧＧＴＧＴＴＴＣＡＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＴＣＣＧＣＡＣＴＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＣＧＧＧＴＧＣＣＡＣＴＧＧＴＧＧＡＴＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＣＴＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴＧＴＴＴＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＴＴＣＡＣＧＡＧＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＣＡＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＣＴＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＣＡＧＧＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＴＧＧＧＧＣＧＡＡＧＡＧＴＧＣＧＣＴＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＴＡＣＧＧＣＡＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＧＧＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＧＴＣＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＴＣＡＧＡＣＴＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＡＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＡＡＴＴＧＧＴＡＴＧＴＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＡＣＧＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＴＣＴＡＣＴＴＡＣＣＧＧＧＴＣＧＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＴＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＣＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＴＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＣＧＡＴＡＧＣＧＡＣＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＧＧＣＧＧＡＴＧＡ（配列番号２５）

ｂ５）ｐＦＲＬ－ｒＰＳ－ＦＩＸ－Ｃ５－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐの構築
ＦＩＸ－Ｃ２－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐをテンプレートとして、ＰＣＲよりＦＩＸ－Ｃ２配列断片（フォワードプライマーＦ７：５’－ＡＴＡＴＡＡＧＣＴＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＧＣＧＣ－３’（配列番号３９）、リバースプライマーＲ４：５’－ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣ－３’（配列番号４０））を増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ二重制限酵素切断部位を通じてベクターｐＦＲＬ－ｒＰＳ－ＦＩＸ－Ｃ２－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐにクローン化し、ＦＩＸ－Ｃ５－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ／Ｆｕｒｉｎを共発現するバイシストロン性発現ベクターｐＦＲＬ－ｒＰＳ－ＦＩＸ－Ｃ５－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ（Ｃ５は、実際に２つのＣ２のタンデムである）を得た。

ＦＩＸ－Ｃ５－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐのアミノ酸配列：
ＭＱＲＶＮＭＩＭＡＥＳＰＧＬＩＴＩＣＬＬＧＹＬＬＳＡＥＣＴＶＦＬＤＨＥＮＡＮＫＩＬＮＲＰＫＲＹＮＳＧＫＬＥＥＦＶＱＧＮＬＥＲＥＣＭＥＥＫＣＳＦＥＥＡＲＥＶＦＥＮＴＥＲＴＴＥＦＷＫＱＹＶＤＧＤＱＣＥＳＮＰＣＬＮＧＧＳＣＫＤＤＩＮＳＹＥＣＷＣＰＦＧＦＥＧＫＮＣＥＬＤＶＴＣＮＩＫＮＧＲＣＥＱＦＣＫＮＳＡＤＮＫＶＶＣＳＣＴＥＧＹＲＬＡＥＮＱＫＳＣＥＰＡＶＰＦＰＣＧＲＶＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴＩＬＤＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦＴＲＶＶＧＧＥＤＡＫＰＧＱＦＰＷＱＶＶＬＮＧＫＶＤＡＦＣＧＧＳＩＶＮＥＫＷＩＶＴＡＡＨＣＶＥＴＧＶＫＩＴＶＶＡＧＥＨＮＩＥＥＴＥＨＴＥＱＫＲＮＶＩＲＩＩＰＨＨＮＹＮＡＡＩＮＫＹＮＨＤＩＡＬＬＥＬＤＥＰＬＶＬＮＳＹＶＴＰＩＣＩＡＤＫＥＹＴＮＩＦＬＫＦＧＳＧＹＶＳＧＷＧＲＶＦＨＫＧＲＳＡＬＶＬＱＹＬＲＶＰＬＶＤＲＡＴＣＬＲＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨＥＧＧＲＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＨＶＴＥＶＥＧＴＳＦＬＴＧＩＩＳＷＧＥＥＣＡＭＫＧＫＹＧＩＹＴＫＶＳＲＹＶＮＷＩＫＥＫＴＫＬＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＧ（配列番号２６）

