CN104130308A - 一种蛋白质定点peg修饰的方法及所得peg修饰的蛋白质 - Google Patents
一种蛋白质定点peg修饰的方法及所得peg修饰的蛋白质 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104130308A CN104130308A CN201410367156.3A CN201410367156A CN104130308A CN 104130308 A CN104130308 A CN 104130308A CN 201410367156 A CN201410367156 A CN 201410367156A CN 104130308 A CN104130308 A CN 104130308A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peg
- protein
- growth hormone
- sorting
- human growth
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种蛋白质定点PEG修饰的方法及所得PEG修饰的蛋白质。本发明提供的一种蛋白质定点PEG修饰的方法包括：获得蛋白质，在该蛋白质的C末端融合分选酶识别的分选基序，得重组蛋白质；取PEG修饰剂、该重组蛋白质，与分选酶混合，经肽键的切割、连接反应，获得PEG修饰的蛋白质，其中的PEG修饰剂具有式(I)所示结构。本发明利用分选酶，实现了在蛋白质的C末端定点修饰PEG，整个操作简单，成本低，避免了蛋白质PEG修饰时容易产生多位点修饰的发生，更有利于PEG修饰在蛋白质修饰中的应用；
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种蛋白质定点PEG修饰的方法及所得PEG修饰的蛋白质。
背景技术
聚乙二醇(PEG)是环氧乙烷水解产物的聚合物，为一种亲水、不带电荷的线性大分子。共价连接亲水性聚合物聚乙二醇是一种增加生物活性分子(包括蛋白、肽、尤其是疏水性生物分子)的水溶性、提高其生物利用度、延长血清半衰期、调节免疫原性、提高生物活性常用的方法。其中，利用PEG修饰蛋白质来延长其半衰期、减少免疫原性、增加稳定性，是一项已成功应用的技术。该技术已被广泛应用于蛋白质类药品的修饰，例如，已经上市的包括PEG-门冬酰胺酶，PEG-ADA(腺苷脱氨酶)，PEG-干扰素和PEG-GCSF(粒细胞集落刺激因子)等。其中PEG-干扰素由原来的每两天或每天注射一次降低到每周一次，而且疗效显著改善。PEG-GCSF也由每天注射一次改善为每个化疗疗程注射一次。
目前，对蛋白质进行PEG修饰的方法主要为化学修饰法，主要步骤包括：取活化的PEG，在偶联剂的作用下，PEG末端的羟基与蛋白质分子上的氨基、羧基或巯基等基团发生偶联作用，即得。因为蛋白质分子上多个基团可以与聚乙二醇发生反应，所以导致了在蛋白质的聚乙二醇化学修饰过程中会有一些副反应的发生，产生多个PEG修饰的蛋白质复杂混合物，并且有可能破坏所修饰蛋白的生物活性，最终导致所得的修饰产物不均一、副产物多、疗效不稳定，进而限制了PEG在蛋白质修饰中的应用。所以，急需提供一种蛋白质定点PEG修饰的方法，以获得产物单一、质量稳定的PEG修饰的蛋白质，推广PEG修饰在蛋白质修饰中的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种蛋白质定点PEG修饰的方法及所得PEG修饰的蛋白质。本发明提供的方法采用分选酶进行蛋白质PEG修饰，可以实现在蛋白质的C末端定点修饰上PEG，避免了蛋白质PEG修饰中副反应的发生，更有利于PEG修饰在蛋白质修饰中的应用。
为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供了一种蛋白质定点PEG修饰的方法，包括以下步骤：
步骤1：获得蛋白质，在该蛋白质的C末端融合分选酶识别的分选基序，得重组蛋白质；
步骤2：取PEG修饰剂、步骤1制得的重组蛋白质，与分选酶混合，经肽键的切割、连接反应，获得PEG修饰的蛋白质；
步骤2中的PEG修饰剂具有式(I)所示结构：
其中，m为聚合度，1≤m≤5；n为聚合度；110≤n≤1100。
分选酶普遍存在于革兰氏阳性细菌中，是一类膜结合的巯基转肽酶，负责将表面蛋白锚定到细胞壁肽聚糖上。分选酶兼有蛋白酶和转肽酶活性，其催化的表面蛋白在N端和C端都有特征信号，N端含有信号肽，而C端的分选信号由分选基序、紧随其后的疏水区和带正电荷的尾部组成。本发明通过在蛋白质的C端偶联上分选酶特异性识别的分选基序，再加入带有游离的N端的PEG修饰剂，利用分选酶特异位点切割肽键、并将氮端带有两个以上甘氨酸的PEG修饰剂连接到被切割位点之上，形成新的肽键，即实现了在蛋白质的C末端定点修饰PEG，整个操作简单，成本低，避免了蛋白质PEG修饰时容易产生多位点修饰的发生，更有利于PEG修饰在蛋白质修饰中的应用。
优选地，本发明提供的方法中，步骤1中的分选酶为分选酶SrtA。本发明提供的方法步骤2中的分选酶SrtA催化的肽键的切割、连接反应过程中，分选酶SrtA先识别融合在蛋白质C末端的分选基序，“LPXTG”或“LPXAG”，并在“T-G”或“A-G”位点切割肽键，产生一个酰基中间产物，之后分选酶SrtA介导PEG修饰剂中游离的氨基，亲核进攻该酰基中间产物，形成新的肽键，即实现了将PEG定点修饰到蛋白质的C末端上，获得了定点PEG修饰的蛋白质。
优选地，本发明提供的方法中，步骤1中的蛋白质为生长激素；更为优选地，步骤1中的蛋白质为人生长激素，具有下述氨基酸序列中的任意一个：
(VIII)具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；
(IX)具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
优选地，本发明提供的方法中，步骤1中分选基序具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
更为优选地，本发明提供的方法中，步骤1中分选基序为下述氨基酸序列中的任意一个：
(I)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
(II)具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
(III)具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
(IV)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
(V)具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
(VI)具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
(VII)具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
更为优选地，本发明提供的方法中，步骤1中分选基序具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，实验结果证实，在人生长激素的C端融合具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列时，所得重组人生长激素按照本发明提供的方法进行PEG修饰时，PEG修饰效率最高。
优选地，本发明提供的方法中，步骤2中的PEG修饰剂中的聚合度m满足：1≤m≤5。在本发明的一些实施例中，步骤2中的PEG修饰剂中的聚合度m＝1。PEG修饰剂由物质的量比为1:1的PEG与聚甘氨酸偶联而得，PEG游离的羟基与聚甘氨酸中游离的羧基发生反应，使得两者通过酯键相连接。
优选地，本发明提供的方法中，步骤2中的PEG修饰剂中PEG修饰剂中的聚合度n满足:110≤n≤1100其对应的PEG的相对分子量为5K～50K。更优选为，PEG的相对分子量为5K、10K、15K、20K、30K、40K或50K。在本发明的一些实施例中，PEG的相对分子量为10K。
优选地，本发明提供的方法中，当蛋白质为生长激素时，包括以下步骤：
步骤1：获得生长激素，在该生长激素的C末端融合分选酶识别的分选基序，得重组生长激素；
步骤2：取PEG修饰剂、步骤1制得的重组生长激素，与分选酶混合，经肽键的切割、连接反应，获得PEG修饰的生长激素，
步骤2中的PEG修饰剂具有式(I)所示结构：
其中，m为聚合度，1≤m≤5；n为聚合度；110≤n≤1100。
本发明通过在生长激素的C端偶联分选酶识别的分选基序，再加入具有游离N端的PEG修饰剂，在分选酶的作用下，即实现了在生长激素C端定点修饰PEG，整个操作简单，成本低，有效避免了生长激素PEG过程中副产物的产生，实验结果证实，本发明制备获得的PEG修饰的生长激素，有效延长了生长激素的半衰期，可作为长效药物使用。
优选地，本发明提供的方法中，步骤2中肽键的切割、连接反应的温度为25℃～40℃。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，步骤2中肽键的切割、连接反应的温度为37℃。
优选地，本发明提供的方法中，步骤2中肽键的切割、连接反应的时间为12h～18h。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，步骤2中肽键的切割、连接反应的时间为1h。