ＦＩＸ－Ｃ５－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐの核酸コード配列：
ＡＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＡＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＴＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＧＣＡＧＡＧＴＧＴＡＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＧＣＡＡＡＴＡＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡＴＡＧＧＣＣＴＡＡＧＣＧＣＴＡＣＡＡＴＴＣＣＧＧＡＡＡＧＣＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＴＧＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＴＡＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＡＴＡＣＴＧＡＧＣＧＣＡＣＴＡＣＴＧＡＧＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＡＴＣＡＧＴＧＣＧＡＧＴＣＣＡＡＴＣＣＡＴＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡＴＴＣＴＴＡＣＧＡＧＴＧＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＴＣＧＧＣＴＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣＡＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＧＡＴＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＧＡＡＣＡＧＣＧＣＣＧＡＴＡＡＴＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＧＴＡＧＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＧＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧＴＧＡＧＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＧＡＣＡＣＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＴＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＴＡＡＴＡＴＴＡＣＴＣＡＧＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＡＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＣＧＴＧＣＴＣＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＣＧＣＡＴＴＴＴＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＡＴＣＧＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＧＣＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＣＧＴＧＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＴＴＡＧＡＡＣＴＡＧＡＴＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＴＣＣＴＡＴＴＴＧＴＡＴＣＧＣＣＧＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＴＴＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＣＧＧＧＴＧＴＴＴＣＡＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＴＣＣＧＣＡＣＴＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＣＧＧＧＴＧＣＣＡＣＴＧＧＴＧＧＡＴＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＣＴＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴＧＴＴＴＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＴＴＣＡＣＧＡＧＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＣＡＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＣＴＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＣＡＧＧＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＴＧＧＧＧＣＧＡＡＧＡＧＴＧＣＧＣＴＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＴＡＣＧＧＣＡＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＧＧＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＧＴＣＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＣＴＧＡＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＡＡＴＴＧＧＴＡＴＧＴＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＡＣＧＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＴＣＴＡＣＴＴＡＣＣＧＧＧＴＣＧＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＴＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＣＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＴＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＣＧＡＴＡＧＣＧＡＣＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＧＧＣＧＧＡＴＡＡ（配列番号２７）

ｂ６）ｐＦＲＬ－ｒＰＳ－ＦＩＸ－ＧＳ－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐの構築
ｐＦＲＬ－ｒＰＳ－ＦＩＸ－Ｃ２－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐと同様な方法でＦＩＸ－ＧＳ－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ／Ｆｕｒｉｎを共発現するバイシストロン性発現ベクターｐＦＲＬ－ｒＰＳ－ＦＩＸ－ＧＳ－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐを構築した。ＰＣＲよりＦｃ－Ｌ２－Ｐ遺伝子を増幅するためのプライマーは、フォワードプライマーＦ８：５’－ＧＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧ－３’（配列番号４１）、リバースプライマーＲ５：５’－ＴＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＣＣＧＣＣＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴ－３’（配列番号４２）を含む。

ＦＩＸ－ＧＳ－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐのアミノ酸配列が以下の通りである。
ＭＱＲＶＮＭＩＭＡＥＳＰＧＬＩＴＩＣＬＬＧＹＬＬＳＡＥＣＴＶＦＬＤＨＥＮＡＮＫＩＬＮＲＰＫＲＹＮＳＧＫＬＥＥＦＶＱＧＮＬＥＲＥＣＭＥＥＫＣＳＦＥＥＡＲＥＶＦＥＮＴＥＲＴＴＥＦＷＫＱＹＶＤＧＤＱＣＥＳＮＰＣＬＮＧＧＳＣＫＤＤＩＮＳＹＥＣＷＣＰＦＧＦＥＧＫＮＣＥＬＤＶＴＣＮＩＫＮＧＲＣＥＱＦＣＫＮＳＡＤＮＫＶＶＣＳＣＴＥＧＹＲＬＡＥＮＱＫＳＣＥＰＡＶＰＦＰＣＧＲＶＳＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶＤＹＶＮＳＴＥＡＥＴＩＬＤＮＩＴＱＳＴＱＳＦＮＤＦＴＲＶＶＧＧＥＤＡＫＰＧＱＦＰＷＱＶＶＬＮＧＫＶＤＡＦＣＧＧＳＩＶＮＥＫＷＩＶＴＡＡＨＣＶＥＴＧＶＫＩＴＶＶＡＧＥＨＮＩＥＥＴＥＨＴＥＱＫＲＮＶＩＲＩＩＰＨＨＮＹＮＡＡＩＮＫＹＮＨＤＩＡＬＬＥＬＤＥＰＬＶＬＮＳＹＶＴＰＩＣＩＡＤＫＥＹＴＮＩＦＬＫＦＧＳＧＹＶＳＧＷＧＲＶＦＨＫＧＲＳＡＬＶＬＱＹＬＲＶＰＬＶＤＲＡＴＣＬＲＳＴＫＦＴＩＹＮＮＭＦＣＡＧＦＨＥＧＧＲＤＳＣＱＧＤＳＧＧＰＨＶＴＥＶＥＧＴＳＦＬＴＧＩＩＳＷＧＥＥＣＡＭＫＧＫＹＧＩＹＴＫＶＳＲＹＶＮＷＩＫＥＫＴＫＬＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＧ（配列番号２８）

ＦＩＸ－ＧＳ－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐの核酸コード配列が以下の通りである。
ＡＴＧＣＡＧＣＧＣＧＴＣＡＡＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＴＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＧＣＡＧＡＧＴＧＴＡＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＣＧＣＡＡＡＴＡＡＧＡＴＴＣＴＣＡＡＴＡＧＧＣＣＴＡＡＧＣＧＣＴＡＣＡＡＴＴＣＣＧＧＡＡＡＧＣＴＣＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＴＧＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＴＡＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＡＡＴＡＣＴＧＡＧＣＧＣＡＣＴＡＣＴＧＡＧＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＡＴＣＡＧＴＧＣＧＡＧＴＣＣＡＡＴＣＣＡＴＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡＴＴＣＴＴＡＣＧＡＧＴＧＴＴＧＧＴＧＣＣＣＡＴＴＣＧＧＣＴＴＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣＡＴＧＴＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＧＡＴＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＧＡＡＣＡＧＣＧＣＣＧＡＴＡＡＴＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＧＴＡＧＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＧＧＡＴＡＣＣＧＣＣＴＣＧＣＡＧＡＧＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧＴＧＡＧＣＣＣＧＣＴＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＴＧＧＣＣＧＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＧＡＣＡＣＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＴＧＴＣＡＡＣＴＣＴＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＴＴＣＴＣＧＡＴＡＡＴＡＴＴＡＣＴＣＡＧＴＣＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＡＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＣＧＴＧＣＴＣＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＣＧＣＡＴＴＴＴＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＡＴＣＧＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡＣＡＧＧＣＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＣＧＴＧＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＡＡＣＡＴＴＧＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＧＣＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＣＧＣＣＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＴＴＡＧＡＡＣＴＡＧＡＴＧＡＧＣＣＴＣＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧＴＣＡＣＴＣＣＴＡＴＴＴＧＴＡＴＣＧＣＣＧＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＡＣＴＡＡＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＴＴＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＣＧＧＧＴＧＴＴＴＣＡＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＴＣＣＧＣＡＣＴＣＧＴＧＣＴＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＣＧＧＧＴＧＣＣＡＣＴＧＧＴＧＧＡＴＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＴＣＣＧＧＴＣＴＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＡＴＡＴＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴＧＴＴＴＴＧＣＧＣＣＧＧＣＴＴＴＣＡＣＧＡＧＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＧＧＣＧＡＴＡＧＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＣＡＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＣＴＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＣＡＧＧＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＴＧＧＧＧＣＧＡＡＧＡＧＴＧＣＧＣＴＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＴＡＣＧＧＣＡＴＣＴＡＴＡＣＴＡＡＧＧＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＧＴＣＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＴＡＧＴＡＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＴＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＡＡＴＴＧＧＴＡＴＧＴＡＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＴＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＡＣＧＣＧＡＡＧＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＴＣＴＡＣＴＴＡＣＣＧＧＧＴＣＧＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＧＴＣＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＧＣＡＣＣＴＡＴＴＧＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡＴＣＡＧＧＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＴＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＣＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＡＣＴＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＣＧＡＴＡＧＣＧＡＣＧＧＴＴＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＴＧＡＴＡＡＧＴＣＴＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＴＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＣＧＧＣＧＧＡＴＡＡ（配列番号２９）

上記の異なるＦＩＸ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ／Ｆｕｒｉｎバイシストロン性発現ベクターの構造概略図は、図１Ａで示される。

ＧＧＣＸ及びＶＫＯＲＣｌ共発現ベクターの構築
ＦＩＸは、ビタミンＫ（ＶＫ）依存性糖タンパク質の一種であり、ＶＫの助けを借り、そのＮ末端Ｇｌａ領域におけるグルタミン酸残基がカルボキシル化され、γ－カルボキシグルタミン酸が生じるため、血液凝固活性を持つ。Ｇｌａ修飾においては、γ－グルタミルカルボキシラーゼ（ＧＧＣＸ）及びビタミンＫエポキシドレダクターゼ複合体サブユニットＩ（ＶＫＯＲＣｌ）が２つの肝要な酵素である。従って、本発明は、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－Ｈｙｇ－ＶＫＧＣを構築し、ＦＩＸとコトランスフォーメーションによって機能性ＦＩＸの発現レベルを増加させる。ｐｃＤＮＡ３．１－Ｈｙｇ－ＶＫＧＣプラスミドの構造は、図１Ｂに示され、以下のような方法で構築した：γグルタミルカルボキシラーゼ（ＧＧＣＸ）、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ複合体サブユニットＩ（ＶＫＯＲＣｌ）及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を全遺伝子合成し、まず、ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ二重制限酵素切断部位を通じてＩＲＥＳをベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ｈｙｇｒｏにクローン化し、プラスミドｐ３．１ｈｙｇ－ＩＲＥＳを構築し、その後、異なる二重制限酵素切断部位を通じて、ＶＫＯＲＣｌ遺伝子（ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ）及びＧＧＣＸ遺伝子（ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ）をｐ３．１ｈｙｇ－ＩＲＥＳにそれぞれクローン化し、ＧＧＣＸ及びＶＫＯＲＣｌの共発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１－Ｈｙｇ－ＶＫＧＣを構築した。