优选地，本发明提供的方法中，步骤2中肽键的切割、连接反应的pH值为7～8。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，蛋白质为人生长激素时，步骤1中的重组人生长激素具有下述氨基酸序列中的任意一个：
III具有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列；
IV具有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；
V具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列；
VI具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；
VII具有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列；
VIII具有SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；
IX具有SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，蛋白质为人生长激素时，该重组人生长激素的制备方法为：采用原核系统表达重组人生长激素。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，蛋白质为人生长激素时，采用原核系统表达该重组人生长激素时，用到的重组载体包括具有如(X)、(XI)、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)所示核苷酸序列中的任意一个：
(X)具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；
(XI)具有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
(XII)具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；
(XIII)具有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；
(XIV)具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；
(XV)具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；
(XVI)具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，蛋白质为人生长激素时，采用原核系统表达重组人生长激素的方法具体包括以下步骤：
步骤1：获得重组人生长激素基因，该重组人生长激素基因具有如(X)、(XI)、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)所示核苷酸序列中的任意一个：
(X)具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；
(XI)具有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
(XII)具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；
(XIII)具有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；
(XIV)具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；
(XV)具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列；
(XVI)具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列；
步骤2：取步骤1所得重组人生长激素基因，构建重组载体；
步骤3：取步骤2制得的重组载体经转化，获得重组菌株；
步骤4：取步骤3制得的重组菌株，经培养、诱导、表达，即得。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，蛋白质为人生长激素时，采用原核系统表达人生长激素时，步骤2制得的重组载体上含有麦芽糖结合蛋白(MBP)基因，该重组载体能够实现MBP与重组人生长激素的融合表达，所得融合人生长激素蛋白的N端具有MBP蛋白标签，更有利于其纯化。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，蛋白质为人生长激素时，采用原核系统表达人生长激素时，所制备获得的融合人生长激素包含MBP蛋白和重组人生长激素，MBP与重组人生长激素之间通过FXa识别肽IEGR连接。该融合人生长激素的N端具有MBP蛋白标签，有利于融合生长激素的纯化；而IEGR的存在可以使纯化之后的融合人生长激素被FXa识别、切割，进而释放出游离的重组人生长激素。
在本发明的一些实施例中，本发明提供的方法中，蛋白质为人生长激素时，包括以下步骤：
步骤1：获得重组人生长激素融合蛋白，该重组人生长激素融合蛋白包括MBP蛋白和重组人生长激素，MBP蛋白与重组人生长激素之间通过FXa识别肽IEGR连接，该重组人生长激素的C末端融合分选酶识别的分选基序；
步骤2：取步骤1所得的重组人生长激素融合蛋白，经FXa切割，得重组人生长激素；
步骤3：取PEG修饰剂、步骤2所得的重组人生长激素、与分选酶SrtA混合，在pH7～8、温度25℃～40℃的条件下发生肽键的切割、连接反应后，经纯化，即获得PEG修饰的人生长激素。
在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的方法中，蛋白质为人生长激素时，包括以下步骤：
步骤1：获得重组人生长激素融合蛋白，该重组人生长激素融合蛋白包括MBP蛋白和重组人生长激素，MBP蛋白与重组人生长激素之间通过FXa识别肽IEGR连接；
步骤2：取PEG修饰剂、步骤1所得重组人生长激素融合蛋白，与分选酶SrtA混合，经肽键的切割、连接反应后，获得初级产品；
步骤3：取步骤2制得的初级产品，经麦芽糖结合蛋白亲和色谱柱纯化、FXa切割、凝胶层析色谱柱纯化，即获得PEG修饰的人生长激素。
本发明还提供了一种PEG修饰的蛋白质，其制备方法包括以下步骤：
步骤1：获得蛋白质，在该蛋白质的C末端融合分选酶识别的分选基序，得重组蛋白质；
步骤2：取PEG修饰剂、步骤1制得的重组蛋白质，与分选酶混合，经肽键的切割、连接反应，获得PEG修饰的蛋白质，
步骤2中的PEG修饰剂具有式(I)所示结构：
其中，m为聚合度，1≤m≤5；n为聚合度；110≤n≤1100。
采用本发明提供的蛋白质定点PEG修饰的方法在制备PEG修饰的蛋白质时，本发明提供的方法步骤2中的分选酶催化的肽键的切割、连接反应过程中，分选酶先识别融合在蛋白质C末端的分选基序，并在特定的位点切割肽键，产生一个酰基中间产物(该酰基中间产物的结构为：从N端到C端依次偶联有蛋白质和分选基序残基)，之后分选酶介导PEG修饰剂中游离的氨基，即带有聚甘氨酸残基的PEG修饰剂中甘氨酸上游离的氨基，亲核进攻该酰基中间产物，形成新的肽键，即实现了将PEG定点修饰到蛋白质的C末端上，获得了定点PEG修饰的蛋白质。采用本发明提供的蛋白质定点PEG修饰的方法制备获得的PEG修饰的蛋白质的结构为：从N端到C端依次偶联有蛋白质、分选基序残基、聚甘氨酸残基和PEG，其具有如式(IV)所示结构：
其中P代表蛋白质；S代表分选基序残基；m为聚合度，1≤m≤5；n为聚合度；110≤n≤1100。
优选地，本发明提供的PEG修饰的蛋白质，优选为PEG修饰的生长激素，在本发明的一些实施例中，本发明提供的PEG修饰的生长激素具体为PEG修饰的人生长激素。
在本发明的一些实施例中，采用本发明提供的蛋白质定点PEG修饰的方法在制备PEG修饰的人生长激素时，本发明提供的方法步骤2中的分选酶SrtA催化的肽键的切割、连接反应过程中，分选酶SrtA先识别融合在人生长激素的C末端的分选基序，“LPXTG”或“LPXAG”，并在“T-G”或“A-G”位点切割肽键，产生一个酰基中间产物(该酰基中间产物的结构为：从N端到C端依次偶联有人生长激素和“LPXT”或“LPXA”)，之后分选酶SrtA介导PEG修饰剂中游离的氨基，亲核进攻该酰基中间产物，形成新的肽键，即实现了将PEG定点修饰到人生长激素的C末端上，获得了定点PEG修饰的人生长激素。采用本发明提供的蛋白质定点PEG修饰的方法制备获得的PEG修饰的人生长激素的结构为：从N端到C端依次偶联有人生长激素、分选基序残基(“LPXT”或“LPXA”)、聚甘氨酸残基和PEG，其具有如式(II)或式(III)所示的结构中的任意一个：
其中，hGH代表人生长激素；LPXT代表分选基序残基对应的氨基酸序列；LPXA代表分选基序残基对应的氨基酸序列；X为任意氨基酸；m为聚合度，1≤m≤5；n为聚合度；110≤n≤1100。
本发明还提供了一种PEG修饰的生长激素，其具有如式(II)或式(III)所示的结构中的任意一个：
其中，hGH代表人生长激素；LPXT代表分选基序残基对应的氨基酸序列；LPXA代表分选基序残基对应的氨基酸序列；X为任意氨基酸；m为聚合度，1≤m≤5；n为聚合度；110≤n≤1100。
优选地，本发明提供PEG修饰的生长激素中，聚合度m满足：1≤m≤5。在本发明的一些实施例中，聚合度m＝1。
优选地，本发明提供PEG修饰的生长激素中，聚合度n满足110≤n≤1100其对应的PEG的相对分子量为5K～50K。更优选为，PEG的相对分子量为5K、10K、15K、20K、30K、40K或50K。在本发明的一些实施例中，PEG的相对分子量为10K。
优选地，本发明提供的PEG修饰的生长激素，具有如式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(X)或式(XI)所示的结构中的任意一个：
其中，hGH代表人生长激素；LPET、LPDT、LPNT、LPAA、LPKT、LPKA、LPQT代表分选基序残基对应的氨基酸序列；LPXA代表分选基序残基对应的氨基酸序列；n为聚合度110≤n≤1100。
更为优选地，本发明提供的PEG修饰的生长激素中，聚合度n满足110≤n≤1100，其对应的PEG的相对分子量为5K～50K。更优选为，PEG的相对分子量为5K、10K、15K、20K、30K、40K或50K。在本发明的一些实施例中，PEG的相对分子量为10K。
本发明还提供了本发明所述的PEG修饰的生长激素在制备促进生长的药物、防治侏儒症、Turner综合征、慢性肾功能不全引起的衰竭或艾滋病引起的衰竭的药物中的应用。
本发明还提供了一种药物，其包括本发明所述的PEG修饰的生长激素。
优选地，本发明提供的药物的剂型为液体注射剂或注射用粉剂。
本发明提供了一种蛋白质定点PEG修饰的方法及所得PEG修饰的蛋白质。一种蛋白质定点PEG修饰的方法包括：获得蛋白质，在该蛋白质的C末端融合分选酶识别的分选基序，得重组蛋白质；取PEG修饰剂、该重组蛋白质，与分选酶混合，经肽键的切割、连接反应，获得PEG修饰的蛋白质，其中的PEG修饰剂具有式(I)所示结构。本发明利用分选酶特异位点切割、连接肽键的功能，通过在蛋白质的C端偶联上分选酶特异性识别的分选基序，再加入带有游离的N端的PEG修饰剂，在分选酶的作用下，即实现了在蛋白质的C末端定点修饰PEG，整个操作简单，成本低，避免了蛋白质PEG修饰时容易产生多位点修饰的发生，更有利于PEG修饰在蛋白质修饰中的应用。实验结果证实，当利用分选酶进行生长激素的PEG修饰时，实现了在生长激素的C端定点修饰PEG，所得PEG修饰的生长激素有效延长了生长激素的半衰期，可作为长效药物使用；
其中，m为聚合度，1≤m≤5；n为聚合度；110≤n≤1100。
附图说明
图1示实施例1中重组载体pMAL-hGH的测序结果；
图2示实施例1中各个hGH-分选基序重组基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中，M代表DNA分子量Marker；泳道1代表hGH-分选基序1重组基因；泳道2代表hGH-分选基序3重组基因；泳道3代表hGH-分选基序2重组基因；泳道4代表hGH-分选基序7重组基因；泳道5代表hGH-分选基序6重组基因；泳道6代表hGH-分选基序5重组基因；泳道7代表hGH-分选基序4重组基因；
图3示实施例1中采用酶切验证重组载体1至重组载体7的正确性的验证结果，其中M代表DNA分子Marker，泳道1至泳道7分别代表了重组载体1至重组载体7；
图4示实施例1中不同的浓度的IPTG对重组菌株1表达融合人生长激素的影响的实验结果；其中，M代表蛋白分子量Marker；泳道1至泳道9代表的IPTG的浓度依次为0.02mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L；T条带代表目的蛋白的条带；
图5示实施例1中诱导前不同的菌体浓度对重组菌株1表达融合人生长激素的影响的实验结果；其中M代表蛋白分子量Marker；泳道1至泳道9代表的诱导前菌体浓度OD600依次为0.1、0.3、0.4、0.55、0.7、1.0、1.3、1.65、1.9；T条带代表目的蛋白的条带；
图6示实施例1中不同的诱导时间对重组菌株1表达融合人生长激素的影响的实验结果；其中M代表蛋白分子量Marker；泳道1至泳道6代表的诱导时间依次为：2h、4h、6h、8h、10h、12h；T条带代表目的蛋白的条带；
图7示实施例1中不同的诱导温度对重组菌株1表达融合人生长激素的影响的实验结果；其中M代表蛋白分子量Marker，泳道1代表诱导温度为16℃；泳道2代表诱导温度为25℃；泳道3代表诱导温度为30℃；泳道4代表诱导温度为37℃；泳道；T条带代表目的蛋白的条带；
图8示实施例1中初级产物用麦芽糖结合蛋白亲和柱纯化时的监测结果；其中，峰1代表杂蛋白峰；峰2为特异性洗脱峰；
图9示实施例1中初级产品用麦芽糖结合蛋白亲和柱纯化后SDS-PAGE电泳检测结果；其中M为蛋白分子量Marker；泳道1为诱导后菌体溶液；泳道2为冻融、离心后收集的沉淀；泳道3为初级产物；泳道4为穿透液；泳道5为目的蛋白收集峰对应的洗脱样品1；泳道6为目的蛋白收集峰对应的洗脱样品2；泳道7为目的蛋白收集峰对应的洗脱样品3；T为目的蛋白条带；
图10示实施例1中重组人生长激素进行SDS-PAGE鉴定结果；其中其中泳道1代表重组人生长激素5；泳道2代表重组人生长激素4；泳道3代表重组人生长激素3；泳道4代表重组人生长激素7；泳道5代表重组人生长激素2；泳道6代表重组人生长激素6；泳道7代表重组人生长激素1；M代表Marker；
图11示实施例1中重组人生长激素1的Western blot检测结果，其中泳道1代表FXa切割未纯化样品，其中条带A为融合人生长激素1，条带B为重组人生长激素1；泳道2代表FXa切割后经superdex G75纯化所得重组人生长激素1；
图12示实施例2中制备获得的分选酶SrtA的SDS-PAGA检测结果，其中M为分子量Marker；泳道1为纯化所得分选酶；条带T为分选酶SrtA；
图13示实施例2中所得的PEG修饰的人生长激素进行PAGE检测的检测结果，其中M代表蛋白分子量Marker；泳道1代表重组人生长激素7；泳道2代表重组人生长激素6；泳道3代表重组人生长激素5；泳道4代表重组人生长激素4；泳道5代表重组人生长激素3；泳道6代表重组人生长激素2；泳道7代表重组人生长激素1；A条带代表PEG修饰的人生长激素；B条带代表未经PEG修饰的重组人生长激素；
图14示实施例3中修饰产物分离时检测结果，其中峰1代表10K PEG修饰的人生长激素1，即PEG修饰的人生长激素1；峰2代表未修饰的重组人生长激素1；其中数字1-21指的是指在洗脱过程中进行收集的管号；
图15示实施例3至实施9制备获得的PEG修饰的人生长激素的检测结果，其中，其中M代表蛋白分子量Marker；泳道1代表PEG修饰的人生长激素7；泳道2代表PEG修饰的人生长激素6；泳道3代表PEG修饰的人生长激素5；泳道4代表PEG修饰的人生长激素4；泳道5代表PEG修饰的人生长激素3；泳道6代表PEG修饰的人生长激素2；泳道7代表PEG修饰的人生长激素1，条带T代表PEG修饰的人生长激素；
图16示利用分选酶进行人生长激素PEG修饰的反应示意图。
具体实施方式
本发明公开了一种蛋白质定点PEG修饰的方法及所得PEG修饰的蛋白质。本领域技术人员可以参考本文内容，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法及应用已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的一种蛋白质定点PEG修饰的方法及所得PEG修饰的蛋白质中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 重组人生长激素的制备
(1)含人生长激素基因的重组载体的获得：
重组基因来源：
重组人生长激素基因，即hGH基因：根据PubMed公布的人生长激素基因，在上海生物工程公司进行基因合成，即获得了人生长激素的基因，即为hGH基因，其具有如SEQID NO:17所示的核苷酸序列。
pMAL-c5x表达载体：来源于New England BioLabs Inc.Cat.NO.N8108s。该表达载体含有MBP基因(即麦芽糖结合蛋白基因)和FXa识别肽IEGR的基因，当插入外源基因，经过诱导表达后所得融合蛋白的N端融合有MBP蛋白和IEGR氨基酸序列；当重组蛋白具有MBP蛋白标签时，有利于其纯化；而IEGR的存在可以使纯化之后的重组蛋白被FXa识别、切割，进而释放出游离的重组蛋白。
引物：均由上海生物工程公司公司合成。
构建人生长激素基因的载体：
取hGH基因、pMAL-c5x表达载体，通过酶切、连接，将所得hGH基因连接在pMAL-c5x表达载体上，即获得人生长激素表达载体，标记为pMAL-hGH。采用PCR及测序方法验证所得人生长激素基因载体的正确。测序结果，见图1，与PubMed公布的人生长激素基因的序列一致，即说明本发明成功构建了人生长激素基因载体，其中含有人生长激素基因序列，即具有如SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。
构建重组载体---重组人生长激素基因载体：
融合基因的获得：
以pMAL-hGH制粒为模板，通过PCR方法，在人生长激素编码基因序列中，即hGH基因中引入一段可以编码分选酶识别的分选基序的基因序列。各个分选基序对应的氨基酸序列、重组人生长激素的C端融合的氨基酸序列(即在hGH基因的3＇端引入的基因序列所对应的氨基酸序列)见表1；在构建hGH-分选基序重组基因时各个分选基序所用的引物见表2。
表1 各个分选基序对应的氨基酸序列
| 分选基序编号 | 氨基酸序列 | 氨基酸序列在序列表中的位置 |