２．発現細胞株の構築
エレクトロポレーション法を使用し、以上で構築されたＦＩＸ融合タンパク質を発現するプラスミドを宿主細胞ＣＨＯ ＤＧ４４にトランスフェクトした。エレクトロポレーションの場合に、１×１０^７の細胞、４０μｇのＦＩＸ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ／Ｆｕｒｉｎ共発現プラスミド、２０μｇのｐｃＤＮＡ３．１－Ｈｙｇ－ＶＫＧＣ発現プラスミドを採取し、プラスミドと細胞を穏やかによく混合した後、エレクトロポレーションカップ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、４ｍｍ）に添加し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ（ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ ＸＣＥＬＬ）エレクトロポレーション装置を使用し、以下のようにエレクトロポレーションパラメーターを設定した。

エレクトロポレーションの後、細胞を回収培地に移し、２４時間培養した後、細胞を１５枚の９６ウェルプレートに播種し、培地をＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ＋５０ ｎＭ ＭＴＸを含むスクリーニング培地に交換した。４～５日間細胞培養の後で、５０ｎＭのＭＴＸの培地を２～３回追加し、クローンコンフルエンスが５０％以上になったら、ドットブロット法により比較的高発現量のクローンをスクリーニングした。ここで、抗体は、マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃとした。スクリーニングした比較的高発現量のクローンを順次に２４ウェルプレート、６ウェルプレート、細胞培養皿及び細胞培養振とうフラスコに移して拡張型培養をした。

融合タンパク質生産量を増加させるため、ＭＴＸ濃度の増加による加圧法を使用して細胞を培養した。このように、ＭＴＸによるＤＨＦＲ遺伝子の阻害により、ＤＨＦＲ遺伝子と融合タンパク質遺伝子との共増幅が実現された。

３．融合タンパク質の生産
３．１ 細胞の回復及び継代
細胞を、培養フラスコに回復し、密度が増加すると振とうフラスコに移し、培養・継代し、培地をＣＤ ＤＧ４４溶媒＋５ｍｇ／Ｌ ＶＫとした。細胞密度が２．５～３．５×１０^６細胞／ｍＬの範囲となると、継代密度を０．８～１．０×１０^６細胞／ｍＬの間として、継代を行った。細胞種子が１．８～２Ｌに増殖し、密度が約３．５×１０^６ 細胞／ｍＬになると、タンク培養を行った。

３．２ 発酵
発酵の時、１５Ｌのバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ、Ｂｉｏｂｕｎｄｌｅ １５Ｌ）を使用し、播種体積を８Ｌとし、細胞密度を１．０×１０^６細胞／ｍＬとした。培養パラメータは、以下のようにに設定した。１）ｐＨ：６．８～７．４；２）ＤＯ：４０％；３）酸素供給モード：大きな気泡換気による酸素供給；４）冷却計略：初期段階で３７℃で培養し、５日目に３３℃に冷却して培養すること；５）回転速度：８０－１４０ｒｐｍ；６）給餌計略：４日目に給餌を開始し、２％、３％、４％、３％、２％、２％、２％、２％、２％のやり方で、総給餌体積を２４％とし、毎日にセルカウンターで数えること；７）回収：１３日程度に培養して上澄みを収穫し、３０００ｇ／１０分で遠心分離より上清を回収すること。

３．３ 試料の検出及び精製
発酵ブロスの上清をアフィニティークロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを含む３つのステップで精製した。精製後の融合タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣより検出した。図２Ａに示すように、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果は、目的タンパク質のサイズが理論分子量とほぼ一致であった。

ＳＥＣ－ＨＰＬＣには、Ａｇｉｌｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｂｉｏ ＳＥＣ ３００Ａ、２．７μｍ、７．８×３００ｍｍ仕様のクロマトグラフィーカラムを使用し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ、かつ、ｐＨ７．２溶離液で、カラム温度を３０℃とし、流速を０．５ｍＬ／ｍｉｎとし、インジェクターの温度を４．０℃とし、注入体積を３０μｇとし、イソクラティック溶離を行った。図２Ｂは、ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐタンバク質を例として保持時間を１５．１分間とした精製結果を示している。３つのステップで精製し後のＳＥＣ純度は、９５．０％であった。

実施例２ ＦＩＸ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐのインビトロでの活性検出および比較
本実施例では、実施例１で作製したＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ、ＦＩＸ－Ｃ２－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ、ＦＩＸ－Ｃ３－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ、ＦＩＸ－Ｃ４－Ｆｃ－Ｌ２－ＰおよびＦＩＸ－Ｃ５－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐのインビトロでの活性を検出し、また第１のリンカーＬ１に剛性単位を含まないＦＩＸ－ＧＳ－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐのインビトロでの活性と比較した。