| 分选基序1 | LPETG | 具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列 |
| 分选基序2 | LPDTG | 具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列 |
| 分选基序3 | LPNTG | 具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列 |
| 分选基序4 | LPAAG | 具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列 |
| 分选基序5 | LPKTG | 具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列 |
| 分选基序6 | LPKAG | 具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列 |
| 分选基序7 | LPQTG | 具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列 |
表2 构建hGH-分选基序重组基因时各个分选基序所用的引物
PCR的体系为：
PCR反应条件为：94℃，变性30s；58℃，退火30s；72℃，延伸45s，循环30次；72℃，延伸10min；保温于4℃。
PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，各个hGH-分选基序重组基因的电泳结果见图2，其中，M代表DNA分子量Marker；泳道1代表hGH-分选基序1重组基因；泳道2代表hGH-分选基序3重组基因；泳道3代表hGH-分选基序2重组基因；泳道4代表hGH-分选基序7重组基因；泳道5代表hGH-分选基序6重组基因；泳道6代表hGH-分选基序5重组基因；泳道7代表hGH-分选基序4重组基因。从图中可知，所有的PCR反应体系都得到了重组基因，重组基因大小约为609bp，分别回收各个片段，回收得到的各个片段与其中包含的重组基因信息的对应关系见表3。
表3 各个基因片段与重组基因信息的对应关系
| 回收片段 | 重组基因信息 |
| 基因片段1 | hGH基因-分选基序1基因 |
| 基因片段2 | hGH基因-分选基序2基因 |
| 基因片段3 | hGH基因-分选基序3基因 |
| 基因片段4 | hGH基因-分选基序4基因 |
| 基因片段5 | hGH基因-分选基序5基因 |
| 基因片段6 | hGH基因-分选基序6基因 |
| 基因片段7 | hGH基因-分选基序7基因 |
重组载体的构建：
对获得的各个基因片段(基因片段1至基因片段7)、pMBP-C载体，分别进行BamHI和Hind III双酶切后，用连接酶将融合基因片段与载体连接，获得重组人生长激素基因载体。
各个融合基因的双酶切体系：
酶切条件：37℃水浴4h。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳后，回收所得基因片段，并用Nanodrop测得DNA浓度。
pMBP-C载体双酶切体系：
酶切条件：37℃水浴4h。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳后，回收所得载体片段，并用Nanodrop测得DNA浓度。
载体与目的片段的连接：
将双酶切回收所得的各个基因片段，与双酶切载体混合，得混合液I，其中的双酶切回收所得各个基因片段与双酶切载体的物质的量之比为3:1。之后进行连接：
连接体系为：
连接条件：16℃，18h。
转化：
将双酶切回收所得的各个基因片段与双酶切载体的连接产物分别进行转化，所选宿主细胞为大肠杆菌Ecoli.DE3，获得重组菌株，保存各个重组菌株。采用天根质粒提取试剂盒提取质粒，各个质粒，即重组载体对应的重组基因信息见表4。
采用酶切方法验证所得重组载体1至重组载体7，验证结果如图3所示，其中，泳道1为重组载体1，泳道2为重组载体2，泳道3为重组载体3、泳道4为重组载体4，泳道5为重组载体5、泳道6为重组载体6、泳道7为重组载体7，M为DNA分子Marker。由图3可知，各个重组载体酶切之后均出现了与各个目的片段大小一致的条带，说明成功获得了各个重组载体。
得所得重组载体均成功整合了hGH基因-分选基序基因，各个菌株中整合入的重组基因序列见表4。
表4 重组载体的重组基因信息
| 重组载体编号 | 重组基因信息 | 重组到载体中的核苷酸序列 |
| 重组载体1 | hGH基因-分选基序1基因 | 具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列 |
| 重组载体2 | hGH基因-分选基序2基因 | 具有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列 |
| 重组载体3 | hGH基因-分选基序3基因 | 具有SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列 |
| 重组载体4 | hGH基因-分选基序4基因 | 具有SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列 |
| 重组载体5 | hGH基因-分选基序5基因 | 具有SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列 |
| 重组载体6 | hGH基因-分选基序6基因 | 具有SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列 |
| 重组载体7 | hGH基因-分选基序7基因 | 具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列 |
(2)融合人生长激素的诱导表达：
取所得重组载体1至重组载体7、pMAL-c5x表达载体，以大肠杆菌Ecoli.BL21(DE3)亚型作为受体细胞，进行转化，获得了重组菌株，对所得重组菌株一一进行标记，各个重组菌株与转入的重组载体的对应关系见表5。
表5 重组菌株的重组基因信息
| 重组菌株编号 | 转入的重组载体 |
| 重组菌株1 | 重组载体1 |
| 重组菌株2 | 重组载体2 |
| 重组菌株3 | 重组载体3 |
| 重组菌株4 | 重组载体4 |
| 重组菌株5 | 重组载体5 |
| 重组菌株6 | 重组载体6 |
| 重组菌株7 | 重组载体7 |
| 重组菌株8 | pMAL-c5x表达载体 |
融合人生长激素的表达条件的优化：
诱导剂IPTG浓度优化：
取重组菌株1菌种，以1:100的比例接种至3mL的含氨苄的LB培养基中，培养16h之后，再以1:100的比例接种至9个含有3mL+Amp+LB培养基的摇菌管中，37℃培养，当OD600达1.0时，分别加入IPTG，至IPTG的终浓度为0.02mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L，30℃诱导18h，收集菌体，SDS-PAGE鉴定。不同的浓度的IPTG对重组菌株1表达融合人生长激素的影响见图4，其中，M代表蛋白分子量Marker；泳道1至泳道9代表的IPTG的浓度依次为0.02mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L、2.5mmol/L；T条带代表目的蛋白的条带。由图可知，在IPTG诱导后，重组菌株表达目的蛋白，目的蛋白的表达量随着IPTG浓度的增大而减小，故选定IPTG的浓度为0.02mmol/L。
诱导前菌体浓度优化：
取重组菌株1菌种，以1:100的比例接种至3mL的含氨苄的LB培养基中，培养16h之后，再以1:100的比例接种至9个含有3mL+Amp+LB培养基的摇菌管中，37℃培养，在菌体生长的不同阶段，OD600为0.1、0.3、0.4、0.55、0.7、1.0、1.3、1.65、1.9时，分别加入IPTG进行诱导，加入IPTG的终浓度均为0.02mmol/L，30℃诱导4h，收集菌体，SDS-PAGE鉴定。诱导前，不同的菌体浓度对对重组菌株1表达融合人生长激素的影响见图5，其中M代表蛋白分子量Marker；泳道1至泳道9代表的诱导前菌体浓度OD600依次为0.1、0.3、0.4、0.55、0.7、1.0、1.3、1.65、1.9；T条带代表目的蛋白的条带。由图可知，当菌体浓度OD600在0.1-1.9之间时，随着菌体浓度的增加，融合人生长激素表达量也逐渐增加；通过bandscan软件分析，当菌体浓度OD600为0.7时，融合人生长激素的含量占蛋白总量的23.4％，若诱导前菌体浓度再增加，融合人生长激素的含量占蛋白总量的百分数却有所下降。所以，此处选择菌体浓度OD600为0.7时进行诱导，表达融合人生长激素。至于当菌体浓度OD600达到0.7之后，随着诱导前菌体浓度的增加融合人生长激素的含量占蛋白总量的百分数反而有所降低的原因，可能是由于培养基被消耗或菌体慢慢老化，因此在高密度发酵时可以通过分批补料培养，增加新鲜培养基，来保持菌体活性和提高目的蛋白表达量。
诱导时间对表达量的影响：在确立IPTG浓度为0.02mmol/L、诱导前菌体浓度为OD600＝0.7的基础上，试验了不同时间对产物表达量的影响。具体方法为：