具体的には、人血液凝固第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）の活性は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐａｒｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ ｔｉｍｅ、ＡＰＴＴ）に基づく一相法により測定した。ここで、エラグ酸を活性剤とし、第８回国際標準２００９ ＦＩＸ濃縮物（８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ２００９ ＦＩＸ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、ＷＨＯ ＦＩＸ活性標準物質）を使用してＡＰＴＴ測定を行い、既知の標準物質の活性と測定したＡＰＴＴ時間の対数をそれぞれ求め、線形フィッティングして標準曲線をプロットした。被験試料を標準曲線範囲に希釈し、ＦＩＸ欠損血漿と混合してＡＰＴＴを測定し、標準曲線により被験試料の生物学的活性を計算した。

等分されたＷＨＯ ＦＩＸ活性標準物質又は試料を採取し、室温に平衡化し、１０μｌを吸い取り、５％ＦＩＸ欠損血漿でそれを約１ＩＵ／ｍｌに希釈し、次に５％ＦＩＸ欠損血漿で上記溶液をそれぞれ１０倍、２０倍（活性標準物質は、さらに４０倍及び８０倍に希釈した）に希釈し、ボルテックスミキサーでよく混合し、希釈した標準物質または試料を自動血液凝固計の分析試料ラックに置き、使用する試薬をそれぞれ対応する試薬位置に置き、自動血液凝固計で相応の測定プログラム、測定凝固時間を設定し、希釈度ごとに２回測定を繰り返した。標準物質活性の対数を横軸とし、血液凝固時間の対数を縦軸とし、標準曲線を作成した。測定した希釈後の受試品の血液凝固時間をそれぞれ標準曲線に代入して計算した活性結果に、希釈倍率を掛けて対応する活性を得る。

発明者らは、図３に示すように、第１のＬ１リンカーに剛性単位を含むＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ、ＦＩＸ－Ｃ２－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ、ＦＩＸ－Ｃ３－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ、ＦＩＸ－Ｃ４－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ及びＦＩＸ－Ｃ５－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐの分子の比活性が第１のリンカーＬ１に剛性単位を含まないＦＩＸ－ＧＳ－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ分子よりもはるかに高いことを予測せずに発見した。これは、第１のリンカーＬ１が剛性単位を含むことにより分子の比活性を大幅に増加させることができることを示している。

さらに、予期せぬことに、Ｌ１に剛性単位を含む各融合タンパク質では、ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐは著しく高い活性を有し、相対比活性が他の融合タンパク質より一倍又はそれ以上高かった（図３）。従って、以降の実施例では、ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐを選択して詳細な調査を行った。

実施例３ ＰＥＧコンジュゲート融合タンパク質ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧの作製
ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐタンパク質のＣ末端にはＬＰＥＴＧＧが含まれ、ソルターゼＡによって特異的に認識される。ソルターゼＡの作用下で、ＴとＧとの間のアミド結合が切断され、Ｔがソルターゼ酵素の１８４番目のＣのチオール基と反応してチオエステル結合中間体を形成し、その後、Ｎ末端にポリグリシンを持つＧＧＧＡＡ－ＰＥＧによって攻撃され、最後に、特定の分子量のＰＥＧをタンパク質のＣ末端の所定の部位に連結させることができる。

ＰＥＧ化反応システム：４０ＫＤ－ＧＧＧＡＡ－ＰＥＧを緩衝液で溶解し、ｐＨ７．５に調整し、次に、タンパク質と４０ＫＤ－ＧＧＧＡＡ－ＰＥＧを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ ７．５.１５０ｍＭ ＮａＣｌのバッファーシステムに１：２０の供給比で添加し、また、ソルターゼＡ及び１０ｍＭのＣａＣｌ_２を添加し、３０分後にＥＤＴＡを添加して反応を停止した。

コンジュゲート生成物（ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧ）のコンジュゲーション率は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより検出した。ＳＥＣ検出では、ＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌ ＵＩｔｒａＳＷ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ ７．８×３００ｍｍ ３μｍ仕様のクロマトグラフィーカラムを使用し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．２溶離液でアイソクラティック溶出を行い、カラム温度を２５℃とし、流速を０．５ｍＬ／分とし、インジェクターの温度を４．０℃とし、注入量を５０μｇとした。コンジュゲート後のタンパク質の保持時間が１２－１４．５分であり、基質保持時間が１５分であった。図４には、ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧの検出結果を示し、ＰＥＧコンジュゲート生成物の割合が３０分で７０％に達した。

ＰＥＧコンジュゲート後の生産物の精製及び検出
ＰＥＧコンジュゲート後の試料は、陰イオン交換クロマトグラフィーより未反応のＧＧＧＡＡ－ＰＥＧ、ソルターゼＡ及びコンジュゲートされていない基質（ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ）を除去し、コンジュゲートされていない基質の残留量を３％以内に制御した。

コンジュゲート後、試料を陰イオン交換クロマトグラフィーより単離し、それぞれのセグメントにおけるピークでの試料を収集した。それぞれのピークについて、ＳＤＳ－ＨＰＬＣ検出及びＳＥＣ検出を行い、そして、コンジュゲートされていない基質の割合が５％未満のピークを合わせて収集し、そのＳＥＣ純度を検出した。ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧのＳＥＣ検出結果、図５に示すように、ＰＥＧ化生成物のＳＥＣ純度が９７．８％であった。ここで、二重コンジュゲート生成物は１５．７％であり、保持時間が１３．２０分であり、単一コンジュゲート生成物は８２．２％であり、保持時間が１３．７０分であり、未反応の基質ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐは、割合が１．２４％であり、保持時間が１５．９４分であった。

実施例４ コンジュゲートＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧ優れたインビトロでの活性を維持したこと
本実施例では、コンジュゲートＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧのインビトロでの活性をさらに検出した。具体的には、人血液凝固第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）の活性は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐａｒｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ ｔｉｍｅ、ＡＰＴＴ）に基づく一相法により測定した。ここで、エラグ酸を活性剤とし、第８回国際標準２００９ ＦＩＸ濃縮物（８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ２００９ ＦＩＸ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、ＷＨＯ ＦＩＸ活性標準物質）を使用してＡＰＴＴ測定を行い、既知の標準物質の活性と測定したＡＰＴＴ時間の対数をそれぞれ求め、線形フィッティングして標準曲線をプロットした。被験試料を標準曲線範囲に希釈し、ＦＩＸ欠損血漿と混合してＡＰＴＴを測定し、標準曲線により被験試料の生物学的活性を計算した。

等分されたＷＨＯ ＦＩＸ活性標準物質又は試料を採取し、室温に平衡化し、１０μｌを吸い取り、５％ＦＩＸ欠損血漿でそれを約１ＩＵ／ｍｌに希釈し、次に５％ＦＩＸ欠損血漿で上記溶液をそれぞれ１０倍、２０倍（活性標準物質に対しては、さらに４０倍及び８０倍に希釈した）に希釈し、ボルテックスミキサーでよく混合し、希釈した標準物質または試料を自動血液凝固計の分析試料ラックに置き、使用する試薬をそれぞれ対応する試薬位置に置き、自動血液凝固計で相応の測定プログラム、測定凝固時間を設定し、希釈度ごとに２回測定を繰り返した。標準物質活性の対数を横軸とし、血液凝固時間の対数を縦軸とし、標準曲線を作成した。測定した希釈後の受試品の血液凝固時間をそれぞれ標準曲線に代入して計算した活性結果に、希釈倍率を掛けて対応する活性を得る。

図３に示すように、コンジュゲートＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧは、ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐよりも比活性が低かった。これは、ＰＥＧコンジュゲートがある程度に分子のインビトロでの比活性を低下させることを反映している。上記の結果は当技術分野の一般的な理解と一致している。ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧのインビトロでの活性が依然として比較的高いレベルに維持し、コンジュゲートされていないのＰＥＧのＦＩＸ－ＧＳ－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐよりもはるか高いだげではなく、ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ以外の他のＰＥＧコンジュゲートされていないＦＩＸ－Ｌ１－Ｆｃ－Ｌ２－Ｐ融合タンパク質のインビトロでの活性も同等であることは、注目に値する。

実施例５ ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧがインビボで半減期有意的に延長されていること
本実施例では、コンジュゲートＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧのマウス体内での活性をさらに検出した。具体的には、ＨＢマウスにＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧを投与し、その後、異なる時点で眼窩から採血し、血漿を分離し、血漿中のｈＦＩＸ活性を一相法で検出し、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ５．２．１ソフトウェアを使用して薬物動態パラメータを計算した。

本実施例で使用した実験動物は、下記の表に示す。

本実施例で使用した測定試料は、以下の通りである。

本実験には、２つの群に分けて、対照薬ＢｅｎｅＦＩＸ及びコンジュゲートＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧの試料を３００ＩＵ／ｋｇで尾静脈から投与した。採血時刻は、１）ＢｅｎｅＦＩＸ：０．０８３、０．５、１、４、８、２４、４８、７２ｈ；２）ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧ：０．０８３、０．５、１、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０ｈとした。各群の各採血ポイントでは、５匹のＨＢ動物（オス２匹、メス３匹）の眼窩から採血し、ｈＦＩＸ活性を検出した。