取重组菌株1菌种，以1:100的比例接种至3mL的含氨苄的LB培养基中，培养16h之后，再以1:100的比例接种至6个含有3mL+Amp+LB培养基的摇菌管中，37℃培养，当OD600达0.7时，加入IPTG至其终浓度为0.02mmol/L，30℃诱导下进行诱导，诱导的时间分别为2h、4h、6h、8h、10h、12h，收集菌体，SDS-PAGE鉴定。不同的诱导时间对重组菌株1表达融合人生长激素的影响见图6，其中M代表蛋白分子量Marker；泳道1代表诱导时间为2h；泳道2代表诱导时间为4h；泳道3代表诱导时间为6h；泳道4代表诱导时间为8h；泳道5代表诱导时间为10h；泳道6代表诱导时间为12h；T条带代表目的蛋白的条带。由图可知，随着诱导时间的延长，融合人生长激素的表达量逐渐增加，诱导12h或者更长时间，能够提高其表达效率。
诱导温度对表达量的影响：
培养温度不仅影响细菌生长和细胞代谢调控，而且可影响载体质粒的稳定性和复制效率。较高的温度有利于细菌的高密度发酵，而低温培养能促进提高重组产物的表达量，因此可以在不同阶段采取不同的培养温度。具体培养方法为：
取重组菌株1菌种，以1:100的比例接种至3mL的含氨苄的LB培养基中，培养16h之后，再以1:100的比例接种至8个含有3mL+Amp+LB培养基的摇菌管中，37℃培养，当OD600达0.7时，加入IPTG至其终浓度为0.02mmol/L，之后在不同的温度下进行诱导，诱导时间均为12h，诱导温度分为16℃、25℃、30℃、37℃。诱导完毕后，收集菌体，SDS-PAGE鉴定。不同的诱导温度对重组菌株1表达融合人生长激素的影响见图7，其中M代表蛋白分子量Marker；泳道1代表诱导温度为16℃；泳道2代表诱导温度为25℃；泳道3代表诱导温度为30℃；泳道4代表诱导温度为37℃；泳道；T条带代表目的蛋白的条带。由图可知，在30℃时，融合人生长激素的表达量最高，故选择30℃作为诱导温度。
经过上述融合人生长激素的表达条件的优化，确定的表达条件为：表达宿主菌为Ecoli.DE3(BL21)，IPTG诱导前菌体浓度OD600为0.7，IPTG诱导剂浓度为0.02mmol/L，诱导温度30℃，诱导时间12小时。
(3)重组人生长激素的获得：
取重组菌株1至重组菌株7，分别进行融合人生长激素的大量表达、纯化、切割、分离，即得各个重组人生长激素，此处以重组菌株1为例，具体方法如下：
融合人生长激素的大量表达和纯化：
取重组菌株，以1:100的比例接种至5mL的含氨苄的LB培养基中，培养16h之后，再以1:100的比例接种至300mL的摇瓶中，37℃培养，当菌液OD600达0.7时，加入IPTG，至IPTG的终浓度为0.02mmol/L，之后转移到30℃摇床中进行诱导表达，诱导时间为12h，离心，收集菌体。
将所得菌体，以1g菌体湿重加入1mL缓冲液(20mmol/L Tris，pH 7.4，200mmol/LNaCl，1mmol/L EDTA)的比例重悬菌体。加入溶菌酶至其终浓度为1mg/mL，加入TritonX-100至其终浓度为0.5％(体积百分比)。冰上振荡30min。将所得产品进行反复冻融，破碎细胞，条件为：将所得产物放入-196℃的液氮30秒，之后移到37℃水浴中至样品融化；重复液氮冷冻和37℃水浴融解，共4次。之后，取冻融后所得产品进行高速离心，吸取上清，即得包含了融合人生长激素的初级产物。
将所得初级产物过0.22μm滤膜后，用麦芽糖结合蛋白亲和柱纯化，具体操作步骤，参见New England BioLabs Inc.Cat.NO.N8108s的说明书。采用AKTA explorer软件实时监测，检测结果见图8，其中峰1代表杂蛋白峰；峰2为特异性洗脱峰。收集洗脱组分，得融合人生长激素1。将整个纯化过程中样品进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果见图9，其中M为蛋白分子量Marker；泳道1为诱导后菌体溶液；泳道2为冻融、离心后收集的沉淀；泳道3为初级产物；泳道4为穿透液；泳道5为目的蛋白收集峰对应的洗脱样品1；泳道6为目的蛋白收集峰对应的洗脱样品2；泳道7为目的蛋白收集峰对应的洗脱样品3；T为目的蛋白条带，从图中可以看出成功获得了融合人生长激素，融合人生长激素的大小约为65KDa，与理论值相符合。
切割和分离：
取所得融合人生长激素1，进行FXa切割，条件为：
FXa的用量为：1μg FXa对应100μg融合人生长激素1。切割条件为：20mmol/L Tris(pH 7.4)，1mmol/L EDTA。切割温度：25℃；切割时间为：6小时。
将FXa切割后所得产品过superdex G75分子筛进行分离，洗脱缓冲液为：20mmol/LTris(pH 7.4)，150mmol/L NaCl，采用AKTA explorer软件实时监测洗脱产物，收集洗脱组分，得重组人生长激素1。
由重组菌株1制备获得的融合人生长激素命名为融合人生长激素1、重组菌株2制备获得的融合人生长激素命名为融合人生长激素2、重组菌株3制备获得的融合人生长激素命名为融合人生长激素3、重组菌株4制备获得的融合人生长激素命名为融合人生长激素4、重组菌株5制备获得的融合人生长激素命名为融合人生长激素5、重组菌株6制备获得的融合人生长激素命名为融合人生长激素6、重组菌株7制备获得的融合人生长激素命名为融合人生长激素7、重组菌株8制备获得的融合人生长激素命名为融合人生长激素8。各个融合人生长激素的制备方法与融合人生长激素1的制备方法相同。
由重组菌株1制备获得的重组人生长激素命名为重组人生长激素1、重组菌株2制备获得的重组人生长激素命名为重组人生长激素2、重组菌株3制备获得的重组人生长激素命名为重组人生长激素3、重组菌株4制备获得的重组人生长激素命名为重组人生长激素4、重组菌株5制备获得的重组人生长激素命名为重组人生长激素5、重组菌株6制备获得的重组人生长激素命名为重组人生长激素6、重组菌株7制备获得的重组人生长激素命名为重组人生长激素7、重组菌株8制备获得的人生长激素为野生型人生长激素。各个重组人生长激素的制备方法与重组人生长激素1的制备方法相同。各个重组人生长激素所对应的氨基酸序列见表6。
将所得重组人生长激素进行SDS-PAGE鉴定，鉴定结果见图10。其中其中泳道1代表重组人生长激素5；泳道2代表重组人生长激素4；泳道3代表重组人生长激素3；泳道4代表重组人生长激素7；泳道5代表重组人生长激素2；泳道6代表重组人生长激素6；泳道7代表重组人生长激素1；M代表Marker。经bandscan软件分析，所得产品的纯度均大于为95％，可以作为活性鉴定实验的样品。
表6 各个重组人生长激素所对应的氨基酸序列信息
| 重组人生长激素编号 | 氨基酸序列 |
| 重组人生长激素1 | 具有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列 |
| 重组人生长激素2 | 具有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列 |
| 重组人生长激素3 | 具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列 |
| 重组人生长激素4 | 具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列 |
| 重组人生长激素5 | 具有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列 |
| 重组人生长激素6 | 具有SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列 |
| 重组人生长激素7 | 具有SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列 |
| 野生型人生长激素 | 具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列 |
(4)重组人生长激素的鉴定：
取步骤(3)中重组菌株1制备获得的重组人生长激素1，利用hGH抗体(人生长激素抗体)进行Western blot检测。
所得检测结果见图11，其中泳道1代表：FXa切割未纯化样品，其中条带A为融合人生长激素1，条带B为重组人生长激素1；泳道2代表FXa切割后经superdex G75纯化所得重组人生长激素1。实验结果证实，本发明构建的重组人生长激素能够与hGH抗体相结合，说明本发明成功获得了重组人生长激素1。
按照相同的实验方法，取步骤(3)中制备获得的重组人生长激素2、重组人生长激素3、重组人生长激素4、重组人生长激素5、重组人生长激素6、重组人生长激素7，考察其生物活性，获得了类似的实验结果，即本发明构建的重组人生长激素2、重组人生长激素3、重组人生长激素4、重组人生长激素5、重组人生长激素6、重组人生长激素7也能够与hGH抗体相结合，说明本发明成功获得了重组人生长激素2、重组人生长激素3、重组人生长激素4、重组人生长激素5、重组人生长激素6、重组人生长激素7。
实施例2 分选酶对不同的融合人生长激素的修饰能力的比较
分选酶SrtA(即Sortase A)的来源：按照王亚男等2013年在吉林农业大学学报上发表的《芦丁对金黄色葡萄球菌Sortase A的抑制作用》中记载的Sortase A重组表达载体的构建及表达纯化方法制备获得，对所得分选酶SrtA进行SDS-PAGE检测，检测结果为见图12，其中M为分子量Marker；泳道1为纯化所得分选酶；条带T为分选酶SrtA；经检测，所得分选酶SrtA的浓度为5μmol/L。
取实施例1中由重组菌株1至重组菌株7分别制备获得初级产物(即收集菌体、经冻融后离心所得上清液)，进行PEG修饰，比较各个融合人生长激素的PEG修饰效率，具体方法如下：
取初级产物，过0.22μm滤膜后，按照1mL初级产物对应2μmol/L分选酶、20μmol/L聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸的比例加入分选酶SrtA、聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸(PEG修饰剂，来源于强越生物科技有限公司，其具有式(I)所示结构)，混合均匀后，调节pH值至7.5，于37℃条件下，反应12h；
其中m＝4；n＝220，其对应的PEG的分子量为10K。
反应完毕后，将修饰产物用麦芽糖结合蛋白亲和柱纯化(详细步骤参见New EnglandBioLabs Inc.Cat.NO.N8108s的说明书)。将纯化得到的融合蛋白的进行FXa切割，条件是1μg FXa(来源于New England BioLabs Inc.)，100μg融合蛋白，20mmol/L Tris(pH 7.4)，1mmol/L EDTA，25℃条件下切割6小时。切割后产物用superdex G75分子筛过滤，洗脱缓冲液：20mmol/L Tris(pH 7.4)，150mmol/L NaCl，收集目的蛋白组分，即得PEG修饰的人生长激素。
所得的PEG修饰的人生长激素所对应的结构式，见表7。
表7 PEG修饰的人生长激素所对应的结构式
| 原始融合人生长激素 | PEG修饰的人生长激素 |
| 融合人生长激素1 | PEG修饰的人生长激素1 |
| 融合人生长激素2 | PEG修饰的人生长激素2 |
| 融合人生长激素3 | PEG修饰的人生长激素3 |
| 融合人生长激素4 | PEG修饰的人生长激素4 |
| 融合人生长激素5 | PEG修饰的人生长激素5 |
| 融合人生长激素6 | PEG修饰的人生长激素6 |
| 融合人生长激素7 | PEG修饰的人生长激素7 |
PEG修饰的人生长激素1具有式(V)所示的结构：
PEG修饰的人生长激素2具有式(VI)所示的结构：
PEG修饰的人生长激素3具有如式(VII)所示的结构：
PEG修饰的人生长激素4具有如式(VIII)所示的结构：
PEG修饰的人生长激素5具有如式(IX)所示的结构：
PEG修饰的人生长激素6具有如式(X)所示的结构：
PEG修饰的人生长激素7具有如式(XI)所示的结构：
其中，hGH代表人生长激素；LPET、LPDT、LPNT、LPAA、LPKT、LPKA、LPQT代表分选基序残基对应的氨基酸序列；n为聚合度n＝220，其对应的PEG的分子量为10K。
分别取所得PEG修饰的人生长激素，进行PAGE检测，检测结果见图13，M代表蛋白分子量Marker；泳道1代表重组人生长激素7；泳道2代表重组人生长激素6；泳道3代表重组人生长激素5；泳道4代表重组人生长激素4；泳道5代表重组人生长激素3；泳道6代表重组人生长激素2；泳道7代表重组人生长激素1；A条带代表PEG修饰的人生长激素；B条带代表未经PEG修饰的重组人生长激素。结果显示融合人生长激素1进行PEG修饰所得的产物产量最多，说明，在采用分选酶SrtA进行融合人生长激素的PEG修饰时，融合人生长激素1的PEG修饰效率最高，即重组人生长激素1的修饰效率最高。
实施例3 利用分选酶进行生长激素PEG修饰
取实施例1制备获得的重组人生长激素1，按照1mol重组人生长激素1对应2μmol/L分选酶、20μmol/L聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸的比例加入分选酶SrtA(实施例2中提供的制备方法制备获得，其浓度为5μmol/L)、聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸(PEG修饰剂，来源于强越生物科技有限公司，其具有式(I)所示结构)，混合均匀后，调节pH值至8，于25℃条件下，反应18h；
其中m＝4；n＝220，其对应的PEG的分子量为10K。
采用HPLC方法，将所得修饰产物进行分离，收集洗脱组分，得PEG修饰的人生长激素1，结果如图14所示，其中峰1代表10K PEG修饰的人生长激素1，即PEG修饰的人生长激素1；峰2代表未修饰的重组人生长激素1；其中数字1-21指的是指在洗脱过程中进行收集的管号。
对所得PEG修饰的人生长激素进行鉴定，鉴定方法为：SDS-PAGE电泳；鉴定结果如图15中泳道7所示。图15示实施例3至实施9制备获得的PEG修饰的人生长激素的检测结果，其中其中，其中M代表蛋白分子量Marker；泳道1代表PEG修饰的人生长激素7；泳道2代表PEG修饰的人生长激素6；泳道3代表PEG修饰的人生长激素5；泳道4代表PEG修饰的人生长激素4；泳道5代表PEG修饰的人生长激素3；泳道6代表PEG修饰的人生长激素2；泳道7代表PEG修饰的人生长激素1，条带T代表PEG修饰的人生长激素。
图16为利用分选酶进行人生长激素PEG修饰的反应示意图，其中(1)代表重组人生长激素1；(2)代表PEG修饰剂；(3)代表分选酶SrtA；(4)代表PEG修饰的人生长激素1；从图中可看出重组人生长激素1和PEG修饰剂在分选酶的作用下，实现了将PEG定点连接到人生长激素的C端。
实施例4 利用分选酶进行生长激素PEG修饰
取实施例1制备获得的重组人生长激素2，按照10μmol重组人生长激素1对应2μmol/L分选酶、20μmol/L聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸的比例加入分选酶SrtA(实施例2中提供的制备方法制备获得，其浓度为5μmol/L)、聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸(PEG修饰剂，来源于强越生物科技有限公司，其具有式(I)所示结构)，混合均匀后，混合均匀后，调节pH值至7，于40℃条件下，反应16h；
其中m＝4；n＝220，其对应的PEG的分子量为10K。
采用HPLC方法，将所得修饰产物进行分离，收集洗脱组分，得PEG修饰的人生长激素2。对所得PEG修饰的人生长激素进行鉴定，鉴定方法为：PAGE电泳；鉴定结果如图15泳道6所示。
实施例5 利用分选酶进行生长激素PEG修饰
取实施例1制备获得的重组人生长激素3，按照10μmol重组人生长激素1对应2μmol/L分选酶、20μmol/L聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸的比例加入分选酶SrtA(实施例2中提供的制备方法制备获得，其浓度为5μmol/L)、聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸(PEG修饰剂，来源于强越生物科技有限公司，其具有式(I)所示结构)，混合均匀后，调节pH值至7.5，于37℃条件下，反应12h；
其中m＝4；n＝220，其对应的PEG的分子量为10K。
采用HPLC方法，将所得修饰产物进行分离，收集洗脱组分，得PEG修饰的人生长激素3。对所得PEG修饰的人生长激素进行鉴定，鉴定方法为：PAGE电泳；鉴定结果如图15泳道5所示。
实施例6 利用分选酶进行生长激素PEG修饰
取实施例1制备获得的重组人生长激素4，按照10μmol重组人生长激素1对应2μmol/L分选酶、20μmol/L聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸的比例加入分选酶SrtA(实施例2中提供的制备方法制备获得，其浓度为5μmol/L)、聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸(PEG修饰剂，来源于强越生物科技有限公司，其具有式(I)所示结构)，混合均匀后，调节pH值至7.5，于37℃条件下，反应12h；
其中m＝4；n＝220，其对应的PEG的分子量为10K。
采用HPLC方法，将所得修饰产物进行分离，收集洗脱组分，得PEG修饰的人生长激素4。对所得PEG修饰的人生长激素进行鉴定，鉴定方法为：PAGE电泳；鉴定结果如图15泳道4所示。
实施例7 利用分选酶进行生长激素PEG修饰
取实施例1制备获得的重组人生长激素5，按照10μmol重组人生长激素1对应2μmol/L分选酶、20μmol/L聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸的比例加入分选酶SrtA(实施例2中提供的制备方法制备获得，其浓度为5μmol/L)、聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸(PEG修饰剂，来源于强越生物科技有限公司，其具有式(I)所示结构)，混合均匀后，调节pH值至7.5，于37℃条件下，反应12h；
其中m＝4；n＝220，其对应的PEG的分子量为10K。
采用HPLC方法，将所得修饰产物进行分离，收集洗脱组分，得PEG修饰的人生长激素5。对所得PEG修饰的人生长激素进行鉴定，鉴定方法为：PAGE电泳；鉴定结果如图15中泳道3所示。
实施例8 利用分选酶进行生长激素PEG修饰
取实施例1制备获得的重组人生长激素6，按照10μmol重组人生长激素1对应2μmol/L分选酶、20μmol/L聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸的比例加入分选酶SrtA(实施例2中提供的制备方法制备获得，其浓度为5μmol/L)、聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸(PEG修饰剂，来源于强越生物科技有限公司，其具有式(I)所示结构)，混合均匀后，调节pH值至7.5，于37℃条件下，反应12h；