図６に示すように、ＢｅｎｅＦＩＸは、投与後２日間、血漿ｈＦＩＸレベルを５％以上維持することができたが、投与３日後、血漿ｈＦＩＸレベルを１％～２％しか維持できなかった。ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧは、投与３日後、血漿ｈＦＩＸレベルを５％以上保持し、投与６日後、血漿ｈＦＩＸレベルを２％より高く維持しており、特に、投与１０日後、血漿ｈＦＩＸレベルを１％－２％に維持した。実験結果は、ＦＩＸ－Ｃ１－Ｆｃ－Ｌ２－ＰＥＧの消失相半減期（Ｔ１／２）が７０時間に達し、対照薬ＢｅｎｅＦＩＸのＴ１／２（１４時間、文献に報告された半減期のデータと一致）及び文献に報告されたＡｌｐｒｏｌｉｘのＴ１／２（４６時間）（Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ａｓ ａ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｂｌｏｏｄ ２０１０； １１５（１０）：２０５７－６４．）よりもはるかに長かったこと、を示している。最大血中濃度Ｃｍａｘが１１９ＩＵ／ｄＬであり、薬物時間曲線下面積（ＡＵＣｌａｓｔ）が１４７５ ｈ×ＩＵ／ｄＬであり、クリアランス（ＣＬ）が０．２０３３ ｄＬ／ｈ／ｋｇであり、平均滞留時間（ＭＲＴ）が７２時間であったので、優れた薬力学的効果に到達した。これにより、ｈＦＩＸとＦｃを融合させて調製したＰＥＧ部位特異的コンジュゲートが、ｈＦＩＸ分子の半減期を有意的に延長し、かつ、従来の医薬品より優れたインビボでの長期効果が大幅に向上し、応用の見通しが良好であることが分かる。

Claims (20)