其中m＝4；n＝220，其对应的PEG的分子量为10K。
采用HPLC方法，将所得修饰产物进行分离，收集洗脱组分，得PEG修饰的人生长激素6。对所得PEG修饰的人生长激素进行鉴定，鉴定方法为：PAGE电泳；鉴定结果如图15泳道2所示。
实施例9 利用分选酶进行生长激素PEG修饰
取实施例1制备获得的重组人生长激素7，按照10μmol重组人生长激素1对应2μmol/L分选酶、20μmol/L聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸的比例加入分选酶SrtA(实施例2中提供的制备方法制备获得，其浓度为5μmol/L)、聚乙二醇修饰的二聚甘氨酸(PEG修饰剂，来源于强越生物科技有限公司，其具有式(I)所示结构)，混合均匀后，调节pH值至7.5，于37℃条件下，反应12h；
其中m＝4；n＝220，其对应的PEG的分子量为10K。
采用HPLC方法，将所得修饰产物进行分离，收集洗脱组分，得PEG修饰的人生长激素7。对所得PEG修饰的人生长激素进行鉴定，鉴定方法为：PAGE电泳；鉴定结果如图15中泳道1所示。
实施例10 PEG修饰的人生长激素的体外活性评价实验
(1)STAT磷酸化实验
生长激素通过JAK-STAT信号通路参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要生物学过程，STAT(Signal transducers and activators of transcription)磷酸化实验可检测人生长激素的活性：利用PEG修饰的人生长激素刺激人IM-9淋巴细胞后，通过流式细胞仪检测STAT磷酸化的水平的高低，进而评价PEG修饰的人生长激素的体外活性。
具体过程如下：人IM-9淋巴细胞(购自American Type Cluture Collection)培养在RPMI 1640+10％FBS(胎牛血清)的培养基中，细胞浓度为5×104/孔。在检测前饥饿过夜，然后将WHO hGH(野生型人生长激素)、PEG修饰的人生长激素(实施例3至实施例9制备获得的PEG修饰的人生长激素)，每个人生长激素分为四个浓度梯度，加入待测样品至其终浓度分别为0.1nmol/L、1.0nmol/L、10nmol/L、50nmol/L。加入待测样品之后，于37℃孵育10分钟，经刺激后的IM-9淋巴细胞按照pSTAT5检测试剂盒(Cell SignalingTechnology)的说明书经固定、透化等处理，所获得的样品经流式细胞仪检测(FACS Array，BD Biosciences)，每组3个平行。检测数据利用Flowjo软件处理，计算得到各个人生长激素的EC50值，实验结果见表8。
(2)BrdU掺入法检测生长激素促细胞增殖的能力
生长激素能够促进细胞增殖，因此可以利用BrdU掺入法检测生长激素促进细胞增殖的能力。
具体过程如下：将白介素-3依赖的小鼠细胞系BAF3细胞(来源于上海研晶实业科技有限公司)，按5×104/孔，铺96孔板。以WHO hGH(野生型人生长激素，实施例1制备获得)，PEG修饰的人生长激素(实施例3至实施例9制备获得的PEG修饰的人生长激素)作为待测样品，每个人生长激素分为四个浓度，加入待测样品至其浓度为分别为0.1nmol/L、1.0nmol/L、10nmol/L、50nmol/L。加入待测样品刺激细胞后，加入50μmol/L的BrdU(Sigma-Aldrich)。48小时后，细胞经固定透化，DNase处理，暴露含有BrdU的表位，然后通过APC连接的抗BrdU抗体染色，经FACS Array检测分析，每组三个平行。
通过SigmaPlot(Systat Software,Inc.)软件处理，绘制BrdU阳性细胞百分数随给药蛋白剂量依赖曲线，计算EC50值，实验结果见表8。
表8 不同的人生长激素的体外活性实验结果
*将WHO hGH的活性比作1，其它样品与此相比。每组样品数n＝3。
从表8中的实验数据可知，与野生型人生长激素相比，在重组人生长激素进行PEG修饰之后，仍然保留了人生长激素的生物活性，并没有明显影响其生物活性，所有待测样品都能够有效促进细胞增殖，说明本发明实施例3至实施例9制备获得的PEG修饰的人生长激素仍有较强的生物活性，采用分选酶能够实现在蛋白的C端进行定点PEG修饰。
实施例11 PEG修饰的人生长激素的体内半衰期检测
取WHO hGH(野生型人生长激素，实施例1制备获得，阳性对照)、PEG修饰的人生长激素(实施例3至实施例9制备获得的PEG修饰的人生长激素)，进行大鼠体内半衰期检测，具体操作如下：
取成年雄性SD大鼠(来源于吉林大学实验动物中心)，被随机分为10组，每组6只。各组的待测样品，用生理盐水进行溶解，按1mg/kg剂量皮下注射，定点取血，测定血清中人生长激素的含量，统计各个待测样品的半衰期，检测结果见表9。
表9 不同的待测样品的半衰期
| 待测样品 | Terminal t1/2(h) |
| WHO hGH | 0.75±0.15 |
| 实施例3制备获得的PEG修饰的人生长激素 | 11.53±1.52 |
| 实施例4制备获得的PEG修饰的人生长激素 | 11.3±1.35 |
| 实施例5制备获得的PEG修饰的人生长激素 | 10.93±1.24 |
| 实施例6制备获得的PEG修饰的人生长激素 | 11.13±0.24 |
| 实施例7制备获得的PEG修饰的人生长激素 | 10.03±1.55 |
| 实施例8制备获得的PEG修饰的人生长激素 | 11.76±1.24 |
| 实施例9制备获得的PEG修饰的人生长激素 | 12.76±2.24 |
注：每组动物数n＝6
从表9中实验数据可知，相比野生型人生长激素，实施例3至实施例9制备获得的PEG修饰的人生长激素都能够有效延长人生长激素的半衰期，差异显著(P＜0.05)，说明实施例3至实施例9制备获得的PEG修饰的人生长激素都能够延长人生长激素的半衰期。
实验结果证明，本发明实施例3至实施例9制备获得的PEG修饰的人生长激素仍具有良好地生物活性，且有效延长了人生长激素的半衰期，可以作为长效药物使用。
实施例12 液体注射剂的制备
取实施例3制备获得的PEG修饰的人生长激素，添加常规辅料，按照常规方法制成液体注射剂。
实施例13 注射用粉针剂的制备
取实施例5制备获得的PEG修饰的人生长激素，添加常规辅料，按照常规方法制成注射用粉针剂。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种蛋白质定点PEG修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：获得蛋白质，在所述蛋白质的C末端融合分选酶识别的分选基序，得重组蛋白质；
步骤2：取PEG修饰剂、所述重组蛋白质，与所述分选酶混合，经肽键的切割、连接反应，获得PEG修饰的蛋白质；
所述PEG修饰剂具有式(I)所示结构：
其中，所述m为聚合度，1≤m≤5；n为聚合度；110≤n≤1100。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中所述分选酶为分选酶SrtA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中所述蛋白质为生长激素。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中所述分选基序具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1中所述分选基序为下述氨基酸序列中的任意一个：
(I)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
(II)具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
(III)具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
(IV)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
(V)具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
(VI)具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
(VII)具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
6.如权利要求1至5中任意一项所述的方法制备获得的PEG修饰的蛋白质。
7.根据权利要求6所述的PEG修饰的蛋白质，其特征在于，其为PEG修饰的生长激素。
8.一种PEG修饰的生长激素，其特征在于，其具有如式(II)或式(III)所示的结构中的任意一个：
其中，所述hGH代表人生长激素；所述LPXT代表分选基序残基对应的氨基酸序列；所述LPXA代表分选基序残基对应的氨基酸序列；所述X为任意氨基酸；所述m为聚合度，1≤m≤5；n为聚合度；110≤n≤1100。
9.如权利要求7或8所述的PEG修饰的生长激素在制备促进生长的药物、防治侏儒症、Turner综合征、慢性肾功能不全引起的衰竭或艾滋病引起的衰竭的药物中的应用。