1. 血液凝固第ＩＸ因子の活性部位と、それに連結した半減期延長融合パートナー（ＦＰ）とを含む融合タンパク質であって、
   前記血液凝固第ＩＸ因子の活性部位が前記融合パートナーと直接連結され、又は第１のリンカーＬ１を介して連結され、
   好ましくは、前記第１のリンカーＬ１が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチドセグメントであり、
   より好ましくは、前記第１のリンカーＬ１が柔軟なペプチドセグメント及び／又は剛性単位を含み、
   前記柔軟なペプチドセグメントがグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）及び／又はスレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）を含むペプチドセグメントであり、
   例えば、前記柔軟なペプチドセグメントが（ＧＳ）ｍ（ＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＳ）ｏ（ＧＧＧＧＳ）ｐ（ただし、ｍ、ｎ、ｏ及びｐは、それぞれ０から５０までの整数から選択され、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０であり、好ましくは、ｍ、ｎ、ｏ及びｐが同時に０ではない。）である、血液凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の融合タンパク質。
2. 前記血液凝固第ＩＸ因子の活性部位がヒトに由来し、例えば、完全長または短縮型の人血液凝固第ＩＸ因子であり、
   前記完全長または短縮型の人血液凝固第ＩＸ因子は、そのＦＩＸ活性を保持している条件下で、１つ又はそれ以上のアミノ酸変異を含む可能性があり、
   例えば、前記血液凝固第ＩＸ因子の活性部位が配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むか、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％又はそれ以上の同一性を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 前記剛性単位が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のプロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）を含むペプチドセグメントであり、
   好ましくは、前記剛性単位が、
   ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡ（配列番号３）；
   ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号４）；
   ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡ（配列番号５）；
   ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号６）；及び
   ＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号７）から選ばれるアミノ酸配列を含み、
   さらに好ましくは、前記第１のリンカーＬ１が、
   ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡ（配列番号８）；
   ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号９）；
   ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡ（配列番号１０）；
   ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＰＶＲＬＰＧＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号１１）；及び
   ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡＧＳＶＡＰＰＰＡＬＰＡＶＡＰＰＰＡＬＰＡ（配列番号１２）から選ばれる、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
4. 前記融合パートナーが、完全長、短縮型又は変異型の免疫グロブリンＦｃセグメント、アルブミン、トランスフェリン又はＸＴＥＮであり、
   例えば、前記融合パートナーが、ヒトに由来し、例えば、前記Ｆｃセグメントがヒト免疫グロブリンＦｃセグメントであり、
   好ましくは、前記免疫グロブリンＦｃセグメントがＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインからなる群から選ばれる１つ～４つのドメインからなり、
   より好ましくは、前記免疫グロブリンＦｃセグメントがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来するＦｃセグメントであり、さらに好ましくは、ＩｇＧ Ｆｃセグメントであり、
   さらに好ましくは、前記ＦｃセグメントがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４に由来するＦｃセグメントであり、
   さらに、前記ＩｇＧ Ｆｃセグメントが低減されたＡＤＣＣ効果及び／又はＣＤＣ効果、及び／又は高められたＦｃＲｎ受容体との結合親和性を有することがさらに好ましい、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
5. 前記融合パートナーが、さらにソルターゼ酵素認識部位を含むアミノ酸配列Ｐに直接連結され、又は、第２のリンカーＬ２を介して連結され、
   前記ソルターゼ酵素が、例えば、ソルターゼＡ又はソルターゼＢであり、
   好ましくは、前記アミノ酸配列ＰがソルターゼＡのコア認識部位であるＬＰＸＴＧを含み、ただし、Ｘは、任意的なアミノ酸であり、例えば、ＰがＬＰＥＴＧ、ＬＰＥＴＧＧ又はＬＰＥＴＧＧＧであり、
   さらに好ましくは、前記アミノ酸配列Ｐがソルターゼ酵素認識部位に連結したアフィニティタグをさらに含み、このようなアミノ酸配列Ｐは、例えば、ＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨ又はＬＰＥＴＧＧＷＳＨＰＱＦＥＫである、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
6. 前記第２のリンカーＬ２が１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチドセグメントであり、
   好ましくは、前記第２のリンカーＬ２がグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）及び／又はスレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）を含む柔軟なペプチドセグメントであり、例えば、（ＧＳ）ｗ（ＧＧＳ）ｘ（ＧＧＧＳ）ｙ（ＧＧＧＧＳ）ｚ（ただし、ｗ、ｘ、ｙ及びｚはそれぞれ０から５０までの整数から選択され、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０であり、より好ましくは、ｗ、ｘ、ｙ及びｚは同時に０ではない。）である、
   さらに好ましくは、第２のリンカーＬ２の配列が、
   ＧＧＧＧＳ（配列番号１４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５）又はＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）である、請求項５に記載の融合タンパク質。
7. 下記の構造を有する、請求項６に記載の融合タンパク質。
   ＦＩＸ－Ｌ１－ＦＰ－Ｌ２－Ｐ
   （ただし、ＦＩＸ、Ｌ１、Ｌ２、ＦＰ及びＰは、請求項６に定義されたものと同じであり、Ｌ１及びＬ２のいずれか一者又は両者が存在しなくてもよい。）
8. 配列番号１８、２０、２２、２４、２６又は２８で示される配列を含むか、又は、配列番号１９、２１、２３、２５、２７又は２９で示される核酸分子によってコードされる、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
9. 親水性ポリマー分子が請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の融合タンパク質の末端に連結され、好ましくは、ペプチド転移反応を介して前記ソルターゼ酵素認識部位に連結され、特には、前記融合タンパク質がモノマー又は二量体として存在してもよい、コンジュゲート。
10. 前記親水性ポリマー分子は、例えば、多糖、及びポリプロピレングリコール及びポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコールから選ばれ、
    前記ポリアルキレングリコールが、例えば、メトキシ基のようなアルコキシ基でエンドキャップされてもよく、及び／又は、前記ポリアルキレングリコールが直鎖状又は分枝状であってもよく、
    前記ポリアルキレングリコールの分子量が１ｋＤａ以上、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、１１０ｋＤａ以上、１２０ｋＤａ以上、１３０ｋＤａ以上、１４０ｋＤａ以上、１５０以上又は１６０ｋＤａ以上であってもよく、例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｋＤａ、又はそれらのうちのいずれか２つの値の間の値であり、好ましくは、前記親水性ポリマー分子の分子量が２０ｋＤ又は４０ｋＤである、請求項９に記載のコンジュゲート。
11. 請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をソルターゼ酵素（例えば、ソルターゼＡ又はソルターゼＢ）及び親水性ポリマー分子と接触させることを含む、請求項９又は１０に記載のコンジュゲートの製造方法であって、
    前記親水性ポリマー分子は、その一端にソルターゼ酵素によってアミド化されることが可能なアミノ基を持つ、製造方法。
12. 前記親水性ポリマー分子は、そのＮ末端に、例えばＧＧＧＡＡである、ポリグリシンを持つ、請求項１１に記載の方法。
13. 有効量の請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の融合タンパク質及び／又は請求項９又は１０に記載のコンジュゲート、及び任意選択的に薬学的に許容されるキャリアを含む、医薬組成物。
14. 出血性疾患を予防及び／又は治療するために使用され、好ましくは、前記出血性疾患は、先天性又は後天性のＦＩＸ欠乏症患者における出血性疾患、及び血友病Ｂ患者における自発的な又は手術による出血から選ばれる、請求項１３に記載の医薬組成物。
15. 液体製剤、又は、凍結乾燥製剤の形態である、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。
16. 出血性疾患を予防及び／又は治療するための医薬品の調製における、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項９又は１０に記載のコンジュゲート、又は請求項１３～請求項１５のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用であって、
    好ましくは、前記出血性疾患は、先天性又は後天性のＦＩＸ欠乏症患者における出血性疾患、及び血友病Ｂ患者における自発的な又は手術による出血から選ばれる、使用。
17. 請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項９又は１０に記載のコンジュゲート、又は請求項１３～請求項１５のいずれか一項に記載の医薬組成物を、これを必要とする対象に投与する工程を含む、出血性疾患を予防及び／又は治療する方法であって、
    好ましくは、前記出血性疾患は、先天性又は後天性のＦＩＸ欠乏症患者における出血性疾患、及び血友病Ｂ患者における自発的な又は手術による出血から選ばれる、方法。
18. 請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項９又は１０に記載のコンジュゲート、又は請求項１３～請求項１５のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び任意選択的に含まれる取扱説明書を含むキット。
19. 請求項１～請求項８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列。
20. 請求項１９に記載の核酸配列を含む発現ベクター。

Images