10.一种药物，其特征在于，其包括如权利要求7或8所述的PEG修饰的生长激素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410367156.3A CN104130308A (zh) | 2014-07-29 | 2014-07-29 | 一种蛋白质定点peg修饰的方法及所得peg修饰的蛋白质 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410367156.3A CN104130308A (zh) | 2014-07-29 | 2014-07-29 | 一种蛋白质定点peg修饰的方法及所得peg修饰的蛋白质 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104130308A true CN104130308A (zh) | 2014-11-05 |
Family
ID=51803199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410367156.3A Pending CN104130308A (zh) | 2014-07-29 | 2014-07-29 | 一种蛋白质定点peg修饰的方法及所得peg修饰的蛋白质 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104130308A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020063628A1 (zh) * | 2018-09-26 | 2020-04-02 | 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 | GLP1-Fc融合蛋白及其缀合物 |
| CN112175088A (zh) * | 2019-07-02 | 2021-01-05 | 郑州晟斯生物科技有限公司 | 改进的fix融合蛋白、缀合物及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103080318A (zh) * | 2010-07-06 | 2013-05-01 | 兰提欧派普有限公司 | 含硫醚桥的肽的细菌表面展示和筛选 |
| CN103764665A (zh) * | 2011-06-28 | 2014-04-30 | 怀特黑德生物医学研究所 | 使用分选酶安装用于蛋白质连接的点击化学柄 |
-
2014
- 2014-07-29 CN CN201410367156.3A patent/CN104130308A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103080318A (zh) * | 2010-07-06 | 2013-05-01 | 兰提欧派普有限公司 | 含硫醚桥的肽的细菌表面展示和筛选 |
| CN103764665A (zh) * | 2011-06-28 | 2014-04-30 | 怀特黑德生物医学研究所 | 使用分选酶安装用于蛋白质连接的点击化学柄 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| POPP M.X.等: "Sortase-catalyzed transformations that improve the properties of cytokines", 《PNAS》 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020063628A1 (zh) * | 2018-09-26 | 2020-04-02 | 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 | GLP1-Fc融合蛋白及其缀合物 |
| CN110964116A (zh) * | 2018-09-26 | 2020-04-07 | 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 | GLP1-Fc融合蛋白及其缀合物 |
| KR20210062053A (ko) * | 2018-09-26 | 2021-05-28 | 지앙수 젠사이언시스 아이엔씨. | GLP1-Fc 융합 단백질 및 이의 접합체 |
| JP2022501405A (ja) * | 2018-09-26 | 2022-01-06 | チアンスー ジェンサイエンス インコーポレイテッド | ＧＬＰ１−Ｆｃ融合タンパク質及びその複合体 |
| JP7174149B2 (ja) | 2018-09-26 | 2022-11-17 | チアンスー ジェンサイエンス インコーポレイテッド | ＧＬＰ１－Ｆｃ融合タンパク質及びその複合体 |
| KR102649941B1 (ko) * | 2018-09-26 | 2024-03-22 | 지앙수 젠사이언시스 아이엔씨. | GLP1-Fc 융합 단백질 및 이의 접합체 |
| AU2019349201B2 (en) * | 2018-09-26 | 2024-03-28 | Jiangsu Gensciences Inc. | GLP1-Fc fusion protein and conjugate thereof |
| CN112175088A (zh) * | 2019-07-02 | 2021-01-05 | 郑州晟斯生物科技有限公司 | 改进的fix融合蛋白、缀合物及其应用 |
| JP2022540402A (ja) * | 2019-07-02 | 2022-09-15 | チアンスー ジェンサイエンス インコーポレイテッド | 改善されたｆｉｘ融合タンパク質、コンジュゲート及びその使用 |
| JP7305864B2 (ja) | 2019-07-02 | 2023-07-10 | チアンスー ジェンサイエンス インコーポレイテッド | 改善されたｆｉｘ融合タンパク質、コンジュゲート及びその使用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110117323B (zh) | 一种可溶性人源角蛋白及其应用 | |
| CN105358694A (zh) | 来自巴斯德毕赤酵母的酵母启动子 | |
| CN110950967A (zh) | 抗人血清白蛋白纳米抗体与il-2融合蛋白及制备方法 | |
| CN105296506B (zh) | 以硫磺菌蘑菇凝集素n-乙酰氨基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化方法 | |
| CN104130308A (zh) | 一种蛋白质定点peg修饰的方法及所得peg修饰的蛋白质 | |
| CN102286490B (zh) | 一种鸡干扰素γ的制备复性方法 | |
| CN107090442B (zh) | 一种N糖基转移酶BtNGT及其应用 | |
| CN110713545B (zh) | 一种人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1及其生产方法和应用 | |
| CN102492714A (zh) | 一种重组中华田园犬α干扰素的制备方法 | |
| CN117881704A (zh) | 新融合蛋白及其用途 | |
| CN105112391A (zh) | 一种人源精氨酸酶突变体及其制备方法和用途 | |
| CN114410558B (zh) | 具有降血压功能的ace抑制肽-aceip及其基因工程制备方法 | |
| CN101225113A (zh) | 一种胸腺肽α1-胸腺五肽融合肽及其制备方法 | |
| CN101892253A (zh) | 在大肠杆菌中无需包涵体复性制备溶栓药物瑞替普酶的方法 | |
| CN104672333A (zh) | 一种人源ctla4融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN104031134A (zh) | 一种基因治疗用载体蛋白及其制备方法和用途 | |
| CN108840934B (zh) | 一种重组羊长效干扰素τ及制备此长效干扰素的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN103145852B (zh) | 一种重组人多功能生长因子Pleiotrophin融合蛋白及其制备方法 | |
| CN109369794B (zh) | 一种具有调控巨噬细胞免疫功能活性的蛋白质 | |
| CN102585013B (zh) | 一种含有ω干扰素的融合蛋白及制备方法 | |
| CN104530212A (zh) | 一种免疫调节肽及其制备方法和应用 | |
| CN103937828A (zh) | 一种猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术 | |
| CN104561021A (zh) | 鸡白介素2表达基因改造方法、利用该方法改造得到的基因 | |
| CN110590930A (zh) | 美洲大蠊生长因子pdgf在制备损伤修复药物中的应用 | |
| CN112898407B (zh) | 重组驼源血清白蛋白的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141105 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |